Solieria filiformis 1

ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE NA ALGA VERMELHA

Solieria filiformis

Norma Maria Barros Benevides

2

, Adriana Melo Leite

3

e Ana Lúcia Ponte

Freitas

2

Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular, Universidade Federal

do Ceará. CP 6020, Fortaleza, CE, 60451-970, Brasil.

RESUMO. A hemaglutinina de Solieria filiformis foi purificada por extração com tampão fosfato 20 mM, pH 7,0, precipitação com sulfato de amônio até 70% de saturação, cromatografia em DEAE-celulose seguida de cromatografia de afinidade em coluna de Manana-Sepharose CL-4B. A atividade hemaglutinante não se apresentou dependente de cátions divalentes e foi inibida por manana, avidina, ovoalbumina e ‘’egg white’’ . A massa molecular de 21,9 kDa foi estimada por filtração em gel de Superose 12R e de 29 kDa por SDS-PAGE. A hemaglutinina apresentou altos teores de aminoácidos ácidos e hidroxilados e baixo conteúdo de aminoácidos básicos. O teor de carboidrato de 1,5% sugere que a hemaglutinina em estudo é uma glicoproteína.

Termos adicionais para indexação: alga marinha

vemelha, lectinas.

HEMAGGLUTINATING ACTIVITY IN THE

RED ALGA Solieria filiformis

ABSTRACT. Solieria filiformis hemagglutinin was purified by extraction with 20 mM phosphate buffer pH 7.0, precipitation with 70% saturation ammonium sulfate, DEAE-cellulose chromatography followed by affinity chromatography on Manan-Sepharose CL-4B. The hemagglutinating activity was not dependent on divalent cations, and was inhibited by manan, avidin, ovoalbumin and egg white. The estimated molecular mass was 21.9 kDa by gel filtration on Superose 12R and 29 kDa by SDS-PAGE. The hemaggltinin showed a high content of hydroxilated and acidic amino acids and low content of basic amino acids. The carbohydrate content of 1.5% suggests that the hemagglutinin under study is a glycoprotein.

Additional index terms: lectins, red marine algae.

INTRODUÇÃO

A presença de hemaglutininas tem sido observada em quase todos os organismos vivos, principalmente em plantas superiores. Apesar do considerável progresso no estudo da distribuição e do carater bioquímico das hemaglutininas de algas marinhas, os dados existentes ainda são considerados insuficientes para esclarecimento de suas propriedadesin vitroe suas possíveis funçõesin vivo. As algas marinhas vermelhas exibem um maior número de espécies com atividade hemaglutinante. Suas hemaglutininas, em geral, apresentam baixas massas moleculares, não são inibidas por açúcares simples, não são dependentes de cátions divalentes e aglutinam preferencialmente eritrócitos de coelho.

Rogers & Topliss (1983) demonstraram que extratos de Solieria chordalis (C. Ag.) J.Ag. aglutinam eritrócitos humanos em presença de albumina sérica bovina. A hemaglutinação foi inibida por fetuína, mucina bovina e mucina porcina. Os autores relatam que a remoção progressiva do ácido siálico da superfície dos eritrócitos com neuraminidase reduz a ligação da aglutinina.

Hori et al. (1988) isolaram três aglutininas a partir de extratos etanólicos da alga marinha S. robusta.

Essas proteínas apresentam pesos moleculares semelhantes (23 kDa por filtração em gel e 29 kDa por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS) e diferentes pontos isoelétricos. Além disso, Hori et al.

(1988) mostraram que as hemaglutininas aglutinam fortemente eritrócitos de coelho mas não eritrócitos humanos.

Entre as espécies coletadas no litoral do Nordeste brasileiro a alga vermelha Solieria filiformis

apresentou atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados ou não com tripsina, bromelaína, papaína e subtilisina e contra eritrócitos de cabra, galinha e porco. Os eritrócitos humanos (sistema ABO) testados não foram aglutinados por extratos da mesma alga (Ainouzet al., 1992).

O presente trabalho tem por objetivo a purificação e caracterização parcial da hemaglutinina de Solieria

1_{Received in 02/10/1995 and accepted in 11/06/1996.} 2

Doutor em Biologia, Prof. Adjunto.

filiformis, considerando os dados anteriormente obtidos por Ainouzet al.(1992).

MATERIAL E MÉTODOS

Material. As algas (Soliera filiformis) foram coletadas quando das marés baixas na Praia do Pacheco, Caucaia (CE) e armazenadas em saco plástico a -20o_{C até o momento da extração.}

Efeito do pH na extração da hemaglutinina. As

algas previamente lavadas foram trituradas em almofariz, em presença de nitrogênio líquido, e usadas para extração, na proporção 1:5 (m/v) com os seguintes tampões: acetato de sódio 20 mM pH 3,0 e 5,0, fosfato de sódio 20 mM pH 7,0, TRIS-HCl 25 mM pH 8,0 e borato de sódio 25 mM pH 10,0. Após três horas de contato, sob agitação, à temperatura ambiente, o extrato límpido foi obtido por centrifugação (9200 g, 30 min, 4 o_{C) e usado para}

determinação de proteína e de atividade hemaglutinante.

Preparação da hemaglutinina. As algas foram

lavadas para eliminação de impurezas, trituradas em almofariz, em presença de nitrogênio líquido, e submetidas a extração com tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,0, na proporção 1:5 (m/v). O homogeneizado foi centrifugado nas condições anteriormente especificadas e o sobrenadante (extrato bruto) foi usado para determinação de proteína, atividade hemaglutinante, termoestabilidade e precipitação com sulfato de amônio até 70% de saturação. O precipitado (fração 0/70) separado por centrifugação nas condições já descritas, foi suspenso em tampão fosfato de sódio 20mM pH 7,0, dialisado contra água e após contra o mesmo tampão, antes de ser aplicado em coluna de DEAE-celulose. A coluna foi equilibrada e eluída inicialmente com o tampão de extração seguido de gradiente de NaCl até 1 M. A fração ativa, após diálise contra NaCl 0,15 M, foi submetida a cromatografia de afinidade em coluna de Manana-Sepharose CL-4B. A coluna foi equilibrada e eluida inicialmente com NaCl 0,15 M e posteriormente com uréia 8M. A fração ativa foi usada para avaliação da massa molecular.

Determinação de proteína. O teor de proteína foi

determinado segundo Lowryet al. (1951), usando-se albumina sérica bovina como padrão. A proteína nos eluatos das cromatografias foi estimada pela absorbância em 280 nm.

Ensaio padrão de atividade hemaglutinante. A

atividade hemaglutinante foi determinada usando-se eritrócitos tripsinizados de coelho como descrito por Ainouz et al. (1992). Volumes iguais de amostra e suspensão de eritrócitos a 2% foram incubados por 30 min a 37o_{C, deixados em repouso por mais 30 min a}

temperatura ambiente e a atividade hemaglutinante

foi observada macroscopicamente. A atividade foi expressa como a concentração mínima de proteína (mg. L-1) ainda capaz de causar hemaglutinação.

Inibição por açúcares e glicoproteínas. A inibição

da atividade hemaglutinante foi estudada usando-se a fração 0/70 previamente diluída de modo a apresentar 25% da atividade inicial. Soluções de açúcares simples e glicoproteínas foram preparadas em NaCl 0,15 M em diferentes concentrações, por diluições sucessivas. Volumes iguais (200µL) da amostra e soluções de açúcares foram previamente incubados por 30 min a 37o_{C antes da adição da suspensão de}

eritrócitos (400µL). A atividade foi determinada como descrita sob ensaio padrão e expressa como a mais baixa concentração do composto na qual não foi observada hemaglutinação.

Termoestabilidade. O efeito do calor sobre a

atividade hemaglutinante foi determinado incubando-se o extrato bruto em banho-maria as temperaturas de 40, 60, 80 e 90o_{C por 10, 20 e 30min.}

Após incubação as amostras foram resfriadas em banho de gelo e usadas para ensaios de hemaglutinação.

Efeito de ions metálicos. Para verificação do efeito

de cátions divalentes sobre a atividade hemaglutinante, a fração 0/70 foi dissolvida em NaCl 0,15 M, dialisada contra EDTA (ácido etilenodiamino tetracético) 5 mM por ca. 18 horas seguida de diálise contra NaCl 0,15M e usada para determinação da atividade hemaglutinante em presença e ausência de CaCl₂ e MnCl₂5 mM, utilizando-se como controle a amostra não dialisada contra EDTA.

Determinação da massa molecular. A massa

molecular aparente das proteínas intactas foi estimada por cromatografia de filtração em gel em coluna de Superose 12R acoplada a sistema de FPLC (Pharmacia), usando-se como referências as seguintes proteínas: quimiotripsogênio A (25 kDa) ovalbumina (43 kDa) e albumina sérica bovina (66 kDa)

A eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS (dodecil sulfato de sódio) foi usada também para estimativa da massa molecular pelo método de Laemmli descrito por Hames & Rickwood (1983). As proteínas usadas como marcadores de massa molecular foram: albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase (36 kDa), anidrase carbônica (29 kDa) tripsinogênio (24 kDa), inibidor de tripsina de soja (20 kDa) e lactoalbumina (14 kDa).

Composição de aminoácidos. A composição de

aminoácidos da proteína foi determinada após hidrólise da mesma (em ampolas seladas sob atmosfera de Nitrogênio) por 24 horas a 110o_{C em}

HCl 6,0 N. O HCl presente no hidrolisado foi removido por evaporação e o resíduo analisado por cromatografia de troca iônica (Analisador de aminoácidos Biocrom 20, Pharmacia-LKB).

Determinação de carboidrato. O teor de carboidrato foi determinado pelo método de Duboiset al(1956), usando-se glicose como padrão.

RESULTADOS

A fim de se escolher o melhor meio de extração da hemaglutinina de S. filiformis, foram feitas determinações com tampões de diferentes valores de pH, verificando-se (Tabela 1) que os tampões borato de sódio pH 10,0 e fosfato de sódio pH 7,0 extrairam maior quantidade de proteína. Entretanto,em pH 7,0 , a proteína extraida requer uma mais baixa concentração (mg.L-1_{) para causar hemaglutinação,}

passando este pH a ser usado nas extrações no decorrer do trabalho.

A Tabela 2 apresenta os dados relativos à purificação da hemaglutinina de S. filiformis.

Verifica-se que a fração que precipita com sulfato de amônio até 70% de saturação corresponde a ca. 58% da proteína extraida e a 36% da atividade hemaglutinante inicial. Por cromatografia em DEAE-celulose (Figura 1) da fração 0/70, foi obtido um pico ativo não retido encerrando ca. 86% da atividade . Por cromatografia de afinidade em coluna de Manana-Sepharose CL-4B (Figura 2) foram obtidos dois picos de proteína com toda a atividade concentrada na fração eluida com uréia 8M.

FIGURA 1- Cromatografia em

DEAE-celulose da fração precipitada com sulfato de amônio até 70% de saturação. Frações: 3 mL. Fluxo: 30 mL.h-1

—

FIGURA 2- Cromatografia de afinidade em Manana-Sepharose CL-4B da fração obtida por cromatografia em DEAE-celulose. Frações: 1,5 mL. Fluxo 30 mL.h-1.

—

TABELA 1- Atividade hemaglutinante e teor de

proteína extraída da alga vermelha Solieria filiformis

com tampões de diferentes valores de pH.

Tampões pH Volume_(ml) Proteínatotal (mg)* Atividade tota (UH) mg** Acetato de Na 3 89 5,3 - -Acetato de Na 5 82 8,2 2 624 3,1 Fosfato de Na 7 95 27,6 24 320 1,1 TRIS-HCl 8 81 22,7 10 368 2,2 Borato de Na 10 98 31,4 12 544 2,5* *Determinada pelo método de Lowry.

** Concentração mínima de proteína (mg.L-1) capaz de aglutinar uma suspensão de eritrócitos tripsinizados de coelho (2%).

TABELA 2- Etapas de purificação da hemaglutinina

de Solieria filiformis.

Frações Volume_{(ml) total (mg)*}Proteína _{total (UH)}Atividade µg** Extrato bruto 475,0 133,0 243 200 0,55 Fração 0/70 10,6 76,9 86 835 0,89 DEAE-celulose 8,7 5,0 71 270 0,07 Manana-Sepharose 7,5 4,4 61 640 0,07* * Determinada pelo método de Lowry.

** Concentração mínima de proteína (mg. L-1) capaz de aglutinar uma suspensão de eritrócitos tripsinizados de coelho (2%).

A atividade hemaglutinante manteve-se estável quando o extrato inicial foi tratado por 30 min até 50

o_{C, decrescendo ca. 75% a 60} o_{C e tornando-se}

inativa a 90o_{C (Figura 3).}

A hemaglutinina não foi inibida na presença dos seguintes açúcares ,em concentrações até 25 mM: arabinose, celobiose, frutose, glicose, galactose, glucosamina, manosamina, manose, melibiose, melezitose, rafinose, ribose, sacarose, trealose e xilose. A atividade hemaglutinante foi inibida por manana (19,5 mg. L-1 _{), avidina e ovalbumina}

(156mg.L-1 _{) e ‘’egg-white’’ (1250 mg.L}-1_{) e não}

apresentou inibição em presença de mucina e fetuina. A hemaglutinina não apresentou dependência de Ca++_{e Mn}++_{para a sua atividade.}

A massa molecular aparente de 21,9 kDa foi estimada por filtração em gel de Superose 12R (Figura 4). Por eletroforese em gel de poliacrilamida a hemaglutinina apresentou uma massa molecular ca. 29 kDa (Figura 5).

Para uma solução de lectina purificada encerrando 2,4 mg de proteína por mL (determinada por absorbância em 280 nm) foi encontrado 0,037 mg de carboidrato por mL.correspondendo a ca. de 1,5% de carboidrato.

FIGURA 3- Efeito da temperatura sobre a atividade

hemaglutinante em extrato deSolieria filiformis.

FIGURA 4- Massa molecular estimada por filtração

em gel de Superose. 12R. 1.Albumina sérica bovina; 2. Ovoalbumina; 3. Quimiotripsinogênio A; 4. Hemaglutinina deSolieria filiformis.

TABELA 3- Composição de aminoácidos da hemaglutinina deSolieria filiformis.

Aminoácidos % Asp 13,47 Thr 8,53 Ser 11,01 Glu 10,53 Gly 19,50 Ala 7,28 1/2 Cys n.d. Val 5,36 Met 0,33 Ile 2,67 Leu 3,60 Tyr 2,28 Phe 2,22 His 1,27 Lis 5,43 Arg 3,04 Pro 3,67

A Tabela 3 apresenta a composição de aminoácidos da hemaglutinina purificada. Ela apresentou alto teor de aminoácidos ácidos e hidroxilados e baixo conteúdo de aminoácidos básicos.

DISCUSSÃO

Ainouz et al. (1992) verificaram que extratos de

Solieria filiformis aglutinavam eritrócitos, tratados enzimaticamente (bromelaína, papaína, subtilisina e tripsina), de porco, coelho, cabra e galinha e não aglutinavam eritrócitos humanos do sistema ABO. No presente trabalho foram usados eritrócitos tripsinizados de coelho a fim de estudar a hemaglutinina deS. filiformispor serem os mesmos de mais fácil obtenção e por serem preferencialmente aglutinados por extratos de algas marinhas vermelhas.

A hemaglutinina foi purificada , a partir de extratos em pH 7,0, por precipitação com sulfato de amônio (70% de saturação) seguida de cromatografia em DEAE-celulose e cromatografia de afinidade em coluna de Manana-Sepharose -CL 4B.

A atividade hemaglutinante foi inibida por manana e a natureza da ligação a manana foi também demonstrada pela adsorção da hemaglutinina em coluna de Manana-Sepharose . A inibição por manana foi também observada emSolieria robusta(Horiet al.,

1988), Carpopeltis flabelata (Hori et al., 1987) e

Boodlea coacta(Horiet al., 1986).

A homogeneidade da hemaglutinina foi testada por eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS e β-mercaptoetanol, quando a fração migrou como uma única banda indicando ser a mesma uma

proteína monomérica. Essa propriedade foi observada em hemaglutinina deAgardihella tenera(Shiomiet al., 1970),Gracilaria bursa-pastoris(Okamotoet al.,1990) , Boodlea coacta, Carpopeltis flabelata e Solieria robusta (Hori et al.,1990). O fato de proteínas monoméricas causarem aglutinação ainda não está esclarecido, sendo sugerido que a molécula se agrega por ela mesma na superfície da célula para causar aglutinação celular (Horiet al.,1990).

Uma massa molecular aparente de 29 kDa observada por eletroforese em gel de poliacrilamida é aproximadamente a mesma daquela estimada por filtração em gel de Superose 12R (21,9 kDa). Uma maior massa molecular apresentada por eletroforese em gel de poliacrilamida pode ser justificada pelo caráter glicoprotéico da molécula, o que foi observado

FIGURA 5- Eletroforese em gel de poliacrilamida da

hemaglutinina deSolieria filiformis. 1. Pico obtido em DEAE. 2. Pico obtido em Manana-Sepharose. 3. Marcadores. Lactoalbumina 14 kDa. Inibidor de tripsina 20 kDa. Tripsinogênio 24 kDa. Anidrase carbônica 29 kDa. Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase 36 kDa. Ovoalbumina 45 kDa. Albumina sérica bovina 66 kDa.

quando da determinação de carboidrato na amostra purificada.

A estabilidade ao calor por 30 min a 50o_{C pode ser}

explicada por se tratar de uma molécula com massa molecular relativamente baixa. Comportamento semelhante foi reportado paraAgardihella teneraque apresenta uma massa molecular ca. 12 kDa (Shiomi

et al.,1979).

A hemaglutinina de S. filiformis não apresentou dependência por cátions divalentes podendo ser incluida no grupo citado por Rogers & Hori (1993) de lectinas de algas vermelhas que apresentam baixa massa molecular, se ligam a glicoproteínas e não requerem cátions divalentes para sua atividade (Rogers & Hori, 1993).

As aglutininas são usualmente ricas em aminoácidos ácidos e hidroxilados e pobres em aminoácidos básicos o que está de acordo com os resultados obtidos para a hemaglutinina de S. filiformis.

Dentro do gênero Solieria os dados obtidos para

S. filiformis estão mais próximos aos encontrados para S. robusta(Hori et al.,1988) e diferem um pouco daqueles relatados para S. chordalis (Rogers & Topliss, 1983).

REFERÊNCIAS

AINOUZ, I.L.; SAMPAIO, A.H.; BENEVIDES,N.M.B.; FREITAS,A.L.P.; COSTA, F.H.F.; CARVALHO, M.C. & PINHEIRO-JOVENTINO. Agglutination of enzyme treated er ythrocytes by Brazilian marine algae.

Botanica Marina, 35:475-479, 1992.

HAMES,B.D. & RICKWOOD,D. Gel Electrophoresis of

Proteins. A Practical Approach. Washington, IRL

Press. 1983, 27-33p.

HORI, K., IKEGAMI, S., MIYAZAWA, K. & ITO, K. Mitogenic and antineoplastic isoagglutinins from the red alga Solieria robusta. Phytochemistry,

27(7):2063-2067, 1988.

HORI,K., MAISUDA,H., MIYAZAWA,K. & ITO,K. A mitogenic agglutinin from the red alga Carpopeltis flabellata. Phytochemistry, 26 (5):1335-1338, 1987. HORI ,K., MIYAZAWA, K. & ITO,K. Isolation and characterization of glycoconjugate-specific isoagglutinins from a marine green alga Boodlea coacta(Dickie) Murray et De Toni. Botanica Marina,

29:323-328, 1986.

HORI, K., MIYASAWA,K., & ITO,K. Some common proper ties of lectins from marine algae.

Hydrobiologia, 204/205:561-566, 1990.

LOWRY, O.H., ROSEBROUGH, N.J., FARR, A.L. & RANDAL, R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry,

193:265-275, 1951.

ROGERS,D.J. & HORI, K. Marine algal lectins: new developments. Hydrobiologia, 260/261:589-593, 1993.

ROGERS, D.J. & TOPLISS, J.A. Purification and characterisation of an anti-sialic acid agglutinin from the red algaSolieria chordalis(C. Ag.) J.Ag.Botanica Marina,26:301-305, 1983.

SHIOMI, K., KAMIYA, H. & SHIMIZU,Y.U Purification and characterization of an agglutinin in the red alga

Agardihella tenera.Biochimica Biophysica Acta,