FUNDAÇÃO EDUCACIONAL MIGUEL MOFARREJ FACULDADES
INTEGRADAS DE OURINHOS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
LEONARDO VANZELI CARVALHO
A TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM EQUINOS
OURINHOS-SP
2015
LEONARDO VANZELI CARVALHO
A TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM EQUINOS
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos, como pré-requisito para a obtenção do Título de Bacharel em Medicina Veterinária.
Orientadora: Profª. Drª. Fernanda Saules Ignácio
OURINHOS-SP
2015
CARVALHO, Leonardo Vanzeli.
A transferência de embriões em equinos./
Leonardo Vanzeli Carvalho. – Ourinhos, SP: FIO, 2015. 41 f.; 30 cm
Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de Medicina Veterinária) - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2015 Orientadora: Profª.Drª. Fernanda Saules Ignácio
1.Biotecnologia 2.Transferência de embrião3.Eqüina 4. Manejo I. Titulo
LEONARDO VANZELI CARVALHO
A TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM EQUINOS
Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária, no Curso de Medicina Veterinária, das Faculdades Integradas de Ourinhos.
Ourinhos, Dezembro 2015.
Prof. PhD. Cláudia Yumi Matsubara Rodrigues Ferreira Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária Roque Quagliato
BANCA EXAMINADORA
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Prof. PhD. Cláudia Yumi Matsubara Prof° Me. Renata Tortorello Rossetti
Faculdade de Medicina Veterinária Faculdade de Medicina Veterinária Roque Quagliato – FIO Roque Quagliato - FIO
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Orientadora. Profª.Drª Fernanda Saules Ignácio Faculdade de Medicina Veterinária Roque Quagliato – FIO
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família, em especial meu avô, mãe e irmã que não mediram esforços para realização desse sonho.
AGRADECIMENTO
Primeiramente, agradeço a Deus por mais essa conquista.
À professora e orientadora Fernanda Saules Ignácio, pela paciência, determinação e experiência com que me orientou para a realização deste trabalho.
Agradeço aos amigos de turma, em especial Renan Busolim Silva, Eliseu Garcia, Thais Cardoso, Kaio Pegorer, Rodrigo Rosa, Layson Silva, Antenor Bueno, Adriano Barduco, Alvaro Garcia e Arthur Negrão.
Aos Professores pela dedicação e competência com que tornaram possível a minha formação.
A minha família que me deu todo suporte e apoio.
Ao Abelardo Lupion e ao Luiz C. Comegno Júnior, por me conceder o estágio proporcionando a oportunidade de um enorme ganho de conhecimento e experiência.
RESUMO
A transferência de embriões é uma das biotecnologias da reprodução mais utilizadas para a espécie equina, sendo o Brasil um dos três maiores produtores de embriões do mundo. O objetivo deste trabalho é revisar as técnicas, as bases fisiológicas para realização dos procedimentos e a importância da transferência de embriões para a indústria e o mercado do cavalo, dadas à possibilidade de versatilidade no manejo e posterior comercialização dos produtos. Estes pontos estão intimamente ligados aos avanços reproduzidos pelo melhoramento genético baseados no desenvolvimento e, ou melhoramento de técnicas. Esta técnica apresenta resultados satisfatórios não somente no produto final e taxas de prenhez, mas também no fator custo, o que viabiliza seu uso comercial em larga escala.
ABSTRACT
Embryo transfer is one of the most used reproduction biotechnologies in the horse, and Brazil is one of the three countries of higher number of transferred embryos. The aim of this work is to review techniques, physiologic basis and the importance of embryo transfer for the horse industry. These points of views are right connected to the genetic improvement achieved with the embryo transfer. This technique shows satisfactory results which enables its widely commercial use.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM MEDICINA
VETERINÁRIA- PECUÁRIA SELETIVA BEKA (NELORE BEKA) SANTO ANTÔNIO DA PLATINA – PR
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO CURRICULAR REALIZADO NA FAZENDA PECUÁRIA SELETIVA BEKA LTDA (NELORE BEKA), SANTO ANTÔNIO DA PLATINA – PR... ... 2
3.1 Estrutura física ... 2
3.2 Atividades desenvolvidas ... 6
3.3 Conclusão ... 7
4. CAPÍTULO 2. A TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM EQUINOS... 8
5. INTRODUÇÃO ... 9
6. REVISÃO DE LITERATURA ... 11
6.1 Seleção e manejo da égua doadora e receptora ... 12
7.TÉCNICA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES ... 15
7.1. Fisiologia da reprodução ... 15
7.2. Utilização dos hormônios ... 17
7.3 Ciclo estral e sincronização ... 17
7.4 Colheita de embriões ... 19
7.5 Classificação e manipulação do embrião ... 20
7.6 Inovulação ... 21
7.7 Vantagens e desvantagens da Transferência de Embrião (TE) ... 22
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 25
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Baias, pavilhão 1... 3
FIGURA 2- Baias, pavilhão 2... 3
FIGURA 3- Confinamento... 4
FIGURA 4- Mangueira para o manejo... 4
FIGURA 5- Trincheiras para armazenagem do silo... 5
FIGURA 6- Área de pastagem... 5
CAPÍTULO 1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM
MEDICINA VETERINÁRIA- PECUÁRIA SELETIVA BEKA (NELORE
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1. INTRODUÇÃO
O estágio curricular supervisionado é uma etapa onde o acadêmico de Medicina Veterinária, pode colocar em prática todo o conhecimento adquirido durante a graduação, aprimorar a comunicação e a se relacionar com as pessoas. Possibilita o estagiário estar em contato com as adversidades do dia a dia, podendo desta forma aprender a contornar situações, imprevistos e absorver a experiência vinda de profissionais atuantes há mais tempo, estabelecendo assim melhor comunicação entre as pessoas que prestam serviços e as que necessitam. Além de todo ganho mencionado acima é uma forma de preparar o acadêmico para o mercado de trabalho. Assim, a primeira parte deste trabalho de conclusão de curso, tem por objetivo, relatar as experiências obtidas no período de estagio, neste caso, realizado na Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Nelore Beka) em Santo Antonio da Platina. Fazenda onde há alguns anos tinha por objetivo a criação do gado PO de elite, e que por sua vez, em 2009, o proprietário optou por começar a inovar seu rebanho, trazendo da Índia novas linhagens do nelore, visando a melhoria genética do seu rebanho, melhora em precocidade e rusticidade, ganho de peso e demais características e junto com isso proporcionando novas seleções de touros POI e ½ sangue POI e também de matrizes, renovando todo seu rebanho e com isso, obtendo resultados positivos podendo difundir essas linhagens por todo Brasil. O relatório expõe as experiências colocadas em prática pelo autor supervisionado por um profissional qualificado na área específica descrita.
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2.
DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO CURRICULAR
REALIZADO NA FAZENDA PECUÁRIA SELETIVA BEKA LTDA
(NELORE BEKA), SANTO ANTÔNIO DA PLATINA – PR.
O estágio foi realizado no período de Agosto a Novembro de 2015, na Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Nelore Beka), perfazendo um total de 635 horas de estágio, localizada em Santo Antonio da Platina - PR, Bairro: Guimarães Carneiro, BR - 153.
Os funcionários, habitualmente, cumprem a carga de oito horas de trabalho, (07h00min as 17h00min, com intervalo de duas horas) e, eventualmente hora extra.
A propriedade conta com Médico Veterinário e gerente, tratador de animais, responsável pelos animais embaiados, responsável pelos animais de campo, responsáveis pela limpeza, cozinheira, responsáveis pela manutenção da fazenda, que é destinada a criação de bovinos de corte e melhoramento genético da raça nelore, com o intuito de produzir reprodutores e matrizes, juntamente com venda de sêmen e também seus produtos finais.
3.1 Estrutura física
A fazenda conta com uma infra-estrutura dividida em setores, por exemplo: O escritório onde é feita toda parte burocrática e contábil da propriedade; a sede onde se localiza a residência e área de lazer do proprietário; as casas dos funcionários da fazenda; uma pequena capela; pavilhões onde alguns animais selecionados permanecem em baias (Figura 1 e 2) separadas, com cocho de água e ração individuais; a área de confinamento (Figura 3), com varias divisões, onde também ficam animais selecionados e divididos conforme faixa etária e sexo, entre doadoras e touros, porém são lotes maiores e dividem cochos para ração e água; a “mangueira” (Figura 4) onde é feito o manejo sanitário dos animais, manejo reprodutivo, onde conta com varias repartições, tronco de contenção, balança para pesagem, embarcador e uma sala para armazenar medicamentos, ferramentas e
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instrumentos utilizados para o manejo dos animais. Possui também uma área onde tem construído quatro “trincheiras” (Figura 5) para deposito de silo, que é utilizado para a alimentação do gado. O armazenamento de ração, sal, feno e outros, são feito em barracões localizados próximo as baias.
Figura 1: Baias, pavilhão 1 Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte: Arquivo pessoal, 2015).
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Figura 3: Confinamento. Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte: Arquivo pessoal, 2015).
Figura 4: Mangueira para o manejo, Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte: Arquivo pessoal,
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Figura 5: Trincheiras para armazenagem do silo, Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte:
Arquivo pessoal, 2014)
O restante da fazenda é de pastagem (Figura 6) separada em módulos, cada um é dividido em vários piquetes, no centro de cada piquete encontra se cochos cobertos para ração, bebedouro e creeping feeding (Figura 7) para os bezerros, destinados para as receptoras e algumas matrizes. Possui também os destinados aos cavalos utilizados no manejo dos animais, para éguas prenhes e para as vacas leiteiras onde é realizada a ordenha e distribuição.
Figura 6: Área de pastagem, Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte: Arquivo pessoal,
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Figura 7: Piquetes, Fazenda Pecuária Seletiva Beka Ltda (Fonte: Arquivo pessoal, 2014)
3.2 Atividades desenvolvidas
Nos diversos setores da fazenda, supervisionado pelo Médico Veterinário Luiz Carmelo Comegno Junior CRMV 6646-PR, foram realizadas atividades na área da bovinocultura de corte e melhoramento genético como: manejo sanitário e nutricional dos animais, cuidados com animais doentes e animais lesionados, cuidados com recém nascidos e desmama, vacinações necessárias, avaliações de touros (andrológico), marcação e identificação dos animais na reprodução juntamente com manejo reprodutivo (Coleta e transferência de embriões) entre outras atividades operacionais no dia a dia da fazenda. Os procedimentos como coleta de embriões, transferência, exame andrológico, foi possível apenas acompanhar a realização dos mesmos por serem feitos por empresas prestadoras de serviços. Já as demais atividades como: vacinação (aftosa, clostridium, vermífugos), curativos, aplicação de antibióticos, antiinflamatórios e demais medicamentos como terapia em animais adoentados, marcação dos animais, foi possível realizar. Através da experiência
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obtida nesse período, foi possível realizar diversos procedimentos e aprendizados que resultaram na facilitação do manejo e cuidado com os animais.
3.3 Conclusão
O estágio curricular proporcionou adquirir uma vasta experiência e prática nas atividades desenvolvidas, possibilitando interagir com profissionais tanto na área da Medicina Veterinária quanto outras. Teve a oportunidade acompanhar a conduta de trabalho, tanto com pacientes (animais tratados individualmente em baias) como proprietários (demais propriedades) e funcionários, maneiras de pensar e agir diante de alguma adversidade. Adquirir novos conhecimentos e experiências, aprender vários procedimentos na prática e aprimorar outros que foram adquiridos no período da graduação. Foi possível saber mais sobre as exigências do mercado de trabalho, novas tendências na área da bovinocultura de corte e também sobre a inovação da raça nelore no Brasil. Obtendo um ótimo aproveitamento e dedicação no período de estágio.
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5. INTRODUÇÃO
Os cavalos estiveram presentes na vida do homem em situações diversas e nos séculos anteriores participaram efetivamente das guerras. Com o passar do tempo e com o advento da agricultura a sua participação foi primordial na produção de alimentos, onde serviram como animais de tração na atividade do campo e transporte, primeiramente como objetivo da própria subsistência do ser humano e foi perdendo seu espaço no campo com a chegada da mecanização, que buscou acima de tudo como conseqüência do capitalismo, o aumento de produção, sua comercialização.
Nas últimas décadas estiveram presentes também nos esportes e atualmente o mercado tem apostado na melhoria genética com o objetivo de explorar outras fontes de comercialização no que concerne aos eqüinos.
Assim, foi abordado neste trabalho a biotécnica de transferência de embrião na espécie equina, de forma que, no primeiro momento, torna-se necessário para entendimento do assunto, conhecer a técnica, que atualmente, é considerada uma biotécnica de grande importância para a indústria e o mercado do cavalo, dadas as possibilidades de versatilidade no seu manejo e posterior comercialização, intimamente ligados aos avanços reproduzidos pelo melhoramento genético baseados no desenvolvimento e, ou melhoramento de técnicas.
Esta técnica apresentou resultados satisfatórios não somente no produto final bem como no fator custo, uma vez que houve a sua diminuição, pois a utlização dos superovulatórios e criopreservação de embriões potencializa o seu uso de forma adequada com perdas menores e mais possiblidades de ganhos, não somente em quantidade, mas em qualidade como um todo.
Torna-se necessário também abordar a biotecnologia, suas definições e os fundamentos teóricos que a fundamentam, uma vez que foi por meio desta oportunizou-se o melhoramento genético, favorecendo também o aprimoramento das raças e porteriormente os seus cruzamentos.
Fica evidente que a mesma busca atingir, através da seleção e do cruzamento, a qualidade no produto final, sempre ligados a probabilidade de maior ganho relacionado a venda do produto. Para que esta estratégia tenha o sucesso
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esperado há que se respeitarem os protocolos de sincronização de estro, bem como a indução da ovulação e os outros aspectos relacionados à aplicação da tecnologia referida.
O objetivo deste trabalho é revisar as técnicas, as bases fisiológicas para realização dos procedimentos e a importância da transferência de embriões para a indústria e o mercado do cavalo, dadas à possibilidade de versatilidade no manejo e posterior comercialização dos produtos.
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6. REVISÃO DE LITERATURA
Os primeiros estudos envolvendo a transferência de embriões na espécie equina foram realizados em 1969, por um grupo de pesquisadores japoneses,que relatou, em 1972, uma taxa de 45% de sucesso nas colheitas dos embriões, porém sem nenhuma concepção confirmada (OGURI e TSUTSUMI, 1972).
Somente nos anos 70, em Cambridge, na Inglaterra, Allen e Rowson (1972), conseguiram desenvolver as primeiras transferências de embriões em eqüinos bem sucedidas, onde os mesmos foram coletados e transferidos por cirurgia via laparotomia, pelo flanco ou linha média (ALLEN, 2005). Em 1980, Oguri e Tsutsumi (1972) realizaram a técnica de transferência não cirúrgica em éguas.
No Brasil, a biotécnica teve seu início na espécie eqüina, em 1987 e os grandes responsáveis foram os médicos veterinários João Junqueira Fleury, Cezinande Meira e Marc Henry, através dos métodos cirúrgico e não-cirúrgico. (FLEURY et al., 1987; MEIRA e HENRY, 1991).
Apesar de a espécie equina ter sido considerada por muito tempo como a de menor fertilidade entre as espécies domésticas, o que foi atribuído a características de seleção e problemas relacionados ao manejo reprodutivo (GINTHER, 1992), o cavalo passou a ser usados na prática de vários esportes e de lazer, e não mais, historicamente falando, apenas no transporte ou simplesmente como tração animal.
As duas técnicas de reprodução que dominam a reprodução equina e que são as mais utilizadas são: a Inseminação Artificial (IA) e a Transferência de Embrião (TE). A inseminação artificial em equinos é largamente praticada em todo o mundo, e a maneira mais comumente usada nessa espécie é mediante o resfriamento e transporte de sêmen (LOOMIS, 2006).
Se bem conduzidas, tanto a inseminação artificial como a transferência de embrião podem ser consideradas financeiramente viáveis e podem vir a contribuir para a melhoria genética de uma raça.
Assim, partimos do caso da equinocultura e da transferência de embrião, como instrumento direto do melhoramento genético e como finalidade da biotecnologia.
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De fato, esta técnica é considerada uma importante ferramenta para o melhoramento genético no plantel e tem apresentado um impacto maior na indústria equina, tornando-a uma importante fonte geradora de renda.
Esta biotécnica pode ser definida como uma técnica de reprodução assistida que possibilita retirar o embrião de uma égua doadora previamente inseminada para que este seja transferido para uma égua denominada de receptora,com boa qualidade uterina e habilidade materna. Segundo Arruda, esta é uma ferramenta promissora para essa finalidade (ARRUDA et al., 2001).
O diferencial desta técnica destaca-se pelo fato de que, efetivamente, se dá a produção de múltiplos potros por ovulação da doadora durante o ano, que servirá como uma barriga de aluguel e criará o potro até o desmame.
6.1 Seleção e manejo da égua doadora e receptora
Antes de selecionar a égua doadora, deve-se observar o seu histórico de reprodução e apresentar um teste negativo para anemia infecciosa equina, alem de receber as vacinas e vermífugos necessários. Sobre esta questão, Squires (1999) reitera que, para a seleção da égua doadora deve ser observado o seu histórico reprodutivo, bem como a fertilidade e genitores, as diretrizes do registro da raça, o valor potencial do potro resultante e o número de gestações desejadas (SQUIRES et al., 1999).
A doadora deve ser avaliada pelo médico veterinário, a escolha da doadora normalmente é feita pelo proprietário, que considerará alguns requisitos tais como: apresentar alto desempenho esportivo e/ou alto valor genético, mas que por algum motivo, não possa levar a gestação a termo em função de ainda estar competindo, ou ainda pela idade avançada. A história reprodutiva da égua e a idade são provavelmente os aspectos mais importantes que um veterinário deve ter em conta quando examina uma égua (SAMPER et al., 2008).
A égua doadora ou em cio deve ser examinada diariamente para monitorar o crescimento folicular, permitindo o momento correto para que ocorra a inseminação (VANDERWALL & WOODS, 2007).
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Para observar estas questões há que se monitorar atividade folicular e ovulação da égua, ou seja, o seu comportamento reprodutivo que pode ser feito através do exame completo do trato reprodutivo e avaliação de um ou dois ciclos estrais consecutivos e também por meio da palpação transretal e da ultrassonografia.
A ovulação da maioria das éguas ocorre em ciclos que duram aproximadamente 21 dias e a coleta de um embrião a cada intervalo. Pode ocorrer ainda a dupla ovulação, que permite que sejam coletados até dois embriões em apenas um ciclo. Isto não ocorre comumente, só entre algumas linhagens de cavalos.
De acordo com McKinnon & Squires(2007) para que o processo ocorra sem sustos, seria interassante ter ao menos duas receptoras disponíveis para cada doadora, permitindo assim, no momento da inovulação, escolher a que apresenta as melhores condições reprodutivas para receber o embrião para que não ocorram perdas de material.
Para a escolha da égua receptora há que se considerarem alguns fatores, entre eles está o fato de que a égua precisa apresentar várias características, tais como boa qualidade uterina, conformação vulvar e habilidade materna; além de grande porte para evitar problemas de parto. Também é interessante que seja dócil para facilitar o seu manejo e o do potro que vai nascer.
Muitas vezes, as receptoras, são consideradas éguas de baixo valor zootécnico, no entanto são peças fundamentais no programa de transferência de embriões, pois serão elas que vão gestar e criar o potro até o desmame. No entanto, a carga genética da égua que carrega o potro nada influencia nas características deste animal, pois as suas característias genéticas foram determinadas pela égua que produziu o óvulo e pelo doador dos espermatozóides.
Assim, Carnevale et al., (2000), orienta que essas éguas precisam estar em boas condições corporais como o lúteo bem definido, o tónus da cérvix e útero e a presença de edema uterino, devem ser avaliados e registados (MACPHERSON, 2010) e nenhuma outra alteração no útero, já que caberá à receptora reconhecer o embrião e fornecer as condições necessárias ao seu desenvolvimento (FLEURY et al., 2007).
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Vanderwall & Woods (2007) e Squires et al. (1999) reiteram ainda outros critérios que devem ser obsevados como: o peso do animal deve ser entre 400 a 550 kg, idade de 3 a 10 anos, boa índole e bom desenvolvimento mamário, além de ciclos estrais normais e livres de anormalidades uterinas e ovarianas.
No dia em que o embrião for transferido, é necessário avaliar as receptoras por meio de exames ginecológicos fazendo uso da palpação retal e utilizando o ultra-som por via trans-retal para a avaliação das mesmas. Onde vai ser verificado o tônus uterino e também da cérvix, as características morfológicas do corpo lúteo e se as receptoras possuem anormalidades como edema, cistos, presença de liquido e ou ar no útero, isso no momento em que for realizada a transferência do embrião (Carnevale et al., 2000) – e respeitando as definições descritas por (Caiado et al. 2007), sendo feita a classificação como receptoras excelentes, boas, marginalmente aceitáveis e inaceitáveis:
Excelentes: Éguas com presença de no mínimo um corpo lúteo com ecogenicidade bem delimitada, o tônus uterino deve estar em 3 ou 4 , cérvix fechada firmemente e sem presença de alterações como dobras uterina e cistos;
Boas: receptoras com tônus uterino e corpo lúteo nas mesmas condições citadas em éguas excelentes, podendo ter dobras endometriais consideradas brandas e ou a cérvix não tão firmemente fechada;
Marginalmente aceitáveis: possui o corpo lúteo, mas de tamanho reduzido e ou ecogenicamente ruim, o tônus uterino pode estar entre 2 e 3 e afrouxamento no fechamento da cérvix;
Inaceitáveis: ausência de corpo lúteo ou sem definição, a tonicidade do útero menor ou igual a 2, útero com alterações patológicas, endométrio com presença de edema acentuado e cérvix aberta.
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7.TÉCNICA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
Com relação às técnicas utilizadas para a transferência de embriões pode-se citar a técnica cirúrgica, por incisão ao flanco, ou pela técnica não cirúrgica por via cervical.
Mas segundo Fleury (et al., 2007) o método menos invasivo mais utilizado para a transferência de embriões é a transferência não cirúrgica coberta, que consiste em depositar o embrião no corpo do útero utilizando um equipamento para inovulação conhecido como pipeta de inseminação artificial que atravessa a cérvix. Esta técnica é considerada rápida, podendo obter alto percentual de prenhez.
Carnevale (et al, 2000) descreve que é fundamental nesse momento que a receptoras esteja em total condições de receber o material, devendo assim fazer a palpação observando se a cérvix se encontra firme e fechada e com aumento de tônus uterino (cilíndrico e tubular) de modo que esta avaliação possa determinar seu status clínico, e determinar uma probabilidade de sucesso do procedimento.
Além disso, por meio de exame ultrassonográfico pode-se observar se não há evidência de dobras endometriais ou secreção uterina que possam colocar a transferencia em risco (CARNEVALE, 2000).
No país, as raças que mais utilizam a técnica são: Mangalarga Marchador, Campolina, Quarto de Milha e Mangalarga Paulista. O uso do sêmen refrigerado e transportado é uma necessidade, devido à tendência dos garanhões pertencerem a diversos proprietários (LOSINNO; ALVARENGA, 2006).
7.1. Fisiologia da reprodução
A fisiologia, ao estudar o funcionamento do organismo, voltadas à reprodução eqüina, colabora no sentido de observar quando os animais estarão em estro, ou seja, neste caso específico, quando demonstrar receptividade sexual ao rufião ou através da constatação de atividade folicular, tônus uterino e cervical, determinada pela palpação naqueles que não exteriorizavam sinais de cio (ROMANO, et al. 1998).
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Independente da manifestação externa de estro, os animais podem ser acompanhados por exame ginecológico semanais, para que suas características anatômicas e fisiológicas poder ser avaliadas procurando-se estros silenciosos. (ROMANO, et al. 1998).
Normalmente o ciclo estral é descrito tendo como início a ovulação definida por dia 0, e o fim do ciclo sendo um dia antes da ovulação seguinte. As éguas possuem um intervalo médio entre as ovulações de aproximadamente doze dias, podendo ter variações de 18 a 24 dias. Qualquer alteração nesse tempo, sendo intervalos muito menores ou maiores pode indicar anormalidades. (LEY, 2006).
A fase folicular (estro) tem duração aproximadamente de 3 a 7 dias, sendo caracterizada pela presença de um ou mais folículos pré – ovulatórios de tamanho superior a 30 mm de diâmetro, presença da ação do estrógeno e por alterações de comportamento demonstrando aceitação ao garanhão (LEY, 2006).
O folículo pré-ovulatório cresce aproximadamente cerca de 3 mm por dia, assim sendo possível saber a freqüência com que é realizado a palpação retal e exame ultrassonográfico para avaliar o crescimento folicular e o momento para a ovulação. (GODDART, 1995).
Na fase de corpo lúteo, fase luteínica ou diestro, tem duração de aproximadamente de 13 a 17 dias, caracterizada pela presença do corpo lúteo, pela ação da progesterona e ausência de manifestações de comportamento de aceitação ao macho. (LEY, 2006).
Após a égua ter ovulado, o corpo lúteo começa a se desenvolver e pode ter vida útil de aproximadamente 85 dias, considerando que o endométrio não inicie a liberação de prostaglandina, o corpo lúteo não entra em luteólise e segue na produção de progesterona sem que aconteça a sua regressão. (LEY, 2006).
Quando uma égua ovula e é coberta e ou inseminada corretamente, resulta na produção de um embrião viável. O embrião estando em desenvolvimento e em fase de mobilidade no útero começa a sinalizar o endométrio com a liberação de estrógeno, inibindo a liberação da prostaglandina pelo endométrio. Essa fase é denominada de reconhecimento materno da gestação, que pode durar até próximo ao 17° dia da gestação ou ocorrer entre os dias 12 e 14 posteriormente a ovulação que obteve produção. (LEY, 2006).
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7.2. Utilização dos hormônios
Na eqüinocultura, o melhoramento genético dos animais ocasiona em maior aproveitamento e intensificação do ritmo e consequentemente na sua eficiência reprodutiva (FARIA; GRADELA, 2010).
O que se conhece como manejo consiste em monitorar o comportamento reprodutivo das éguas, através do emprego da palpação transretal e da ultrassonografia para monitorar a atividade folicular e ovulação, além do uso de hormônios exógenos para sincronizar o estro e ovulação (VANDERWALL & WOODS, 2007).
Quando em cio, a égua doadora é examinada para monitorar o crescimento folicular, permitindo o ótimo momento para inseminação com sêmen fresco, refrigerado ou congelado (VANDERWALL & WOODS, 2007).
Devido às influências do fotoperíodo, a incidência de ovulações varia no decorrer do ano, o que de certa forma limita a utilização reprodutiva das éguas, de modo que autilização da hormonioterapia aplicada à ginecologia equina desempenha papel primordial (FARIA; GRADELA, 2010).
Essa técnica quando utlizada de forma correta colabora, por meio da melhora da eficiência reprodutiva de animais de alto valor genético, para o aumento dos lucros gerando benefícios tanto para o profissional quanto para o proprietário.
Pode-se citar como benefícios da hormonioterapia, o aumento do período de ciclicidade durante o ano, a diminuição do ciclo estral, o aumento do número de ovulações por ciclo e, consequentemente, de embriões por ciclo. Outra possibilidade é a sua contribuição na utilização de biotécnicas reprodutivas, como inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE).(FARIA; GRADELA, 2010).
7.3 Ciclo estral e sincronização
Outra questão muito importante é o controle do ciclo estral e sincronização da ovulação de doadoras e receptoras ou sincronização do estro. A sincronização entre doadora e receptora é uma técnica relativamente simples e consiste em observar o ciclo estral de ambas. Ciclo estral é um conjunto de alterações dos níveis hormonais,
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que se refletem sobre o trato reprodutivo e em alterações comportamentais da égua, nesse sentido, produção de estradiol pelos folículos (MOREL, 2005).
De acordo com Allen (2001), geralmente, administra-se uma injeção intramuscular de PGF2α na égua doadora 1 ou 2 dias a frente da mesma terapia aplicada nas receptoras. O estro pode ser induzido através da administração de uma injecção de PGF2α, que põe fim à fase lútea (SAMPER, 2008). Por esta razão, esta prostaglandina e os seus análogos sintéticos têm sido usados efectivamente para induzir lise do CL e a indução do estro (ALCÁNTARA et al., 2005).
A prostaglandina é caracterizada por ser um hormônio luteólitico, sendo que age controlando a lise do corpo lúteo que se da através de sua liberação pelo endométrio próximos dos dias 13 a 16 posteriormente a ovulação nas éguas que não estão em gestação (Milvae et al., 1996).
Seu uso pode ser para por fim a fase luteínica prolongada, controle do período da ovulação, realizar sincronização do estro, no tratamento de infecções endometriais e solucionar pseudogestação. (McKinnon e Voss, 1992).
Com relação ao uso de prostaglandina, alguns autores como (Lindeberg, et al., 2002) e Nielson (et al., 2008), defendem que a mesma está associada a taxas de gestação mais baixas (dependendo do dia de aplicação, e fase do ciclo). Já Metcalf e Thompson (2010) demonstram ser contrários à esta teoria e defendem o fato que o uso de prostaglandinas para indução do estro não afeta as taxas de gestação.
A ação da progesterona (P4) tem um papel fundamental na gestação, é liberado pelas células luteínicas do corpo lúteo, pela placenta e pelas glândulas adrenais. Sua ação se da através da estimulação pelo LH, assim sendo secretada a progesterona que proporciona o fim dos sinais de estro e dos sinais de receptividade ao garanhão, torna o útero um ambiente propício para chegada de um embrião, estimulando as glândulas endometriais a secretar o leite uterino e com isso mantendo a gestação e também proporciona o aumento do tônus uterino. (Hafez e Hafez, 2004).
Para as fêmeas usadas como receptoras de embrião a progesterona ajuda aumentando o tônus uterino. (Caiado et al., 2007). Mantém a gestação, com tratamento tendo início após o diagnóstico de gestação confirmado, entre o 14° ao
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20° dia depois da ovulação, mantendo a terapia até próximo dos dias 100 e 120 da gestação. (McKinnon e Voss, 1992).
Com o uso da progesterona, torna possível realizar a inovulação em éguas que foram selecionadas como receptoras de embrião, em apenas dois dias pós-ovulação (receptoras em D2), sem que os índices de taxa de prenhez diminuam comparados a inovulações feitas em receptoras consideradas excelentes e boas estando em D5 e D6 posteriormente a ovulação. (Caiado et al., 2007).
De qualquer forma, em todos os protocolos de sincronização empregados, monitora-se o crescimento folicular por ultrassonografia e utiliza-se hCG, GnRH ou EPE (DUCHAMP et al., 1987) a fim de induzir ovulação nas éguas receptoras dentro de 48 h depois que a doadora for inseminada.
O hCG utilizado como indutor da ovulação nas éguas mostra-se bastante eficiente, sendo que diminui a duração do estro, com isso diminuindo o tempo até a ovulação que pode ocorrer em até 48 horas após aplicação, e com sua utilização torna possível reduzir a quantidade de inseminações e ou coberturas necessárias por ciclo estral. (Bergefelt, 2000; Ley, 2006).
Segundo Oliveira e Souza (2003) além de sincronizar o estro e a ovulação, melhoram os índices de fertilidade e taxas de prenhez da receptora.
Com o aumento da progesterona, estimulado pelo hCG, obtém melhoras no tônus do útero e da cérvix, na morfologia, diâmetro e na ecogenicidade do corpo lúteo, sendo que essas são as principais características desejadas em uma receptora na transferência de embrião. (Sousa, 2006; Fleury et al., 2007).
7.4 Colheita de embriões
A colheita dos embriões é realizada pelo procedimento não cirúrgico transvaginal, lavagem uterina transcervical (lavado) para coleta do embrião, feita de 6 a 9 dias após a ovulação da doadora; e foi descrito primeiramente em eqüinos por Oguri e Tsutsumi (1972), que utilizaram um cateter de três vias, onde o lavado era então realizado no corno ipsilateral à ovulação, inflando o balão do cateter na base desse corno.
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Segundo Fleury, (2007) ocorrida a ovulação, recomenda-se que a colheita de embriões seja realizada nos dias 7 ou 8 pós-ovulação; os dias 6 e 9 também são utilizados pelos técnicos, porem em menor freqüência, por ainda estarem imaturos no caso do dia 6 e ou por difícil manipulação devido ao seu tamanho no dia 9 .
Vanderwall (2007) explica que a colheita de embrião é executada utilizando-se a lavagem uterina transcervical. Atualmente, usa-utilizando-se um cateter de silicone com balão (VEUF-80, Bivona, Inc., Gary, IN 46406) com diâmetro de 8,0 mm; porém, outros estilos de cateter estão disponíveis.
Com o cateter devidamente inserido no corpo uterino, e com o balão (cuff) inflado na região cranial da cérvix é realizado o lavado (flushing) do útero de 3 a 4 vezes. Atualmente utiliza-se o Ringer com lactato de sódio como solução para realizar a coleta dos embriões, considerando o grande volume de infusão e ao seu baixo custo comparado as demais soluções. (Alvarenga et al., 1993; Fleury, 1998b; Caiado et al., 2005).
Fleury (et al., 2001); Squires (et al., 2003) e Silva (2003) descrevem procedimentos do lavado explicando que atualmente o balão é inflado, aproximadamente com 60 mL de ar, no corpo do útero, tracionando o cateter caudalmente para se ajustar no óstio cranial da cérvix, lavando-se os dois cornos.
Dependendo do tamanho do útero da égua doadora, são usados durante todo o processo de recuperação 3 a 6 litros (DAELS, 2007) e o volume recuperado representa normalmente de 95% a 98% do volume infundido (IMEL, 1981; CARVALHO, 2000; SILVA, 2003). Estes procedimentos permaneceram essencialmente inalterados durante as últimas duas décadas (SQUIRES et al., 2003).
7.5 Classificação e manipulação do embrião
Com relação ao rastreamento dos embriões é realizado com auxílio de uma lupa sob aumento de 10X e a classificação embrionária é realizada utilizando-se 40X de aumento e removido com o ajuda de uma palheta de 0,5 ou 0,25 mL, acoplada a uma seringa de insulina, e transferido para uma placa de petri menor (35 x 10 mm),
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contendo o meio de manutenção TQC®, Ham F10, Encare®, dentre outros (LIRA, et al., 2009).
Em seguida é feita a sua classificação, conforme as recomendações da IETS (International Embryo Transfer Society), descritas por McKinnon & Squires (1988) atribuindo-lhe um escore de 1 a 5, levando em consideração a sua morfologia,o seu formato, simetria, coloração, extrusão celular e integridade de zona pelúcida. (MCKINNON & SQUIRES, 1988).
Conforme a classificação de 1 a 5, é seguido os parâmetros segundo MCKINNON & SQUIRES, (1998):
Qualidade 1 - excelente, caracterizado por ser esféricos e com as células de tamanho e cor uniforme;
Qualidade 2 - bom, possuindo forma irregular e podendo ter pouca extrusão dos blastômeros;
Qualidade 3 - regular, onde possui vários blastômeros em extrusão, degeneração nas células do botão germinativo e ou colapso da blastocele;
Qualidade 4 - ruim, onde existe varios blastômeros extrusos, blastocele severamente colapsada e botão germinativo escuro;
Qualidade 5 – degenerado, totalmente degenerados, destruição das células do trofoblasto e total colapso do embrião.
E segundo Vanderwall (2007), é classificado quanto ao estágio de desenvolvimento sendo em mórula (M), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e blastocisto expandido(Bx).
Antes de transferir o embrião para uma égua receptora ou ser condicionado ao resfriamento para o transporte, o mesmo é lavado em 10 passagens consecutivas para eliminar as impurezas presentes na zona pelúcida (VANDERWALL D.K. & WOODS G.L., 2010).
7.6 Inovulação
Primeiramente é feita a avaliação da receptora, para que possa selecionar a que esteja mais apta para receber o embrião. Assim por meio da palpação retal avaliando características como: cérvix firmemente fechada, tônus uterino aumentado
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e com o ultrassom avaliar ausência de alterações como dobras endometriais e presença de liquido no útero, que são características desejadas no dia da inovulação. Também pode ser feito a utilização da progesterona exógena nas receptoras (no intervalo de D0, dia da ovulação, a D5), para que o útero tenha mais exposição ao hormônio tornando o ambiente favorável ao desenvolvimento do embrião. Visando utilizá-las para inovulação em D2, podendo obter índices parecidos de taxa de prenhez comparados com receptoras classificadas como excelentes estando em D5 (receptoras em D5 e D6 são consideradas excelentes). (CARNEVALE, 2000).
O material comumente utilizado para realizar a inovulação é a pipeta de inseminação artificial (CARNEVALE, 2000). Sendo colocada uma camisinha protetora para evitar contaminação da ponteira da pipeta, lembrando de estourá-la assim que o aplicado estiver no 1/3 inicial da cérvix. A inovulação só se inicia com a receptora devidamente contida, e com a região perineal e vulva corretamente higienizada. Juntamente com a experiência do técnico, lubrificação da luva, e cuidados com contaminação, o embrião é depositado no corpo do útero. (CARNEVALE, 2000).
7.7 Vantagens e desvantagens da Transferência de Embrião (TE)
Podem-se observar as inúmeras vantagens da técnica de transferência de embriões que permite aos proprietários a obtenção de mais de um produto ao ano e a produção de éguas de grande valor, de forma a obter mais lucratividade. (VANDERWALL & WOODS, 2007).
A grande maioria dos embriões equinos coletados é de qualidade boa ou excelente, provavelmente devido ao transporte seletivo de embriões viáveis através do oviduto (Weber et al., 1991). Isto ocorre porque os embriões de má qualidade, mortos e ovócitos não fertilizados costumam ficar retidos no oviduto.
Além disso, por meio desta técnica, podem-se obter produtos de éguas, que por algum motivo, não possam levar uma gestação a termo, seja por conta de prenhêz de éguas com idade avançada, ou ainda, produtos de éguas que estão
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competindo, sem que para isso precisem ser retiradas das competições (LIRA, 2009).
Esta biotécnica tem sido utilizada como uma gestão de procedimentos para a produção de múltiplos potros por égua durante o ano, o melhor aproveitamento de éguas que possuam alto valor zootécnico e sejam idosas ou que estejam em atividade esportiva (Hurtgen, 2008; Arruda et al., 2001; Daels, 2007).
Outras questões que devem ser levadas em conta são com relação a adaptações de manejo, estrutura, equipamentos e profissionais capacitados para trabalhar de acordo com a necessidade do proprietário e do animal. (CARNEVALE, et al., 2000)
De acordo com leituras, pode-se observar que se somam a estas vantagens a prevenção da transmissão de várias doenças sexualmente transmissíveis, lesões por transporte dos animais e contaminações uterinas na égua, que possam vir a desencadear perda de material genético significativo bem como perdas financeiras para o produtor. (SAMPER et al., 2008; CARNEVALE, et al., 2000; VANDERWALL & WOODS, 2007).
Com relação aos custos para a realização da inseminação artificial não há necessidade de investimentos altos de infraestrutura, o mínimo, que seria o tronco de contenção, já é o suficiente. Já para instalação de um programa de transferência de embriões um investimento maior é necessário, uma vez que o embrião precisa ser manipulado em um laboratório limpo e com equipamentos ideais para sua manipulação (CARNEVALE, et al., 2000; VANDERWALL & WOODS, 2007).
Alguns autores como Arruda (ARRUDA et al., 2001), defendem que por meio desta técnica é possível promover maior controle de doenças quando da transferência de material genético entre estados ou países, bem como a obtenção de divisas através de exportações de embriões congelados .
No Brasil destaca-se como o segundo país que mais a utiliza esta técnica e nas ultimas décadas, houve um grande avanço desta biotécnica aplicada a referida espécie, melhorando consideravelmente as taxas de prenhez de 12,5% a 74.55% (VOGELSANG et AL., 1979; OGURI & TSUTSUMI 1980; FLEURY & ALVARENGA, 1999; PERES et al., 2002; ROCHA., et al., 2004).
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Como desvantagem é necessário citar o fato de que manipular excessivamente ao longo dos anos pode causar algumas alterações no trato reprodutivo das éguas reduzindo a eficiência da técnica, no entanto, a TE não causa nenhuma complicação séria para doadoras nem receptoras se realizada dentro das condições ideais de higiene e utilizando materiais estéreis.
Com relação a Inseminação Artificial, menos complicações ainda podem ser citadas, pelo contrário, é uma forma de prevenir muitas lesões e contaminações na égua e no garanhão.
Outra importante questão a ser levantada é o fato da necessidade de receptoras de boa qualidade e em um número razoável para sincronização de doadoras e receptoras, seja na propriedade ou em bancos de receptoras. A ausência destes investimentos e adaptações que promovem as desvantagens que a técnica pode trazer causando perdas para o produtor (CARNEVALE, et al. 2000).
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8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As técnicas de reprodução assistida surgiram com a tecnologia aplicada à ciência e podem ser usadas para ampliar as possibilidades de obter produtos de melhor qualidade e no caso, dos eqüinos, de maior qualidade genética e, por conseguinte, valor comercial.
A cada três transferências consegue-se uma prenhez, ou seja, 33% de chance de alcançar uma prenhez por TE. No entanto, este número pode melhorar se trabalharmos com animais seja em qualquer etapa do procedimento, de alto valor genético, tendo bom desempenho esportivo e com índice de fertilidade bons no caso de doadores e principalmente receptoras de boa qualidade e eficiência reprodutiva, objetivando subir esta estimativa.
A Transferência de Embriões é ainda considerada uma técnica em ascensão no mercado mas, que tem grandes chances de ainda melhorar sua técnica e isso pode ocorrer mediante pesquisas e estudos.
Esta área que está em constante evolução seja no mercado ou em seu aspecto científico, pode ser um campo um tanto quanto promissor para os especialistas que trabalham na área.
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