ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO E DOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE Acritopappus micropappus

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Vanessa Rodrigues Guedes

ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO

E DOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE

Acritopappus micropappus

Salvador

2004

ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO

E DOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE

Acritopappus micropappus

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química na área de concentração em Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Dirceu Martins

Salvador

2004

Dedico este trabalho àqueles que sempre acreditaram em mim: meus pais, meus queridos irmãos e em especial ao meu marido Alziro.

AGRADECIMENTOS

A Deus por estar sempre ao meu lado me guiando.

Ao Prof. Dr. Dirceu Martins pela preciosa orientação, dedicação e por ter acreditado no meu potencial.

Aos professores Frederico Guaré, Jorge David, Leila Aguiar e Nídia Roque pelos conhecimentos transmitidos.

Aos professores do Departamento de Química Orgânica por todo conhecimento adquirido durante minha formação, em especial a professora Anair pela disponibilidade e obtenção de alguns espectros de massa.

À professora Hortensia Pousada Bautista pela identificação botânica e ajuda indispensável. A todos os funcionários do Instituto de Química que colaboraram na realização desse trabalho.

A Cristovão e a Paulo pelo apoio técnico.

Aos meus colegas de laboratório: Meire, Jaquelina, Suzimone, Luciana, Carla, Marcus, Larissa, Manuela, Débora, Rosane, Vânia, Pedro, e André, pelo companherismo e pelos momentos agradáveis que passamos juntos.

A Martins, Flávia, Rita e Sandra pela troca de conhecimentos e pela amizade que construímos.

A Josanaide pela disponibilidade e apoio constantes.

A Lourdes pela preciosa ajuda durante a conclusão desse trabalho.

A Floricéa pela grande amiga que foi em todos os momentos, pelo grande incentivo e pelas incontáveis contribuições.

Ao CNPq pelo indispensável apoio financeiro. Aos meus pais pela compreensão e incentivo.

Aos meus queridos irmãos, em especial a Ninho pelo apoio fundamental e carinho. Aos meus avós, Jolira e Epaminondas sempre presentes.

Ao meu amado marido Alziro pela paciência, incentivo e amor, tão importantes em cada momento da minha vida.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...vii LISTA DE FIGURAS...ix ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...xvii RESUMO...xix ABSTRACT...xx 1.0 INTRODUÇÃO...1 1.1 A FAMÍLIA ASTERACEAE...1 1.2 A TRIBO EUPATORIEAE...2 1.3 O GÊNERO ACRITOPAPPUS...5

1.4 A ESPÉCIE Acritopappus micropappus...7

1.5 CONSTITUINTES QUÍMICOS ENCONTRADOS NO EXTRATO HEXÂNICO DAS PARTES AÉREAS DE Acritopappus micropappus...26

1.6 CONSTITUINTES QUÍMICOS IDENTIFICADOS NOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE TRÊS ESPÉCIMENS DE Acritopappus micropappus...28

2.0 TERPENOS...31

2.3 TRITERPENOS...36

2.4 ESTERÓIDES...38

3.0 LIGNANAS...39

4.0 PARTE EXPERIMENTAL...41

4.1 MATERIAL VEGETAL...41

4.2 REAGENTES; MÉTODOS E EQUIPAMENTOS...42

4.3 ESTUDO DOS COMPONENTES FIXOS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus...43

4.3.1 Obtenção dos extratos...44

4.3.2 Isolamento dos constituintes químicos do extrato hexânico...45

4.4 ESTUDO DOS COMPONENTES VOLÁTEIS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus...53

4.4.1 Obtenção dos óleos voláteis...53

5.0 IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS...57

5.1 IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO HEXÂNICO DAS PARTES AÉREAS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus...57

SESQUITERPENOS 5.1.1 Identificação da substância I...58

5.1.2 Identificação da substância VI...72 5.1.3 Identificação da substância VII...77

TRITERPENOS

5.1.4 Identificação das substâncias II, III, IV e V...85

ESTERÓIDES

5.1.5 Identificação das substâncias VIII e IX...93

LIGNANA

5.1.6 Identificação da substância X...96

ÓLEOS VOLÁTEIS

5.1.7. Identificação dos constituintes químicos dos óleos voláteis dos três espécimens de

Acritopappus micropappus...106

6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS...126 7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...128

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Diferentes metabólitos produzidos na tribo Eupatorieae...3

Tabela 02 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus...10

Tabela 03 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus heterolepis...15

Tabela 04 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus longifolius...17

Tabela 05 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus morii...19

Tabela 06 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi...20

Tabela 07 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus prunifolius...23

Tabela 08 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus. teixeirae...25

Tabela 09 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Saúde...28

Tabela 10 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Morro do Chapéu...29

Tabela 11 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Jacobina...30

Tabela 12 Dados de RMN de 1H, 13C, HETCOR (13C-1H), COLOC (13C-1H), COSY (1H-1H) e NOESY (1H-1H) da substância I...71

Tabela 14 Dados de RMN de 13C dos sesquiterpenos I, VI e VII...83

Tabela 15 Dados de RMN de 13C dos triterpenos II, III, IV e V...91

Tabela 16 Dados de RMN de 1H, 13C, HETCOR (13C-1H), COLOC (13C-1H),

COSY (1H-1H) da substância X...105

Tabela 17 Constituintes químicos presentes nos óleos essenciais dos três espécimens de

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Isótipo de Acritopappus micropappus...8

Figura 02 Esquema da origem taxonômica da espécie Acritopappus micropappus...9

Figura 03 Rotas biossintéticas para a obtenção do isopentenil difosfato (IPP)...32

Figura 04 Isomerização do IPP para DMAPP...33

Figura 05 Formação do E-pirofosfato de geranila, precursor geral dos monoterpenos...33

Figura 06 Estrutura de alguns monoterpenos com atividades biológicas...34

Figura 07 Formação do Pirofosfato de E,E-farnesila, precursor geral dos sesquiterpenos..35

Figura 08 Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividades biológicas...36

Figura 09 Formação do 2,3-epóxi-esqualeno e do cicloartenol...37

Figura 10 Estruturas de alguns triterpenos com atividades biológicas...37

Figura 11 Estruturas de alguns esteróides encontrados em plantas...38

Figura 12 Esquema biossintético para obtenção de lignanas...40

Figura 13 Obtenção dos extratos hexânico e metanólico das partes aéreas de Acritopappus micropappus...47

Figura 14 Fracionamento do extrato hexânico das partes aéreas de. Acritopappus micropappus...48

Figura 15 Obtenção da substância I e das substâncias II, III, IV e V em mistura...49

Figura 16 Isolamento das substâncias VI e VII...50

Figura 17 Obtenção das substâncias VIII e IX em mistura...51

Figura 18 Isolamento da substância X...52

Figura 19 Aparelhagem de Clevenger modificada...54

Figura 20 Obtenção dos óleos voláteis dos espécimens coletados nos municípios de Morro do Chapéu, Jacobina e Saúde ...56

Figura 21 Estruturas: esqueleto bornano, borneol e isoborneol...58

Figura 22 Espectro de RMN de1H da substância I ...61

Figura 23 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 0,01 ppm a 1,75 ppm ...62

Figura 24 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 5,07 ppm a 5,16 ppm ...62

Figura 25 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 4,04 ppm a 4,13 ppm...63

Figura 26 Espectro de RMN de 13C da substância I ...63

Figura 27 Expansão do espectro de RMN de 13C da substância I na região de 3,35 ppm a 51,29 ppm ...64

Figura 30 Espectro HETCOR (13C-1H) da substância I ...65

Figura 31 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância I ...66

Figura 32 Espectro COLOC (13C-1H) da substância I ...66

Figura 33 Expansão do Espectro COLOC (13_C-1_{H) da substância I ...67}

Figura 34 Espectro COSY (1H-1H) da substância I ...67

Figura 35 Expansão do espectro COSY (1H-1H) da substância I ...68

Figura 36 Espectro NOESY (1H-1H) da substância I...68

Figura 37 Expansão espectro NOESY (1H-1H) da substância I ...69

Figura 38 Expansão espectro NOESY (1H-1H) da substância I ...69

Figura 39 Espectro de massas da substância I ...70

Figura 40 Proposta de fragmentação de massas para a substância I...70

Figura 41 Espectro de RMN de1H da substância VI...74

Figura 42 Expansão do espectro de RMN de1H da substância VI na região de 4,05 ppm a 5,04 ppm...74

Figura 43 Espectro de RMN de 13C da substância VI ...75

Figura 44 Espectro DEPT-135º da substância VI ...75

Figura 46 Espectro de RMN de1H da substância de VII ...79

Figura 47 Expansão do espectro de RMN de1H da substância VII na região de 4,07 ppm a 5,78 ppm...79

Figura 48 Espectro de RMN de 13C da mistura de VI e VII ...80

Figura 49 Espectro DEPT-135º da mistura de VI e VII...80

Figura 50 Espectro DEPT-90º da mistura de VI e VII...81

Figura 51 Tipos de sistemas de anéis para os triterpenos pentacíclicos isolados de A. micropappus...84

Figura 52 Espectro de RMN de 1H da mistura de II, III, IV e V...88

Figura 53 Expansão do espectro de RMN de 1H da mistura de II, III, IV e V na região de 3,20 ppm e 5,20 ppm...88

Figura 54 Espectro de RMN de 13C da mistura de II, III, IV e V...89

Figura 55 Expansão do espectro de RMN de 13C da mistura de II, III, IV e V na região de 79,05 ppm e 115,13 ppm...89

Figura 56 Espectro DEPT-135º da mistura de II, III, IV e V ...90

Figura 57 Espectro DEPT-90º da mistura de II, III, IV e V...90

Figura 58 Espectro de RMN de 1_{H da mistura de VIII e IX...94}

Figura 59 Esqueleto de lignana do tipo diarilbutanolídeo. (8.8’, 9.0.9’)...95

na região de 2,30 ppm a 6,80 ppm ...99

Figura 62 Expansão do espectro de RMN de1H da substância X...100

Figura 63 Expansão do espectro de RMN de1H da substância X na região de 5,88 ppm a 6,69 ppm...100

Figura 64 Espectro de RMN de 13_{C da substância X ...101}

Figura 65 Espectro de DEPT-135º da substância X ...101

Figura 66 Espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...102

Figura 67 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...102

Figura 68 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...103

Figura 69 Espectro COLOC (13C-1H) da substância X...103

Figura 70 Espectro COSY (1H-1H) da substância X...104

Figura 71 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Jacobina obtido no CG/EM...108

Figura 72 Espectro de massas do α-pineno ...109

Figura 73 Espectro de massas do β-pineno ...109

Figura 74 Espectro de massas do β-mirceno ...109

Figura 76 Espectro de massas do Limoneno ...110

Figura 77 Espectro de massas do α-copaeno...110

Figura 78 Espectro de massas do Cariofileno ...111

Figura 79 Espectro da massas do α-humuleno...111

Figura 80 Espectro de massas do Germacreno D ...111

Figura 81 Espectro de massas do Biciclogermacreno ...112

Figura 82 Espectro de massas do δ-cadineno ...112

Figura 83 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Morro do Chapéu obtido no GC/EM...112

Figura 84 Espectro de massas do 6-metil-5-hepten-2-ona...113

Figura 85 Espectro de massas do Limoneno ...113

Figura 86 Espectro de massas do β-selineno ...113

Figura 87 Espectro de massas do 1,10 epóxi-cariofileno ...114

Figura 88 Espectro de massas do (+)-Junenol ...114

Figura 89 Espectro de massas do β-acorenol ...114

Figura 90 Espectro de massas do α-muurolol...115

Figura 93 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus

coletado no município de Saúde no CG/EM...……...116

Figura 94 Espectro de massas do α-pineno ...116

Figura 95 Espectro de massas do β-pineno ...116

Figura 96 Espectro de massas do β-mirceno...117

Figura 97 Espectro de massas do Limoneno...117

Figura 98 Espectro de massas do (E)-β-ocimeno ...117

Figura 99 Espectro de massas do δ-elemeno ...118

Figura 100 Espectro de massas do α-copaeno ...118

Figura 101 Espectro de massas do β-cubebeno ...118

Figura 102 Espectro de massas do Cariofileno ...119

Figura 103 Espectro de massas do α-santaleno...119

Figura 104 Espectro de massas do α-humuleno ...119

Figura 105 Espectro de massas do β-santaleno ...120

Figura 106 Espectro de massas do Germacreno D ...120

Figura 108 Espectro de massas do Valenceno ...121

Figura 109 Espectro de massas do Biciclogermacreno ...121

Figura 110 Espectro de massas do (Z)-α-bisaboleno ...121

Figura 111 Espectro de massas do β-bisaboleno ...122

Figura 112 Espectro de massas do δ-cadineno ...122

Figura 113 Espectro de massas do (E)-γ-bisaboleno ...122

Figura 114 Espectro de massas do Germacreno B ...123

Figura 115 Espectro de massas do Espatulenol...123

Figura 116 Espectro de massas do 1,10-epoxi-cariofileno ...123

Figura 117 Espectro de massas do α-muurolol ...124

δ - Deslocamento químico Ang - Angeloil

AcOEt – Acetato de etila CC – Cromatografia em coluna

CCDC – Cromatografia em camada delgada comparativa

CG/EM – Cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas CoA – Coenzima A

COLOC – Espectro de correlação heteronuclear (13C-1H) a duas e três ligações

d – Dubleto

DCM – Diclorometano dd – Duplo dubleto

ddd – Duplo duplo dubleto

DEPT – Intensificação do sinal sem distorção por transferência de polarização (Distortionless enhancement by polarization tranfer)

DMAPP – Pirofosfato de dimetilalila DMSO – Dimetilsulfóxido

HETCOR – Espectro de correlação heteronuclear (13C-1H) a uma ligação

Hex – Hexano

HMG-CoA - β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA

HOMOCOSY – Espectro de correlação homonuclear (1H-1H)

IPP – Pirofosfato de isopentenila IR – Índice de retenção

IV – Infravermelho

J – Constante de acoplamento

m/z – Relação massa carga

MeOH – metanol

MVA – Ácido mevalônico

MVAPP – Difosfato do ácido mevalônico

NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

RMN de 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio s – Singleto

TPP – Difosfato de tiamina Tr – Tempo de retenção

O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico das partes aéreas (folhas e galhos) de espécimens de Acritopappus micropappus (Asteraceae) coletados no Morro da Antena, município de Saúde (abril de 2001); no Morro do Cruzeiro, município de Jacobina (abril de 2001) e no município de Morro do Chapéu (agosto de 1999). A espécie Acritopappus

micropappus é endêmica da Chapada Diamantina e até o presente momento, nenhum estudo

fitoquímico foi relatado para a mesma. As partes aéreas foram submetidas a extrações com hexano e a seguir com metanol. Do extrato hexânico do espécimen coletado no município de Saúde, foram isoladas e identificadas as seguintes substâncias: o sesquiterpeno canferenol,

que sofreu decomposição através de fotooxidação, levando aos derivados 10ξ

-hidroperoxi-canferen-11-eno e 11-hidroperoxi-canferen-9-eno; a lignana yateína; uma mistura contendo os

triterpenos β-amirina, α-amirina, lupeol e pseudotaraxasterol e uma mistura contendo os

esteróides sitosterol e estigmasterol. Foram obtidos os óleos voláteis das partes aéreas dos três espécimens coletados, através de hidrodestilação. Estes óleos foram analisados através de cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas, levando à identificação de 31 constituintes, sendo 6 monoterpenos, 24 sesquiterpenos e a cetona 6-metil-5-hepten-2-ona, mostrando variabilidade estrutural entre os constituintes dos três óleos. Os componentes majoritários presentes no óleo volátil obtido do espécimen coletado em Jacobina foram

germacreno D, α-pineno e β-pineno, do espécimen coletado no município de Saúde foram α

-humuleno, cariofileno e valerianona e do espécimen coletado em Morro do Chapéu foram β

-acorenol, 1,10-epoxi-cariofileno, (+)-junenol e 6-metil-5-hepten-2-ona. Os fracionamentos do extrato hexânico e os isolamentos das substâncias foram realizados através de cromatografia em coluna de sílica e sephadex LH-20. As identificações das substâncias foram realizadas

através de métodos espectrométricos, tais como RMN de 1H e 13C (incluindo DEPT, COSY,

HETCOR, COLOC e NOESY) e espectrometria de massas. O sesquiterpeno canferenol e a

lignana yateína são raros na natureza, tendo sido relatados para poucas espécies de plantas. Os extratos dos espécimens coletados nos municípios de M. do Chapéu e Jacobina foram submetidos a bioensaios contra o fungo Cladosporium sphaerospermum utilizando o método bioautográfico e ensaios biológicos preliminares contra Staphylococcus aureus e Candida

albicans, respectivamente. Sendo que apenas os extratos hexânicos mostraram-se ativos.

Palavras-chaves: Acritopappus micropappus; Asteraceae; canferenol; yateína; triterpenos;

ABSTRACT

The present work describes the phytochemical study of the aerial parts (leaves and stems) of

Acritopappus micropappus specimens (Asteraceae) collected on Morro da Antena in Saúde

(April 2001); on Morro do Cruzeiro in Jacobina (April 2001) and in Morro do Chapéu (August 1999). The Acritopappus micropappus species is endemic from Chapada Diamantina and, until this moment, no phytochemical study has been reported on this species. The aerial parts were submitted to extractions with hexane followed by methanol. From the hexane extract of the specimen collected in Saúde, the following substances were extracted: the campherenol sesquiterpene that was decomposed by photooxidation, leading to the derived

10ξ-hidroperoxi-campheren-11-ene and 11-hidroperoxi-campheren-9-ene, the yatein lignan; a

mixture with β-amirin, α-amirin, lupeol and pseudotaraxasterol triterpernes; and a mixture

with the sitosterol and stigmasterol steroids. Volatile oils were obtained from the aerial parts of the three specimens through hydrodestilation. These oils by analyzed with gas chromatography in association with mass spectrometry leading to the identification of 31 constituents, including 6 monoterpenes, 24 sesquiterpenes and the 6-metil-5-hepten-2-one cetone, showing structural variability among the constituents of the three oils. The major components present in the volatile oil obtained from the specimen collected in Jacobina were

germacrene D, α-pinene and β-pinene, from the specimen collected in Saúde were α

-humulene, caryophyllene and valerianone, and from the specimen collected from Morro do

Chapéu were β-acorenol, 1,10-epoxi-caryophyllene, (+)-junenol and 6-metil-5-hepten-2-one.

The fractionations of the hexane extracts and the isolation of the substances were accomplished by using chromatography column over silica and sephadex LH 20. The

identification of the substances were made using spectrometrics methods, such as RMN of 1H

and 13C (including DEPT, COSY, HETCOR, COLOC and NOESY) and the mass

spectrometry. The campherenol sesquiterpene and the yatein lignan are rare in nature; they have been reported in few species of plants. The extracts of the species collected in Morro do Chapéu and Jacobina were submitted to bioassays against the fungus Cladosporium

sphaerospermum using the bioauthographic method and preliminary biological assays against Staphylococcus aureus and Candida albicans, respectively. But only the hexane extracts were

active.

Key words: Acritopappus micropappus; Asteraceae; campherenol; yatein; triterpenes;

1.0-Introdução

1.1-A Família Asteraceae

A família Asteraceae (Compositae) é uma das maiores famílias de plantas, representa 10% do total da flora de angiospermas, e compreende cerca de 1.500 gêneros com aproximadamente 25.000 espécies [Bautista, 2000]. A Asteraceae está dividida em quatro subfamílias e dezessete tribos [Alvarenga et al, 2001].

Esta família apresenta ampla distribuição, sendo bem representada nas regiões tropical, subtropical e temperada. São plantas que podem desenvolver-se em localidades ao nível do mar, como atingir os picos das mais altas montanhas, tendo invadido, com sucesso, todos os tipos de habitats, com exceção, talvez, do aquático, visto que poucas espécies são, realmente, aquáticas verdadeiras. São mais abundantes nas regiões áridas do que nas florestas tropicais úmidas [Barroso, 1978].

Na flora brasileira, em particular, as asteráceas encontram sua maior representatividade, respectivamente, nos estados de Minas Gerais e Bahia, onde se localizam exatamente as áreas core da distribuição de Acritopappus [Bautista, 2000].

A subdivisão da família Asteraceae em 17 tribos tem sido bem aceita, estando assim constituída pelas tribos Barnadesieae, Cardueae, Lactuceae, Liabeae, Vernonieae, Eupatorieae, Astereae, Inuleae, Heliantheae, Helenieae, Anthemideae, Senecioneae, Calenduleae, Arctoteae, Mutisieae, Plucheeae e Gnafalieaea [Alvarenga et al, 2001].

Das 17 tribos classificadas para a família, Vernonieae, Eupatorieae, Heliantheae, Helenieae e Mutisieae são predominantemente americanas, com poucas espécies originadas nas regiões tropical e subtropical da África e da Ásia [Barroso, 1978].

Na grande maioria, as Asteraceaes estão representadas por espécies herbáceas, anuais ou perenes, subarbustivas ou arbustivas e raramente por espécies arbóreas. De maneira geral, suas folhas são alternadas ou radicais, folhas opostas surgem em alguns gêneros e espécies, principalmente nas tribos Heliantheae e Eupatorieae [Barroso, 1978].

1.2-A Tribo Eupatorieae

A tribo Eupatorieae constitui a maior parte da família Asteraceae na região Neotropical e está representada por 16 subtribos, com 170 gêneros, com aproximadamente 2.400 espécies, espalhadas pelo México, América Central, Índias Ocidentais e América do Sul. Apenas quatro gêneros – Adenostemma J.R. Forst & G. Forst, Austroepatorium R.M. King & H. Rob., Eupatorium L. e Mikania Willd. – apresentam algumas espécies na África, Ásia e nas Ilhas do Pacífico, e somente a espécie – Eupatorium cannabinum L. – estende-se pela Europa [Bautista, 2000].

De plantas da tribo Eupatorieae foram isolados uma ampla variedade de metabólitos secundários, tais como, alcalóides pirrolizidínicos [Wiedenfeld & Andrade-Cetto, 2001], que causam danos ao fígado quando ingeridos por mamíferos; flavonóides [El-Sayed et al, 1990], presentes nas flores e capazes de absorverem raios ultravioletas; cumarinas; cromanos e benzofuranos [Sigstad et al, 1996] que são responsáveis por alguns efeitos tóxicos (“doença do leite” ou “tremedeira”); monoterpenos derivados do timol [González et al, 1992];

1984], cadineno [Cuenca et al, 1992], alguns na forma de ésteres derivados do ácido angélico; lactonas sesquiterpênicas dos tipos germacranolídeos [Sigstad et al, 1991], guaianolídeos [Hernández et al, 1997] e eudesmanolídeos [Bohlman et al, 1981 A]; diterpenos, como os kaurânicos [Bardón et al, 1996], clerodânicos [Bohlman et al, 1982 B] e labdânicos [Escamilla et al, 1990]; carotenóides e poliacetilenos, principalmente do tipo pentaineno e seus derivados [King e Robson, 1987]. Algumas substâncias presentes na tribo Eupatorieae estão representadas na tabela 01.

Tabela 01-Diferentes metabólitos produzidos na tribo Eupatorieae

Espécies

Substâncias

Classe

Referências

Eupatorium semialatum 1 Alcalóide pirrolizidínico Lang et al, 2001 Graziela mollissima

2 Flavonóide Nakashima et al, 1994

Conocliniopis prasiifolia

3 Cumarina Bolhmann et al,

1980 B

Eupatorium

aschembornianum 4 Benzofurano Gomez et al, 1982 Stevia grisebachiana 5 Sesquiterpeno germacranolídeo Sigstad et al, 1991 Lasiolaena santosii 6 Sesquiterpeno eudesmanolídeo Bohlmann et al, 1981 B Stevia grisebachiana 7 Sesquiterpeno

guaianolídeo Sigstad et al, 1991

Stevia seleriana 8 Diterpeno labdânico Escamilla et al, 1990 Goyazianthus

N H OH CH3 O OCH3 O O HO HO OCH3 OH OH O O O OH O 1 2 3

Tussilagina 3-metoxi- 11-hidroxi- 11,12-diidro obliquina 6,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona O H3CO OHOH O O HO O OH O OH 4 5 6

6-metoxi-2-[1,2-diidroxi- 3β-hidroxi 8α-hidroxi-11β, 2-propil] benzofurano costunolideo 13-diidroreynosina

H H O O O H O COOH H O AcO OAc OAc 7 8 9

Estafietina Ácido ent-labd-7-en 15 acetil-2α,16-diacetoxi 3-oxo-15-óico 3β, 4β-epoxi-3,4-diidrokolavenol

As plantas do gênero Acritopappus apresentam-se como arbustos eretos moderadamente ramificados, com folhas opostas. O nome Acritopappus refere-se a irregularidade da forma de pappus, uma irregularidade que tem resultado na localização indevida de algumas espécies na classificação tradicional da tribo. O gênero apresenta também folhas coriaceas ou subcoriaceas sem grandes pontuações glandulares, tem a superfície com receptáculos pouco convexos, apresenta flores de coloração lavanda pálida com a cor concentrada em anteras e tem os segmentos pappus totalmente resistente [King e Robson, 1987].

O gênero Acritopappus ocorre, principalmente, nas zonas montanhosas com um tipo de vegetação próprio denominada campo rupestre. Por causa desses habitats preferentes e sua freqüente inacessibilidade, o gênero tem sido pobremente coletado e é relativamente pouco conhecido [Bautista, 2000].

Todo o gênero é caracterizado por seu alto grau de endemicidade; apenas duas espécies – A. confertus e A. longifolius –possuem uma faixa de distribuição geográfica mais

ampla A. confertus éabundante no estado da Bahia, desde o litoral até as serras, mas também

ocorre nos estados do Ceará, Pernambuco e Sergipe, em regiões orográficas. Ocorre, ainda, em planícies litorâneas, em vegetação de restiga, a menos de 500 m da linha da praia, situadas logo a norte de Salvador, prolongando-se por cerca de 100 km e ao sul dessa cidade, na região de Valença, situada entre as baías de Todos os Santos e de Camamú [Bautista, 2000].

Cerca de 95% das espécies do gênero Acritopappus localizam-se em zonas serranas situadas na parte central dos estados da Bahia e Minas Gerais [Bautista, 2000].

por 19 espécies: A. buiquensis A. catolesensis, A. confertus, A. connatifolius, A.

diamantinicus, A. harleyi, A. heterolepis, A. irwinii, A. jacobaeus, A. longifolius, A. micropappus, A. morii, A. pereirae, A. pintoi, A. prunifolius, A. santosii, A. stenophyllus, A. subtomentosus e A. teixeira.. Sendo as espécies A. longifolius e A. confertus as primeiras espécies descritas para o gênero.

Antes de o nosso grupo começar a estudar espécies pertencentes ao gênero

Acritopappus já haviam sido estudadas, do ponto de vista fitoquímico, seis espécies (A.

heterolepis, A. confertus, A. longifolius, A. morii, A. prunifolius e A. teixeirae) relatadas na literatura. Atualmente duas novas espécies foram estudadas pelo nosso grupo A. pintoi (Tabela 06, p.20) e A. micropappus, além da espécie A. confertus (Tabela 02, p.10) que já havia sido estudada anteriormente por Bohlmann et al. Comparando os metabólitos secundários isolados e/ou identificados dessas oito espécies foi observado que cinco das espécies (A. heterolepis, A. confertus, A. morii, A. teixeirae, A. longifolius) apresentaram como metabólitos secundários comuns, diterpenos ent-labdânicos e clerodânicos. Foram encontrados também alguns eudesmanos, cadineno e derivados do desidronerolidol. Além disso, muitas dessas espécies contêm humuleno e trideca pentaineno (Tabelas 02 a 08, p.10).

Nenhum diterpeno foi isolado da espécie Acritopappus prunifolius (Tabela 07, p.23). Dos constituintes isolados dessa espécie alguns são comuns a outras espécies, tais como cadineno (A. heterolepsis), germacreno (A. heterolepsis, A. confertus, A. morii, A. teixeirae), humuleno (A. morii, A. confertus) e angelato de desidronerolidol (A. longifolius).

1.4-A Espécie Acritopappus micropappus

A espécie Acritopappus micropappus (Figura 01, p.8) apresenta-se com porte arbustivo com altura máxima de 1,75 m, o que corresponde a um dos menores arbustos do gênero. Com ramificação abundante desde próximo à base e intensamente folhoso. Suas folhas são simples, opostas com lâminas inteiras e, freqüentemente, com pilosidade em ambas as faces. As margens são revolutas e a base apresenta-se atenuada. A inflorescência é representada por corimbos com menor número de capítulos. O número de flores por capítulo varia de cinco a cinqüenta. A espécie floresce e frutifica durante todo o ano. O epíteto específico, formado pelo prefixo micro e a desinência pappus, refere-se ao pappus pequeno, coroniforme. Esta espécie que foi classificada como Ageratum micropappum quando descrita para o gênero Ageratum por Baker (1876), representava a única com pappus curto coroniforme, ante todas as demais espécies circunscritas para o gênero Ageratum, que possuem o pappus aristado. Na atualidade, o posicionamento desta espécie na concepção do gênero Acritopappus está coerente com outras espécies do gênero, em que é comum o mesmo tipo de papus, como sejam: A. harleyi, A. jacobaeus, A. santosii e A. subtomentosus [Bautista, 2000].

Os espécimens estudados foram coletados no município de Morro do Chapéu em agosto de 1999, no Morro da Antena, município de Saúde em abril de 2001 e no Morro do Cruzeiro, município de Jacobina em abril de 2001, todos localizados no Estado da Bahia e

foram identificados pela Profa. Dra Hortensia Pousada Bautista, curadora do Herbário

RADAMBRASIL, do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística localizado em Salvador-BA. As exsicatas encontram-se depositadas no Herbário RADAMBRASIL sob numeração:

HRB 41.223 (município de Morro do Chapéu), HRB 49.440 (município de Saúde) e HRB 49.441 (município de Jacobina).

Um esquema sobre a origem taxonômica da espécie está representado na figura 02, p.9.

Família

Asteraceae

Subfamília

Latucoideae

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Família

Asteraceae

Subfamília

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Família

Asteraceae

Subfamília

Latucoideae

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Família

Asteraceae

Subfamília

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Tribo

Eupatorieae

Subtribo

Ageratinae

Gênero

Acritopappus

Espécie

Acritopappus micropappus

Figura 02 - Esquema da origem taxonômica da espécie Acritopappus micropappus [King e Robson, 1987]

Tabela 02-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

confertus

Acritopappus confertus

Bohlmann et al, 1980 A C C CH₃ CH=CH₂ 5 HO H O H OH H CO₂H HO R" H _R' CO2R R= H R'= CH2OH R"= CH₂OH

CO₂H CH2OAc CH2OH R=CO2H R'=CH2OH R"=CH3 CO₂H CH2OH CH2OH CO₂H CH2OH CHO R' R H R" CO₂H CH2OH CH2OCH3

Tabela 02–

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

confertus (continuação)

Acritopappus confertus

Bohlmann et al, 1983 OH H CHO H H O H H OH H OH OH

O H O O OH HO O H O OH HO O OH H O OH CH3O O OH H

Tabela 02–

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

confertus (continuação)

Acritopappus confertus

Bohlmann et al, 1983 H O O OH H O O R O R=H R=OH H R CO₂R' OR" R=CH₃ CHO R'=CH3 CH3 R"=H AC CO₂R OR' H O R = CH₃ CH₃ CH₃ R'=Ac CH₃ H

H CHO CO2CH3 OH H R CO2CH3 O R= CH₂OAc CHO O H O O CO₂CH₃ H H OH CO₂H

Tabela 02–

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

confertus (continuação)

Acritopappus confertus

Bohlmann et al, 1983 O H OHC CO2CH3 O H O CO₂CH₃ OH

H O OAc CH₃O₂C OH H R OAc CO2CH3 CHO R=β-OH R =α-OH H X OR' CO₂R R=CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 R'= Ac Ac Ac H H Ac

X=β-CHO β-OCHO β-CO2CH3β-OH CH2 O

α-H α-H α-H α-H

Tabela 02-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

confertus (continuação)

Lopes, 2002

O

OH H

H OH

O

CHO

Tabela 03-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

heterolepis

Acritoppapus heterolepis

Bohlmann et al, 1980 A C C CH₃ CH=CH₂ 5 HO H H OH R R=H R=OH O O O O HO H O OH HO OCH3 OH O H HO O O

heterolepis (continuação)

Acritoppapus heterolepis

Bohlmann et al, 1980 A R HO H R =CO2H CH2OH H _O O X X= β-OH; α-H X= O H HO H H H O O R' R'' R R= OH OH R’= OH H R’’= H OH R" H _R' CO2R R=H R'=CH₂OAc R"=CH2OH H CH2OH CH2OH H CHO CH₂OAc CH₂OH H CHO

Tabela 04-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

longifolius

Acritopappus longifolius

Bohlmann et al, 1981 A H H H H OH OH OAng O O O O O HO H

longifolius (continuação)

Acritopappus longifolius

Bohlmann et al, 1981 A H O O O O H H R OH R =CH2OH R =CHO O H O HO CHO H HO H H H O H OO O

Tabela 05-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus morii

Acritopappus morii

Bohlmann et al, 1980 A R O O CH3O O O H O O OH H OH O H O X X=CH2OH CHO H CO₂H H OH OH OH H O O O O H

Acritopappus pintoi

Sousa et al, 2000 O H O OH O O H3CO H H HO

Tabela 06–

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi

(continuação)

Acritopappus pintoi

Sousa et al, 2001 O O H3CO O H CO2H

OH

HO

_COH 2H H3CO O O O O

(continuação)

Acritopappus pintoi

Sousa et al, 2002 O CO₂H OH H CO2H CHO H CO2H O CO₂H

Tabela 07-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

prunifolius

Acritopappus prunifolius

Bohlmann et al, 1982 A H HO OR R=Ac R=Ang OH H H O O H OAng O H O

Tabela 07-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus

prunifolius (continuação)

Acritopappus prunifolius

Bohlmann et al, 1982 A OH OAng O O O O O HO H HO H H H H H HO H H

Tabela 08-

Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus teixeirae

Acritopappus teixeirae

Bohlmann et al, 1980 A H CO2H CHO O OCH₃ HO O

OH

O O H

1.5-Constituintes químicos encontrados no extrato hexânico das partes

aéreas de

Acritopappus micropappus

OH

H

HO

H

H

I II Canferenol β-amirina

HO

H

H

H

HO

H

H

H

H

III IV α-amirina Lupeol

HO

H

H

H

H

OH

OOH

V VI Pseudotaraxasterol 10ξ-hidroperoxi-canferen-11-eno

OH

OOH

HO

H

H

H

VII VIII 11-hidroperoxi-canferen-9-eno Sitosterol

HO

H

H

H

O O O O H3CO OCH3 H3CO H H IX X Estigmasterol Yateína

1.6-Constituintes químicos identificados nos óleos voláteis de três

espécimens de

Acritopappus micropappus

Tabela 9–

Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no

Município de Saúde (abril/2001)

Município de Saúde

α-pineno _β-pineno β-mirceno Limoneno _β-ocimeno

δ-elemeno H H H α-copaeno H H β-cubeno H H Cariofileno α-santaleno

α-humuleno

β-santaleno Germacreno D

H

β-selineno Valenceno

Biciclo

germacreno α-bisaboleno β-bisaboleno

H δ-cadineno γ-bisaboleno Germacreno B H H HO Espatulenol O H H 1,10-epoxi cariofileno H H HO α-muurolol O Valerianona

Tabela 10-

Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no

Município de Morro

do Chapéu (agosto/1999)

Município de Morro do Chapéu

O

6-metil-5-hepten-2-ona Limoneno H β-selineno O H H 1,10-epoxi-cariofileno

H

OH

(+)-junenol HO β-acorenol

H α-muurolol H OH α-eudesmol

HO

Valerianol

Tabela 11-

Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no

Município de Jacobina (abril/2001)

Município de Jacobina

α-felandreno Limoneno H H H α-copaeno H H

Cariofileno α-humuleno Germacreno D

Biciclogermacreno

H

δ-cadineno

29.000 compostos conhecidos, incluindo os esteróides [Adam and Zapp, 1998]. São estruturas que contêm esqueletos carbônicos derivados de unidades de isopreno (C5 ) e são classificados como hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40).

A unidade de isopreno é produzida naturalmente, mas não está envolvida na formação desses compostos. As unidades bioquimicamente ativas foram identificadas como os ésteres difosfatados: dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil difosfato (IPP) [Dewick, 1997].

Diversos produtos naturais contêm derivados do isopreno nas suas moléculas, em combinação com esqueletos carbônicos derivados de outras fontes, tais como as rotas do acetato e chiquimato. Um fragmento terpênico comum nesses casos é a unidade C5, normalmente um substituinte dimetilalilico. Essas moléculas são chamadas de meroterpenóides [Dewick, 1997].

Antigamente, a rota do ácido mevalônico era a única rota biossintética conhecida para obtenção do IPP. Recentemente, um novo caminho biossintético foi proposto, através da rota da triose/piruvato [Adam e Zapp, 1998]. As duas rotas estão esquematizadas na figura 03, p.32. No entanto, existe a hipótese de que a rota da triose/piruvato ocorra nos plastídios, estando envolvida na formação dos mono-, di-, e tetraterpenos, enquanto os sesquiterpenos, os triterpenos e os esteróides biologicamente relacionados são formados no citoplasma pela rota do mevalonato [Adam e Zapp, 1998].

+ EnzSH S N HOOC O H + + -TPP Piruvato H HO H PO H H O S N _OH H+ Gliceraldeído-3-P S N O OH H H HO H PO H H + - TPP O H H HO H PO H O H H+ 1-Desoxi-xilulose-5-P OP O OH HO S N OH O O H + - CO₂ O ADP HO OH O P H + H - _S O CoA AcetoacetilCoA IPP ATP -CO2 -H2O OPP MVAPP 2 ATP 2 NADPH OPP OH O O MVA HOOC OH OH HMG-CoA CoA HOOC S O OH CoA S O O CoA S O O znES

Rota do mevalonato Rota da triose/piruvato

Figura 03

-

Rotas biossintéticas para a obtenção do isopentenil difosfato (IPP) [Adam e Zapp, 1998 e Dewick, 1997].

O IPP é isomerizado para outra unidade de isopreno, DMAPP, por uma enzima isomerase (Figura 04). O DMAPP possui um bom grupo de saída, o difosfato, e pode gerar via um processo Sn1 um carbocátion alílico que é estabilizado por deslocalização de carga.

OPP

DMAPP

HR HSOPP

H

IPP

Figura 04

-

Isomerização do IPP para DMAPP

2.1-Monoterpenos

Os monoterpenos são compostos que possuem 10 átomos de carbono, derivados da condensação de duas unidades isoprênicas. Um precursor comum dos monoterpenos é o pirofosfato de geranila, o qual é formado a partir da combinação do DMAPP e do IPP envolvendo a ação da enzima prenil transferase (Figura 05).

(GPP) Geranil PP E OPP OPP + HR HS OPP OPP HS HR + DMAPP OPP

Figura 05-Formação do E-pirofosfato de geranila, precursor geral dos monoterpenos

Os monoterpenos são compostos de grande interesse comercial que estão presentes nos óleos voláteis que utilizamos na indústria de perfumes e fragrância, na produção de especiarias e de ervas empregadas em culinária, na industria de alimentos e condimentos [Robbers et al, 1997].

Muitos monoterpenos são utilizados para fins medicinais. A cânfora (Figura 06) é utilizada como auxiliar em analgésicos locais; o ascaridol e o eucaliptol (Figura 06) são utilizados como anti-helmínticos [Seigler, 1998]; o mentol (Figura 06), em pequenas doses orais tem ação carminativa, mas em grandes doses pode exercer ação de depressão cardíaca; o terpinol (Figura 06) é utilizado como expectorante [Robbers et al, 1997].

O

O O

O

Cânfora Ascaridol Eucaliptol

OH

OH

Mentol Terpinol

Figura 06-Estrutura de alguns monoterpenos com atividades biológicas

5.000 compostos conhecidos, com mais de 200 esqueletos diferentes. Sua distribuição nas plantas basicamente é a mesma dos monoterpenos, sendo que os sesquiterpenos também são comuns em óleos voláteis [Seigler, 1998].

O pirofosfato de E,E-farnesila (FPP) é o precursor biossintético comum dos sesquiterpenos, o qual é formado pela adição de uma unidade de IPP (C5) ao E-pirofosfato de geranila com participação da enzima prenil transferase (Figura 07).

Pirofosfato de E,E-farnesila IPP Geranil PP OPP _OPP HS HR OPP HS HR + OPP + OPP E E

Figura 07

-

Formação do Pirofosfato de E,E-farnesila, precursor geral dos sesquiterpenos

Muitos sesquiterpenos apresentam atividades biológicas das mais diversas. O β

-bisaboleno e o bergamoteno (Figura 08, p.36) são agentes alelopáticos, inibidores do crescimento de raízes; o capsidiol e o hemigossipol (Figura 08, p.36) são fitoalexinas; o debneiol (Figura 08, p.36), possui atividade fungitóxica; o gossipol (Figura 08, p.;36), que é um dímero de sesquiterpeno, apresenta propriedade contraceptiva em mamíferos machos [Seigler, 1998].

OH

HO

β-bisaboleno Bergamoteno Capsidiol

CHO HO HO OH

OH OH Hemigossipol Debneiol CHO OH HO HO OH OH OH CHO Gossipol

Figura 08-Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividades biológicas

Triterpenos são compostos que possuem 30 átomos de carbono, sendo formados pela adição de duas moléculas do pirofosfato de farnesila. Os triterpenos possuem esqueleto derivado da ciclização do 2,3-epóxiesqualeno, que leva ao cicloartenol e a outros triterpenos subsequentes (Figura 09, p.37) [Dewick, 1997].

Cátion alílico Farnesil PP

OPP H Prescaleno PP OPP OPP + Farnesil PP Esqualeno O HO H H H O2 NADPH

2,3-epóxido de esqualeno _Cicloartenol

Figura 09-Formação do 2,3-epóxi-esqualeno e do cicloartenol

Muitos triterpenos apresentam atividades biológicas, dando-lhes uma importância terapêutica e comercial [Mahato and Sem, 1997]. Como exemplo tem-se o ácido betulínico [Fujioka et al, 1994] e o ácido morônico [Ito et al, 2001], os quais são utilizados no tratamento anti-HIV (Figura 10).

H HO CO2H H H H

H O CO2H H H

Ácido betulínico Ácido morônico

Figura 10-Estruturas de alguns triterpenos com atividades biológicas

2.4-Esteróides

Os triterpenos são os precursores dos esteróides, os quais são essenciais como constituintes de membranas celulares, pois ajudam a manter sua integridade e o controle da permeabilidade. Os organismos eucariotas são capazes de sintetizar os esteróides ou os adquirem através da dieta. Já os organismos procariotas têm a capacidade de efetuar a ciclização do esqualeno para formar moléculas como os esteróides. Esses compostos têm três carbonos a menos que os triterpenos, devido à perda das metilas ligadas aos carbonos 4 e 14 [Mann, 1994] e geralmente, os que são encontrados em plantas são hidroxilados no C-3 [Kaufman, 1999]. A figura 11 exemplifica alguns esteróides encontrados em plantas.

HO H H H H HO H H H Fucosterol Ergosterol

HO H H H H Colesterol

3.0-Lignanas

As lignanas são dímeros encontrados na natureza, obtidas a partir do acoplamento fenólico oxidativo de monômeros derivados do ácido cinâmico, que é o precursor de muitos metabólitos com unidades básicas C6-C3 [Mann, 1994].

Diferentes ciclizações e modificações podem ocorrer gerando lignanas dos mais variados tipos estruturais. A lignana yateína apresenta atividade inseticida contra os insetos

Sitophilus granarius, Tribolium confusum e Trogoderma granarium [Harmatha & Nawrot, 2002], além de participar da rota biossintética da lactona ariltetralina, podofilotoxina, a qual é derivada do álcool coniferílico passando pelas dibenzilbutirolactonas matairesinol e yateína (Figura 12, p.40). O anel metilenodioxílico, é encontrado em muitos produtos naturais derivados do chiquimato e é formado por uma reação no modelo orto-hidroximetoxi [Dewick, 1997].

A podofilotoxina é um potente inibidor de mitoses (divisão celular), através da inibição da enzima tubulina polimerase, a qual é responsável pela produção da proteína tubulina. Os inibidores de mitoses são utilizados no tratamento de câncer [Mann, 1994]. Um dos derivados semi-sintéticos da podofilotoxina, o etoposideo, é um potente agente anticancerígeno utilizado no tratamento de câncer de pulmão, câncer testicular e linfomas, geralmente em combinação com outras drogas. Outro derivado semi-sintético, o teniposideo, tem similar propriedade anticancerígena, embora não seja usado amplamente como o

podofilotoxina e as lignanas relacionadas foram encontradas nas raízes das espécies de

Podophyllum (Berberidaceae) [Dewick, 1997].

CO2H CH2OH H3CO OH O O H3CO HO H H OCH3 OH Acoplamento fenólico oxidativo Ácido cinâmico Álcool coniferílico (+)-Pinoresinol _NADPH OH OH H3CO HO OH H3CO H3CO HO OH H3CO O O OCH3 H3CO O O O O OCH3 Secoisolariciresinol Matairesinol Yateína NAD+ OCH3 H3CO O O O O OCH3 OCH3 H3CO O O O O OCH3 OH Desoxipodofilotoxina Podofilotoxina Hidroxilação

4.0-Parte Experimental

4.1-Material Vegetal

Os três espécimens de Acritopappus micropappus estudados foram coletados no estado da Bahia em locais diferentes, no município de Morro do Chapéu em agosto de 1999; no Morro da Antena, município de Saúde em abril de 2001 e no Morro do Cruzeiro, município de Jacobina em abril de 2001.

A identificação botânica foi realizada pela Profª Drª Hortensia Pousada Bautista, curadora do herbário RADAMBRASIL do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, localizado em Salvador-BA. As exsicatas dos três espécimens encontram-se depositadas no mesmo herbário, catalogadas sob os números: HRB 41.223 (Morro do Chapéu), HRB 49.440 (Saúde) e HRB 49.441 (Jacobina).

As partes aéreas do material vegetal depois de secas ao ar a temperatura ambiente foram trituradas no Moinho Thomas Wiley Laboratory Mill-Model 4.

Os solventes utilizados nos procedimentos cromatográficos e na preparação dos extratos foram das marcas Merck, Vetec e Quimex.

A evaporação dos solventes orgânicos utilizados na obtenção dos extratos hexânicos e metanólicos e das frações foi realizada sob pressão reduzida no evaporador rotatório de marca Buchi, modelo R-3000.

Na cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foi utilizado gel de sílica GF254 da marca Merck como fase estacionária. As cromatoplacas para CCDC foram preparadas espalhando-se a suspensão de sílica em água destilada sobre placas de vidro através do espalhador mecânico Heidelberg, obtendo-se placas com 0,5 mm de espessura. Foram utilizadas placas de vidro de 2,5 X 7,0 cm, 5,0 X 20,0cm e 20,0 X 20,0 cm. Depois de

secas ao ar livre todas as cromatoplacas foram ativadas em estufa a 100º C por um período de

aproximadamente uma hora.

Como reveladores foram utilizadas irradiações com lâmpada ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 nm e 366 nm, vapores de iodo e sulfato cérico.

O fracionamento através da técnica de cromatografia em coluna foi feito utilizando gel de sílica grau 60 da marca Merck (0,060-0,200 mm); gel de sílica (0,035-0,070 mm) da marca Merck e sephadex LH-20 da Pharmacia.

Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C unidimensionais e

bidimensionais foram registrados em espectrômetros Varian Gemini 300 e Brucker DPX 300, operando com freqüências do hidrogênio a 300 MHz e do carbono a 75MHz, utilizando o

clorofórmio deuterado como solvente e o pico em 7,27 ppm, da impureza de CHCl3, como referência interna.

Os espectros de massas da substância I e dos óleos voláteis foram obtidos em espectrômetro HP, modelo 5973 MSD, acoplado ao cromatógrafo a gás Hewlett Packard (HP), modelo 6890, utilizando coluna capilar de sílica fundida HP 5MS (5% difenil e 95%

dimetilpolisiloxano), com 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de

espessura do filme, com temperatura do injetor a 220ºC e programação do forno de 60ºC a

240ºC, com taxa de aquecimento de 3º C por minuto, permanecendo a 240º C durante 10

minutos, para os óleos; e com temperatura de injetor a 240º C, programação de forno de 60º C a 240º C , com taxa de aquecimento de 3º C por minuto, permanecendo a 280º C durante 15 minutos, para a substância I.

4.3-Estudo dos componentes fixos da espécie A

critopappus micropappus

Os componentes fixos foram estudados utilizando o extrato hexânico das partes aéreas do espécimen coletado no Morro da Antena, no município de Saúde em abril de 2001.

As substâncias obtidas do extrato hexânico, após fracionamento cromatográfico,

foram analisadas através da técnica de espectrometria de RMN de 1H, 13C, DEPT-135º,

As partes aéreas dos espécimens de Acritopappus micropappus foram inicialmente secas à temperatura ambiente e em seguida moídas, separadamente. O material vegetal obtido para cada espécimen foi submetido a três extrações sucessivas utilizando 2L de hexano e em seguida com 2L de metanol. Após eliminação do solvente em evaporador rotatório, sob pressão reduzida à temperatura de aproximadamente 35º C, foi obtido 7,1g do extrato hexânico e 26,8g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de Saúde; 30,1g do extrato hexânico e 41,6g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de Jacobina e 1,4g do extrato hexânico e 4,4g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de Morro do Chapéu (Figura 13, p.47).

Os extratos hexânico e metanólico do espécimen coletado no município de Morro do Chapéu foram submetidos a bioensaio para verificação de atividade contra o fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum, utilizando o método bioautográfico, onde apenas o extrato hexânico mostrou-se ativo [Silva et al, 1998]. Os extratos hexânico e metanólico do espécimen coletado no município de Jacobina foram submetidos a ensaios preliminares contra Staphylococcus aureus e Candida albicans, sendo apenas o extrato hexânico ativo.

4.3.2-Isolamento dos constituintes químicos do extrato hexânico

O extrato hexânico obtido das partes aéreas (7,1g) do espécimen coletado no município de Saúde, foi submetido a uma coluna cromatográfica filtrante em gel de sílica 0,060-0,200 mm, empacotada a seco, utilizando-se como eluentes misturas de Hex:AcOEt:MeOH, em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), obtendo-se 16 frações denominadas MSH.

Após a evaporação do solvente, todas as frações da coluna filtrante foram submetidas a CCDC e após análise dos resultados as frações MSH-9 (1088mg), MSH-10 (790mg) e as frações MSH-12 e MSH-13 que foram previamente reunidas (893mg), foram submetidas a fracionamento cromatográfico (Figura 14, p.48).

A fração MSH-9 foi submetida à coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 98:2:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100). Foram obtidas 99 frações denominadas MSA. As frações MSA-19 e MSA-23 foram reunidas (150mg), após a análise dos resultados obtidos por CCDC e submetidas a fracionamento em coluna de Sephadex LH-20 utilizando-se como eluentes misturas de Hex:DCM (1:4), DCM:Acetona (3:2) e DCM:Acetona (1:4), obtendo-se 53 frações denominadas MSA(19-23). Após análise dos resultados obtidos por CCDC, algumas frações foram reunidas e das frações MSA(19-23)29-30 e MSA(19-23)20-22 foram isoladas a substância I (30mg) e quatro substâncias em mistura (15mg), respectivamente. As substâncias encontradas em mistura foram denominadas de substância II, III, IV e V (Figura 15, p.49). As frações MSA-13 e MSA-18 também foram reunidas (298mg) e submetidas à

DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), obtendo-se 115 frações denominadas MSA(13-18). Algumas frações foram agrupadas, após análise dos resultados obtidos por CCDC. As frações MSA(13-18)(96-98) (10mg) e MSA(13-18)(104-106) (13mg) foram submetidas a fracionamento, separadamente, em coluna de Sephadex LH-20 utilizando-se como eluentes misturas de Hex:DCM (1:4), DCM:Acetona (3:2) e DCM:Acetona (1:4). Da fração MSA(13-18)(96-98)27 foi identificada a substância VI (4mg) e da fração MSA(13-18)(104-106)27 foi identificada a substância VII (2mg) (Figura 16, p.50).

A fração MSH-10 (790mg) foi fracionada em coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), onde foram obtidas 97 frações (MSC-0 a MSC-96). Nas frações MSC-38 e MSC-41, previamente reunidas, foram identificadas as substâncias VIII e IX (94mg) em mistura (Figura 17, p.51).

As frações MSH12-13 reunidas (893mg) foram submetidas a fracionamento cromatográfico através de coluna em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100). Foram obtidas 81 frações denominadas MSE. Todas as frações foram analisadas por CCDC e após a análise, algumas frações foram agrupadas. A fração MSE41-45 (135mg) foi fracionada através de coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de Hex:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes

de 0:0:100), onde foram obtidas 75 frações denominadas MSE(41-45). Algumas frações foram reunidas após análise por CCDC, na fração MSE(41-45)68-72 foi identificada a substância X (88mg) (Figura 18, p.52).

Extrato metanólico (26,76g)

Partes aéreas secas e moídas (408,4g) TORTA TORTA TORTA Extrato hexânico (7,14g) TORTA Extrato metanólico (26,8g)

Partes aéreas secas e moídas (408,4g) TORTA TORTA TORTA Extrato hexânico (7,1g) TORTA

Extração com 2L de hexano (3X)

Extração com 2L de metanol (3X)

Evaporação do solvente

Evaporação do solvente

Extrato metanólico (26,76g)

Partes aéreas secas e moídas (408,4g) TORTA TORTA TORTA Extrato hexânico (7,14g) TORTA Extrato metanólico

Partes aéreas secas e moídas

TORTA

TORTA TORTA

Extrato hexânico

TORTA

Extração com 2L de hexano (3X)

Extração com 2L de metanol (3X)

Evaporação do solvente

Figura 13–Obtenção dos extratos hexânico e metanólico das partes aéreas da espécie A. micropappus C.C. filtrante (sílica 0,060-0,200mm) eluente:hex:AcOEt:MeOH CCDC MSH 12-13 (892,5mg) MSH 10 (789,7mg) Frações: MSA 1-99 Frações: MSC 0-96 Frações: MSE 0-80 Extrato Hexânico (7,14g) Extrato Hexânico (7,1g) C.C. filtrante (sílica eluente:hex:AcOEt:MeOH (gradiente) Frações: MSH 1-16 Frações: MSH1-16 -CCDC MSH 9 (1087,9mg) MSH 9 (1088mg) MSH 12--13 (893mg) MSH 10 (790mg) Frações: MSA 1-99 Frações: MSC 0-96 Frações: MSE 0-80 :DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm :DCM: (gradiente) C.C. filtrante (sílica 0,060-0,200mm) eluente:hex:AcOEt:MeOH CCDC MSH 12-13 (892,5mg) MSH 10 (789,7mg) Frações: MSA 1-99 Frações: MSC 0-96 Frações: MSE 0-80 Extrato Hexânico (7,14g) Extrato Hexânico (7,1g) C.C. filtrante (sílica eluente:hex:AcOEt:MeOH (gradiente) Frações: MSH 1-16 Frações: MSH1-16 -Frações: MSH 1-16 Frações: MSH1-16 -CCDC MSH 9 (1087,9mg) MSH 9 (1088mg) MSH 9 (1087,9mg) MSH 9 (1088mg) MSH 12--13 (893mg) MSH 10 (790mg) Frações: MSA 1-99 Frações: MSC 0-96 Frações: MSE 0-80 :DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

(gradiente)

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

eluente AcOEt MeOH

C.C. em sílica 0,035-0,070mm

:DCM:

Figura 14–Fracionamento do extrato hexânico das partes aéreas de Acritopappus micropapppus MSA 13-18 (298,0mg) MSA 19-23 (150,2mg) MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-55 MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V ( mg) I ( mg) MSA 13-18 (298,0mg) MSA 19-23 (150,2mg) MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-55 MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V (15,2 mg) I ( 8 mg) MSA 13-18 (298,0mg) MSA 19-23 (150,2mg) MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-55 MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V ( mg) I ( mg) MSA 13-18 (298,0mg) MSA 19-23 (150,2mg) MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-55 MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V (15,2 mg) I ( 8 mg) MSA 13-18 (298,0mg) MSA 19-23 (150,2mg) MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-55 MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V ( mg) I ( mg) MSA 13-18 (298mg) MSA 19-23 (150mg) Frações: MSA 1-99 Frações: MSA 1-99 Frações: MSA 1-99 Frações: MSA 1-99 Frações: MSA 1-99 Frações: MSA 1-99 MSA (19 -23) 20-22 Frações: MSA(19-23)0-52 -MSA (19 -23) 29-30 II, III, IV e V (15mg) I (30mg) (gradiente) CCDC CCDC C.C. (Sephadex LH 20) eluente: Hex:DCM:Acetona

Figura 15–Obtenção da substância I e das substâncias II, III, IV e V em mistura. MSA (13-18) (104-106) (12,9mg) MSA (13-18) (96-98) (9,9mg) MSA 13-18 (298,0mg) CCDC MSA (13-18) (104-106) 0-39 MSA (13-18) (96-98) 0-63 Frações: MSA (13-18)0-114 VI ( 4 mg) VII ( 1,4 mg) MSA (13-18) (96-98) 27 MSA (13-18) (104-106) 27 CCDC CCDC MSA (13-18) (104-106) (13mg) C.C. com sílica 0,035-0,070mm

eluente:DCM: AcOEt:MeOH

eluente :MeOH MSA (13-18) (96-98) (10mg) MSA 13-18 (298mg) CCDC MSA (13-18) (104-106) 0-39 MSA (13-18) (96-98) 0-63 Frações: MSA (13-18)0-114 VI ( 4mg) VII ( 2mg) MSA (13-18) (96-98) 27 MSA (13-18) (104-106) 27 CCDC CCDC (gradiente) C.C. (Sephadex LH 20) eluente: Hex:DCM:Acetona (gradiente) C.C. (Sephadex LH 20) eluente: Hex:DCM:Acetona (gradiente)

Figura 16–Isolamento das substâncias VI e VII. Fração: MSC 38-41 IX e X (46,0mg) Fração: MSC 38-41 VIII e IX (46,0mg) Fração: MSC 38-41 IX e X (46,0mg) Fração: MSC 38-41 MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 CCDC MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 MSH 10 (7907mg) Frações: MSC 0-96 VIII e IX (46mg) C.C. em sílica 0.035-0.070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente) Fração: MSC 38-41 IX e X (46,0mg) Fração: MSC 38-41 VIII e IX (46,0mg) Fração: MSC 38-41 IX e X (46,0mg) Fração: MSC 38-41 MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 CCDC MSH 10 (789,7mg) Frações: MSC 0-96 MSH 10 (790 mg) Frações: MSC 0-96 VIII e IX (94mg) C.C. em sílica 0.035-0.070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente)

Figura 17–Obtenção das substâncias VIII e IX em mistura MSH 12-13 (892,5mg) Frações: MSE 0-80 MSE 41-45 (134,7mg) MSE (41-45) (68-72) Frações: MSE (41-45) 1-75 X (87,9mg) MSH 12-13 (893mg) Frações: MSE 0-80 MSE 41-45 (135mg) MSE (41-45) (68-72) Frações: MSE (41-45) 1-75 X (88mg) C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente) (gradiente) CCDC CCDC MSH 12-13 (892,5mg) Frações: MSE 0-80 MSE 41-45 (134,7mg) MSE (41-45) (68-72) Frações: MSE (41-45) 1-75 X (87,9mg) MSH 12-13 (893mg) Frações: MSE 0-80 MSE 41-45 (135mg) MSE (41-45) (68-72) Frações: MSE (41-45) 1-75 X (88mg) C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente) (gradiente) CCDC CCDC

Figura 18–Isolamento das substâncias X.

4.4-Estudo dos componentes voláteis da espécie A

critopappus

micropappus

O estudo dos constituintes voláteis presentes nas partes aéreas dos três espécimens coletados nos municípios de Saúde (abril de 2001), Jacobina (abril de 2001) e Morro do Chapéu (agosto de 1999) foi realizado através da obtenção dos óleos por hidrodestilação, utilizando-se um aparelho doseador de óleos voláteis do tipo Clevenger modificado (Figura 19, p.54).

A composição química do óleo assim obtido foi analisada através de cromatografia à gás acoplada a espectrometria de massas (CG/EM) com o auxílio da espectroteca.

A identificação dos constituintes presentes nos óleos voláteis foi realizada através da determinação de seus índices de retenção, além de compará-los com os dados disponíveis na literatura [Adams, 1995]

4.4.1-Obtenção dos óleos voláteis

As partes aéreas dos três espécimens foram previamente secas ao ar à temperatura ambiente e depois moídas, obtendo-se 51,3g; 53,4g e 212,5g de material vegetal coletado nos