INSTITUTO DE BIOLOGIA
UIARA ROMERO SOUZA
Mudanças no padrão de deposição da lignina em madeira
de tensão em espécies de eucaliptos e avaliação do perfil de
expressão de genes relacionados à quinases e à via de
biossíntese da lignina
CAMPINAS
Mudanças no padrão de deposição da lignina em madeira de tensão
em espécies de eucaliptos e avaliação do perfil de expressão de
genes relacionados à quinases e à via de biossíntese da lignina
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de doutora em BIOLOGIA VEGETAL.
Orientador: PAULO MAZZAFERA
CAMPINAS 2020
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA UIARA ROMERO SOUZA E ORIENTADA PELO PROF. DR. PAULO MAZZAFERA.
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Souza, Uiara Romero, 1987-
So89m SouMudanças no padrão de deposição da lignina em madeira de tensão em espécies de eucaliptos e avaliação do perfil de expressão de genes
relacionados à quinases e à via de biossíntese da lignina / Uiara Romero Souza. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
SouOrientador: Paulo Mazzafera.
SouTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Sou1. Eucalipto. 2. Proteínas quinases. 3. Lignina. 4. Transcriptoma. 5.
Madeira de tensão. I. Mazzafera, Paulo, 1961-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Changes on lignin deposition pattern in tension wood in eucalyptus species and expression profile evaluation of genes related to kinases and the lignin
biosynthesis pathway Palavras-chave em inglês: Eucalyptus Protein kinases Lignin Transcriptome Tension wood
Área de concentração: Biologia Vegetal Titulação: Doutora em Biologia Vegetal Banca examinadora:
Paulo Mazzafera [Orientador] Adilson Pereira Domingues Júnior Paula Macêdo Nobile
Sara Adrián Lopez de Andrade Michael dos Santos Brito Data de defesa: 31-08-2020
Programa de Pós-Graduação: Biologia Vegetal
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7147-2871 Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3145441184931194
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Paulo Mazzafera (Orientador)
Dr. Adilson Pereira Domingues Júnior
Dra. Paula Macêdo Nobile
Prof. Dra. Sara Adrian Lopez de Andrade
Dr. Michael dos Santos Brito
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Instituto de Biologia da Unicamp.
que foram minha referência profissional e de aprendizagem por dez anos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de doutorado concedida (processo 140428/2015-1).
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Mazzafera, pela orientação e paciência nestes muitos anos de aprendizado no laboratório. Foi inspirador ser orientada por uma pessoa tão empolgada e dedicada a pesquisa científica.
Aos ex-técnicos do DBV Luciano e Néia que me atendiam solicitamente e estavam sempre dispostos a me ensinar ou ajudar nos experimentos. E especialmente ao Eduardo que por diversas vezes me acompanhou e auxiliou nos experimentos de proteômica.
Aos professores Prof. Dr. Renato Vicentini (IB/Unicamp), Prof. Dr. Tiago Santana Balbuena (FCAV/UNESP), Prof. Dr. Daniel Martins-de-Souza (IB/Unicamp) e Profª. Drª. Juliana Lischka Sampaio Mayer (IB/Unicamp) pelo suporte nas análises e tratamento de dados realizados durante o período do doutorado.
Aos alunos do LaFiMP e colegas do DBV pela colaboração nos trabalhos, pela troca de informações e pelas conversas/cafés na copa.
Às amigas Simone, Sarinha e Elzira pelas divertidas conversas, trocas de receitas e por alegrarem a hora do almoço.
Aos meus pais, avô (em memória), minha irmã e marido que sempre me apoiaram, dando suporte e cuidado ao meu filho, para que eu conseguisse exercer todas as minhas atividades como estudante, professora e mãe.
A todos que fizeram parte desse processo de formação.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
interesse neste polímero é vinculado à manipulação do teor de lignina em determinadas espécies de plantas, tais como nas gramíneas utilizadas como forrageiras e em espécies arbóreas utilizadas para a produção de papel e, mais recentemente, em produção de biocombustíveis. Muitos componentes desta via como as enzimas e os fatores de transcrição que participam de sua regulação vêm sendo alvo de pesquisas, porém proteínas quinases reguladoras especificamente para esta via são pouco conhecidas em plantas. Para induzir modificações no metabolismo e no nível de expressão da via de biossíntese da lignina, eucaliptos foram submetidos ao tensionamento do caule. Este tipo de tratamento resulta na mudança da composição e redução da lignificação na região de tensão da madeira (TW) e no aumento de lignificação da região oposta (OW). Alterando o metabolismo da lignina, quinases potencialmente relacionadas a sinalização da via durante o tratamento de tensão foram mobilizadas e identificadas. Verificamos que as alterações anatômicas, o aumento da lignificação e a razão S/G apresentaram nas espécies de eucalipto estudadas um padrão similar. A análise de expressão gênica demonstrou alterações nas espécies E. globulus e E. grandis em genes da via de biossíntese da lignina, fatores de transcrição e proteínas quinases; proporcionado a identificação de genes potencialmente relacionadas com a regulação e formação da parede celular por apresentarem aumento de expressão na OW. O gene HCT4 demonstrou ser altamente correlacionado com as quinases analisadas na espécie E. globulus. As lacases EglLAC38, EglLAC44 e as peroxidases EglPRX11 e EglPRX12 se destacam pela possível atuação na polimerização da lignina, enquanto as quinases
EglCAMK_CDPK12, EglMAPK3 e EglMAPK9-1 estariam relacionadas a vascularização e lignificação do caule. As quinases receptoras EglWAK_LR1,
EgrWAK5 e EgrWAK8 são potenciais candidatas a sinalização do estresse
gravitacional em eucalipto. Em E. grandis, o tensionamento do caule provocou maior expressão de enzimas relacionadas a via de biossíntese da lignina, pectina e celulose. Os resultados deste estudo confirmam dados já apresentados na literatura e identificam genes de quinases candidatos para futuras análises funcionais.
this polymer linked to the manipulation of lineage content in specific plant species, such as grasses, used as fodder and tree species used in paper production, more recently, in biofuels production. Many components of this pathway, such as enzymes and transcription factors (FTs) that participate in its regulation, have been the target of research, but regulatory protein kinases specifically for this pathway are poor known in plants. To induce changes in the metabolism and expression level of lignin biosynthesis pathway, eucalyptus was subjected to tension wood. This type of treatment results on composition altering and lignin reducing in the tension wood (TW) and lignin increasing in opposite wood (OW). Kinases potentially related to pathway signaling during tension treatment were mobilized and identified after lignin metabolism altering. We found that anatomical changes, lignin increase and the S/G ratio show a similar pattern in the studied eucalyptus species. Gene expression analysis showed changes in E. globulus and E. grandis species on lignin biosynthesis pathway, transcription factors and protein kinases genes expression; identifying genes potentially related to cell wall regulation as they present increased expression in OW. The HCT4 gene was shown to be highly correlated to Eucalyptus globulus kinases. Laccases EglLAC38, EglLAC44 and peroxidases EglPRX11 and EglPRX12 were indicated by their potential to act in lignin polymerization, while kinases
EglCAMK_CDPK12, EglMAPK3 and EglMAPK9-1 would be related to stem
vascularization and lignification. Receptor-like kinases EglWAK_LR1, EgrWAK5 and
EgrWAK8 are potential candidates for signaling gravitational stress in eucalyptus. In E. grandis, tension wood caused greater protein expression related to lignin, pectin
and cellulose biosynthesis pathway. The results presented confirm literature data and identify kinases candidates for further functional analysis.
1.1 Madeira de Tensão (TW) ... 10 1.2 Eucalipto ... 11 1.3 Parede celular ... 13 1.4 Lignina ... 15 1.5 Quinases ... 18 1.6 PQs e eucalipto ... 20 1.7 PQs e lignina ... 23 2 Objetivos ... 24 3 Materiais e Métodos... 25 3.1 Metodologia do tratamento ... 25 3.2 Delineamento experimental ... 25
3.3 Esquema dos experimentos ... 30
3.4 Análises Histoquímicas ... 31
3.5 Dosagem de lignina ... 31
3.5.1 Ácido Tioglicólico (TGA) ... 31
3.5.2 Lignina Klason (KL) ... 32
3.6 Razão S/G ... 33
3.7 Análise de monômeros e oligômeros de lignina solúvel ... 33
3.8 Expressão gênica por RNAseq de E. globulus e E. grandis ... 33
3.8.1 Análise dos dados de RNAseq ... 35
3.9 Análise de expressão gênica por qRT-PCR ... 36
3.10 Proteômica ... 37 3.10.1 Extração... 37 3.10.2 Dessalinização ... 38 3.10.3 Quantificação ... 38 3.10.4 Digestão... 39 3.10.5 Purificação ... 39
3.10.6 Análise por espectrometria de massas ... 39
3.10.7 Identificação das proteínas ... 40
3.11 Análise Estatística ... 40
4.2.1 Floroglucinol ... 42
4.2.2 Reagente de Maüle ... 44
4.3 Dosagem de lignina Klason e razão S/G ... 45
4.4 Composição da lignina solúvel ... 46
4.5 Análises de Expressão ... 49 4.5.1 RNAseq de E. globulus ... 49 4.5.2 RNAseq de E. grandis ... 56 4.6 Proteômica de E. grandis ... 60 5 Discussão ... 61 6 Conclusão ... 74 7 Referências ... 76 ANEXO I ... 90 ANEXO II ... 118
Declaração de bioética e biosegurança... 130
1 INTRODUÇÃO
1.1 Madeira de Tensão (TW)
Ao se dobrar o caule de uma árvore se desenvolve um estresse mecânico e a madeira formada no local é conhecida como madeira de reação. Esse estresse provoca uma reação contrária no caule que altera o tecido da região tensionada para retornar a posição vertical e a reprogramação da biossíntese da madeira, sendo observadas características anatômicas típicas nas hastes e galhos inclinados natural ou artificialmente (Mellerowicz & Sundberg, 2008).
Em coníferas a madeira de reação é denominada madeira de compressão (CW) e em dicotiledôneas é denominada madeira de tensão (TW). A CW diferencia-se da TW principalmente pelo lado de formação do tecido (figura 1). A madeira de compressão se forma na posição inferior do caule inclinado e há traqueídes densamente lignificados, destacando a região por ser mais densa e escura (Barnett
et al., 2014). A madeira de tensão (TW) forma-se tipicamente nas laterais superiores
do ramo que foi inclinado e caracteriza-se pela baixa lignificação da parede celular, aumento na razão S/G (Aoyama et al., 2001; Aguayo et al., 2010), e muitas vezes, a presença de uma camada gelatinosa interna (camada G) que substitui uma das camadas tradicionais das fibras (Ruelle, 2014). No lado oposto a TW, forma-se a região conhecida como madeira oposta (OW) à medula que também pode sofrer alterações nas suas propriedades estruturais e composição química, como parede celular secundária menos espessa, maior frequência de elementos de vaso e deposição de lignina (Aguayo et al., 2010; Barnett et al., 2014; Mizrachi et al., 2015). A madeira de reação é utilizada como um modelo exploratório para estudos de desenvolvimento das vias de formação da parede celular secundária e do fluxo de carbono para a formação dos componentes da parede, devido às mudanças de composição e deposição destes compostos estruturais em espécies arbóreas (Andersson-Gunnerås et al., 2006). Deste modo, consideramos este modelo interessante para avaliarmos alterações no padrão de lignificação e nas mudanças de expressões gênicas e proteicas relacionadas a esta via em eucalipto.
Figura 1: Formação da madeira de reação em caule inclinado. (a) Madeira de tensão (TW) em angiosperma. (b) madeira de compressão (CW) em gimnosperma. Extraído de Gril et al. (2017).
1.2 Eucalipto
As espécies de eucalipto e seus híbridos estão entre as principais fontes mundiais de biomassa lenhosa e correspondem às madeiras mais utilizadas para extração de celulose e produção de papel, devido à sua rápida taxa de crescimento, sua capacidade de adaptação a diversas condições ambientais e sua boa qualidade de fibra de madeira (Turnbull et al., 2002; Grattapaglia & Kirst, 2008).
O gênero Eucalyptus (família Myrtaceae) é nativo da Austrália e outras ilhas da Oceania como Papua Nova Guiné e Filipinas, de distribuição ampla, ocorrem em regiões chuvosas a semiáridas, do nível do mar até grandes altitudes (Ladiges et al., 2003). Apesar de seu centro de origem ser na Austrália, encontramos espécies de eucalipto sendo cultivadas amplamente em outros continentes, ocupando uma área com cerca de 18 milhões de hectares, predominantemente na Índia (45%), Brasil (17%) e China (7%) (Novaes et al., 2010). Utilizados em diversas aplicações como
produção de móveis, painéis de madeira, óleos essenciais e recuperação de solos, o eucalipto também se destaca no cenário nacional para a produção de carvão vegetal, pois o Brasil é considerado o maior produtor e consumidor deste segmento, sendo a indústria siderúrgica responsável pela utilização de 90% deste recurso (Oliveira et al., 2010).
As espécies E. grandis, E. globulus, e E. camaldulensis, junto a seus híbridos, representam cerca de 80% das florestas plantadas (Myburg et al., 2007) e suas características estão relacionadas às distribuições de origem: E. grandis é uma espécie de ocorrência tropical da costa leste da Austrália, com clima quente e úmido;
E. globulus se limita a climas temperados da região sul e E. camaldulensis tem ampla
distribuição, ocorrendo em grande parte do território australiano (Müller et al., 2017). Florestas que geram matéria-prima para a indústria de papel e celulose são majoritariamente formadas pelos híbridos E. grandis × E. urophylla, E. grandis × E.
camaldulensis e variedades de E. pellita, E. saligna, E. exserta e E. tereticornis
(Myburg et al., 2007) que variam de acordo com a região: o cultivo de E. grandis e E.
urophylla concentra-se em regiões tropicais e subtropicais, E. pellita em regiões
equatoriais, E. globulus em regiões temperadas e E. camaldulensis, com maior plasticidade, pode se adaptar a regiões tropicais e temperadas (Myburg et al., 2007; Grattapaglia & Kirst, 2008; Costa et al., 2012).
Além da questão regional, outras características são desejáveis para aumentar a produtividade do setor de produção de celulose e papel, dentre elas se destacam aspectos relacionados às propriedades da madeira, como a redução de substâncias recalcitrantes que dificultam a extração da celulose e melhoria da resistência a estresses bióticos e abióticos. Uma das principais substâncias que oferecem recalcitrância a extração de celulose é a lignina, um dos principais componentes da parede celular secundária.
Dentre as espécies mais utilizadas, E. globulus é a que possui melhor rendimento na extração de celulose, o que está relacionado ao seu menor teor de lignina e maior proporção siringil/guaiacil (S/G) que outras espécies. Porém, não é bem adaptada a climas tropicais (Salazar et al., 2013). A proporção S/G tem implicações no rendimento da polpação e branqueamento durante a produção de papel, pois a lignina de tecidos com maior quantidade de unidades tipo S são mais facilmente extraídas devido à abundância de ligações β-O-4, mais facilmente clivadas
neste processo (Ramadevi et al., 2016). E. camaldulensis e E. pellita tem valores mais altos de lignina e razão S/G menor, no entanto, apresentam resistência a seca e ao ataque de patógenos (Costa et al., 2012; Diniz et al., 2019). E. grandis, a espécie mais utilizada comercialmente, apresenta valores intermediários de lignina no caule e razão S/G, tendo o crescimento mais rápido dentre as espécies citadas (Pereira et al., 2000; Ramadevi et al., 2016).
É fundamental para o desenvolvimento tecnológico e melhoria da produtividade das florestas de eucalipto o conhecimento sobre espécies com características diversas, com o propósito de inserir nos programas de hibridação e clonagem novas variedades mais adaptadas ao clima e solo de determinadas regiões. Por outro lado, conhecer de que forma cada espécie responde ao estresse mecânico e reprograma a formação da madeira em seus aspectos moleculares e de sinalização, com ênfase em lignina, fatores de transcrição e quinases seria um ponto de partida importante para estudos funcionais.
1.3 Parede celular
A parede celular vegetal (figura 2) é uma estrutura rígida, dinâmica e complexa que determina o tamanho e o formato da célula, continuamente monitorada quanto à integridade funcional durante o desenvolvimento e interação com o meio ambiente (Denness et al., 2011). Dependendo do estágio de desenvolvimento, a parede celular é chamada de primária, formada durante o crescimento celular, ou secundária, formada durante a expansão celular (Evert, 2006).
Figura 2: Diferenças entre parede primária e parede secundária em plantas. Extraído de https://onlinesciencenotes.com/differences-between-primary-and-secondary-cell-wall-in-plants/ acesso em 06/07/2020. Detalhe para a composição das camadas de celulose S1, S2 e S3.
A parede celular primária é mais delgada e possui em sua composição microfibrilas de celulose imersas em uma matriz de hemicelulose e pectinas, sendo a primeira parede formada nos diferentes tipos celulares. Quando o crescimento celular cessa, inicia-se a deposição da parede celular secundária geralmente em células especializadas como xilema e esclerênquima, na qual a composição difere, por maior abundância de celulose, presença de lignina que confere maior rigidez as células e baixas quantidades de pectina (Evert, 2006).
A celulose é o componente mais abundante da parede celular secundária e está tipicamente depositada em três camadas distintas (S1, S2 e S3), que por sua vez, distinguem-se por diferenças na orientação das microfibrilas. Na madeira de tensão (TW) comumente a S2 é substituída pela camada G, celulósica, mas pode haver variações no padrão ou até mesmo ausência da formação desta camada (Mizrachi et al., 2015). A parede celular secundária define o formato da célula, regula o seu crescimento e proporciona suporte mecânico e estrutural às plantas, atua na defesa da planta contra ataques de patógenos e estresses abióticos e representa a maior fonte de biomassa renovável utilizada no mundo (Zhong & Ye, 2007).
1.4 Lignina
A deposição da lignina na parede celular secundária, após a finalização do alongamento celular, se dá em alguns tipos de células, principalmente no xilema, esclerênquima, fibras do floema e periderme. A lignina é um polímero aromático complexo, que pode ser sintetizado a partir de três álcoois hidroxicinamoil (p-cumarílico, coniferílico e sinapílico), que recebem o nome comum de monolignóis e diferem na metoxilação dos C3 e C5 posicionados no anel aromático. Quando
incorporados ao polímero, os monolignóis tradicionais são denominados unidades p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S) (Boerjan et al., 2003).
A madeira, constituída pelo xilema secundário, é comumente classificada em dois tipos: a madeira das gimnospermas é chamada de softwoods e a madeira das angiospermas de hardwood, sendo que a composição da lignina nestes tipos de madeira difere. As softwoods apresentam unidades tipo G, com baixos níveis de unidades H, e as hardwoods são compostas por unidades S e G, principalmente, e unidades H com quantidades maiores em gramíneas (Boerjan et al., 2003).
Figura 3: Biossíntese de monolignóis em angiospermas. Extraído de Wagner et al. (2015).
A biossíntese da lignina deriva da via dos fenilpropanóides, tendo como substrato inicial a fenilalanina. Atualmente são reconhecidas as seguintes enzimas necessárias para a biossíntese dos monolignóis (figura 3): fenilalanina amônia liase (PAL), cinamato-4-hidroxilase (C4H), Cafeoil-shiquimato esterase (CSE), hidroxicinamoil-CoA ligase (4CL), hidroxicinamoil-CoA: shiquimato/quinato hidroxicinamoil transferase (HCT), p-Cumarato 3-hidroxilase (C3H), cafeoil-CoA O-metiltransferase (CCoAOMT), hidroxicinamoil-CoA redutase (CCR), ferulato 5-hidroxilase (F5H), ácido cafeico O-metiltransferase (COMT) e cinamil álcool desidrogenase (CAD). A localização subcelular destas enzimas é diferenciada, a maioria delas está localizada no citosol e no retículo endoplasmático, aderidas ou em vesículas. No entanto, PAL e CAD são mais amplamente distribuídas, localizadas no complexo de Golgi, plastídios, membrana plasmática e parede celular. Os monolignóis sintetizados são transportados até a parede celular onde são oxidados por peroxidases (PER) e lacases (LAC), e ocorre a polimerização da lignina (Boerjan et
al., 2003; Vanholme et al., 2010; Wagner et al., 2015; Barros et al., 2015).
A composição da lignina difere nos tipos celulares: os elementos traqueais geralmente possuem maior quantidade de unidades do tipo G e o esclerênquima (fibras e esclereides) tem mais unidades do tipo S em gramíneas (Barros et al., 2015). Para que esta deposição diferenciada ocorra, são necessários mecanismos de
regulação gênica. Entre os mecanismos mais conhecidos e estudados está a regulação por fatores de transcrição (FTs). Porém, dada a complexidade da via de biossíntese da lignina, outros fatores pós-transcricionais e pós-traducionais como fosforilação, ubiquitinação e glicosinação (Lu et al., 2013; Barros et al., 2015; Wang et
al., 2015; Sulis & Wang, 2020) interferem na quantidade e qualidade deste polímero,
além da incorporação de monômeros não tradicionais a estrutura da lignina. Recentemente foram encontrados em algumas espécies de angiospermas compostos fenólicos, como flavona tricina em gramíneas, hidroxistilbenos e ácidos fenólicos conjugados aos monolignóis tradicionais em palmeiras, que provavelmente estão associados ao sistema de defesa destas plantas (Lan et al., 2016; del Río et al., 2017; Karlen et al., 2017).
Os FTs podem se organizar em redes regulatórias, atuam positiva ou negativamente no controle de outros FTs ou de genes que codificam enzimas, se ligando a região do promotor. Os FTs são chamados de reguladores másters quando atuam em níveis hierárquicos mais altos na rede de regulação, abaixo destes, outros FTs controlam diretamente os genes da via (Grotewold, 2008).
Estudos com Arabidopsis thaliana, Pinus taeda, Eucalyptus gunni e
Nicotiana tabacum têm demonstrado a existência de vários FTs envolvidos na
biossíntese da parede celular secundária. Na figura 4 apresentamos a rede de regulação da parede celular secundária revisada por Zhang et al. (2018). As famílias gênicas que mais se destacam pela quantidade de trabalhos na literatura são NAC e MYB: reguladores “masters” (Wang & Dixon, 2011). Os genes dos FTs NST1 (NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1), NST2 e NST3/SND1 (SECONDARY WALL–ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN1), VND6 e VND7 (VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN), AtMYB46, AtMYB83, EgMYB1, EgMYB2, entre outros, são reguladores da região promotora dos genes da via da lignina e podem atuar promovendo ou reprimindo a sua transcrição (Goicoechea et al., 2005; Zhong et al., 2007; McCarthy et al., 2009; Legay et al., 2010; Zhong & Ye, 2012).
Figura 4: Esquema da rede reguladora da formação da parede celular secundária em
Arabidopsis, Pinus, Eucalyptus e Populus. A rede de regulação divide-se em três
camadas, de acordo com o nível hierárquico de regulação dos FTs “másters”. As setas no final das linhas representam ativação e as barras em “T” representam repressão. Interações proteína-proteína são representadas por linhas tracejadas em azul. Linhas sólidas e pontilhadas representam regulação direta ou indireta, respectivamente. Extraído de Zhang et al. (2018).
1.5 Quinases
Quinases (PQs) são importantes reguladoras pós-traducionais em eucariotos, utilizam o alpha-fosfato do ATP para fosforilar resíduos de serina, treonina ou tirosina de outras proteínas, alterando a atividade destas enzimas de forma
reversível, devido a função antagônica de proteínas fosfatases que atuam na remoção do fosfato ligado (Hanks & Hunter, 1995). As PQs das plantas dividem-se em várias famílias, formando dois grupos parafiléticos: quinases solúveis e quinases receptoras. A maioria das PQs pertence ao clado das quinases receptoras de membrana RLK (receptor-like kinase), que abrange as famílias de quinases com domínios extracelulares e/ou transmembrana: LRR (leucine-rich repeat), WAK (Wall Associated Kinase) e RLCK (receptor-like cytoplasmic kinase), que funcionalmente atuam na percepção e transmissão dos sinais extracelulares para o interior da célula (Zulawski & Schulze, 2015).
O clado das PQs solúveis é mais diversificado, apresenta muitas famílias, atuando em diversas funções. As famílias mais conhecidas são (Zulawski & Schulze, 2015):
• MPK (mitogen-activated protein kinases) envolvidas na resposta imune inata, estresses e processos de crescimento e desenvolvimento;
• CDPK (calcium-dependent protein kinases) e CIPK/SnRK3
(CBL-interacting kinases), que são ativadas por cálcio;
• CDK (Cyclin-dependent kinases), CKL (casein-like kinase family) e NIMA / NEK (NimA-Related Kinase), que são reguladoras do ciclo celular;
• CKII (casein II kinases) e WNK (with-no-lysine kinases), que são reguladoras do ritmo circadiano;
• AGC quinases (cATP, cGTP, and Phospholipid-Dependent Kinases), que atuam no crescimento e proliferação celular;
• SnRK1 - Snf1(sucrose non-fermenting-1)-related protein kinases, que se destacam pelo papel no controle de disponibilidade de nutrientes e de resposta a estresse;
• SnRK2, que responde a estresse abiótico.
No quinoma (conjunto de proteínas quinases codificadas no genoma) humano, atualmente o mais estudado, são conhecidos cerca de 500 genes codificantes para PQs e estima-se que as pesquisas se concentrem em apenas 10% delas, limitando o potencial deste grupo, que está relacionado a doenças como câncer, inflamações e sinalização celular (Knapp et al., 2013).
Em plantas a situação é mais complexa, pois a duplicação dos genomas em plantas é relativamente comum. Logo, o tamanho do quinoma das plantas é significativamente maior comparado a outros eucariotos (Zulawski & Schulze, 2015), paralelo a isto, ocorre redundância gênica, o que dificulta estudos de função (Chevalier & Walker, 2003).
Lehti-Shiu & Shiu (2012) classificaram as PQs de 25 espécies de plantas e desenvolveram a análise evolutiva e funcional mais abrangente até então. Utilizando o banco de dados disponíveis no Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov), fizeram a comparação dos quinomas dessas espécies com as de outros eucariotos. Estes autores encontraram a variação no número de genes entre 600 a 2500, sendo o menor quinoma da espécie Carica papaya e o maior de Eucalyptus grandis. Além destas espécies, algumas poucas tiveram o quinoma mais recentemente publicado, sendo milho, Arabidopsis thaliana, soja e videira os principais exemplos (Wei et al., 2014; Zulawski & Schulze, 2015; Liu et al., 2015a; Zhu et al., 2018).
1.6 PQs e eucalipto
Há muito pouco sobre PQs em eucalipto. Na busca por referências, poucos artigos foram encontrados relacionando PQs, eucalipto, expressão gênica e seu papel funcional. Estes trabalhos são comentados a seguir.
Os dados mais abrangentes sobre a classificação e evolução do quinoma de eucalipto estão no trabalho de Lehti-Shiu & Shiu (2012), onde foram encontrados 2532 genes de quinases em E. grandis, distribuídos em 9 grupos, dos quais 2190 genes estão no grupo RLK-Pelle, de quinases receptoras de membrana. Os genes das PQs identificadas, a classificação e sequências estão disponíveis no banco de dados iTAK (http://itak.feilab.net) (Zheng et al., 2016).
O RNAseq de nova geração tem se popularizado e proporcionado grande quantidade de dados em curto período de tempo. Liu et al. (2014) construíram uma biblioteca do transcriptoma da folha de Eucalyptus dunni, submetido a estresse por frio, a 4ºC, durante diferentes períodos. Estes autores verificaram dentre os vários genes alterados, que três PQs tiveram aumento da expressão em resposta ao frio: diacylglycerol kinase, histidina quinase e uma MPK, sugerindo o seu envolvimento em mecanismos de tolerância ao frio em eucalipto.
A família das quinases dependentes de mitógeno - MPK formam cascatas de sinalização e envolvem basicamente três níveis de ações sequenciais das PQs (figura 5). A reação se inicia com as MPKK kinase (MEKK ou ANP), que recebem o sinal para iniciar a cascata de fosforilação, passam para MPKK (MKK ou MEK) e terminam com as MPK (MAPK), que serão reguladoras dos substratos; estas MPK apresentam promiscuidade em seus alvos e podem ser redundantes, o que dificulta a validação funcional (Xu & Zhang, 2015). Por exemplo, AtMPK3 e AtMPK6 que participam da cascata de sinalização, umas das mais estudadas em resposta de defesa das plantas, são homólogos funcionais em Arabidopsis e juntas atuam na ativação da biossíntese do etileno, camalexina e no fechamento estomático em resposta a bactérias (Devendrakumar et al., 2018). Num estudo que incluiu 40 espécies, foram identificados e nomeados os membros da família MPK com base na presença de motivos de ativação em ciclo TEY/TDY e domínios conservados, em E.
grandis foram identificadas 13 MPKs (Mohanta et al., 2015).
Figura 5: Cascata de sinalização das MAPK. Os estímulos ambientais bióticos e abióticos iniciam a ativação de uma MAPK quinase quinase (MAPKKK) que medeia a fosforilação de uma MAPK quinase que por sua vez fosforila uma MAPK. Adaptado de Cho et al. (2009).
As proteínas da família CDPK atuam em diversos processos biológicos em resposta a variação dos níveis de cálcio e auto fosforilação relacionados a sinais ambientais. Dentre as funções conhecidas estão a atuação na abertura e fechamento estomático, regulação de FTs em resposta a giberelina e ativação da produção de espécies reativas de oxigênio – ROS (Kudla et al., 2010). Martins et al. (2018) verificaram a expressão gênica de proteínas associadas à tolerância a seca em folhas de clones de híbridos E. camaldulensis x E. urophylla, contrastantes para tolerância ao estresse hídrico. Entre os genes relacionados à tolerância por sinalização por ABA está EgrCDPK26, homólogo de AtCPK6. Em Arabidopsis as PQs CPK3 e CPK6 atuam conjuntamente na regulação do fechamento dos estômatos em resposta ao ABA e íons cálcio (Mori et al., 2006). Porém, nestes clones não houve modificação da expressão de EgrCDPK26 após o tratamento, ao contrário dos demais genes. Em eucalipto, a família CDPK tem 40 membros, possivelmente outro gene desta família atue neste processo.
Recentemente, foram publicadas informações sobre a família SnRK em eucalipto (Xiong et al., 2013; Wang et al., 2019b). Esta família de QP tem sido estudada principalmente pela sua relação com metabolismo de carbono, balanço energético e resposta a estresses. Wang et al. (2019b) desenvolveram um estudo filogenético da família SnRK, que em E. grandis se divide em 3 subfamílias, SnRK1, SnRK2 e SnRK3. A subfamília SnRK1 tem apenas dois representantes EgrSnRK1.1 e EgrSnRK1.2 que correspondem a KIN10 e KIN11. Estes genes possuem um domínio altamente conservado, são “master” reguladores de resposta ao estresse e alteram a homeostase energética, regulando o metabolismo de carbono em plantas, mamíferos e leveduras (Wang et al., 2019b). Domingues-Junior et al. (2019) verificaram a expressão dos genes KIN10B e KIN10C (KIN10/EgrSnRK1.1 e
KIN11/EgrSnRK1.2) em folhas e caules de duas espécies de eucalipto com tolerância
contrastante para o frio: E. globulus e E. grandis. Nas folhas, mais do que KIN11,
KIN10 foi ativado após exposição rápida a temperatura de 10ºC, mas o padrão diferiu
entre as espécies. Os autores sugerem que E. globulus suporta melhor a taxa de crescimento em condições de estresse por frio, ao contrário de E. grandis.
As subfamílias SnRK2 e SnRK3 são exclusivas de plantas e mais diversas do que SnRK1, e em E. grandis apresentam 8 e 24 genes, respectivamente. Estas subfamílias são mais especificamente relacionadas à resposta a estresses. Para
verificar se estes genes eram responsivos ao estresse salino, Wang et al. (2019b) analisaram a expressão deste grupo e observaram um aumento generalizado da expressão, pois 28 genes foram ativados nas folhas, 20 na raiz e 15 nos caules tratados.
1.7 PQs e lignina
Durante os diversos tipos de estresses bióticos sofridos pelas plantas há ativação de mecanismos de defesa contra patógenos. Esta sinalização é reconhecida principalmente por RLKs, localizados na membrana plasmática, que reconhecem sinais de danos secundários. Estas RLKs desencadeiam uma rápida sinalização controlada por outras PQs que, por sua vez, controlam a atividade e síntese de fatores de transcrição, enzimas, hormônios, entre outros agentes químicos que contribuem para a resistência da planta contra patógenos (Tena et al., 2011). Sabe-se que dentre os efeitos causados por estresses estão o aumento do teor de lignina (Moura et al., 2010) e, portanto, espera-se que a via de biossíntese da lignina possa ser regulada através de vias de sinalização por PQs. A seguir serão apresentados alguns trabalhos que relacionam a fosforilação de enzimas da via de biossíntese da lignina e FTs por PQs.
Cheng et al. (2001) identificou a fosforilação específica da proteína PAL de álamo pela proteína quinase AtCPK1, no entanto a função fisiológica da fosforilação nesta enzima não foi elucidada. A PAL é a primeira enzima da via de biossíntese da lignina, mas não é exclusiva, pois está relacionada ao metabolismo de fenilpropanóides como um todo.
Em pinus, foi evidenciado que o FT PtMYB4, ativador da biossíntese de lignina, é fosforilado pela PtMPK6. O sítio de fosforilação de PtMYB4, reconhecido por esta MPK, localiza-se no domínio de ativação deste FT que também é encontrado em outros MYBs relacionados à lignina (Morse et al., 2009). Além disso, outras famílias de FTs tais como bZIPs, AP2/EREBP, homeobox e WRKY, possuem um grande número de membros que são fosforilados, como mostrado em ensaios de microarranjo em A. thaliana (Popescu et al., 2009).
Wang et al. (2015) demonstraram por análises de fosfoproteômica em álamo, que algumas proteínas atuantes na via de biossíntese da lignina apresentavam sítios de fosforilação nos peptídeos analisados: PtrPAL1, PtrPAL4, PtrPAL5, PtrAldOMT2, PtrLIM1, PtrLIM2, PtrSND2/3-B1 e PtrSND2/3-B2. Foi comprovada a
fosforilação da enzima PtrAldOMT2, uma O-metiltransferase, que resulta na inibição de sua atividade durante a lignificação do xilema em diferenciação, porém a PQ não foi identificada.
Uma vez que vários trabalhos mostram a indução da biossíntese da lignina por estresses, parece plausível admitir que genes controladores – fatores de transcrição - ou mesmo genes da biossíntese da lignina possam ter sua expressão afetada por mudanças pós-traducionais, como fosforilação. Paralelamente, vem sendo documentado o papel de PQs da família MPK como mediadoras de cascatas de sinalização, ativando respostas a estresses bióticos e abióticos, com consequente alteração na deposição da lignina (Kishi-Kaboshi et al., 2010; Tena et al., 2011) e também o envolvimento de fatores de transcrição MYB em resposta a diversos tipos de estresses (Morse et al., 2009; Persak & Pitzschke, 2013).
Sabemos que o tratamento por tensão da madeira implica em reprogramação do xilema nos caules de eucalipto, e consequentemente, altera o padrão e a regulação da via de biossíntese da lignina. Utilizando este modelo verificamos o padrão de expressão de genes da via da lignina, os reguladores que são alterados em resposta a dobra do caule e as quinases que potencialmente podem atuar na regulação desta via em eucalipto.
2 OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi gerar dados que revelem, em eucalipto, a relação entre genes e fatores de transcrição da biossíntese da lignina e PQs, evidenciando um novo nível de controle no acúmulo desse polímero da parede celular.
Como objetivos específicos, verificou-se 1) quais modificações no padrão de lignificação que ocorrem em decorrência do tensionamento nos caules dobrados das espécies E. camaldulensis, E. pellita, E. grandis e E. globulus, tanto do lado tensionado quanto do lado oposto à tensão; 2) as mudanças anatômicas em resposta ao tratamento; 3) genes da via de biossíntese da lignina, fatores de transcrição e proteínas quinases diferencialmente expressos por RNAseq durante o tratamento de tensionamento do caule em E. grandis e E. globulus; 4) a identificação das proteínas expressas nos caules tratados de E. grandis.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Metodologia do tratamento
Antes de iniciar os experimentos definitivos realizamos experimentos preliminares para verificar a efetividade da dobra dos caules. Utilizamos duas formas de dobrar o caule: 1) dobra por arqueamento com barbante e 2) dobra com haste de metal. Para a dobra do caule por barbante amarramos o barbante na base do caule e no topo da planta, arqueando o caule; e por haste de metal (arame revestido com plástico) que era dobrada a 30° e fixada no caule (figura 6A e 6B). Neste caso, a região do caule que seria curvada foi determinada pela medida do caule, dividindo-o em três partes iguais, sendo o terço superior dobrado (Foston et al., 2011). Após verificar que não seria possível a padronização da dobra utilizando o barbante, seguimos com os experimentos avaliativos utilizando apenas haste de metal.
3.2 Delineamento experimental
Experimento preliminar do tratamento de indução de lignina e duração: este experimento avaliou por quanto tempo seria necessário que os caules permanecessem dobrados para que houvesse aumento da lignificação, utilizando hastes de metal para dobrar os caules das plantas. As espécies utilizadas neste experimento foram E. globulus e E. grandis com 8 meses de idade (tabela 1 -Experimentos I e II), com 3 repetições biológicas, sendo que no grupo controle havia 3 plantas e no grupo tratamento (caule dobrado) 12 plantas. A coleta do grupo controle foi realizada apenas na 4ª semana, enquanto o grupo tratamento era coletado semanalmente (2ª à 4ª semana). Os caules tratados eram seccionados com uma lâmina de metal no centro da medula (detalhe da figura 6C) e subdivididos em dois: o lado superior do caule que sofreu tensionamento foi nomeado de TW (madeira tensionada) e o lado oposto foi nomeado de OW (madeira oposta), o comprimento coletado foi variável, pois dependia da visualização do espessamento do córtex. O grupo controle foi coletado em uma região similar, mas com comprimento de 5 cm.
Após a coleta o material vegetal foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em ultrafreezer até a maceração e análise de lignina por ácido tioglicólico (TGA). As amostras para corte histológico foram fixadas em FAA 50% (formaldeído, ácido acético e etanol) para posterior análise por floroglucinol.
Figura 6: Representação do experimento definitivo de dobra do caule. Em A, a planta de eucalipto está dobrada com a haste fixada, em B, a haste dobrada a 30°. Em C estão esquematizados dois eucaliptos: em 1 a planta ereta (controle) e em 2 a planta dobrada no terço superior. A planta 2 teve o caule separado por uma lâmina de aço na coleta, dividindo-a em duas partes: a parte superior corresponde a TW (madeira de tensão) e a parte inferior a OW (madeira oposta).
Experimentos definitivos: os experimentos definitivos utilizaram a metodologia de dobra por haste de metal. Devido ao baixo rendimento de material foram realizados mais de um experimento para algumas espécies, os experimentos (III, IV e V) e as análises estão descritas na tabela 1. A duração do tratamento em todos os experimentos definitivos foi de quatro semanas, houve variação na época de
coleta e idade das plantas para algumas espécies que serão especificadas na descrição dos experimentos.
As sementes das espécies E. camaldulensis, E. pellita, E. globulus e E.
grandis foram adquiridas da firma de Sementes Caiçara (http://www.sementescaicara.com/base.asp), que são produzidas em jardins clonais, e plantadas em vasos de 2 L com terra e vermiculita na proporção de 1:1, v/v. As plantas foram mantidas em casa de vegetação durante todo crescimento e duração dos experimentos.
Foram utilizadas 48 plantas de cada espécie para os experimentos III e IV:
E. camaldulensis, E. pellita, E. globulus e E. grandis com idade entre 6-8 meses. Os
grupos, controle e tratamento eram formados por quatro repetições biológicas, compostos por 4 plantas no controle e 8 plantas no tratamento (caules dobrados), totalizando 16 e 32 plantas por espécie. Para as espécies E. globulus e E. grandis foi realizado um experimento adicional (Experimento IV), nas mesmas condições descritas acima.
As coletas foram sempre no período da manhã e o procedimento foi o mesmo descrito para os experimentos preliminares. Os caules tratados eram seccionados e subdivididos em dois: TW e OW, o comprimento coletado foi variável, pois dependia da visualização do espessamento do xilema. O grupo controle foi coletado em uma região similar, mas com comprimento de 5 cm. Após a coleta, o material vegetal foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em ultra freezer até a maceração.
No experimento III (E. camaldulensis, E. pellita, E. globulus e E. grandis) foram feitas as seguintes análises: dosagem de lignina TGA, Klason, razão S/G e lignina solúvel. As amostras para análises de histoquímica (floroglucinol e Mäule) foram fixadas em FAA 50% (formaldeído, ácido acético e etanol). No experimento III as espécies E. camaldulensis, E. pellita e E. globulus foram coletadas em outubro/2014, e E. grandis foi coletada em dezembro/2014.
No experimento IV (E. globulus e E. grandis), foram realizadas as análises de sequenciamento de RNA e expressão gênica por qRT-PCR. A espécie E. globulus foi coletada em janeiro/2015 e E. grandis em março/2015.
Para a análise de proteômica de E. grandis foram utilizadas 30 plantas com 18 meses de idade (tabela 1 – Experimento V). Não houve grupo controle, todas as
plantas foram submetidas ao tratamento de dobra do caule e separadas em três repetições biológicas, contendo 10 plantas cada. Seguimos o mesmo procedimento para coleta e armazenamento do caule seccionado. A coleta foi realizada em abril/2016.
O estágio de desenvolvimento das plantas era similar. A idade de 8 meses para E. grandis foi estabelecida para que o caule atingisse o diâmetro aproximado das demais espécies. A duração do tratamento manteve-se em 4 semanas em todos os experimentos e apenas para a análise de proteômica a idade das plantas foi de 18 meses.
submetidas ao tratamento e suas respectivas análises.
Experimento Espécies Data de
plantio
Data de
coleta Idade Análises
I E. globulus 06/2013 03/2014 8 meses Dosagem de lignina TGA e histoquímica (floroglucinol)
II E. grandis 06/2013 03/2014 8 meses Dosagem de lignina TGA e histoquímica (floroglucinol)
III E. camaldulensis 03/2014 10/2014 6 meses Dosagem de lignina TGA, Klason, razão S/G, lignina solúvel e histoquímica (floroglucinol e Mäule)
III E. pellita 03/2014 10/2014 6 meses Dosagem de lignina TGA, Klason, razão S/G, lignina solúvel e
histoquímica (floroglucinol e Mäule)
III E. globulus 03/2014 10/2014 6 meses Dosagem de lignina TGA, Klason, razão S/G, lignina solúvel e histoquímica (floroglucinol e Mäule)
III E. grandis 03/2014 12/2014 8 meses Dosagem de lignina TGA, Klason, razão S/G, lignina solúvel e
histoquímica (floroglucinol e Mäule)
IV E. globulus 06/2014 01/2015 6 meses Sequenciamento de RNA e análise por qRT-PCR.
IV E. grandis 06/2014 03/2015 8 meses Sequenciamento de RNA
3.3 Esquema dos experimentos
Para facilitar o entendimento sobre quais foram os experimentos desenvolvidos em cada uma das espécies de eucalipto representamos todas as análises na figura 7.
Figura 7: Representação dos experimentos definitivos e espécies analisadas. Em A, espécies analisadas no experimento III para dosagem de lignina KL, razão S/G e histoquímica: E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis e E. pellita; em B, espécies analisadas no experimento IV para RNAseq e agrupamento hierárquico: E. globulus e
A
E. grandis; em C: a espécie analisada no experimento IV para expressão gênica por
qRT-PCR: E. globulus; e em D, a espécie analisada no experimento V para proteômica: E. grandis.
3.4 Análises Histoquímicas
Os caules controles e os dobrados foram seccionados transversalmente com espessura aproximada de 30 µm, a mão livre com lâminas para navalha, e corados com reagentes específicos (floroglucinol e reagente de Maüle) para evidenciar a lignificação.
As secções mais delgadas foram dispostas em lâminas e coradas com solução de floroglucinol (1%) durante 2 min e em seguida adicionou-se gotas de 25% HCl (Johansen, 1940). Nesta técnica a lignina é indicada pela coloração vermelha-violeta.
Para a coloração com reagente de Mäule, as secções permaneceram por 2 min em solução de KMnO4 0,5%; em seguida foram lavadas com água destilada,
descoloridas com 4N HCl por 1 min, lavadas com água destilada novamente e adicionadas gotas da solução concentrada de NH4OH (Chapple et al., 1992). Este
reagente diferencia as unidades Siringil (S) no tecido - coloração vermelha - e as unidades Guaiacil (G) - coloração marrom.
A visualização do material foi realizada em microscópio óptico Olympus BX51 e as capturas das imagens foram feitas com a câmera Olympus DP71.
3.5 Dosagem de lignina
3.5.1 Ácido Tioglicólico (TGA)
A dosagem de lignina pelo método do Ácido Tioglicólico foi realizada de acordo com Barber & Ride (1988), nas espécies E. globulus e E. grandis do experimento avaliativo. Lavou-se aproximadamente 100 mg das amostras previamente maceradas em nitrogênio líquido, com 1,5 mL de etanol 80% (três vezes) e logo após com água deionizada. A mistura foi centrifugada a 12.000 rpm durante 15 min e o precipitado foi colocado em estufa “overnight” a 65°C. Deste resíduo seco foram retirados 150 mg, os quais foram homogeneizados com 1 mL de HCl 2N (1:10, v/v) e 0,2 mL de ácido tioglicólico a 98%. O tubo com o resíduo homogeneizado na solução foi mantido em banho-maria (100ºC) por 4 h, e em seguida, o tubo foi resfriado em gelo e colocado em câmara fria a 4ºC durante 10 min; em seguida centrifugado a
12.000 rpm por 10 min, e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado com 1,5 mL de água destilada e centrifugado novamente a 12.000 rpm por 10 min, descartando-se o sobrenadante e solubilizando o precipitado em 1,5 mL de NaOH 0,5N. Esta solução foi mantida “overnight” sob agitação a 150 rpm na temperatura ambiente, para depois ser centrifugada a 10.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foi adicionado 200 μL de HCL concentrado e o tubo foi levado para uma câmara fria, onde permaneceu 4 h. Foi realizada uma última centrifugação a 10.000 rpm por 10 min, descartando-se o sobrenadante e solubilizando-se o precipitado em 2 mL de NaOH 0,5N. A lignina obtida por ácido tioglicólico (TGA) teve sua absorbância lida em 280 nm, utilizando-se lignin, alkali, 2-hydroxypropyl ether (Sigma-Aldrich) na construção da reta padrão.
3.5.2 Lignina Klason (KL)
A dosagem de lignina pelo método de Klason das espécies E.
camaldulensis, E. pellita, E. globulus e E. grandis do experimento III, seguiu o
protocolo de Rogers et al. (2005a). As amostras foram maceradas com nitrogênio líquido e liofilizadas, lavou-se o material triturado com acetona em Soxhlet por 8 h. Após a extração a acetona foi evaporada sob o fluxo de ar em capela.
Em tubos de ensaio, foi utilizado 200 g do material seco e adicionou-se 3 mL H2SO4 a 72%, que foram homogeneizados em vortex e mantidos a 20ºC por 2 h,
sendo agitados por 1 min a cada 10 min. Em seguida, o conteúdo de cada frasco foi transferido para tubos de 125 mL, utilizando-se 112 mL de água Milli-Q para lavagem dos resíduos dos tubos de reação. Os tubos de 125 mL contendo as amostras foram selados e autoclavados a 121ºC por 60 min. As amostras foram resfriadas no ambiente e os hidrolisados foram filtrados à vácuo em filtro de vidro (filtros secos em estufa a 105ºC e pré-pesados), lavando-se com 200 mL de água Milli-Q pré-aquecida a aproximadamente 50ºC, para remover resíduos do ácido e de açúcares. Os filtros utilizados foram novamente secos em estufa a 105ºC e pesados. A lignina Klason (lignina insolúvel em ácido) foi determinada gravimetricamente a partir da diferença do peso final do filtro com seu peso inicial. O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado a partir da absorbância em 205 nm.
A razão S/G e a análise de monômeros e oligômeros de lignina solúvel das espécies E. camaldulensis, E. pellita, E. globulus e E. grandis do experimento III, foram analisadas pelos métodos a seguir.
3.6 Razão S/G
Inicialmente, 100 mg de material macerado com nitrogênio líquido e liofilizado foram hidrolisados com 2 mL de solução a 4M de NaOH, aquecidos a 95ºC durante 24 h. Após o resfriamento das amostras, foram acidificadas com 1,6 mL de 6M HCl, seguido de centrifugação a 13.000 rpm por 5 min. Foram coletados 500 µL do sobrenadante e extraiu-se duas vezes com 1 mL de acetato de etila. O solvente foi seco sob fluxo de gás nitrogênio e o resíduo foi solubilizado em 1 mL de água Mili-Q. As amostras foram analisadas por UPLC-MS, de acordo com as especificações de Mokochinski et al. (2015).
3.7 Análise de monômeros e oligômeros de lignina solúvel
A extração utilizou 100 mg de material liofilizado e macerado com nitrogênio líquido. Foram adicionados 700 µL de etanol 80 % e extraído em banho de ultrassom por 30 min. Após centrifugação por 10 min a 12.000 rpm, o sobrenadante foi coletado e evaporado em concentrador SpeedVac (Savant). O resíduo seco obtido foi dissolvido em 300 µL de água Milli-Q e 300 µL de acetato de etila. A fase superior (orgânica) contendo as ligninas solúveis foi coletada, seca em SpeedVac e o resíduo resultante foi solubilizado em solução de acetonitrila/água (1:2). Os compostos analisados por espectrometria líquida de massas (UPLC-MS/MS - Acquity Waters) de acordo com Kiyota et al. (2012). A identificação dos monômeros e oligômeros foi realizada pelo Dr. Eduardo Kiyota (Lafimp-Unicamp/IB) por comparação com dados de uma biblioteca local de estruturas de ligninas sintéticas produzidas no laboratório. O tempo de retenção, a razão massa-carga (m/z) e o padrão de fragmentação MS/MS dos compostos foram utilizados como parâmetros para a identificação destes compostos (Kiyota et al., 2012).
3.8 Expressão gênica por RNAseq de E. globulus e E. grandis
A seguir serão detalhados os métodos de extração de RNA dos caules das espécies E. grandis e E. globulus (Experimento IV) previamente macerados com nitrogênio líquido, os quais foram analisadas por RNAseq e expressão gênica por qRT-PCR (apenas em E. globulus).
A extração de RNA total foi realizada de acordo com Chang et al. (1993), com modificações (Sassaki, 2008). Inicialmente, aqueceu-se a 65°C o volume de 750 μL de tampão de extração e acrescentou-se 15 μL de beta-mercaptoetanol em cada
tubo. Cerca de 100 mg de amostra macerada em nitrogênio líquido foi colocada no tubo, agitados em vortex e mantidos a 65ºC por 10 min; após resfriar em temperatura ambiente adicionou-se 750 μL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1, v/v), sob agitação por 2 min. Foi realizada uma centrifugação a 12.000 rpm por 10 min a 4°C, coletou-se o sobrenadante e adicionou-se um volume de 5M LiCl, agitando o tubo por inversão. As amostras foram mantidas a 4°C, por 3 h para precipitação do RNA. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 30 min em temperatura ambiente, descartou-se o sobrenadante e dissolveu o “pellet” (RNA) em 200 μL de tampão TE-SDS 1%, 100 μL NaCl 5M e 300 μL de isopropanol. A amostra foi mantida a -20ºC durante 1 h e centrifugada a 12.000 rpm por 20 min na temperatura de 4ºC. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol 70% e fez-se uma nova centrifugação a 12.000 rpm por 5 min a 4ºC, o pellet secou na capela em temperatura ambiente e foi solubilizado em 20 μL de água tratada com dietilpirocarbonato (água DEPC). A quantificação da concentração de RNA de cada amostra foi verificada com o equipamento Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Para a degradação do DNA residual presente nas amostras de RNA extraídas foi utilizada DNAse (RQ1, RNAse-Free DNAse) da Promega. A qualidade do RNA foi aferida por eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) contendo brometo de etídio e visualizado sob luz UV no fotodocumentador Gel Doc 2000 (BIO RAD®).
O sequenciamento de nova geração do transcriptoma (RNAseq) em E.
globulus e E. grandis foram realizadas no Laboratório Central de Tecnologias de Alto
Desempenho em Ciências da Vida – Unicamp (LaCTAD).
Foram enviados 4 µg de RNA total das amostras extraídas ao LaCTAD, que as submeteu inicialmente a teste de controle de qualidade antes do processo de preparação das 18 amostras, sendo duas espécies, com um grupo controle e dois grupos de tratamentos (TW e OW) e três repetições biológicas. O controle de qualidade das amostras consiste em verificar a pureza e integridade do RNA pelo equipamento Bioanalyser 2100 da Agilent que fornece um valor de RIN > 8 (Schroeder et al., 2006).
A construção das bibliotecas de RNAseq (100 paired-end) seguiu as especificações do kit TruSeq RNA Sample Preparation (Illumina), que consiste em fragmentação por enzimas, ligação de adaptadores as regiões terminais e enriquecimento por PCR. Estes fragmentos de cadeia simples foram depositados na
superfície da flow cell, que contém adaptadores complementares, onde estes se ligam, e inicia-se a amplificação em ponte para formar fragmentos de cadeia dupla. Ocorrem desnaturação, formação de fragmentos de cadeias simples e amplificação. Finalizada a amplificação dos fragmentos, as amostras foram analisadas no sequenciador HiSeq 2500 (Illumina) onde há a captação dos nucleotídeos marcados por fluorescência.
3.8.1 Análise dos dados de RNAseq
Os dados gerados no sequenciamento foram analisados pelo Prof. Dr. Renato Vicentini - IB/Unicamp. Os dados brutos gerados no sequenciamento foram analisados no programa NGS QC Toolkit (Patel & Jain, 2012). Para assegurar a qualidade dos dados, sequências com baixa qualidade foram removidas, dentro deste grupo havia sequências menores de 70pb, reads com baixa qualidade de índice Phred Q ≤ 20 e bases ambíguas.
O transcriptoma de E. globulus, previamente montado pelo nosso grupo com a abordagem de montagem de novo, foi usado como referência para obter as sequências de transcritos (Araújo et al., 2018). O tratamento destes dados utilizou o conjunto de programas Velvet/Oases (Zerbino & Birney, 2008; Schulz et al., 2012), com comprimento de hash = 47, resultando em um conjunto de 89.213 transcritos em
E. globulus. Os conjuntos de dados de E. grandis foram combinados com o genoma
de referência (Myburg et al., 2014) e os reads trimados foram montados no programa Trinity (Grabherr et al., 2011) com parâmetros padrões, resultando em um conjunto de 291.328 transcritos.
Para identificação dos transcritos, os “reads” das 18 bibliotecas formadas foram mapeados contra montagens de referência usando o software Bowtie (Langmead et al., 2009). Os arquivos BAM (Binary Alignment/Map) gerados no alinhamento tiveram os níveis de abundância de transcritos estimados para cada biblioteca usando o software RSEM – RNA-Seq by Expectation Maximization (Li & Dewey, 2011). Na análise de expressão diferencial foi usado o Pacote DESeq 2 (Love
et al., 2014), nesta etapa apenas a isoforma principal de cada transcrito foi
considerada, deste modo, o conjunto de transcritos passou a ser de 70.398 em E.
globulus e 194.843 em E. grandis. Nesta análise os genes diferencialmente expressos
tiveram a expressão comparada entre os tratamentos e controle, par a par. Os grupos de comparações formados analisados para cada espécie separadamente foram: TW
x C, OW x C e TW x OW. As sequências montadas foram identificadas usando o genoma de E. grandis (Myburg et al., 2014) e para anotação funcional o software Blast2GO (Götz et al., 2008) com parâmetros padrões.
Dentre o conjunto de dados gerados pelo sequenciamento, selecionamos para análise de expressão diferencial os grupos gênicos das enzimas da via de biossíntese da lignina, fatores de transcrição e grupos de quinases não receptoras, NDPK e WAK (wall cell kinase).
Para a construção dos agrupamentos hierárquicos, genes com valores de FPKM (fragmentos por quilo bases de éxons por milhões de fragmentos mapeados) < 8 foram excluídos da análise, por apresentarem FPKM menor do que o gene C3’H4 da via de biossíntese da lignina, o gene menos expresso da via em nossas análises.
Após análise dos gráficos de plotagem e de vulcão que mostram os transcritos diferencialmente expressos de forma global para todos os transcritos analisados por comparações (figura S1), consideramos os resultados com maiores alterações de expressão gênica na espécie E. globulus a comparação TW x OW e na espécie E. grandis a comparação TW x C. Os valores de fold change > 0,4 (em destaque na tabela S1 – anexo I) foram considerados significativos quando o mesmo padrão de expressão era confirmado em outra comparação
Após o refinamento dos dados de expressão, as tabelas de comparações com os valores de fold change foram inseridas para análises de agrupamento hierárquico (HCL) no programa MeV (Multiple Experiment Viewer) versão 4.9.0 com distância métrica por correlação de Pearson. As árvores HCL resultantes são apresentadas como mapa de calor (heatmap) no anexo II para cada família de genes, exceto os genes da via da lignina que estão agrupados em uma mesma árvore.
Para relacionar as quinases potencialmente envolvidas na via de biossíntese da lignina, submetemos os dados de expressão de E. globulus e E.
grandis à correlação de Pearson. Os resultados das correlações positivas (+1) e
significativas (p<0,05) que relacionam os genes da via de biossíntese da lignina com quinases estão apresentados na tabela S2 (anexo I).
3.9 Análise de expressão gênica por qRT-PCR
As amostras de RNA de E. globulus (Experimento IV) foram extraídas como descrito no item 3.8. Para sintetizar a primeira fita de cDNA, utilizou-se o kit RevertAid Fisrt Strand cDNA Synthesis (Thermo), conforme as instruções dos fabricantes.
Construção de primers
Os pares de “primers” foram obtidos utilizando o programa Primer3 na plataforma do NCBI, com parâmetros padrões (Ye et al., 2012). As melhores combinações, após a verificação de formação das estruturas secundárias, foram escolhidas com o programa GeneRunner (Ramakers et al., 2003). Foram desenhados 28 pares de primes (tabela S3 – anexo I) para os genes de quinases e genes da via de biossíntese da lignina. Os genes de referência foram escolhidos de acordo com Moura et al. (2012), dentre as opções citadas foram escolhidos três para os testes
IDH, SAND e GAPDH. As análises de expressão gênica e validação dos resultados
do RNAseq são detalhadas a seguir.
As reações de qPCR foram feitas utilizando-se o aparelho StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). O volume final das reações foi de 10 μL e utilizou-se o kit de reações QuantiFastTM SYBR Green – PCR Mix (Qiagen). A
programação da temperatura foi: 95°C por 3 min, seguidos por 40 ciclos de 95°C por 10 s, 60°C por 30 s e uma etapa final de 71 ciclos de 60°C/95°C por 30 s. As reações foram feitas com 4 repetições biológicas e, para cada réplica biológica, foram feitas triplicatas técnicas. Também foram feitas triplicatas de reações controle, livres de DNA. Os cálculos do nível de expressão usaram (2^-ΔΔCt) conforme proposto por
Livak & Schmittgen (2001). Utilizou-se o módulo de expressão normalizada, no qual os dados de expressão do gene alvo são normalizados com relação à expressão de genes de referência. Os genes de referência utilizados foram escolhidos após o teste no programa geNorm dentro do Software Expression Suite v1.0.3 (Applied Biosystems). Foram escolhidos como mais estáveis os primers IDH e SAND.
3.10 Proteômica
As análises de proteômica foram realizadas na espécie E. grandis do experimento V, conforme descrito nos próximos itens.
3.10.1 Extração
A extração das proteínas do caule de E. grandis baseou-se no protocolo proposto por Hurkman & Tanaka (1986), com modificações. Os caules foram macerados em nitrogênio líquido e 2 g do tecido transferido para tubos de 50 mL. A amostra foi homogeneizada com 15 mL de tampão de extração (0,5 M Tris-HCl, 0,1 M KCl, 0,05M EDTA, 0,7 M sacarose e 2 mM PMSF), 2 % v/v β-mercaptoetanol e 1 %
p/v PVPP. Os tubos foram mantidos no gelo por 30 min em agitador orbital (120 rpm). Em seguida adicionado 15 mL de fenol equilibrado em 10 mM de Tris-HCl (pH = 8) e os tubos mantidos por mais 30 min no agitador. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 30 min a temperatura de 4ºC; o sobrenadante foi recuperado, transferido para um novo tubo e 15 mL de tampão de extração e 1 % p/v PVPP foi adicionado. As amostras foram homogeneizadas no agitador orbital por 30 min. Os tubos foram novamente centrifugados, o sobrenadante recuperado e transferido para um novo tubo junto ao tampão de extração. Repetimos a homogeneização, centrifugação e coleta do sobrenadante. Transferimos o sobrenadante para dois novos tubos, nos quais foram adicionados 5 volumes do tampão de precipitação gelado (0,1 M de acetato de amônio em 100 % metanol), em seguida foram mantidos por 12 h a temperatura de -20ºC. O conteúdo dos tubos, correspondentes a mesma amostra, foram reunidos em um único tubo para a centrifugação (13.500 rpm) durante 40 min, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram adicionados 30 mL de tampão de lavagem I (0,1 M de acetato de amônio em 100 % metanol), as amostras permaneceram durante 2 h, a -20ºC e em seguida, foram centrifugadas (13.500 rpm) por 40 min, a 4ºC. Repetimos este processo e adicionamos ao sedimento, após descarte do sobrenadante, o tampão de lavagem II (100 % acetona gelada), mantivemos a amostra por 2 h no freezer (-20ºC). Os tubos foram centrifugados (13.500 rpm) por 40 min e o sobrenadante descartado, os pellets secaram dentro de um pote com sílica na geladeira a 4ºC “overnight”.
Aos pellets foram adicionados 1 mL de tampão de solubilização (7 M uréia, 2 M tiouréia, 10 mM DTT e 0,01 % p/v Triton X-100), homogeneizados com a pipeta. Após a solubilização no tampão, as amostras foram centrifugadas (13.500 rpm) por 15 min, a 6ºC.
3.10.2 Dessalinização
O sobrenadante recuperado das amostras foi dessalinizado em bicarbonato de amônio 50 mM pH 8,5 com auxílio de colunas Amicon®Ultra-15 3K (Millipore), de acordo com o protocolo do fabricante.
3.10.3 Quantificação
A quantificação seguiu o protocolo de Bradford (1976). Alíquotas de 10 µL de amostra dessalinizada foram misturadas a 200 µL de solução de Bradford (1:4
