As análises de proteômica foram realizadas na espécie E. grandis do experimento V, conforme descrito nos próximos itens.
3.10.1 Extração
A extração das proteínas do caule de E. grandis baseou-se no protocolo proposto por Hurkman & Tanaka (1986), com modificações. Os caules foram macerados em nitrogênio líquido e 2 g do tecido transferido para tubos de 50 mL. A amostra foi homogeneizada com 15 mL de tampão de extração (0,5 M Tris-HCl, 0,1 M KCl, 0,05M EDTA, 0,7 M sacarose e 2 mM PMSF), 2 % v/v β-mercaptoetanol e 1 %
p/v PVPP. Os tubos foram mantidos no gelo por 30 min em agitador orbital (120 rpm). Em seguida adicionado 15 mL de fenol equilibrado em 10 mM de Tris-HCl (pH = 8) e os tubos mantidos por mais 30 min no agitador. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 30 min a temperatura de 4ºC; o sobrenadante foi recuperado, transferido para um novo tubo e 15 mL de tampão de extração e 1 % p/v PVPP foi adicionado. As amostras foram homogeneizadas no agitador orbital por 30 min. Os tubos foram novamente centrifugados, o sobrenadante recuperado e transferido para um novo tubo junto ao tampão de extração. Repetimos a homogeneização, centrifugação e coleta do sobrenadante. Transferimos o sobrenadante para dois novos tubos, nos quais foram adicionados 5 volumes do tampão de precipitação gelado (0,1 M de acetato de amônio em 100 % metanol), em seguida foram mantidos por 12 h a temperatura de -20ºC. O conteúdo dos tubos, correspondentes a mesma amostra, foram reunidos em um único tubo para a centrifugação (13.500 rpm) durante 40 min, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram adicionados 30 mL de tampão de lavagem I (0,1 M de acetato de amônio em 100 % metanol), as amostras permaneceram durante 2 h, a -20ºC e em seguida, foram centrifugadas (13.500 rpm) por 40 min, a 4ºC. Repetimos este processo e adicionamos ao sedimento, após descarte do sobrenadante, o tampão de lavagem II (100 % acetona gelada), mantivemos a amostra por 2 h no freezer (-20ºC). Os tubos foram centrifugados (13.500 rpm) por 40 min e o sobrenadante descartado, os pellets secaram dentro de um pote com sílica na geladeira a 4ºC “overnight”.
Aos pellets foram adicionados 1 mL de tampão de solubilização (7 M uréia, 2 M tiouréia, 10 mM DTT e 0,01 % p/v Triton X-100), homogeneizados com a pipeta. Após a solubilização no tampão, as amostras foram centrifugadas (13.500 rpm) por 15 min, a 6ºC.
3.10.2 Dessalinização
O sobrenadante recuperado das amostras foi dessalinizado em bicarbonato de amônio 50 mM pH 8,5 com auxílio de colunas Amicon®Ultra-15 3K (Millipore), de acordo com o protocolo do fabricante.
3.10.3 Quantificação
A quantificação seguiu o protocolo de Bradford (1976). Alíquotas de 10 µL de amostra dessalinizada foram misturadas a 200 µL de solução de Bradford (1:4
diluídos em água deionizada) e mantidas em temperatura ambiente por 5 min, tendo as absorbâncias medidas a 595 nm. Os valores de concentração foram estimados por comparação a curva-padrão de BSA.
Para confirmar a quantificação das proteínas e verificar a integridade das amostras foram elaborados géis de poliacrilamida, conforme protocolo descrito em Laemmli (1970). Foram aplicados no gel 4 µg de cada amostra e diferentes concentrações do marcador Rainbow™ Marker (GE Healthcare): 2 µg, 4 µg e 6 µg. 3.10.4 Digestão
O protocolo da digestão seguiu os procedimentos proposto por Murad (2011). Foram utilizadas 50 µg de proteínas nas quais foram adicionados 25 µL da solução RapiGest SF (0,2 %); as amostras foram mantidas em banho seco por 15 min a 80 ºC. Seguido de centrifugação (pulso) e adição de 2,5 µL de ditiotreitol (100 mM). Após agitação em vortex, os tubos foram mantidos durante 30 min a 60 ºC, e posteriormente deixados em temperatura ambiente seguido de centrifugação (pulso). Adicionamos 2,5 µL de iodoacetamida (300 mM) às amostras, que permaneceram no escuro durante 30 min, para alquilação das cisteínas. Para a digestão, adicionamos nas amostras 10 µL de solução de tripsina (Promega) e 50 mM de bicarbonato de amônio. Após a agitação em vortex as amostras foram mantidas a 37ºC durante 16 h, a proporção enzima: proteína foi de 1:10. Após a digestão, foram adicionados 10 µL de TFA a 5 % (v/v) e agitados em vortex, para hidrolisar o RapiGest SF. As amostras ficaram incubadas a 37ºC durante 90 min e em seguida centrifugadas (15.000 rpm) durante 30 min, a 6 ºC. O sobrenadante foi transferido para novos tubos os quais foram colocados no “speed-vac” até que secassem completamente.
3.10.5 Purificação
As amostras foram solubilizadas em 1 mL de solução 0,4% de ácido trifluoroacético (TFA) e purificadas em colunas de fase reversa Supelclean™ ENVI™18 SPE Tube (500 mg, 3 mL). Os peptídeos foram eluídos em solução de 0,5% de TFA em 50% de acetonitrila, e foram novamente secos em “speed-vac”.
3.10.6 Análise por espectrometria de massas
As amostras foram enviadas para o Laboratório de Neuroproteômica (LNP) do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual IB/Unicamp sob supervisão do Prof. Dr. Daniel Martins-de-Souza. As análises de espectrometria de massas seguiram
o protocolo descrito em Saia-Cereda et al. (2016); foram realizadas no equipamento Synapt G2-Si HDMS (Waters) por método de aquisição dependente de dados (DDA). O processamento dos dados utilizou o software ProteinLynx Global Server (PGLS) da Waters.
3.10.7 Identificação das proteínas
Os dados obtidos foram encaminhados para identificação das proteínas ao Laboratório de Proteômica Vegetal FCAV/UNESP – Campus de Jaboticabal pelo Prof. Dr. Tiago Santana Balbuena, que utilizou o software Proteome Discoverer (Thermo Scientific™) para as análises de dados.
Os arquivos MS/MS foram pesquisados no banco de dados do genoma de
E. grandis (obtido do banco de dados Phytozome em maio de 2017) usando os
mecanismos de busca Sequest e MS-Amanda. A correspondência segura de espectros peptídicos sugeridos - PSM (peptide-spectrum match) foram obtidas considerando um precursor máximo e tolerâncias de massa de fragmento iguais a 10 e 0,02 ppm, respectivamente. Apenas peptídeos trípticos completos foram notificados e um máximo de 2 locais de clivagem considerado. Os PSMs sugeridos foram filtrados de acordo com os seguintes critérios: XCorr mínimo de 1,5 (+1); 2 (+2); 2,25 (+3); 2,25 (+4); 3 (>= + 5), para identidades do Sequest, e uma pontuação mínima de 120, para identidades do MS-Amanda. A carbamidometilação da cisteína e a oxidação da metionina foram consideradas como possíveis modificações peptídicas. A máxima parcimônia foi usada durante a inferência de proteínas e foi adotada uma taxa máxima de falsa descoberta de 1% (FDR).
Para a quantificação da abundância das proteínas utilizamos a abordagem do NSAF (normalized spectrum abundance fator) (Florens et al., 2006). A anotação funcional (Gene Ontology - GO) das proteínas foi realizada através da ferramenta Biomart disponível no site do Phytozome, e a classificação em categorias funcionais das proteínas através do programa Mercator que classifica as categorias por MapMan- BINs (Lohse et al., 2014).