UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LAÍS LOVISON STURARO
Avaliação da plataforma de DNA microarray na
identificação de fungos patogênicos a partir de
frascos de hemocultura
CAMPINAS 2018
LAÍS LOVISON STURARO
Avaliação da plataforma de DNA microarray na
identificação de fungos patogênicos a partir de
frascos de hemocultura
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na área de concentração Clínica Médica.
ORIENTAÇÃO: Profa. Dra. Maria Luiza Moretti
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA LAÍS LOVISON STURARO, E ORIENTADA PELA PROF. DRA. MARIA LUIZA MORETTI
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
LAÍS LOVISON STURARO
ORIENTADORA: PROFa. Dra. MARIA LUIZA MORETTI
MEMBROS:
1. PROF. DR. MARIA LUIZA MORETTI
2. PROF. DR. SÍLVIA DE BARROS MAZON
3. PROF. DR. GILDA MARIA BARBARO DEL NEGRO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
À Deus por me conceder muitas graças, sabedoria e perseverança durante o preparo desse trabalho.
Aos meus pais, Ernison A. Sturaro e Maria de Lourdes L. Sturaro por todo carinho, incentivo e pelos sábios conselhos.
EPÍGRAFE
“Pobre é o discípulo que não excede seu mestre” Leonardo da Vinci
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Luiza Moretti, pela confiança depositada em mim e por todos seus ensinamentos durante essa jornada.
À Profa. Dra. Angélica Zaninelli Schreiber pela amizade, apoio e grande auxílio.
Ao Prof. Dr. Plínio Trabasso pelos conselhos, ensinamentos e amizade.
À Luzia Lyra por todo seu ensinamento, por sua valiosa contribuição durante a execução desse trabalho e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Carlos Emílio Levy por toda a sua contribuição e amizade.
À Marizete Salvadego pela grande ajuda e amizade.
À Profa. Dra. Sílvia de Barros Mazon, por toda sua amizade e ótimos conselhos.
À Eliene Ribeiro pela grande amizade e pela disposição em me ajudar em todos os momentos.
Às funcionárias, Ariane B. Lopes, Cibele Tararam, Larissa Levy e Érivan Ribeiro, do Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças Infecciosas por todos os seus ensinamentos, pelos sábios conselhos, pela paciência e pela grande amizade.
À todos meus amigos Pamella Stivanelli, Franqueline R. Lima, Sidney Ribeiro, Laís Pontes, Débora Sant Anna, Isabela Haddad, Gabriela Cavarretto e Adenilza Silva, por toda amizade, carinho, incentivo e apoio.
RESUMO
Introdução: As plataformas de DNA microarray vem sendo uma técnica
promissora para o diagnóstico rápido de vários microrganismos incluindo fungos. Objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho da técnica de DNA microarray para a identificação de fungos diretamente dos frascos de hemoculturas e comparar com as identificações obtidas pela técnica de sequenciamento e pelos métodos microbiológicos convencionais.
Metodologia: Estudo retrospectivo, descritivo e analítico desenvolvido no
período de setembro/2014 a setembro/2016. Foram estudados frascos de hemoculturas que resultaram positivos para fungos, frascos de hemoculturas com resultado negativo e frascos com crescimento bacteriano. O DNA extraído diretamente dos frascos de hemocultura foi submetido à PCR utilizando-se as regiões ITS1 e ITS4 e posteriormente à plataforma de DNA microarray e sequenciamento de DNA. A plataforma de DNA microarray continha 18 gêneros e 35 espécies fúngicas. Também foram analisados dados do prontuário médico dos pacientes que tiveram as hemoculturas incluídas no estudo. Resultados: Foram estudados 466 frascos de hemoculturas divididos em: Grupo A com 132 amostras positivas para fungos, Grupo B com 93 amostras positivas para bactérias, Subgrupo B com 209 amostras positivas para bactérias com crescimento em até 12 horas e Grupo C com 32 amostras negativas. O sequenciamento de DNA identificou 129 amostras positivas para fungos. Dois dos 12 frascos de hemocultura identificados pelas técnicas convencionais como Candida parapsilosis foram classificados como Candida orthopsilosis (Complexo psilosis) pelo sequenciamento de DNA. Não foi identificado Fusarium spp.:5 devido à ausência de material genético. A plataforma de DNA microarray identificou 118 amostras positivas para fungos, dois Fusarium solani em nível de espécie , mas não identificou C. orthopsilosis: 2, Candida pelliculosa:1, e Sacharomyces cerevisiae: 2, pois não faziam parte da composição da plataforma. Não positivaram na plataforma de DNA microarray: Candida tropicalis: 2, Candida parapsilosis: 1, Cryptococcus neoformans: 1 e Fusarium spp.: 5. Entre os controles negativos, a plataforma de DNA microarray identificou C.albicans e C. tropicalis, em um frasco de hemocultura
identificado como Staphylococcus coagulase negativa e duas Candida krusei em dois frascos de hemocultura positivos para Enterococcus faecium. Todos os resultados obtidos pela plataforma de DNA microarray foram confirmados pela técnica de sequenciamento de DNA e concordaram em 93,1% para C. tropicalis, 90% para C. parapsilosis, 95,8% para C. neoformans e 100% para as demais espécies fúngicas. Conclusão: A plataforma de DNA microarray apresentou alta concordância em relação ao sequenciamento de DNA e foi sensível na detecção do gênero Candida em frascos de hemoculturas positivas para bactérias.
ABSTRACT
Backgroud: DNA microarray has been a promising technique for the rapid diagnosis of several microorganisms including fungi. Objectives: The aim of this study was evaluate the performance of DNA microarray platform for the identification of fungal specimens direct from blood culture bottles and compare with the identification by DNA sequencing technique and conventional microbiological methods. Methods: Retrospective, descriptive and analytical study was performed from September/2014 to September/2016. Blood cultures bottles were studied for positive for fungi growth, blood culture bottles with negative growth for microorganisms and bottles with bacterial growth. The DNA samples extracted directly from blood culture bottles were subjected to PCR using ITS1 and ITS4 regions and afterward to DNA microarray platform and DNA sequencing. The DNA microarray platform containeds 18 genera and 35 fungi species. Medical records data were analyzed of patients who had blood cultures included in the study. Results: 466 blood cultures bottles were separated in: A group with 132 positive samples for fungi, B group with 93 positive samples for bacteria, B subgroup with 209 positive samples for bacteria to growth in 12 hours and C group with 32 negative samples. The DNA sequencing identified 129 positive samples for fungi. Two of 12 blood culture bottles identified by conventional techniques such as C.parapsilosis were classified as C. orthopsilosis (C. parapsilosis complex) by DNA sequencing. Fusarium spp.: 5 was not identified owing to absence of genetic material. The DNA microarray platform correctly identified 118 positive samples for fungi and identified at species level two F. solani. It could not identify C. orthopsilosis: 2, C. pelliculosa: 1, and S. cerevisiae: 2, which probe sequences were absent from the platform. No positivated at DNA microarray platform: C.parapsilosis: 1, C. tropicalis: 2, C. neoformans: 1 e Fusarium spp: 5. Among negative controls, DNA microarray identified one C. albicans and one C. tropicalis in a bottle that was positive for coagulase negative Staphylococus, and two C. krusei in bottles positive for E.faecium. All the results obtained by DNA microarray platform were confirmed by DNA sequencing technique and agreed on 93,1% for C. tropicalis, 90% for C. parapsilosis, 95,8% for C. neoformans and 100% for other fungal species.
Conclusion: The DNA microarray platform showed high concordance
between DNA sequencing and was sensitive in the detection of Candida genera in bottles positive blood cultures for bacteria.
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Página
Figura 1. Esquematização dos procedimentos para a identificação da hemocultura positivapelos métodos clássicos e plataforma de DNA microarray... ...31
Figura 2. A) equipamento BacT/ALERT ILMY (Becton Dickinson, New Jersey, USA), B)
Frascos de hemocultura estudados: BacT/Alert ® FA - Anaeróbios, BacT/Alert ® SA -
Aeróbios, BacT/Alert ® PF - Pediátrico, BacT/Alert ® MB – Micobactérias, e BacT/Alert ® SN – Anaeróbios. ... 36
Figura 3. A) Equipamento BD BACTEC TM FX (Becton Dickinson, New Jersey, USA). B)
frascos de hemocultura utilizados foram: BD BACTEC TM Plus Anaerobic/F Culture Vials, BD
BACTEC TM Plus Aerobic/ F Culture Vials e BD BACTEC TM Peds PlusTM/F Culture Vials. .. 37
Figura 4. Esquema representativo da extração de DNA das amostras clínicas e a extração
de DNA da cultura de Fusarium spp.. ... 40
Figura 5. Esquema representativo das etapas realizadas na técnica de sequenciamento de
DNA...41
Figura 6. Esquema representativo da região do DNA ribossomal fúngico amplificado. ... 42
Figura 7. Esquematização da revelação da técnica de DNA microarray. Nas lâminas foram
plotados oligonucleotídeos, os quais se ligam aos produtos de PCR biotinilados quando há complementaridade de bases. A revelação da lâmina é realizada pela adição do substrato TMB, ocorrendo a reação colorimétrica da ligação estreptavidina-biotina-peroxidase, resultando em um precipitado azul...46
Figura 8. Esquema da plataforma de DNA microarray utilizada nesse estudo. O quadrado
mostra as sondas controle positivo de região comum para várias espécies fúngicas utilizado nas reações da técnica de DNA microarray...47
Figura 9. Frascos de hemocultura incluídos no período de 2013 a 2016.... ... .48 Figura 10. Pacientes tratados com antifúngico em nosso estudo...53
Figura 11: Resultados das lâminas após a técnica de DNA microarray para identificação dos
frascos de hemocultura positivos para fungos. Nos círculos são encontrados as sondas universais para espécies fúngicas (controle positivo), nos quadrados estão a localização das sondas de espécies fúngicas específicas...58
Tabela 1: Tempo da identificação definitiva entre os métodos microbiológicos convencionais
e a realização da técnica DNA microarray...49
Tabela 2: Classificação das 132 hemoculturas positivas para fungos, segundo a
identificação microbiológica...49
Tabela 3: Caracterização geral dos pacientes incluídos no estudo...51
Tabela 4: Caracterização dos antifúngicos utilizados pelos pacientes do estudo...52
Tabela 5: Classificação dos pacientes com infecção fúngica incluídos de acordo com a
doença de base...54
Tabela 6: Classificação dos pacientes incluídos de acordo com a doença de base. ... 55 Tabela 7: Distribuição e identificação dos 132 frascos de hemoculturas positivos para
fungos comparados com a identificação microbiológica, DNA microarray e sequenciamento de DNA...57
Tabela 8: Estudos de identificação de fungos isolados a partir de diferentes amostras
clínicas pela técnica de DNA microarray...59
Tabela 9: Estudo de identificação de fungos a partir de culturas pela técnica de DNA
microarray...60
Tabela 10: Estudo de identificação de fungos a partir de hemoculturas pela técnica de DNA
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana Aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
GM Galactomanana
BDG 1,3 β-D-glucana
DNA Ácido desoxirribonucleico
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction)
ITS Internal Transcribed Spacer
NCBI National Center for Biotechnology Information RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism LAMP Loop-mediated Isothermal Amplification
RT-PCR Reação da Transcriptase Reversa (Transcriptase Chain Reaction) RNA Ácido ribonucleico
cDNA DNA complementar
qPCR PCR em tempo real (Real Time PCR)
MALDI-TOF MS
Matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight mass
spectrometer
UV Radiação ultravioleta
HC-Unicamp Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas LEMDI Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças Infecciosas LIF Laboratório de Investigação em Fungos
CAISM Centro de Atenção Integral à saúde da Mulher
M Molar
g Constante gravitacional universal
mM Milimolar
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
bio Biotinilado
ng Nanograma
V Volts
h Horas
SUMÁRIO
1. Introdução ... 18
1.2. Diagnóstico Laboratorial das Infecções Fúngicas Invasivas ... 20
1.2.1. Métodos Convencionais para a Identificação de Espécies Fúngicas ... 20
1.2.1.1. Exame microscópico direto ... 20
1.2.1.2. Cultura e identificação ... 21
1.2.1.3. Hemocultura ... 21
1.2.1.4. Testes Bioquímicos...23
1.3. Métodos não dependentes de cultura para a identificação de fungos ... 24
1.3.1. Testes Sorológicos ... 24
1.3.2. Testes Moleculares ... 26
1.3.2.1. PCR: Reação em Cadeia da Polimerase ... 26
1.3.2.3. Sequenciamento de DNA ... 27
1.3.2.3. Polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrição: Restriction Fragment Lenght Polymorphysm (RFLP) ... 28
1.3.2.4. Amplificação Circular Isotérmica: Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) ... 29
1.3.2.5. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ... 29
1.3.3. Plataforma de DNA mocroarray...30
2. Objetivos ... 33
Geral ... 33
3. Metodologia ... 34
3.1. Local de estudo ... 34
3.2. Desenho de estudo ... 34
3.3. Obtenção dos frascos de hemoculturas... 35
3.4. Extração de DNA fúngico dos frascos de Hemocultura ... 37
3.4.1. Extração de DNA das colônias de Fusarium spp. ... 39
3.5. Técnica de Sequenciamento ... 40
3.5.1. Amplificação do DNA alvo por PCR ... 41
3.5.1.2. Sequenciamento de DNA ... 42
3.5.1.3. Análise do Resultado do Sequenciamento ... 42
3.6. Reação de PCR em tempo real ... 43
3.7. Técnica de DNA microarray ... 43
a) Elaboração da plataforma de DNA microarray. ... 43
b) Amplificação do DNA alvo por PCR ... 44
c) Desnaturação e Hibridização... 44
d) Interpretação de resultados ... 47
4. Resultados ... 48
4.2. Identificação das amostras de hemoculturas pelos métodos moleculares ... 55
5. Discussão ... 59
5.1. Considerações Finais...69
6. Conclusão ... 70
8. Anexos ... 86
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP. ...86
Anexo 2: Sondas espécies específicas para fungos utilizadas na Plataforma de DNA microarray...89
Anexo 3: Tempo para realização do DNA microarray a partir do recebimento das hemoculturas positiva para fungos. ... ...95
Anexo 4: Caso Clínico 1 – C. tropicalis ... 99
Anexo 5: Caso Clínico 2 – C. albicans...100
Anexo 6: Caso Clínico 3 - C.krusei ... 101
Anexo 7: Manuscrito aceito para publicação no Journal of Clinical Microbiology...1012
1. Introdução
Micologia é a ciência que estuda os fungos – agentes de infecções conhecidas como micoses. Eles possuem distribuição mundial e são representados por espécies macroscópicas, como os cogumelos, e espécies microscópicas, como leveduras e fungos filamentosos (1,2). Ao longo do tempo foram descritas mais de 100.000 espécies de fungos e, a cada ano, são descritas aproximadamente 1500 novas. Entretanto, apenas cerca de 270 foram documentadas como causadoras de infecções em seres humanos (3,4).
As infecções fúngicas podem ser:
a) superficiais, quando estão limitadas às camadas mais externas como pele, pelos, unhas e áreas cutaneomucosas. São transmitidas geralmente pelo contato com indivíduos, animais ou mesmo solo contaminados (2); b) subcutâneas, que envolvem principalmente a derme e tecidos subcutâneos. Raramente evoluem para doença sistêmica, ocorrendo geralmente por implantação do organismo na pele através de trauma local (5);
c) sistêmicas, que são infecções de origem pulmonar que podem se disseminar para todos os órgãos ou tecidos (6). Geralmente são as mais severas para o ser humano, podendo ser endêmicas ou oportunistas (7,8). As endêmicas geralmente causam infecções nos pulmões e outros órgãos em indivíduos prioritariamente imunocompetentes, que apresentam doenças tais como a paracoccidioidomicose, histoplasmose e coccidioidomicose (7,8). Já as oportunistas comumente causam infecções que afetam indivíduos gravemente enfermos, pacientes hospitalizados em unidades de terapia intensiva, pacientes com doenças onco-hematológicas, transplantados de órgão sólido e de células tronco hematopoiéticas, entre outros (9).
As infecções fúngicas invasivas estão associadas à elevada morbimortalidade em pacientes imunodeprimidos e causam infecção em mais de 40% dos pacientes com leucemia e transplantados de células tronco hematopoiéticas, 35% dos pacientes transplantados de coração, 40% dos transplantados de fígado e cerca de 5% para transplantados de outros órgãos sólidos, incluindo transplante renal (9,10). Dentre os outros grupos de pacientes com
doenças predisponentes para o desenvolvimento de infecções fúngicas invasivas, encontram-se os pacientes portadores de infecção pelo HIV, queimados graves, em uso de antibióticos de amplo espectro e em uso de cateteres, além daqueles com longo tempo de hospitalização (9,10).
As leveduras do gênero Candida se destacam como causadoras de infecções sistêmicas ou invasivas em pacientes com doenças ou condições predisponentes. Podem ser citadas como espécies mais frequentes: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusitaniae, Candida dubliniensis, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e Candida catenulata (11,12). Elas são mais frequentemente isoladas em infecções sanguíneas, representando verdadeiras ameaças para a sobrevida dos pacientes, possuindo habilidades para colonizar, penetrar e invadir tecidos (10,12). Outros gêneros de leveduras como Hansenula sp., Rhodotorula sp. e Trichosporon sp. também podem causar quadros infecciosos sistêmicos nos pacientes imunodeprimidos (11).
Entre os fungos filamentosos, os do gênero Aspergillus são os principais causadores de infecção sistêmica em pacientes gravemente imunodeprimidos – como transplantados de medula óssea e pacientes com neutropenia severa e prolongada – destacando-se: Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus e Aspergillus niger. Sua transmissão ocorre pela inalação de conídios dispersos (11). Outros gêneros como Fusarium sp, Acremonium sp e Penicillium sp, também podem causar infecções nessa população de pacientes (11).
Estima-se que no Brasil, mais de 3.8 milhões de pessoas são afetadas por infecções fúngicas graves, incluindo portadoras de neoplasias malignas, receptores de transplantes, asmáticos, tuberculosos, infectados pelo HIV e moradores de áreas endêmicas. Porém poucas informações precisas sobre a epidemiologia das infecções fúngicas no Brasil estão disponíveis (13).
1.2. Diagnóstico Laboratorial das Infecções Fúngicas Invasivas
O diagnóstico do agente etiológico da infecção fúngica é o ponto chave para a escolha precoce e adequada da terapia antifúngica para a sobrevida do paciente (14). O diagnóstico tardio é determinante para as altas taxas de mortalidade, que variam de 30 a 80% nas infecções fúngicas invasivas (14). Os agentes fúngicos podem ser detectados e identificadas por técnicas microbiológicas convencionais, citologia, histopatologia e pelas técnicas moleculares, conforme descrito abaixo.
1.2.1. Métodos Convencionais para a Identificação de Espécies Fúngicas
A detecção e identificação fúngica convencional são baseadas principalmente na combinação de análises das características microscópicas e do crescimento do microrganismo em cultura (15).
1.2.1.1. Exame microscópico direto
A análise microscópica e o tratamento dos materiais clínicos podem variar de acordo com o seu tipo. Materiais clínicos opacos como unhas, cabelos e pele necessitam de digestão da queratina com hidróxido de potássio (KOH) a 10% para sua clarificação (15-17). A identificação também pode ser realizada por outros métodos, com o emprego das colorações:
a) Gram: como fungos são gram-positivos, são marcados de cor violeta; b) Giemsa: corante de esfregaços de escarro e pus, sendo utilizado na suspeita de Histoplasma sp;
c) Wright: utilizado para exames de medula óssea e hematológicos para identificação de Histoplasma sp e Cryptococcus sp;
d) Tinta nanquim: usado na suspeita de Cryptococcus sp (17).
O exame de microscopia direta é a metodologia mais utilizada no diagnóstico das micoses, na rotina do laboratório de micologia e na observação microscópica de espécimes fúngicas, com ou sem a utilização de diferentes tipos de corantes, leva a uma rápida detecção e possui baixo custo. No entanto, esse método
possui baixa sensibilidade e especificidade, permitindo somente uma identificação preliminar (15,17,18).
1.2.1.2. Cultura e identificação
A recuperação de fungos, em uma amostra clínica, começa a partir do meio de cultura apropriado. Os tipos de meios de cultura fúngica utilizados são: os não-seletivos, que permitem o crescimento de qualquer espécie fúngica patogênica, e os seletivos, que restringem o crescimento de microrganismos contaminantes, selecionando fungos patogênicos através da adição de antibióticos como penicilina, estreptomicina, gentamicina, cloranfenicol,ciprofloxacina e cicloheximida (16).
A identificação definitiva depende do crescimento do agente em cultura, sendo este considerado o padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial de infecções, abrangendo espécies. Apesar da importância do crescimento do fungo em cultura para o diagnóstico da infecção, o crescimento do agente não resulta em rápida turvação do meio de cultura – como ocorre com as bactérias – podendo demorar dias (ex. Aspergillus spp.), semanas (ex. Histoplasma capsulatum) ou até mesmo não ocorrer (ex. Pneumocystis jirovecii), retardando o diagnóstico e o início do tratamento, além dos problemas com o crescimento demorado para as espécies fúngicas, há possibilidade de contaminação desses meios de culturas por bactérias (10,19,20).
1.2.1.3. Hemocultura
O diagnóstico etiológico das infecções fúngicas sistêmicas é realizado pelo crescimento dos microrganismos em frascos de hemocultura (21,22). Essa técnica é baseada na utilização de diversos meios líquidos de cultura onde a amostra de sangue do paciente pode ser inoculada com baixo risco de contaminação (23-25). Os equipamentos automatizados são baseados na detecção por fluorescência ou colorimetria que monitoram continuadamente cada frasco para o crescimento microbiano (25).
Os equipamentos disponíveis no Brasil são: O BacT/ALERT® 3D 60/120/240 (bioMérieux, Durham, NC, EUA), BACTEC® modelos FX, série 9000
(9050, 9120, 9240) e MGIT (Becton Dickinson Diagnostics Instrument Systems, Sparks, MD, EUA) (23). O sistema BacT/ALERT® (bioMérieux, Durham, NC, EUA) possui meios de cultura com carvão vegetal que apresenta ação inibitória para antimicrobianos sendo útil para pacientes que receberam antibioticoterapia (26), o sistema conta com os seguintes frascos: BacT/ALERT® SA (meio de cultura suplementado com caldo tríptico de soja) , e BacT/ALERT® FA (meio de cultura suplementado com Brain-Heart Infusion (BHI) e caldo tríptico de soja) para organismos aeróbios; BacT/ALERT® SN (meio de cultura suplementado com caldo trípitico de soja) para organismos anaeróbios; BacT/ALERT® FN (meio de cultura suplementado BHI e caldo tríptico de soja) para bactérias anaeróbias; BacT/ALERT® PF (meio de cultura suplementado BHI e caldo tríptico de soja) para uso pediátrico na pesquisa de bactérias aeróbias e BacT/ALERT® MP, suplementado com meio Middlebrook desenvolvido para a pesquisa de micobactérias (26).
O sistema BACTEC® aeróbio/anaeróbio Plus (Becton Dickinson Diagnostics Instrument Systems, Sparks, MD, USA) contém dois tipos de resina no interior dos frascos de hemocultura que inibem a ação de antibióticos, permitindo o crescimento do patógeno (27). Esse sistema conta com diferentes frascos de hemocultura: BD BACTEC Peds Plus™/F Medium para uso pediátrico; BD BACTEC™ Plus Aerobic/F e Plus Anaerobic/F Medium; desenvolvidos para bactérias aeróbias, anaeróbias e fungos; BD BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium, que contém agente de lise para células brancas para maior detecção e recuperação de organismos parcialmente fagocitados; BACTEC Myco/F-Sputa Culture Medium e BACTEC Myco/F Lytic para a detecção de espécies de micobactérias em amostras clínicas (27).
Os frascos devem manter um volume suficiente de ar para o crescimento de micro-organismos aeróbios, como bactérias e leveduras, enquanto os frascos para anaeróbios devem ter uma mistura de gases livres de oxigênio, evitando a entrada de ar durante a coleta (23). A verificação do crescimento microbiano nos frascos de hemocultura ocorre através de um sensor de detecção colorimétrica que rastreia os microrganismos pelo aumento da produção de CO2, tornando o sensor do
frasco amarelo (23,26). Ao medir a luz refletida, o aparelho detecta a mudança de cor do sensor e notifica através de alarmes sonoros e visuais (23,26). Utilizando
sistemas automatizados de monitoração contínua, as culturas de sangue não necessitam de incubação por mais que cinco dias (28).
As hemoculturas para fungos apresentam baixa positividade, cerca de 50%, necessitando de análises posteriores, como a microscopia ou uma nova cultura, para a identificação do patógeno (23,28). Dessa forma, é de extrema importância o desenvolvimento de diagnósticos mais rápidos, levando em consideração o alto risco de disseminação do fungo para órgãos internos através do sangue, que aumenta o risco de óbito (29,30).
1.2.1.4. Testes bioquímicos
O reconhecimento das características estruturais dos micro-organismos como a forma (micromorfologia e macromorfologia)–, é utilizado no processo de identificação, além dos pelos métodos bioquímicos, fisiológicos e de termotolerância (31). Os testes de atividades bioquímicas podem ser manuais ou automatizados e são baseados na assimilação de carboidratos e ácidos orgânicos e detecção de oxidases e arilamidase (31). Quando associados a métodos complementares como macro e micromorfologia, os testes bioquímicos comerciais para a identificação manual tem apresentado eficiência de 68% a 97,4%, com resultados em até 72 horas (32-36).
Os sistemas bioquímicos permitem a identificação precisa de microrganismos, porém há necessidade do crescimento em cultura, elevando o tempo de diagnóstico (31). Mutações genéticas, da morfologia celular ou até mesmo falhas na esporulação podem prejudicar o diagnóstico (23).
Atualmente, são utilizados vários kits comerciais automatizados, como: o VITEK® 2 (bioMérieux, Durham, NC, EUA) e miniTek TM (Siemens Munique,
Alemanha), MicroScan (Microscan Systems, Inc. Renton, Washington, EUA) que substituíram as metodologias bioquímicas manuais de identificação de leveduras (17,37).
Para minimizar as limitações dos métodos clássicos, foram desenvolvidos métodos de identificação genotípica dos agentes de infecções fúngicas invasivas (37).
1.3. Métodos não dependentes de cultura para a identificação de fungos
Considerando a baixa sensibilidade e tempo elevado para realização da identificação clássica, os microbiologistas buscam constantemente novas metodologias no diagnóstico de infecções fúngicas invasivas (38,39).
Dentre os métodos não dependentes de cultura podemos citar: a detecção de anticorpos ou antígenos específicos para determinadas infecções fúngicas (38,39), os biomarcadores como (1,3)-β-d-glucana (diagnóstico de infecções por Candida sp. e Pneumocystis sp.), galactomanana (diagnóstico de aspergilose invasiva) e mananas para Candida sp. (38,39).
Os ensaios moleculares também têm sido estudados para o diagnóstico de infecções fúngicas, pois reduzem o tempo de identificação (39,40), aumentando a sensibilidade e especificidade, permitindo maior segurança pela diminuição da manipulação de culturas fúngicas (39,40). Além disso, as técnicas moleculares podem ser utilizadas para o diagnóstico do fungo através do seu material de cultura, bem como a partir do material clínico (sangue, lavado brônquio-alveolar, escarro, biópsia e entre outros) (39,40).
1.3.1. Testes Sorológicos
O isolamento dos fungos pelos métodos dependentes de cultura é um processo demorado de diagnóstico (40) que pode ser atenuado pelos métodos não dependentes de cultura (por exemplo: detecção de anticorpo e antígenos fúngicos, técnicas moleculares, e/ ou histopatologia) (40).
Os fungos são seres ubíquos, o que torna a exposição humana inevitável a potenciais patogênicos (41). A detecção de anticorpos específicos fornece uma evidência prévia da exposição fúngica, podendo ajudar na identificação do agente etiológico em uma doença instalada, ou sob o risco do desenvolvimento de doenças futuras (41). Algumas das técnicas utilizadas para a detecção de anticorpos específicos são a Reação da Fixação de Complemento, Ensaio de Imunodifusão, Ensaio imunoenzimático (ELISA), Western Blot e Contraimunoeletroforese (41).
A primeira baseia-se na capacidade do complemento livre de lisar hemácias recobertas por hemolisina(41). Esse teste apresenta sensibilidade de 70 a
90% e especificidade de 60 a 90%, sendo empregado na identificação de Histoplasma sp., Blastomyces sp. e Coccidioides sp. (41,42,44,45).
O Ensaio de Imunodifusão é realizado em um meio de difusão em gel de agarose (45). Ao se adicionar um antígeno solúvel com anticorpo também solúvel forma-se um precipitado antígeno-anticorpo que é insolúvel e sofre precipitação (45). Esse ensaio apresenta uma sensibilidade de 70 a 100% e especificidade de 100%, sendo realizado para a pesquisa de anticorpos para Histoplasma sp., Blastomyces sp., Coccidioides sp. e Paracoccidioides sp.(42,44,45).
O teste de ELISA ( Enzime-Linked Immunosorbent Assay) é um ensaio imunoenzimático de alta sensibilidade e especificidade, aliada com a fácil execução da técnica na identificação de infecções fúngicas invasivas para espécies de Candida e Aspergillus (46-48). Essa reação é baseada em uma ligação reversível e não-covalente de um antígeno com um anticorpo específico (46-48). Na reação de uma enzima (peroxidase) conjugada a um anticorpo com o substrato incolor, é produzido um produto colorido que permite a detecção do antígeno (46-48).
O Western blotting (WB) é um importante método utilizado para imunodetecção de proteínas, que são separadas por eletroforese em gel de acordo com o a massa molecular, seguida da transferências para membrana de nitrocelulose adsorvente (49,50). Essa técnica permite a detecção, quantificação e caracterização de múltiplas proteínas, incluindo as que estão em baixa quantidade em uma amostra (49-50). Esse método tem apresentado uma sensibilidade de 90 a 100% e uma especificidade de 100% na detecção do Histoplasma capsulatum (49,50).
A contraimunoeletroforese (CIE) é uma outra opção para o diagnóstico imunológico de micoses (51). Esse método consiste na aplicação de uma corrente elétrica para acelerar o processo de imunodifusão em ágar do antígeno contra o anticorpo, ao se encontrarem produzem uma imunopreciptação (51). O teste pode ser usado na detecção de antígenos para Sporothrix schenkii, Paracoccidioides
brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Candida sp, Aspergillus fumigatus (51). A capacidade de detectar antígenos de fungos em amostras de pacientes aumenta a abordagem diagnóstica de suas infecções (43). Os biomarcadores (componentes de sua parede celular) são eliminados durante seu crescimento e sua identificação pode sugerir doença invasiva (43).
A (1, 3) -β-D-glucana compõe a parede celular de vários fungos, como: Candida sp e Pneumocystis jiroveci , Aspergillus spp., Fusarium spp., e Acremonium sp. (42). Esse teste tem apresentado sensibilidade de 50% a 90% e espeficidade de 70% a 100% e estão disponíveis comercialmente (43).
A detecção de componentes de fungos como o antígeno galactomanana, um polissacarídeo termoestável presente na parede celular fúngica do gênero Aspergillus, torna-se circulante no soro e pode ser encontrado em diferentes amostras clínicas (52,53). O teste fornece um resultado rápido em aproximadamente 3 horas, com eficiência próxima de 90% de sensibilidade e 80% de especificidade e está disponível comercialmente (Platelia® Aspergillus EIA, BioRAD, Marbes-la-Coquete, França) (53).
Tanto o Cryptococcus neoformans, quanto o Cryptococcus gattii liberam um antígeno polissacarídeo que pode ser detectado em pacientes infectados (54-56). Há vários testes disponíveis comercialmente, como: detecção do antígeno criptocócico (CrAg), baseado em aglutinação do látex, ensaios imunoenzimáticos e metodologias de ensaio de fluxo lateral (54-56).
1.3.2. Testes Moleculares
Nos últimos anos foram desenvolvidos sistemas de amplificação de ácidos nucleicos, os quais permitem um diagnóstico sensível e específico para identificação de espécies fúngicas (57,58). Essas técnicas incluem diversas modalidades de PCR (reação em cadeia da polimerase simples, transcriptase reversa, multiplex, nested, em tempo real e outras), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) e microarray (57-60).
1.3.2.1. PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
A técnica da PCR baseia-se na amplificação exponencial artificial (in vitro) (61-62) de uma reduzida quantidade de DNA de um conjunto de células em poucas horas. Trata-se de uma metodologia rápida e eficiente (61).
A reação da PCR envolve três fases: desnaturação – separação da dupla hélice de DNA por aquecimento a uma temperatura de 94ºC a 96ºC originando duas cadeias separadas (61); hibridação – a temperatura é diminuída até o intervalo de 50ºC a 54ºC, ocorrendo a ligação entre os iniciadores (61); e a extensão do DNA – quando a temperatura é elevada até o intervalo entre 72ºC e 76ºC, ativando a enzima DNA polimerase que reconhece os sítios de ligação entre os iniciadores e o DNA alvo, unindo-se a eles (61). No final de um ciclo de PCR, são obtidas duas novas cadeias de DNA para cada alvo, assim mais duas novas são sintetizadas a partir da cadeia molde, fazendo o crescimento exponencial dessas amostras (61).
Outras técnicas de PCR podem ser citadas:
a) Reverse Transcriptase Chain Reaction (RT-PCR): ferramenta útil na detecção de proteínas expressas em estudos de expressão gênica, essa técnica não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra, mas sim, a amostra fornece o RNA, que é convertido em DNA complementar (cDNA) (59);
b) Multiplex PCR: essa técnica se baseia na amplificação de mais de um segmento genômico em uma única reação, cada um com seu par de iniciadores específicos, e vem sendo aplicada na investigação de paternidade em que vários marcadores genômicos devem ser analisados (59);
c) Nested PCR: essa técnica visa melhorar a especificidade e eficiência da reação que é realizada em duas etapas: amplificação do DNA alvo de forma abrangente; amplificação do resultado com iniciadores mais internos da região de estudo (59);
d) PCR em tempo real (qPCR): essa técnica é mais rápida e possui maior sensibilidade quando comparada a PCR convencional (63,64).
1.3.2.3. Sequenciamento de DNA
O Sequenciamento de ácidos nucleicos tornou-se uma ferramenta de identificação de espécies de microrganismos (65), com maior acurácia do que as técnicas convencionais que não conseguem diferenciar as espécies com características morfológicas semelhantes (65).
O sucesso da identificação fúngica através dessa técnica está na escolha da região gênica para amplificação e na disponibilidade de um banco de dados de sequências para que possam ser comparadas (66,67). Essa metodologia é baseada na amplificação do sítio alvo do DNA genômico pela reação da PCR (Polymerase Chain Reaction), seguido pelo sequenciamento do fragmento específico (66,67). A região a ser avaliada depende do grupo a qual o patógeno pertence (66,67). Em geral, as regiões ITS (Internal Transcribed Spacer) do DNA ribossomal são utilizadas para identificação molecular de fungos por se tratarem de marcadores “universais” conservados e polimórficos do DNA (66). A região ITS está localizada entre a pequena subunidade (18S) e da grande subunidade (28S) do DNA ribossomal (66). A região ITS1 se localiza entre as regiões 18S e 5.8 enquanto a região ITS2 está localizada entre as regiões 5.8 e 28S do DNA ribossômico, nesses locais ocorrem múltiplas cópias do DNA de espécies fúngicas (66). Estas sequências são depositadas em bancos de dados, tais como o GenBank, NCBI, que são atualizados continuamente (67).
Uma das desvantagens dessa técnica é a falta de depósitos de sequências nos bancos de dados, devido a uma grande diversidade de fungos não explorada e a complexa taxonomia do reino Fungi (67). A qualidade da sequência, o número e precisão dos registros existentes nos bancos de dados, o tamanho do fragmento da sequência e do programa utilizado podem ser outros fatores que interferem na identificação dos microrganismos pela técnica de sequenciamento de DNA (57,65,66,68,69).
1.3.2.3. Polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrição: Restriction
Fragment Lenght Polymorphysm (RFLP)
RFLP tem sido escolhido para identificar a diversidade genética microbiana de difícil caracterização pelos meios morfológicos tradicionais (70).
Essa tecnologia associa amplificações de regiões específicas (como região ITS) e utiliza enzimas de restrição que reconhecem e clivam esses sítios específicos, possibilitando a detecção de polimorfismos e diferenças genéticas entre e dentro de espécies (70). Com a geração de fragmentos de tamanhos diferentes, a análise do resultado é realizada em gel de agarose de alta resolução (70).
1.3.2.4. Amplificação Circular Isotérmica: Loop-mediated Isothermal
Amplification (LAMP)
LAMP vem sendo aplicada como uma técnica de alta sensibilidade e especificidade na detecção de DNA de patógenos (71). Essa técnica realizada com a DNA polimerase Bst polymerase, fazendo o deslocamento da fita de DNA, permitindo sua amplificação sob condições isotérmicas relativamente baixas, que se mantém entre 60°C a 65°C durante até uma hora (71-74).
Nesta reação, utilizando quatro ou seis pares de iniciadores reconhecendo entre seis e oito regiões distintas do gene alvo, tornando a reação mais específica e acumulando entre 109 e 1010 cópias do sitio de estudo em menos
de uma hora (73,75,76). A amplificação dos produtos do LAMP pode ser detectada tanto pela observação visual da turvação e fluorescência, como pelo uso de equipamentos especializados (77,78).
Têm sido detectados agentes microbianos com a tecnologia LAMP em diversos tipos de amostras como água, meios de cultura, fluídos oculares, sangue, tecidos e entre outros, sendo uma técnica menos sensível à presença de inibidores de PCR convencional (76,79).
1.3.2.5. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)
MALDI-TOF MS surgiu como um método rápido e eficaz para a identificação de bactérias e fungos (80,81) baseado na fotovolatilização e ionização de uma amostra biológica embebida em uma matriz (ácido orgânico) que, bombardeada por um laser de radiação ultravioleta (UV) (81), gera um perfil de massa pelo software, cujo resultado é comparado em um banco de dados de espectros de referência em que cada espécie possui perfil único (81).
Entretanto, o método tem falhado na identificação de culturas mistas e com densidade de fungos inferior ao limiar estabelecido pela metodologia (80,81). Outra limitação da técnica relaciona-se a base de dados disponíveis das bibliotecas,
já que o sucesso de identificação está diretamente relacionado à disponibilidade de dados (81).
1.3.3. Plataforma de DNA microarray
Outro exemplo de teste são as plataformas de DNA microarray que vêm sendo utilizadas como ferramenta para a detecção e identificação simultânea de vários agentes patológicos (82-86), tais como: fungos de interesse clínico (85), vírus (86), bactérias patogênicas (87) e parasitas (88). Além disso, a tecnologia é aplicada para avaliação e identificação da resistência aos fármacos (84) e diagnóstico e classificação para tipos de câncer (89).
Um array pode ser definido como um conjunto ordenado de sondas, em que cada sonda representa uma única espécie de microrganismo correspondente ao gene de estudo, fixado em uma matriz sólida (lâmina de vidro, sílica ou membrana de nylon) (90-92). A amostra de DNA em análise é submetida à amplificação por PCR que, quando aplicada na plataforma, permite à hibridação nas sondas espécies-específicas da lâmina em caso de complementaridade de bases(90-92).
Os resultados são interpretados de acordo com o padrão de hibridação (83,87,93) e visualizados através de leitura óptica, podendo ser feita pela fluorescência, luminescência, ressonância e pela leitura a olho nu (83,93). A última baseia-se na observação visual de precipitados que permitem a detecção de pontos coloridos na lâmina (83,93). Como é considerada uma análise colorimétrica, não há a necessidade de equipamentos especiais para a leitura, minimizando os custos (83,93). Geralmente essa leitura é realizada em lâminas de vidro contendo spots (sondas de oligonucleotídeos) com sequências curtas entre 25 a 80 pares de base impressos na superfície da lâmina (83,93). Trata-se de uma metodologia econômica, cujas bases são estáveis a variações de temperatura e resistentes a lavagens (83,93).
Além da identificação e da diferenciação de microrganismos realizados em um único teste, a técnica de DNA microarray é rápida, requer até nove horas, em comparação com cinco ou mais dias utilizados pela metodologia clássica (Figura 1). Apresenta fácil execução e, por serem as sondas presentes na plataforma de DNA microarray espécie-específicas, produzem resultados consistentes (94-96).
Figura 1: Esquematização dos procedimentos para a identificação da hemocultura
positiva pelos métodos clássicos e plataforma de DNA microarray.
Uma das desvantagens da técnica de DNA microarray ocorre quando a amplificação do DNA alvo resulta em número reduzido de cópias. Por se tratar de uma técnica recente, o desenho das sondas requer um profissional com conhecimento de genética em microrganismos de interesse médico. Outra desvantagem é a necessidade de mais de uma sonda por espécie a fim de evitar reações cruzadas (95-97).
Em uma análise retrospectiva realizada por Souza, et al. (98), de 21 amostras de sangue com Fusarium sp. isolados, a metodologia DNA microarray, juntamente com o sequenciamento, identificou 17 das 21 amostras como complexo Fusarium solani, e 4 delas como complexo Fusarium não solani. A tecnologia de DNA microarray teve concordância e sensibilidade de 100% com a técnica de sequenciamento de DNA e cultura, apresentando alto desempenho na identificação dessas espécies.
No estudo realizado por Ferrari, et al. (99), dentre 167 isolados de espécies não - C. albicans, a plataforma de DNA microarray mostrou elevada
concordância (97,6%) com a identificação obtida pelo sequenciamento. Todos os resultados desse estudo foram corretamente identificados, com exceção de espécies fúngicas ausentes na plataforma.
Os avanços da medicina trouxeram um aumento significativo da sobrevida dos pacientes, principalmente no que tange aos gravemente enfermos e internados nas unidades de terapia intensiva, como também para os imunodeprimidos (102). No entanto, a mortalidade por fungemias em especial, por candidemia, manteve-se elevada, em torno de 40 a 60% em centros internacionais (102) e de 50 até 85,9% nos hospitais brasileiros (103). A alta mortalidade deve-se, em parte, à baixa sensibilidade da hemocultura que é o exame padrão-ouro no diagnóstico de candidemia (104,105). Desse modo, a implementação de novos testes diagnósticos está entre os principais objetivos da tecnologia moderna aplicada às doenças infecciosas (104,105). A utilização de técnicas que complementem ou aumentem a sensibilidade da hemocultura, para a identificação de fungos e podem colaborar substancialmente com a prática clínica (104,105).
2. Objetivos
Geral
• Avaliar o desempenho da técnica de DNA microarray para a identificação de fungos diretamente do material contido nos frascos de hemoculturas, colhidos de pacientes internados no Hospital de Clínicas da UNICAMP, durante os anos de 2013 a 2016.
Específicos
• Comparar os resultados de identificação de gênero e espécie de fungos presentes em frascos de hemocultura, analisados pela técnica de DNA microarray, com a identificação por sequenciamento de DNA.
• Descrever as características clínicas dos pacientes cujas hemoculturas colhidas foram analisadas neste trabalho.
3. Metodologia
3.1. Local de estudo
O estudo experimental foi conduzido nos Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças Infecciosas (LEMDI) e Laboratório de Investigação em Fungos (LIF), ambos localizados no Hospital de Clínicas (HC) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). O HC-UNICAMP é um hospital universitário e de referência terciária localizado na região de Campinas – SP. Esse hospital conta com 403 leitos, onde os pacientes são atendidos em diferentes especialidades médicas. Além do HC- UNICAMP também faz parte do complexo hospitalar da UNICAMP, o Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), que está localizado ao lado do prédio do HC, onde estão situados o Departamento de Tocoginecologia e Berçário de alto risco.
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas/ Universidade Estadual de Campinas com o número CAAE: 32955414.0.0000.5404 (Anexo 1).
3.2. Desenho de estudo
Trata-se de estudo retrospectivo, descritivo e analítico realizado no período de setembro de 2014 a setembro 2016. Para o estudo da identificação de fungos contidos nos frascos de hemocultura, foram analisadas as hemoculturas que resultaram positivas para fungos, hemoculturas que resultaram positivas para o crescimento de bactérias e hemoculturas cujo resultado final foi negativo, ou seja, sem crescimento de microrganismos . Todas as hemoculturas foram realizadas pelo sistema automatizado Bact/Alert (bioMérieux, Hazelwood, França) e identificados pelo sistema Vitek 2 (Lab Equipment bioMérieux, Inc., Durham, NC, EUA). As hemoculturas cujos resultados foram negativos ou onde houve crescimento de bactérias foram estudadas como controle da técnica de microarray para a identificação de fungos.
Além do estudo microbiológico, também foram coletados os dados de prontuário médico dos pacientes, que tiveram as hemoculturas incluídas no estudo,
como: nome completo, iniciais do nome, gênero, idade, data de nascimento, número de registro do HC, enfermaria/especialidade, doenças de base, data de internação, data de saída hospitalar (alta ou óbito), data de coleta de hemocultura em estudo, resultado da hemocultura (informado pelo Serviço de Microbiologia do Laboratório de Patologia Clínica do HC-UNICAMP), uso de antifúngicos (não e sim e qual antifúngico), data de início e fim do tratamento com antifúngico.
3.3. Obtenção dos frascos de hemoculturas
Foram estudados frascos de hemoculturas positivas para fungos, estocados no LIF e no LEMDI. O mesmo ocorreu com os frascos de hemocultura encerrados previamente para bactérias e frascos de hemocultura encerrados como negativos pela microbiologia. Os frascos de hemoculturas encerrados como positivos para fungos foram estudados nos períodos de setembro/2014 a fevereiro/2016. Os frascos positivos para bactérias e frascos encerrados como negativos tiveram o período de estudo de janeiro/2015 a fevereiro /2015.
Conforme a obtenção de frascos com resultados positivos para bactérias com crescimento em até 12 horas no LIF, foram enviados ao LEMDI, e estudos no período de julho/2015 a janeiro/2016.
Foram utilizados os seguintes frascos de hemocultura do fabricante BacT/ALERT ILMY ILMY (bioMérieux, Hazelwood, França): BacT/Alert ® FA - Anaeróbios, BacT/Alert ® SA - Aeróbios, BacT/Alert ® PF - Pediátrico, BacT/Alert ® MB – Micobactérias, e BacT/Alert ® SN – Anaeróbios, incubados a 37 ºC em um período de 40 dias para micobactérias, 15 dias para fungos e 5 dias para bactérias (Figura 2).
Figura 2: A) equipamento BacT/ALERT ILMY (bioMérieux, Hazelwood, França), B)
Frascos de hemocultura utilizados: BacT/Alert ® FA - Anaeróbios, BacT/Alert ® SA - Aeróbios, BacT/Alert ® PF - Pediátrico, BacT/Alert ® MB – Micobactérias, e BacT/Alert ® SN – Anaeróbios.
Durante o ano de 2014, houve a troca do sistema automatizado de cultura de sangue, BacT/ALERT ILMY para BD BACTEC TM FX (Becton Dickinson, New
Jersey, EUA), e os frascos de hemocultura utilizados foram: BD BACTEC TM Plus
Anaerobic/F Culture Vials, BD BACTEC TM Plus Aerobic/ F Culture Vials e BD
BACTEC TM Peds PlusTM/F Culture Vials, incubados a 37 ºC em um período de 40
dias para micobactérias, 15 dias para fungos e 5 dias para bactérias (Figura 3).
Figura 3: A) Equipamento BD BACTEC TM FX (Becton Dickinson, New Jersey,
EUA). B) frascos de hemocultura utilizados foram: BD BACTEC TM Plus Anaerobic/F
Culture Vials, BD BACTEC TM Plus Aerobic/ F Culture Vials e BD BACTEC TM Peds
PlusTM/F Culture Vials.
Desse modo, os frascos de hemocultura pertencentes ao equipamento BacT/ALERT ILMY foram coletados entre fevereiro de 2012 a agosto de 2014, e os frascos do equipamento BD BACTEC TM FX no período de agosto de 2014 a outubro
de 2015. Todos os frascos de hemoculturas foram enviados ao LEMDI pelo Serviço de Microbiologia do Laboratório de Patologia Clínica do HC-UNICAMP.
3.4. Extração de DNA fúngico dos frascos de Hemocultura
A técnica de extração de DNA das amostras de hemocultura foi realizada de acordo com as especificações do protocolo do Kit High Pure PCR Template Preparation (Roche Applied Sciences, CA, EUA).
Uma alíquota de 200 µL da hemocultura foi adicionada à 1 mL da solução alcalina de lavagem (NaOH 0,5 M, Citrato de Trisódio Desidratado 0,05 M) em microtubo de polipropileno de 1,5 mL, para remoção de possíveis inibidores de PCR. As amostras foram submetidas à agitação vigorosa por 15 segundos e incubadas em temperatura ambiente durante 5 minutos. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 16.000 g durante 5 minutos e o precipitado foi suspenso em 1 mL de
Tampão Fosfato Salino (PBS) 0,01M (NaCl 0,138 M; KCl - 0.0027 M, pH7,4) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), e novamente submetida a vigorosa agitação e centrifugada a 16.000g durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao precipitado 300 µL de tampão PBS e 200 µL de Tissue and Lysis Buffer (ureia 4 M, Tris 200 mM, NaCl 20mM, EDTA 200 mM, pH7,4) para homogeneização no equipamento MagnaLyzer (Roche Applied Sciences, CA, EUA) a 5.000 g por 10 minutos. A seguir, as amostras foram submetidas à centrifugação a 10000 g durante 2 minutos, o sobrenadante foi transferido para um microtubo de polipropileno de 1,5 mL e foram adicionados 200 µL de Binding Buffer (guanidina – HCl 6 M, ureia 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20%, pH 4,4) e 40 µL de Proteinase K reconstituída, segundo as especificações do protocolo do Kit High Pure PCR Template Preparation e incubados em banho seco a 70 ºC durante 10 minutos, centrifugadas posteriormente à 16000 g por 2 minutos. O sobrenadante foi transferido para um microtubo de polipropileno de 1,5 mL e foi adicionado 100 µL de isopropanol, a amostra foi transferida para colunas posicionadas em tubos coletores e centrifugadas a 8000 g durante 1 minuto e o sobrenadante descartado.
Posteriormente, foram adicionados 500 µL de Inhibitor Removal Buffer (5M guanidina - HCl, 20 mM Tris – HCl, pH6,6, com adição de 20 mL de etanol absoluto para o volume final) às amostras e submetidas a centrifugação a 8000 g durante 1 minuto e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, foram adicionados 500 µL de Wash Buffer (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, pH 7,5, com adição de 80 mL de etanol absoluto para o volume final) as amostras e submetidas a centrifugação a 8000 g durante 1 minuto e o sobrenadante foi descartado, procedimento foi executado duas vezes.
Ao final da extração do DNA, as amostras foram eluídas com 50 µL de Elution Buffer (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5) em um microtubo de polipropileno de 1,5 mL e os produtos foram submetidos as técnicas de Sequenciamento de DNA e DNA microarray.
Para quatro frascos de hemocultura identificados pela técnica microbiologica como Fusarium sp., foram realizados inóculo de 500 µL de hemocultura em tubos de ensaio contendo Agar Sabouraud Dextrose (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, EUA) e incubados durante cinco dias em temperatura ambiente. Posteriormente, a colônia foi armazenada utilizando o
método Castellani. O procedimento foi necessário devido à baixa quantidade de material genético extraído diretamente dos frascos de hemocultura.
3.4.1. Extração de DNA das colônias de Fusarium spp.
A técnica de extração de DNA das colônias de Fusarium spp., foi realizada de acordo com as especificações no protocolo do Kit High Pure PCR Template Preparation (Roche Applied Sciences, CA, EUA).
As colônias das culturas de fungos filamentosos foram suspensas em 500 µL de Tampão PBS e submetidas à maceração mecânica. Em seguida, o produto foi transferido para tubos contendo beads de cerâmica e as células lisadas no equipamento MagnaLyzer (Roche Applied Sciences, CA, EUA) a 5.000 g por 10 minutos.
As etapas seguintes da extração do DNA das colônias de Fusarium spp. seguiram as especificações do protocolo do kit, apontado no item 3.4. (Figura 4).
Figura 4: Esquema representativo da extração de DNA das amostras clínicas e a
extração de DNA da cultura de Fusarium spp..
3.5. Técnica de Sequenciamento
A técnica de sequenciamento foi realizada de acordo com Moreira-Oliveira et al. (101)com modificações. Utilizou-se os reagentes Bigdye® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) seguindo o protocolo recomendado para o equipamento ABI Prism genetic analyser 3100 (Applied Biosystems,Foster City, Califórnia, EUA) (Figura 5).
Figura 5: Esquema representativo das etapas realizadas na técnica de
sequenciamento de DNA.
3.5.1. Amplificação do DNA alvo por PCR
A amplificação do DNA fúngico foi realizada utilizando os pares iniciadores universais marcados com biotina ITS1 – bio (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 - ( 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) biotinilados, os quais são responsáveis pela amplificação da região ITS1, 5.8s e ITS2 do DNA ribossomal fúngico (Figura 6). A PCR das amostras foi realizada em tubos de polipropileno com a capacidade de 200 µL contendo 12,5 µL de PCR Master Mix (Promega, Fitchburg, WI, EUA), 10 mM de cada iniciador, 50 ng de DNA e 8 µL a Nuclease Free Water (Promega, Fitchburg, WI, EUA) <250 ng para um volume final de 25 µL. As reações foram incubadas em termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) observando-se as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 ºC por 2 minutos, 40 ciclos de 95 ˚C por 30 segundos, 55 ˚C por 30 segundos para o anelamento dos iniciadores com o DNA em estudo, uma fase de 72 ˚C para a expansão final da fita por 5 minutos. A seguir, os fragmentos amplificados
foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 2%, utilizando tampão TBE 1x (Promega, Fitchburg, WI, EUA), a 100V, por 30 minutos. O gel foi corado com brometo de etídeo a 0,5 µg/mL durante 15 minutos e visualizado em iluminação ultravioleta.
Figura 6: Esquema representativo da região do DNA ribossomal fúngico
amplificado.
3.5.1.2. Sequenciamento de DNA
Após a visualização dos produtos de PCR em gel de agarose foram purificados pela adição de 2 µL da enzima ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up (USB® Corporation, Cleveland, OHIO, EUA) e 5 µL de produto da PCR nas seguintes condições: 37 ºC durante 30 minutos e 80 ºC por 15 minutos.
As reações de sequenciamento foram realizadas com os iniciadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) em sequenciador automático AB IPrism 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA. EUA) utilizando o Big DyeTM Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA. EUA), para as reações foram utilizados: 5 µL de Água Milli-Q, 1 µL BigDye Terminator Sequencing Buffer 5x, 1µL BigDye Terminator v3.1, 1µL dos iniciadores ITS1 e ITS4 a 1,6mM, 2µL do produto de PCR purificado. As amostras foram submetidas a um ciclo de 96 ºC por 1minuto, 25 ciclos de 96 ºC por 10 segundos, 55 ºC por 5 segundos e 60 ºC por 4 minutos.
3.5.1.3. Análise do Resultado do Sequenciamento
Os fragmentos de DNA amplificados das diferentes amostras foram alinhados no programa ATSQ (Japan Software Inc., Japão) e a homologia com outras sequencias disponíveis em banco de dados foram avaliadas com as
ferramentas BLAST (Basic Local Aligment Search Tool, disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), CBS-Knaw (Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre - Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and situated in Utrecht, disponível em http://www.cbs.knaw.nl/index.php) e Mycology Lab (Molecular Mycology Research Laboratory - University of Sidney, disponível em http://www.mycologylab.org).
3.6. Reação de PCR em tempo real
As amostras identificadas como Fusarium spp. pelas técnicas microbiologicas foram submetidas a dois ensaios distintos: (a) identificação de complexo Fusarium não - solani e (b) identificação de complexo Fusarium solani. Os ensaios foram realizados no equipamento StepOnePlusTM Real-Time PCR System
(Applied Biosystems,Foster City, Califórnia, EUA), simultaneamente, de acordo com a técnica descrita por Muraosa et al. (100).
3.7. Técnica de DNA microarray
A técnica de DNA microarray foi realizada de acordo com Sakai et al, (85) e Ferrari et al.,(99) e foi composta de quatro etapas: a) Elaboração da plataforma de DNA microarray, b) Amplificação do DNA alvo por PCR, c) Desnaturação e Hibridização e d) Interpretação dos resultados.
a) Elaboração da plataforma de DNA microarray.
A plataforma de DNA microarray utilizada nesse estudo foi elaborada pelos pesquisadores, Sakai et al, (85) da Medical Mycology Reserch Center da Universidade de Chiba – e teve a colaboração de pesquisadores da Faculdade de Ciências Medicas – UNICAMP. A plataforma contém 14 gêneros e 35 espécies fúngicas: Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Blastomices dermatidis, Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondi, Candida
kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides posadassi, Cryptococcus sp., Fusarium sp., Fusarium solani, Histoplasma capsulatum, Malassezia furfur, Mucor sp., Paracocidiodes brasiliensis, Penicillium marneffei, Rhizomucor sp., Trichophyton rubrun, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon asteoides, Trihcosporon inkin, Trichosporon asahii, Trichosporon faecale, Trihcosporon mucoides. As sondas (cauda poli T) foram compostas por 14 a 20 sequencias de oligonucleotídeos específicos para espécies fúngicas, e para o controle positivo da técnica de DNA microarray, foram construídas sondas com regiões fúngicas conservadas e comuns para várias espécies (Anexo 2).
b) Amplificação do DNA alvo por PCR
A amplificação do DNA fúngico foi realizada utilizando os pares iniciadores universais marcados com biotina ITS1 – bio (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4- bio (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (Sigma-Aldrich, Saint. Louis, MO, EUA), descrito no item 3.5.1.
c) Desnaturação e Hibridização
Para a desnaturação foram utilizados 4 µL da PCR em tubo de polipropileno de 0,2 µL e procedeu-se o aquecimento a 95 ˚C durante 2 minutos e em seguida o resfriamento em gelo por 2 minutos. Foi adicionado à PCR desnaturada, 16 µL do tampão de hibridação (Tetramethyllammonium chroride 2M, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 10%, 5mM EDTA, 6x (SSC) Saline Sodium Citrate). O volume total de 20 µL da solução foi aplicado à lâmina de plástico (Plataforma microarray), e coberta com uma lamínula de plástico, para permitir a hibridização (Figura 7), as lâminas foram acomodadas em uma caixa úmida com água destilada e incubada a 37 ˚C por 2 horas.
Após o período de incubação foi preparada a solução conjugada (1,5 mL de Coloring buffer: Tampão Fosfato Salino (PBS) 0,01M (NaCl 0,138 M; KCl - 0.0027 M, pH7,4), Tween-20 0,05%; 24 µL da Solução A: Tampão PBS e 0,02 mg/mL Biotina HRP; 24 µL da Solução B: Tampão PBS e 0,04 mg/mL streptavidina) para
cada amostra. Completado o tempo de incubação, as lamínulas foram removidas da plataforma e submersas em tampão de lavagem (Tampão PBS), durante 5 minutos a 37 ˚C em estufa incubadora.
Em seguida, as lâminas foram deitadas em papel toalha e foi adicionado 1,2 mL da Solução Conjugada e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Passado o tempo, a Solução Conjugada foi vertida e as lâminas acomodadas em uma cuba contendo Coloring buffer (Tampão PBS, 0,05% Tween-20) durante 10 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram removidas do Coloring buffer e repousadas em papel toalha.
Foi aplicado 1,2 mL de Coloring agent (1,5 mL de H2O Milli-Q, 24 µL da
Solução 1: H2O e CH3COONa 0.2M, pH3.3 ajustado com HCl; 24 µL da Solução 2:
TMB (3,3’,5,5’- tetramethylbenzidina) diluído com DMSO (dimethyl sulfoxida); 24 µL da Solução 3: H2O e 3% Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.) e 24 µL
da Solução 4: H2O e 1,5% de H2O2 ), solução reveladora, sobre as lâminas,
incubadas novamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. A lâmina foi lavada com água destilada para remoção de resíduos de reagentes, secada à temperatura ambiente e realizada a leitura dos resultados a olho nu.
Figura 7. Esquematização da revelação da técnica de DNA microarray. Nas
lâminas foram plotados oligonucleotídeos, os quais se ligam aos produtos de PCR biotinilados quando há complementaridade de bases. A revelação da lâmina é realizada pela adição do substrato TMB, ocorrendo a reação colorimétrica da ligação estreptavidina-biotina-peroxidase, resultando em um precipitado azul.
d) Interpretação de resultados
A identificação do DNA do fungo foi realizada a olho nu, onde ocorreu a hibridização e revelação de pontos de coloração azul em posições específicas na lâmina, que continham diferentes números de sondas para fungos de interesse clínico, de acordo com o mapa de construção do array (Figura 8).
Figura 8. Esquema da plataforma de DNA microarray utilizada nesse estudo. O
quadrado mostra as sondas controle positivo de região comum para várias espécies fúngicas utilizado nas reações da técnica de DNA microarray.
