CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS DIFERENTES
GENÓTIPOS DE
Candida parapsilosis
ISOLADOS DE
HEMOCULTURA
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, Departamento de
Medicina-Disciplina de Infectologia, para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
SARAH SANTOS GONÇALVES
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS DIFERENTES
GENÓTIPOS DE
Candida parapsilosis
ISOLADOS DE
HEMOCULTURA
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina, Departamento
de Medicina - Disciplina de Infectologia, para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
Co-orientadora: Dra. Analy Salles de Azevedo Melo
São Paulo
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório Especial de Micologia, da
Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, aprovado
pelo Comitê de Ética (1085/05), contando com o apoio financeiro da
Coordenação e Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES
)e a
Sarah Santos Gonçalves
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS DIFERENTES GENÓTIPOS DE
Candida parapsilosis
ISOLADOS DE HEMOCULTURA
Presidente da banca:
Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
________________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Sydney Hartz Alves
Profa. Dra. Ana Cristina Galles
Prof. Dr. Marcelo Afonso Vallim
SUPLENTE
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Imaginei que esse dia não chegaria mais... Dois anos que pareceram mil... Como foi difícil chegar até aqui. Muitas vezes pensei em desistir. São Paulo era muito pra mim. Passei finais de semana infernais... Como queria voltar para casa... Hoje, meu coração já é um pouco paulista. A vida não foi e nem tem sido fácil para mim, mas por mais que esta caminhada fosse árdua, aprendi que no decorrer dela existem pessoas que estão sempre dispostas a ajudar a traçar um caminho mais fácil. Este espaço é dedicado a vocês.
A Deus, por permitir que eu conhecesse pessoas maravilhosas, por me fazer descobrir que sou forte e posso vencer. Sei que nunca me abandonou e apesar de não entender os enigmas da vida, acredito que nada é ao acaso. Obrigada pela vida!
Ao Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo, pela diligência, credibilidade e apoio. Tenho um imenso respeito pelo senhor e pelo seu trabalho. Foi uma honra tê-lo como orientador. Obrigada por me apresentar o mundo fantástico da micologia.
À Dra. Analy, pois foi muito gratificante e enriquecedora a sua presença neste trabalho. Obrigada pela paciência, pela preocupação. Com você aprendi muito de biologia molecular, mas aprendi também a ter calma, ser menos ansiosa e acreditar que no fim tudo vai dar certo. Você foi peça fundamental nesse trabalho. Obrigada por me ajudar a concretizar esse sonho. Concordo plenamente com a Cledja, quando menciona que você faz ciência e, acredito que tudo isso é fruto da sua paixão pelo trabalho que realiza. Mais uma vez obrigada!
Ao Dr. João Canela, por ter me iniciado no mundo científico e por acreditar que eu alçaria vôos muito maiores nessa jornada. Obrigada pelo incentivo!
Ao Dr. Divino, pela indicação da Universidade Federal de São Paulo. O senhor é responsável por esse título. Obrigada por almejar muito além do que eu esperava. Obrigada por abrir as portas da pós-graduação e acreditar sempre na minha capacidade.
A Beatriz Quental (Tita), pelas palavras amigas, pelo carinho, preocupação e atenção dispensada. Você é uma grande amiga!
Ao Bruno, meu primo de coração, obrigada pelos momentos alegres, pelo carinho e amizade.
À Mara (Marinha), minha grande amiga. Minha companheira de gargalhadas, minha conselheira. Obrigada pela sua disponibilidade em ajudar e pela sua preocupação. Sei que você será muito feliz porque tem o dom de querer bem as pessoas. Obrigada pela força.
Á Maria e Fátima, por compartilhar comigo a saudade dos entes queridos. Obrigada pelo imenso carinho e atenção.
Ao Ricardo (Cacá), apesar do pouco tempo que nos conhecemos sua amizade foi muito importante. Obrigada pelo carinho, pelas inúmeras vezes que tentou elevar o meu astral. Na vida, temos dois tipos de irmãos, aqueles que Deus designou para formar a nossa família e aqueles que escolhemos. Você é um deles. Obrigada pela força!
À Sabrina (Sá), pela amizade, carinho e consideração. Nossa amizade floresceu muito rápido e gerou bons frutos. Gosto muito dessa paulistinha e ela é extremamente prestativa. Obrigada pela torcida e pelos conselhos amigos.
A todos os amigos do LEMI que compartilharam comigo toda trajetória da minha tese e
que, de alguma forma, me ajudaram a realizar este sonho: Débora, Edméa Helena,
Fernanda Dias, Fernando, Gisela, Guilherme, Leila Paula, Marcelo Vallim, Norka,
Robert, Thaís, Thelma, Thomas, Vinicius.
Ao Antônio Charlys (Salsicha-Retro), por todo apoio oferecido durante a elaboração desta tese. Obrigada pelas gargalhadas compartilhadas, pela amizade e por cuidar com carinho da sua sobrinha (Mel), sempre que eu estava correndo com as minhas obrigações. Obrigada pelos inúmeros favores.
À minha amiga Rose e família, por dividir comigo vários momentos importantes. Por me fazer sentir parte da sua família, pelo carinho e atenção. Obrigada pelos almoços de domingo, que me fizeram novamente ter a sensação de estar almoçando em família. Obrigada pela amizade! Amo vocês!
Ao meu primo Marcelo Leite, pelo incentivo, amor e longos bate-papos pelo telefone. Obrigada por não me deixar só e por ser um grande amigo. Sei que você desejou esse título tanto quanto eu. Amo você!
A minha professora de Dança do Ventre Sylvia (Syl), por ser muito mais que uma mestra, pelas inúmeras vezes que a Dança aliviou minhas dores de cabeça. Você é muito especial na minha vida. Obrigada pelo imenso carinho. Amo você!
À Dra. Ana Cecília e Dra. Cintia, que juntas têm me ajudado a suportar os altos e baixos da vida. Obrigada pela preocupação, amizade e imenso carinho.
Aos meus amigos de Montes Claros: Anne, Ariel, Kassandra e Pedrinho pela imensa
torcida, por achar que eu poderia ir mais longe e vim...rsrsrsrs. Vocês serão sempre meus grandes amigos. Como tenho saudade das nossas farras. Essa vitória é nossa! Obrigada pela força e pela presença em minha vida mesmo a 1.104 Km. Amo vocês!
Aos meus amigos de Belo Horizonte: Adriana, Alessandro, Ernane Aguiar, Flávia
Santos, João Fagundes, Marcele, Marly e Wânia, por não me deixarem desistir desse sonho em meio a tantas atribulações. Vocês são muito importantes na minha vida. Com certeza alcançaremos outras vitórias juntos. Amo vocês!
Aos meus colegas e professores do Yázigi International pela torcida.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para esse trabalho.
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Sumário
Dedicatória ... v
Agradecimentos Especiais ... ix
Agradecimentos ... x
Lista de abreviaturas e símbolos ... xviii
Resumo ... xix
Abstract ... xx
1.0INTRODUÇÃO ... 01
1.1 Candida parapsilosis como patógeno humano ... 02
1.2 Variabilidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis ... 08
1.3 Fatores de virulência ... 12
1.4. C. parapsilosis e resistência a antifúngicos ... 17
2.OBJETIVOS ... 20
3. MATERIAL E MÉTODOS... 22
3.1 Seleção das amostras ... 23
3.2 Verificação de viabilidade e pureza das leveduras armazenadas no LEMI e identificação fenotípica das amostras ... 23 3.3 Tipagem molecular dos isolados de hemocultura ... 24
3.3.1 Formação de protoplastos e extração do DNA ... 24
3.3.2 Tratamento do DNA com RNAse ... 25
3.3.3. Quantificação do DNA ... 26
3.4.2 Avaliação da similaridade dos padrões de bandas ... 28
3.5 Seqüenciamento da região ITS ... 28
3.5.1. Reação de seqüenciamento ... 29
3.6 Seleção das amostras de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis para a análise comparativa das características fenotípicas ... 31 3.6.1 Análise de micromorfologia das colônias ... 31
3.6.2 Determinação do crescimento em caldo hipertônico ... 32
3.6.3 Teste de crescimento de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis à temperatura de 42° C em SDA ... 32 3.6.4 Provas bioquímicas: Sistema de ID32 C (API – bioMérrieux Marcy-I’Étoile, França) ... 32 3.6.5 Formação de biofilme ... 33
3.6.6 Coloração do biofilme pelo cristal violeta ... 34
3.7 Testes de susceptibilidade a antifúngicos ... 35
3.8 Análise dos resultados ... 37
4. RESULTADOS ... 38
4.1 Seleção, viabilidade e pureza das amostras ... 39
4.2 Identificação genotípica de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis através da técnica de RAPD ... 40 4.2.1 Prevalência das espécies entre as amostras analisadas neste estudo ... 42
4.3 Análise comparativa de características fenotípicas de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis ..... 43 4.3.1 Avaliação da tolerância dos isolados à temperatura de 42°C ... 44
4.3.5 Teste de susceptibilidade das cepas de , e
metapsilosis frente a vários antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo ..
47
4.3.6 Produção de biofilme por C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis .
49
5.0 FIGURAS ... 51
Figura 1. Gel de agarose exibindo padrões genotípicos de isolados de leveduras
amplificados pela técnica de RAPD ...
52
Figura 2. Dendrograma construído a partir dos perfis de bandas de 19 isolados
de leveduras, gerados a partir de RAPD ...
53
Figura 3. Dendrograma construído a partir dos perfis de bandas dos 138 isolados
de leveduras ...
54
Figura 4. Prevalência de isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis ...
55
Figura 5. Micromorfologia de três cepas distintas de C. parapsilosis ... 56
Figura 6. Produção de biofilme dos isolados de C.parapsilosis, C. orthopsilosis e
C. metapsilosis ...
57
6.0TABELAS ... 58
Tabela 1. Valores de ponto de corte sugeridos para interpretação de testes de ssusceptibilidade de leveduras ...
59
Tabela 2. Distribuição geográfica dos isolados de leveduras identificados
fenotipicamente como C. parapsilosis ...
60
Tabela 3. Prevalência das espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis nos centros médicos que contribuíram com amostras de leveduras ..
61
Tabela 4. Lista de isolados selecionados para estudo comparativo do perfil
fenotípico entre C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis ...
63
Tabela 6. Porcentagem de assimilação das fontes de carbono testadas no ID32 C 64
Tabela 7. Padrão de susceptibilidade dos isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis a seis antifúngicos ...
65
Tabela 8. Análise da produção de biofilme entre as cepas das espécies C.
parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis ...
66
7.0. DISCUSSÃO ... 67
8.0 CONCLUSÕES ...
82
9.0 ANEXOS ... 84
10.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 99
C.: Candida
Ca2+ : ions cálcio
Céls/mL: Células por mililitro
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dATP: desoxiadenosina trifosfato
dCTP: desoxicitosina trifosfato
dGTP: desoxiguanosina trifosfato
dTTP: desoxitimidina trifosfato
dNTP: Desoxinucleosídeo
DO: Densidade óptica
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
et al: Colaboradores
g: Gramas
g/L: Gramas por litro
h: Horas
HCl: Ácido clorídrico
M: Molar
mA: mili Amperagem
mm: milímetro
mM: Milimolar
μg/mL: micrograma por mililitro.
Mg2+: ions magnésio
MgCl2: Cloreto de magnésio
mg: Miligrama
mg/mL: Miligrama por mililitro
mg/L: Miligrama por litro
μL: Microlitro
mL: Mililitro
MOPS: Ácido morfolinopropanosulfônico
No: Número
NaCl: Cloreto de sódio
ng: Nanograma
ng/μL: Nanograma por microlitro
nm : Nanômetro
nmol: Nanomol
P: Probabilidade de um evento ocorrer ao
acaso
PBS: Solução salina tamponada
pH: Potencial hidrogeniônico
pmol: Picomol
q.s.p: Quantidade suficiente para
®: marca registrada.
rDNA: Ácido desoxirribonucléico
ribossomal
RNA: Ácido ribonucleíco
RNAse: Ribonuclease
rpm: rotações por minuto
spp.: éspecie
TAE: Tris acetato EDTA
TM
: Trade mark
UV: Ultra violeta
Volts: unidade de corrente elétrica
YEPD: Yeast extract peptone dextrose.
X: Vezes
x: Versus
%: Por cento
> Maior
< Menor
≥ Maior que ou igual a ≤ Menor que ou igual a = igual
RESUMO
Introdução: Isolados de C. parapsilosis são fisiologicamente indistinguíveis, mas geneticamente heterogêneos. Em estudo recente, baseado em variações da seqüência de DNA observada entre os grupos, Tavanti et al. (2005) propuseram que cada um desses grupos fossem considerados espécies distintas, C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis, respectivamente. Objetivos: 1) Avaliar, através da técnica de RAPD, a prevalência dessas espécies em isolados de ICS de várias regiões do Brasil; 2) Verificar o comportamento fenotípico dessas espécies, a fim de averiguar possíveis diferenças em relação ao perfil metabólico, sensibilidade a antifúngico e produção de biofilme. Material e
Métodos: 141 cepas, identificadas previamente através de testes fenotípicos como C. parapsilosis, foram analisadas utilizando a técnica de RAPD para identificação de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis utilizando o iniciador 1281. As cepas identificadas como C. orthopsilosis e C. metapsilosis tiveram a região ITS do rDNA seqüenciada para confirmação da identidade. Posteriormente, as amostras encontradas como C. orthopsilosis, C. metapsilosis e 24 cepas de C. parapsilosis foram avaliadas em relação aos seguintes testes fenotípicos: i) micromorfologia, ii) crescimento em caldo hipertônico, iii) tolerância à temperatura de 42° C, iv) perfil bioquímico utilizando o sistema ID32 C, v) teste de susceptibilidade a antifúngicos (TSA) pelo método de microdiluição em caldo, utilizando anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol, 5-fluorocitosina e caspofungina, vi) produção e quantificação de biofilme pelo método de coloração com cristal violeta. Resultados: 124 (87,9%) isolados foram identificados como C. parapsilosis, 13 (9,2%) isolados como C. orthopsilosis e 4 (2,9%) como C. metapsilosis. Não foi possível a identificação de apenas 3 isolados pela técnica de RAPD, porém sua identificação foi confirmada como C. orthopsilosis através de seqüênciamento da região ITS do rDNA. O comportamento dos isolados das 3 espécies foi semelhante em relação ao crescimento em alta temperatura e alta concentração salina. Não houve diferenças micromorfológicas relevantes entre as espécies. Através do sistema de ID32 C, foi possível observar que somente 3 isolados de C. metapsilosis (60%), foram tolerantes a actidiona e 1 (20%) assimilou o açúcar ribose. Quanto ao TSA, a ocorrência de resistência entre os isolados foi vista somente para 2 cepas frente a 5-fluorocitosina. Em relação ao biofilme, 60% (15) das cepas de C. parapsilosis foram fortes produtoras de biofilme
seguidas de 14,3% (2) das cepas de C. orthopsilosis. Todos os isolados de C.
ABSTRACT
Introduction: Candida parapsilosis strains are physiologically similar but genetically different. Some studies based on molecular methods clearly divided C. parapsilosis into three different groups (I, II and III). Recently, Tavanti et al. (2005) detected coding genes polymorphisms and suggested the replacement of the old nomenclature of C. parapsilosis
groups I, II and III into 3 new species: Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis and
Candida metapsilosis, respectively. Objectives: 1) To evaluate the prevalence of these species within blood stream isolates from different Brazilian geographic areas using RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA); 2) To study phenotypic characteristic of these 3 species to evaluate possible differences on biochemical profile, susceptibility to antifungal drugs and biofilms production. Material and Methods: Species identification by RAPD using the primer 1281 was carried out for isolates previously identified as C. parapsilosis. RAPD identification confirmation of C. orthopsilosis e C. metapsilosis was done by sequencing the ITS region. Four C. metapsilosis, 13 C. orthopsilosis and 24 C. parapsilosis
strains were subjected to the following phenotypic tests: i) micromorphology, ii) hypertonic broth growing, iii) tolerance to 42oC, iv) biochemical profiling using ID32 C system, v) microdilution broth susceptibility testing to amphotericin B, itraconazole, voriconazole, 5-fluorocitosine and caspofungin, vi) Production and quantification of biofilm formation by crystal violet method. Results: 124 (87.9%) isolates were identified as C. parapsilosis, 13 (9.2%) as C. orthopsilosis and 4 (2.9%) as C. metapsilosis. The RAPD technique was not able to identify three isolates as C. orthopsilosis, but this was possible by sequencing the ITS region. No differences were detected among the strains under the high temperature and saline concentration growing conditions. We did not verify major micromorphological differences among the species. Three (60%) C. metapsilosis isolates were tolerant to actidione and one (20%) of them assimilated ribose on ID32C system. Two strains were resistant to 5-fluorocitosine. Fifteen (60%) C. parapsilosis and 2 (14%) C. orthopsilosis
Gonçalves, Sarah Santos
Caracterização fenotípica dos diferentes genótipos de Candida parapsilosis isolados de hemocultura. / Sarah Santos Gonçalves - São Paulo, 2007.
xx 117f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Phenotypic characterization of different genotypes of
Candida parapsilosis isolated strains from hemocultura.
1.1 Candida parapsilosis como patógeno humano
A Candida parapsilosis é uma espécie emergente, oportunista e
importante patógeno nosocomial que causa candidíase superficial e sistêmica. Foi
considerada como levedura não-patogênica até 1940 quando foi relatado o primeiro caso
fatal de endocardite por C. parapsilosis em um paciente usuário de drogas ilícitas (Joachin
e Palayes, 1940). Embora menos comum que C. albicans, C. parapsilosis pode causar
candidíase hematogênica, vaginite, peritonite, candidíase oral, infecção do trato urinário,
artrite séptica, endocardite e outras complicações (Chen et al., 2006; Legout et al., 2006;
Rodriguez et al., 2006; Vasquez et al., 2002; Diekema et al., 1997; Weems, 1992).
Infecções sistêmicas por este agente têm sido relacionadas à contaminação de soluções
de nutrição parenteral (devido à sua capacidade de proliferar em soluções contendo
glicose), dispositivo de monitoramento de pressão intravascular e cateteres vasculares em
posição central (devido à aderência em materiais sintéticos) (Al-Tawfiq, 2006; Brito et al.,
2006; Medrano et al., 2006; Nakamura e Takahashi, 2006; Bonassoli et al., 2005; Duran et
al., 2005; Clark et al., 2004; Weems, 1992).
Atualmente, as candidemias estão entre as principais infecções
nosocomiais, devido ao aumento no número de hospitalizações, cirurgias de alto risco,
depressão imunitária secundária à doença de base ou distúrbios metabólicos do
hospedeiro, fatores iatrogênicos relacionados aos procedimentos médicos invasivos,
quimioterapia e abuso na utilização de antibióticos de amplo espectro (Brito et al., 2006;
Gudlaugsson et al., 2003; Saiman et al., 2001; Colombo et al., 1999; Rangel-Frausto et al.,
1999; Abi-said et al., 1997; Pfaller et al., 1996). Apesar de avanços nos tratamentos
antifúngicos, a mortalidade por candidemia tem-se mantido alta, da ordem de 50%
(Aquino et al., 2005; Hajjeh et al., 2004; Gudlaugsson et al., 2003). Evidências sugerem
que Infecções da Corrente Sangüínea (ICS) causadas por Candida spp. têm se tornado o
maior problema em hospitais terciários em todo o mundo (Almirante et al., 2006; Colombo
Durante a década de 1980, a infecção por Candida spp. apresentava-se
como a sétima causa mais freqüente de infecções nosocomiais nos Estados Unidos (EUA)
(Pfaller, 1996). No período entre 1986 a 1990, este gênero encontrava-se entre os cinco
primeiros agentes isolados em hemoculturas de pacientes internados (Pfaller et al., 1998).
Já na década de 1990, de acordo com os dados obtidos por Pfaller et al. (1998) através do
programa SCOPE (Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological), realizado
em 50 centros médicos dos EUA, Candida spp. passou a ocupar a quarta posição na
categoria de infecções nosocomiais mais freqüentes, responsável por 8% (379) dos 4.725
episódios de ICS obtidos nessas instituições. Nesta casuística, C. parapsilosis foi
encontrada em 8% (30) dos pacientes com candidemia, posicionando-se entre as
espécies de Candida mais freqüentes. Em estudo recente, conduzido por Wisplinghoff et
al. (2004), reunindo dados de 40 hospitais terciários de várias regiões dos EUA, foram
analisados um total de 24.179 episódios de bacteremias e fungemias documentados entre
março de 1995 a setembro de 2002. Candida respondeu por 9% (1890) das ICS,
posicionando-se após os casos de bacteremia por Staphylococcus coagulase-negativo
(31%), Staphylococcus aureus (20%) e Enterococcus spp. (9%). Entre as espécies de
Candida mais comum, C. parapsilosis foi a terceira espécie mais prevalente, detectada
em 11% (208) dos casos de candidemia. Nos EUA, alguns estudos encontraram grande
variação na prevalência de C. parapsilosis como agente causador de ICS, com taxas
variando entre 7 e 21% (Diekema et al., 2002; Kao et al., 1999)
Vários estudos têm demonstrado alta incidência de candidemia na
Europa. Alguns trabalhos relataram que C. parapsilosis é responsável por
aproximadamente 19% das ICS por Candida neste continente (Almirante et al., 2006;
Bassetti et al., 2006; Bedini et al., 2006; Messer et al., 2006; Rodriguez et al., 2006; San
Miguel et al., 2006; Tortorano et al., 2004; Pfaller et al., 2001). Dois estudos, um na Irlanda
(Asmundsdottir et al., 2002) e outro em Barcelona (Almirante et al., 2005), registraram uma
incidência similar de ICS causadas por patógenos do gênero Candida de 4,9 casos por
100.000 habitantes. Nestes estudos, C. parapsilosis foi responsável por 9,6% (17) em 172
episódios de candidemia e 23% de 341 casos de ICS por Candida, respectivamente. Em
outros trabalhos, Almirante et al. (2006) analisaram a epidemiologia e a incidência de
fungemias em Barcelona, Espanha, no período de 2002 a 2003 e observaram que C.
parapsilosis tem emergido como uma importante espécie de levedura causando ICS. Um
total de 78 episódios de candidemia por esta espécie foi documentado e comparado com
um grupo controle de 175 casos de ICS por C. albicans. Análise multivariada dos dados
demonstrou que entre os fatores predisponentes à ICS por C. parapsilosis estão:
pacientes neonatos (Odds Ratio [OR]=7,5 e P=0,002), pacientes submetidos à transplante
(OR=9,2 e P=0,05), pacientes com história prévia de terapia com antifúngicos (OR=5,4 e
P=0,002) e aqueles recebendo nutrição parenteral (OR=2,2 e P=0,028). Em um estudo
recentemente conduzido na Dinamarca, no período de maio de 2002 a abril de 2003, foi
demonstrada uma estimativa anual alta de fungemias, com incidência de 11
casos/100.000 habitantes (Arendrup et al., 2005). Até o momento, esta espécie tem uma
menor prevalência documentada na Turquia (12,5%) (Yapar et al., 2006) e Noruega (6%)
(Sandven et al., 2006).
C. parapsilosis responde hoje por um número significante de infecção
hematogênica em hospitais na América Latina. Nesta região, este patógeno tem sido
considerado o principal representante de espécies de Candida não-albicans em episódios
de fungemia (Colombo et al., 2006; Medrano et al., 2006; Pfaller et al., 2004; Godoy et al.,
2003; Pfaller et al., 2001; Colombo et al., 1999).
Na Argentina, Giusiano et al. (2006), em um estudo epidemiológico
para verificar os agentes causadores de candidemia, isolaram cepas de culturas de
sangue de pacientes pediátricos hospitalizados na UTI e unidade oncológica. Foram
documentados 54 isolados do gênero Candida (45 da UTI e 9 da oncologia), sendo C.
albicans (40,8%) a espécie mais comumente encontrada seguida por C. parapsilosis
(26,6%) e C. tropicalis (15%).
Colombo et al. (2006) conduziram estudo prospectivo de fungemias e
bacteremias de março de 2003 a dezembro de 2004, em 11 centros médicos localizados
quarto agente etiológico mais comumente encontrado em hemoculturas, precedido por
Staphylococcus coagulase-negativo (11,97/1000 admissões), Staphylococcus aureus
(7,31/1000 admissões) e Klebsiella pneumoniae (2,92/1000 admissões). Foi documentado
um total de 712 episódios de candidemia com uma incidência de 2,49 casos por 1000
admissões e 0,37 casos por 1000 pacientes-dia. C. albicans foi a espécie mais encontrada
(40,9%), seguida de C. tropicalis (20,9%), C. parapsilosis (20,5%) e C. glabrata (5%). Na
população pediátrica a ocorrência de C. parapsilosis foi maior que C. tropicalis, 21 e 15%,
respectivamente.
Várias casuísticas demonstram que C. parapsilosis é a segunda
espécie de Candida mais freqüentemente isolada de hemoculturas na população
pediátrica na Europa, Canadá e América Latina (Almirante et al., 2006; Barchiesi et al.,
2007; Colombo et al., 2006; Messer et al., 2006; Spellberg et al., 2006; Peman et al., 2005;
Hajjeh et al., 2004; Tortorano et al., 2004; Pappas et al., 2003). As razões dessa ampla
variação de prevalência da espécie de C. parapsilosis não estão claras, mas podem está
relacionadas às diferenças na composição das casuísticas em relação à faixa etária,
doenças de base, bem como diferenças nos procedimentos hospitalares como, por
exemplo, os cuidados adotados pelos profissionais de saúde no manuseio de cateter
venoso central (Pappas et al., 2004; Colombo e Guimarães, 2003). Além disso, é
importante observar que a prevalência de cepas de C. parapsilosis relacionadas à
infecção humana sofre influências regionais, provavelmente em decorrência de diferenças
climáticas (Colombo et al., 2006; Hajjeh et al., 2004; Colombo et al., 1999).
Algumas espécies de fungos são importantes elementos da microbiota
humana (Bengmark, 1998). Acredita-se que a maioria dos casos de candidemia seja
adquirida por via endógena, pela translocação do agente através do trato gastrointestinal,
local onde há rica colonização por Candida spp. em até 70% da população normal
(Colombo e Guimarães, 2003). A maior parte das candidemias é precedida pelo evento de
colonização pela mesma espécie de levedura, que é considerado um fator de risco
independente para o seu desenvolvimento (Yamaguchi, et al., 2006; Colombo e
Guimarães, 2003). Qualquer variável que provoque desequilíbrio da microbiota ou lesão
da mucosa gastrointestinal pode ser um agente facilitador de translocação de Candida spp
até os capilares mesentéricos (Tortorano et al., 2004; Pittet et al., 1997; Alexander et al.,
1990; Wey et al., 1989). Sendo assim, fatores que aumentem a colonização intestinal por
Candida (uso de antibióticos, oclusão intestinal) ou determinem atrofia ou lesão de
mucosa intestinal (jejum prolongado, uso de nutrição parenteral total, hipotensão,
quimioterapia) podem potencializar o fenômeno de translocação no tubo gastrointestinal
(Alexander et al., 1990). Vários estudos demonstraram ICS relacionadas à translocação
gastrointestinal de algumas espécies de Candida (Tortorano et al., 2004; Pittet et al., 1997;
Wey et al., 1989).
Apesar da relevância da candidemia por aquisição endógena de
Candida spp., vários estudos relatam a aquisição de candidemia a partir de fontes
exógenas, relacionadas a surtos de infecção hospitalar. C. parapsilosis pode ser
considerado um patógeno de aquisição exógena, possivelmente adquirida por fluídos ou
biomateriais contaminados, bem como através da colonização de cateter venoso central
pela própria microbiota do paciente ou mesmo dos profissionais durante sua manipulação
(Almirante et al., 2006, Bakir et al., 2006; Brito et al., 2006; Duran et al., 2005; Clark et al.,
2004; Pfaller et al., 1997; Pfaller et al., 1996; Pfaller, 1995; Sanchez et al., 1993; Weems,
1992).
Brito et al. (2006), em um estudo observacional de candidemia em
quatro hospitais de São Paulo, analisaram dados epidemiológicos com o intuito de avaliar
fatores de risco associados à fungemia por C. parapsilosis e C. albicans, sendo
selecionados 282 casos. Desses episódios, 107 (37,9%) tiveram como agente C. albicans,
67 (23,8%) C. parapsilosis e 108 (38,3%) outras espécies de Candida. O câncer foi a
doença de base mais freqüentemente encontrada em ambos os grupos (27% no grupo
com C. parapsilosis e 22% no grupo com C. albicans). Foi observado que pacientes em
uso de quimioterapia são mais propensos a desenvolver candidemia por C. parapsilosis
em virtude da presença de cateter venoso central de longa permanência. De acordo com a
análise multivariada realizada neste estudo, o uso deste tipo de cateter foi a única variável
de confiança 1,28-10,70). Segundo os autores, esses dados suportam a idéia de que uma
fonte externa seja o principal modo de aquisição de candidemia por C. parapsilosis.
Essa levedura é a espécie mais comumente recuperada de mãos de
profissionais da saúde (Mediratta et al., 2006; Saiman et al., 2001; Diekema et al., 1997).
Estudo realizado por Sanchez et al. (1993) no Hospital Harper (Michigan, EUA) relatou a
transmissão de C. parapsilosis através das mãos destes profissionais. Para identificar os
aspectos epidemiológicos das infecções nosocomiais por esta espécie, os autores
realizaram culturas de material proveniente de diferentes sítios dos pacientes admitidos na
unidade de transplante de medula óssea e na unidade de terapia intensiva (UTI), como
também de superfícies inanimadas e mãos dos profissionais de saúde. Com a utilização
de métodos genotípicos, foram identificados três padrões geneticamente distintos em 32
cepas analisadas. O mesmo padrão de bandas foi idêntico entre quatro amostras de
pacientes, três dos membros da equipe hospitalar e duas de superfícies inanimadas, o que
sugere que a provável fonte de contaminação partiu da manipulação dos profissionais de
saúde.
Barchiesi et al. (2004) reportaram um surto de candidemia por C.
parapsilosis em seis pacientes de uma unidade de oncologia pediátrica do Hospital
Universitário da Itália. Foram isoladas cepas da mesma espécie do meio ambiente, mãos
e unhas de profissionais de saúde. Através da cariotipagem eletroforética, foi verificada a
presença de um único padrão genotípico para cepas isoladas de quatro pacientes e de
mãos de alguns profissionais de saúde. Estes resultados confirmaram que esses
profissionais são a principal rota de transmissão implicada neste surto de C. parapsilosis.
Estudo realizado por Bonassoli et al. (2005), em um Hospital
Universitário de Maringá, Paraná, relatou a ocorrência de 59,3% de leveduras isoladas das
mãos de 62 indivíduos saudáveis que trabalhavam em hospitais e 24 indivíduos da
comunidade com outro tipo de ocupação. C. parapsilosis foi a espécie mais
freqüentemente isolada (51%) independente da origem das amostras, demonstrando,
assim, que pessoas saudáveis podem ser colonizadas por leveduras, sugerindo o risco de
infecção a indivíduos susceptíveis.
Concluindo, na história natural de fungemia por C. parapsilosis, há
fortes indícios de que sua origem seja predominantemente exógena, diferente da C.
albicans cuja principal origem é endógena. Neste contexto, podemos inferir que C.
parapsilosis é um microrganismo que pode desencadear infecções invasivas,
particularmente, em pacientes em uso de cateter venoso central que recebem nutrição
parenteral e imunocomprometidos.
1.2 Variabilidade genotípica entre isolados de C. parapsilosis
A identificação de organismos infectantes ao nível de espécie tem se
tornado cada vez mais importante devido a uma série de razões. Não só a distribuição de
espécies de Candida tem mudado nos últimos anos, como também a susceptibilidade a
agentes antifúngicos. A análise dos caracteres genotípicos dos microrganismos constitui
grande avanço para caracterização das espécies em diferentes grupos de patógenos,
permitindo também a avaliação de variabilidade intra-específica entre as amostras. O
desenvolvimento de ferramentas da biologia molecular contribui para solucionar os
complexos agrupamentos taxonômicos, trazendo como principal contribuição o melhor
conhecimento das relações evolutivas (Guarro et al., 1999). Vale mencionar ainda, que
tais técnicas sejam fundamentais para identificação correta dos microrganismos
estudados, contribuindo para definir a ocorrência de surtos e possibilitar a identificação de
possíveis fontes de infecção, fato importante para permitir o estabelecimento de medidas
eficazes para o controle de infecções hospitalares (Valério et al., 2006; Boldo et al., 2003;
Resende et al., 2002; Melo et al., 1998; Sullivan et al., 1996; Pfaller, 1995). Entre as
a cariotipagem realizada com eletroforese em campo pulsátil (Pulsed Field Gel
Electrophoresis–PFGE), análise das seqüências de nucleotídeos de genes ribossômicos
(Sader, 1995), análise de fragmentos de restrição de DNA e hibridização com sondas
específicas de DNA entre outras (Pinto et al., 2004).
Sherer e Stevens (1987), aplicando ensaio de análise das variações
de tamanho de fragmentos de DNA gerados por digestão com enzimas de restrição
(Restriction Fragments Lengths Polymorphism-RFLP) em amostras de Candida, revelaram
três grupos geneticamente distintos de C. parapsilosis. Os dados, a partir deste estudo,
sugeriram que C. parapsilosis é genotipicamente mais heterogênea que C. albicans e C.
tropicalis. Lehmann et al. (1992), com base no uso de RAPD, relatou a presença de três
grupos geneticamente distintos de C. parapsilosis entre isolados provenientes de origens
diferentes.
Lin et al. (1995) examinaram 45 isolados clínicos de C. parapsilosis que
eram fisiologicamente iguais quando testados pelo kit API 20 C® e reportaram a presença de 3 padrões genotípicos diferentes resultantes da análise de isoenzimas, perfis de RAPD
e seqüências da região ITS (Internal Transcribed Spacers) do gene rDNA. Estes autores
utilizaram as seqüências das regiões ITS1, ITS2 e 5.8S do gene rDNA para a inferência
filogenética dos grupos de C. parapsilosis e encontraram várias diferenças na
comparação das seqüências ITS1. Neste estudo, o padrão genotípico do grupo I foi
detectado na maioria das amostras, seguido pelo do grupo II e III, respectivamente.
Diferenças fenotípicas também foram encontradas, como a não assimilação de D-xilitol
pelo grupo I e II, o que resultou no código 6756171 de identificação do kit API 20 C®, enquanto que os únicos dois isolados do grupo III assimilaram fortemente este açúcar,
sendo identificados pelo código 6776171.
Melo et al. (1998), utilizando o RAPD, relataram a presença de C.
parapsilosis do grupo I e II entre 13 isolados brasileiros de hemocultura, sendo o grupo I
predominante entre as amostras estudadas. Song et al. (2005) obtiveram resultados
semelhantes, utilizando a mesma técnica, em um estudo realizado na Coréia do Norte.
Vários estudos demonstraram a utilidade do RAPD na identificação dos
diferentes grupos de C. parapsilosis. Zancopé-Oliveira et al. (2000) analisaram 8 casos de
fungemia causados por C. parapsilosis no Rio de Janeiro, utilizando RAPD e cariotipagem
eletroforética. Todos os isolados dos pacientes, e uma cepa adicional de solução de
alimentação parenteral, foram avaliados para verificar a relação genética entre eles.
Ambas as técnicas mostraram-se eficazes na identificação dos grupos de C. parapsilosis e
da rota de transmissão. A fungemia causada por C. parapsilosis em três dos oito pacientes
resultaram de uma fonte de infecção comum, ou seja, da solução de infusão parenteral.
Ambas as técnicas demonstraram que as cepas dos três pacientes e da solução foram
similares à C. parapsilosis do grupo II. Entretanto, o RAPD demonstrou um poder
discriminatório melhor quando comparado à cariotipagem. O RAPD tem sido considerado
um método seguro para a identificação genotípica de C. parapsilosis e uma ferramenta
importante para identificação de outras espécies de Candida (Melo et al., 1998; Valério et
al., 2006).
Dassanayake e Samaranayake (2000) observaram vantagem
significativa do RAPD quando comparado ao RFLP em um estudo sobre a diversidade
genotípica entre 15 isolados sistêmicos e superficiais de C. parapsilosis. O RAPD
apresentou melhor poder discriminatório inter-específico nos 15 isolados testados por
estes autores produzindo 10 genótipos distintos.
Uma sonda espécie-específica para C. parapsilosis (Cp3-13) foi
desenvolvida por Enger et al. (2001). Estes autores analisaram 89 isolados desta espécie,
sendo 78 não relacionados quanto à região geográfica de origem. Estas amostras foram
submetidas às técnicas de RAPD e RFLP, sendo a hibridização com a sonda Cp3-13
realizada após dupla clivagem do DNA genômico com as enzimas EcoR I e SaI II. Os
resultados apresentaram capacidade de aglutinação e de identificação de três grupos
dessa espécie por ambas as técnicas, reforçando a idéia de C. parapsilosis pode ser
Recentemente, Tavanti et al. (2005) relataram divergências entre cepas
de C. parapsilosis ao realizarem comparação das seqüências de 11 genes essenciais pelo
método MLST (Multilocus Sequence Typing). Os produtos de PCR (Polymerase Chain
Reaction) destes genes, quando seqüenciados, apresentaram diferenças na seqüência de
apenas quatro deles: COX3, LIA1, SADH e SYAQ diferenciando C. parapsilosis nos
grupos I, II e III. A análise filogenética baseada no polimorfismo das seqüências destes
genes consistentemente separou os isolados em 3 subgrupos distintos. A similaridade
inferior a 90% encontrada na seqüência da região ITS1 (82,5% [grupo I x grupo III], 88,1%
[grupo I x grupo II] e 86,1% [grupo II x grupo III], juntamente com as características
descritas anteriormente, sugeriram que os subgrupos gerados deveriam ser classificados
como novas espécies. Sendo assim, foi proposto uma reclassificação de C. parapsilosis
grupo II e III em espécies distintas: Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis,
respectivamente.
Uma vez que métodos fenotípicos tradicionais não distinguem C.
orthopsilosis e C. metapsilosis, vários métodos moleculares mostram-se eficazes para a
caracterização dessas novas espécies antes identificadas como C. parapsilosis. Entre
eles, o RAPD se destaca pelas suas vantagens sobre os outros procedimentos
moleculares para tipagem de Candida spp., incluindo simplicidade na execução, uma
maior rapidez, detecção de polimorfismos genéticos sem necessidade de conhecimento
prévio das seqüências das espécies a serem estudadas, possibilidade de análise de uma
ampla variedade de espécies, além de permitir a avaliação de um grande número de
amostras (Valério et al., 2006; Sullivan et al., 1996; Cobb e Clarkson, 1994; Coutinho et
al., 1993; Lehmann et al., 1992; Williams et al., 1990; Skolnick e Wallace, 1988). De
acordo com alguns autores, o aumento no número de infecções nosocomiais causadas
por espécies de Candida requer, urgentemente, um procedimento eficiente e rápido que
permita a identificação de espécie (Pinto et al., 2004; Boldo et al., 2003, Resende et al.,
2002). Portanto, as características apresentadas pela técnica de RAPD, a tornam
uma ferramenta de grande utilidade na identificação de espécies, principalmente do
complexo C. parapsilosis. A identificação correta destas espécies permite instituir
medidas corretas de prevenção e tratamento para tais agentes.
1.3 Fatores de virulência
C. parapsilosis é um microrganismo ubíquo que tem sido isolado de
várias fontes ambientais, incluindo solo e água do mar (de Bernardis et al., 1999; Pipper et
al., 1998; Weems, 1992). Pode ser encontrado também em superfícies epiteliais e da
mucosa, tais como pele e unhas onde são normalmente considerados parte da microbiota
do homem (de Bernardis et al., 1999).
Estudos experimentais mostraram que cepas de C. parapsilosis são
menos virulentas que C. albicans e C. tropicalis. Em um trabalho conduzido por Mellado et
al. (2000) foi avaliado a capacidade de 9 isolados clínicos de espécies de Candida (3 de
C. albicans, 3 de C. tropicalis e 3 de C. parapsilosis) de colonizar o trato gastrointestinal e
causar infecção. Eles verificaram, também, o impacto da suplementação dietética dos
animais com tetraciclina e glicose sob o perfil microbiológico e a colonização intestinal. As
cepas foram inoculadas nos animais por gavagem concomitantemente com dois padrões
de suplementação dietética: antibiótico e glicose. A tetraciclina e a glicose alteraram
substancialmente a microbiota aeróbia, especialmente a estreptocócica. Depois de duas
semanas, os autores observaram uma alta colonização do trato gastrointestinal pelas
espécies de Candida nos camundongos que receberam a suplementação. Secções
histológicas do estômago desses animais revelaram micro abscessos intraepiteliais com
presença de hifas. Sobre imunossupressão, a disseminação sistêmica de C. albicans e C.
tropicalis foram observadas em 62 e 24% dos animais que receberam suplementação
dietética, respectivamente. Neste estudo, não foram observadas disseminações nos
animais infectados por C. parapsilosis.
A patogenicidade relativa de oito espécies de Candida de importância
médica foi investigada em modelo animal por Arendrup et al. (2002). Foram incluídos
neste estudo 17 isolados de Candida, sendo 2 de C. albicans, 2 de C. glabrata, 2 de C.
tropicalis, 2 de C. lusitanae, 2 de C. parapsilosis, 2 de C. Kefyr, 2 de C. guilliermondii e 3
inoculados com 105 e 107 unidades formadoras de colônia (UFC), respectivamente. Nos dias 2 e 7, os pesquisadores removeram os rins para verificar a UFC/g. A mortalidade foi
documentada somente em camundongos infectados com C. albicans e C. tropicalis. A
média do log da UFC/g de rim dos camundongos inoculados com 107 UFC de C. tropicalis, C. glabrata, C. kerfyr, C. lusitanea, C. parapsilosis, C. krusei e C. guilliermondii foi
significativamente diferente (P<0,0001) entre as espécies estudadas. Mudanças
histológicas nos rins também foram verificadas. Os autores observaram que a virulência
das espécies estudadas pode ser dividida em 3 grupos em ordem decrescente de
patogenicidade: 1) C. albicans e C. tropicalis, 2) C. glabrata, C. kerfyr e C. lusitanea e 3)
C. parapsilosis, C. krusei e C. guilliermondii.
Em estudo clínico, Pappas et al. (2003) investigaram o índice de
mortalidade de pacientes com ICS por espécies de Candida. Neste estudo, pacientes
adultos com candidemia por C. parapsilosis tinham menores índices de mortalidade (24%
x 46%; P<0,001) e menores índices de mortalidade atribuída (2% x 12%; P<0,001) do que
outras espécies de Candida. Na população infantil desse mesmo estudo, foi relatada a
mesma tendência, ou seja, baixos valores de mortalidade e mortalidade atribuída quando
comparados a outras espécies de Candida (15% x 28%; P=0,08) e (4% x 12%; P=0,219),
respectivamente.
Apesar dos dados apresentados acima, Brito et al. (2006) estudaram
aspectos clínicos de candidemia devido à infecção por C. parapsilosis e C. albicans. A
mortalidade dos pacientes com candidemia devido à C. parapsilosis foi significativamente
menor (45% C. parapsilosis x 62% C. albicans; P=0,03). Entretanto, quando o APACHE II
score foi incluído em modelo multivariado de análise de risco para óbito, C. parapsilosis
não apresentou mortalidade significativamente menor que C. albicans. Entre os pacientes
tratados com antifúngicos, a taxa de mortalidade foi 49% em C. parapsilosis e 51% em C.
albicans (P=0,79).
Os dados apresentados sugerem que apesar da menor patogenicidade
de C. parapsilosis em modelos experimentais, em pacientes críticos esse patógeno pode
causar doença disseminada e óbito.
Importante realçar que a virulência de C. parapsilosis não é bem
caracterizada na literatura. Supõe-se que determinantes de virulência de todas as
espécies patogênicas do gênero Candida sejam similares à C. albicans (Haynes, 2001).
Entretanto, em contraste à C. albicans, infecções por C. parapsilosis podem ocorrer sem
colonização prévia dos pacientes (Shin et al., 2001), principalmente em neonatos e
pacientes de UTIs (Bassetti et al., 2006; Fridkin et al., 2006; Levy et al., 1998). Acredita-se
que alguns fatores são importantes para colonização e infecção por este agente, entre
eles, a produção e secreção de aspartil-proteinase, bem como a capacidade de adesão a
materiais médicos, produção de polissacarídeos extracelulares e a habilidade de formar
biofilme (Merkerová et al., 2006; Kojic e Darouiche, 2004; Kuhn et al., 2004; Haynes,
2001).
C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis podem ser distinguidas de
outras leveduras pela secreção de proteinase in vitro. Em relação à C. albicans e C.
tropicalis, a atividade secretória proteolítica é considerada um importante fator na
virulência dessas espécies (Medrano et al., 2006; Nakamura e Takahashi, 2006;
Calderone, 2002; Shin et al., 2002). Para C. parapsilosis, a correlação entre atividade
proteolítica e virulência ainda não foi estabelecida. De acordo com o potencial proteolítico
desta espécie, a virulência é baixa in vitro, assim como em animais e em alguns cenários
de doença em humanos (Rüchel et al., 1986).
A habilidade de produzir biofilme está fortemente associada com a
habilidade de causar infecção e, desta forma, pode ser considerada um importante
determinante de virulência durante a infecção por Candida spp.
Os biofilmes são estruturas complexas, formadas de microrganismos
células fúngicas primeiro aderem a estas por intermédio de fatores não específicos
(hidrofobicidade da superfície da célula e forças eletrostáticas) e fatores específicos do
hospedeiro, tais como proteínas do soro (fibronectina e fibrinogênio). Em seguida, as
células aderidas ao substrato se dividem formando microcolônias e desenvolvem o
biofilme, que são notadamente difíceis de eliminar (Ramage et al., 2005; Donlan, 2002).
Nos biofilmes, os organismos encontram-se envolvidos em uma densa matriz de
exopolissacarídeos, habitando algumas superfícies (Blankenship e Mitchell, 2006; Adam et
al., 2002), particularmente, aquelas de sistemas de água, ambientes aquáticos, assim
como, dispositivos médicos hospitalares. Dessa maneira, os biofilmes são altamente
relevantes para a saúde pública. Esta matriz de polissacarídeos pode ser composta de
populações que se desenvolvem a partir de uma única espécie ou de uma comunidade
derivada de múltiplas espécies microbianas (Adam et al., 2002).
Especulações sobre as vantagens de formação do biofilme para os
microrganismos incluem: proteção contra as agressões geradas pelo meio ambiente
(drogas antifúngicas e sistema imunológico do hospedeiro), disponibilidade de nutrientes,
cooperação metabólica e aquisição de novos traços genéticos (Douglas, 2002).
A capacidade de aderência e conseqüente formação de biofilme em
superfícies plásticas podem explicar porque a C. parapsilosis está freqüentemente
associada a infecções de cateteres vasculares (Nett et al., 2007; Medrano et al., 2006;
Nakamura e Takahashi, 2006; Calderone, 2002; Shin et al., 2002). C. parapsilosis isolada
de sangue ou de cateteres infectados devem possuir probabilidade mais alta de
produzirem biofilme do que isolados de outras localidades, assim como, isolados de
candidemias recorrentes (Nett et al., 2007; Tumbarello et al., 2007; Kojic e Darouiche,
2004; Kumamoto, 2002). Ademais, há evidências de que células do biofilme formado
sobre materiais implantados estejam sendo constantemente liberadas para a corrente
sangüínea. Por estas razões, estudos sobre formação de biofilme de Candida spp.
adquiriram interesse considerável (Seidler et al., 2006; Douglas, 2003; Calderone, 2002).
Branchini et al. (1994) investigaram a diversidade genotípica e a
produção de biofilme de 31 cepas de C. parapsilosis isoladas de sangue e cateter. Estas
resultaram em 14 subtipos de DNA. Dos 31 isolados estudados, 80% (24) produziram
biofilme, sendo 67% (16) entre moderado a fortemente produtores e 13% (4) fracos
produtores. O estudo demonstrou que este traço fenotípico não é compartilhado por todos
os membros de um determinado subtipo de DNA. Além disso, a maior propensão de
isolados clínicos de C. parapsilosis formarem biofilme em soluções contendo glicose
sugere que fatores ambientais podem contribuir para a habilidade de C. parapsilosis aderir
a cateteres e causar infecções.
Vários estudos demonstraram que o biofilme de Candida aumenta
dramaticamente os níveis de resistência aos agentes antifúngicos mais comumente
usados (Ramage, 2005; Schierholz et al., 2001). Novos agentes antifúngicos, tais como
equinocandinas e formulações lipossomais de anfotericina B, mostraram atividade contra
biofilme de Candida (Ramage, 2005). Os biofilmes parecem ter múltiplos mecanismos de
resistência (Baillie e Douglas, 2000). Presume-se que pelo menos três fatores possam
influenciar ou agir concomitantemente para promovê-los, como, a expressão de genes
biofilme-específicos por contato com determinadas superfícies, modificações fenotípicas
em decorrência da queda na taxa de crescimento ou de nutrição e a matriz extracelular
presente como barreira contra a penetração das drogas (Douglas, 2003). Hawser e
Douglas (1995) observaram que CIM (Concentração Inibitória Mínima) de alguns
antifúngicos em biofilmes eram 30 a 2.000 vezes mais altos que os CIMs de células
planctônicas. A resistência pode variar dependendo do organismo e da natureza do
material sobre o qual o biofilme é formado. Kuhn et al. (2002) verificaram a
susceptibilidade frente ao fluconazol de biofilmes produzidos por 2 cepas de C. albicans.
Ambas desenvolveram rápida resistência a essa droga, em um período de incubação de
apenas 6 horas, com CIM50 > 128 μg/mL. Os mesmos isolados em condições planctônicas
apresentaram CIM50 ≤ 1 μg/mL.
A quantificação da produção de biofilme tem relevância na avaliação da
que C. parapsilosis, apesar de ser um microrganismo de menor virulência quando
comparado a outros microrganismos do mesmo gênero, pode desencadear infecções
invasivas. Torna-se importante a realização de pesquisas com intuito de acrescentar
informações à história natural deste patógeno, bem como estudos sobre diferentes fatores
de virulência produzidos durante a infecção invasiva por este agente.
1.4 C. parapsilosis e resistência a antifúngicos
Problemas com resistência a drogas antifúngicas têm emergido devido
ao aumento na incidência de infecções fúngicas sistêmicas e o uso difundido destes
agentes (Pinto et al., 2004; Hajjeh et al., 2004; Tortorano et al., 2003; Kontoyiannis e
Lewis, 2002; Nucci e Colombo, 2002; Pfaller et al., 2002).
Apesar da grande sensibilidade à anfotericina B e aos triazólicos, há
estudos mostrando relatos de amostras de C. parapsilosis resistentes a estas drogas. Em
um estudo realizado por Ostrosky-Zeichner et al. (2003), observou-se que 2-3% das
amostras de C. parapsilosis apresentaram valores de CIMs para a anfotericina B
compatíveis com resistência in vitro.
Cantón et al. (2003) encontraram resistência à anfotericina B (CIM >1
µg/mL) em amostras de C. parapsilosis isoladas de hemoculturas utilizando o método de
microdiluição em caldo. Embora o CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) tenha
comprovado que esse seja um método confiável e reprodutível, ainda há uma variação
restrita para os CIMs de anfotericina B, não permitindo a discriminação de isolados
susceptíveis e resistentes de espécies de Candida (Park et al., 2006). De qualquer forma,
pouco tem sido descrito sobre mecanismos de resistência a antifúngicos relacionados à C.
parapsilosis.
Em relação ao fluconazol, Sarvikivi et al. (2005) avaliaram a resistência
a este antifúngico de cepas de C. parapsilosis isoladas de UTI neonatal em hospitais da
Finlândia e encontraram resistência em 2 dos 26 isolados, com CIM ≥ 64 mg/L. Esses
autores sugerem que o uso de fluconazol como profilático contribui para a emergência de
subclones de C. parapsilosis com susceptibilidade diminuída entre os isolados
responsáveis por infecções de corrente sanguínea.
Apesar de controvérsias sobre a relevância clínica dos testes de
susceptibilidade com caspofungina, CIMs elevadas desta droga têm sido observadas.
Pfaller et al. (2003) realizaram um estudo com 3.959 isolados de Candida spp. obtidos de
95 centros médicos de todas as partes do mundo e compararam a susceptibilidade à
caspofungina com fluconazol e itraconazol. A caspofungina foi muito ativa contra Candida
spp (96% dos CIMs foram ≤ 2 μg/mL). C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis e C.
glabrata foram as espécies mais susceptíveis (CIM90= 0,25 a 0,5 μg/mL). C. parapsilosis,
entretanto, obteve uma menor susceptibilidade (CIM90 = 4 μg/mL).
Barchiesi et al. (2007) investigaram a atividade in vitro da caspofungina
em associação com a anfotericina B em três isolados de C. parapsilosis, utilizando o
método de microdiluição em caldo. Este método demonstrou redução significativa de CIM
para uma ou ambas as drogas, quando usadas de forma combinada. Esses achados
foram confirmados com o emprego da curva de morte dos isolados. Foi empregado, ainda,
como método comparativo, o ensaio de disco-difusão. Neste, o diâmetro dos halos
produzidos pelos agentes antifúngicos associados foram significativamente maiores que
aqueles produzidos pelas drogas avaliadas separadamente. Segundo os pesquisadores, a
interação positiva entre uma equinocandina e um poliênico pode ser explicada pelo fato de
as equinocandinas, ao inibirem a síntese da parede celular, podem aumentar a atividade
da anfotericina B facilitando o acesso dessa droga à membrana celular.
Com o aumento da importância das infecções fúngicas em diferentes
grupos de pacientes, bem como o reconhecimento do número crescente de espécies de
