UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS
VITÓRIA RÉGIA GONÇALVES DE SOUSA
ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA: BIODEGRADAÇÃO POR BACTÉRIAS Pseudomonas sp. E Oceanimonas baumannii
FORTALEZA 2019
VITÓRIA RÉGIA GONÇALVES DE SOUSA
ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA: BIODEGRADAÇÃO POR BACTÉRIAS
Pseudomonas sp. E Oceanimonas baumannii
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Ciências Ambientais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Ambientais. Orientadora: Profª. Drª. Oscarina Viana de Sousa
Coorientadora: Profª. Drª. Marina Teresa Torres Rodriguez
FORTALEZA 2019
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
S698Ó Sousa, Vitória Régia Gonçalves de.
Óleo residual de fritura: biodegradação por bactérias Pseudomonas sp. e Oceanimonas baumannii / Vitória Régia Gonçalves de Sousa. – 2019.
49 f. : il. color.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Instituto de Ciências do Mar, Curso de Ciências Ambientais, Fortaleza, 2019.
Orientação: Profa. Dra. Oscarina Viana de Sousa.
Coorientação: Profa. Dra. Marina Teresa Torres Rodriguez.
1. Biossurfactantes. 2. Degradação bacteriana. 3. Composto hidrofóbico. I. Título.
VITÓRIA RÉGIA GONÇALVES DE SOUSA
ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA: BIODEGRADAÇÃO POR BACTÉRIAS
Pseudomonas sp. E Oceanimonas baumannii
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Ciências Ambientais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Ambientais.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profª. Drª. Oscarina Viana de Sousa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profª. Drª. Fátima Cristiane Teles de Carvalho
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profª. Drª. Karla Maria Catter
A Deus.
Aos meus pais, Lucileide Gonçalves e Luis Sousa, e ao meu irmão Vitor Sousa.
AGRADECIMENTOS
Aos meus amados pais, Lucileide e Luis, por quem tenho orgulho de ser filha! Sou grata por todo o amor, dedicação, zelo, compreensão e sacrifícios demonstrados ao longo da minha vida para que eu chegasse onde estou. Ao meu irmão, Vitor, pelo carinho, companheirismo e por torcer pelo meu sucesso (apesar das implicâncias)! E ao meu primo, Fernando, pela gentileza nos momentos de aperreio!
À minha orientadora profª. Oscarina Viana por ter me aceitado como orientanda. Por toda a paciência, apoio, dedicação e suporte demonstrados ao longo, não só no desenvolvimento deste trabalho, mas desde que cheguei (mesmo que não oficialmente) ao Lamap em 2017.1. Muito obrigada!
À Marina Rodriguez, minha coorientadora! Muito obrigada por ter me acompanhado nos experimentos, pelas palavras de encorajamento, por acreditar em mim quando na grande maioria das vezes eu não acreditava e por ter me tratado de forma carinhosa e gentil.
À Cristiane Teles por todo o conhecimento repassado desde que cheguei ao Lamap, pelo apoio, compreensão, por fazer parte da minha banca examinadora e, principalmente pelo cuidado em me manter alimentada! Obrigada, Cris!
À Jéssica Lucinda! Muito obrigada por toda ajuda ao longo dos meus experimentos, por todos os “e aí, tá dando certo?”, por ser gentil e sempre se mostrar disponível em tirar minhas dúvidas ajudando a aperfeiçoar este trabalho.
À minha mãe de laboratório, Jade Abreu! Obrigada por ter me acolhido como filha e, por mais que eu tenha me sentido renegada em alguns momentos (brincadeira! Não podia deixar passar), me orientou, ajudou, ouviu e lidou pacientemente com minhas dúvidas.
Ao Francisco Sylvânio por sempre responder minhas mensagens repletas de dúvidas acerca da metodologia de alguns experimentos. Ao Matheus Maia pela amizade, ajuda e momentos mega divertidos! À Rosa Helena pela ajuda na escolha do título do meu trabalho e à Karla Catter por ter aceitado estar na minha banca examinadora colaborando para o aperfeiçoamento deste trabalho.
À toda família Lamap por colaborar de alguma forma, seja em bancada, lavando materiais utilizados nos experimentos ou simplesmente pela empatia demonstrada na rotina do laboratório.Vocês são massa!
À minha turma, Kariry, que na “minha nada humilde opinião” é a melhor turma que o curso de Ciências Ambientais teve, tem e terá! E, em especial a uma galera muito massa que
tem estado comigo desde o começo dessa luta que é a graduação. Álef, Débora, Eliziane, Lucas, Maria Helena, Rafael e Régia sou grata por tê-los conhecido! Obrigada pela amizade, carinho e cuidado, por todas as idas ao espigão, pelas músicas compartilhadas, pelas palavras de conforto, pelas histórias de sonhos malucos, pelas partidas de UNO, pela espera de um Taquara que levava uma eternidade para chegar e pelas esperas ao RU!
Ao Laboratório de Zoobentos, minha primeira experiência em laboratório e como bolsista. Meu muito obrigada ao prof. Luis Ernesto por ter ensinado um pouco sobre o mundo da carcinologia e a profª. Cristina Rocha pela oportunidade dada de ter estado no Zoobentos. À Pró-Reitoria de Assuntos Estudantis (PRAE) e à Pró-Reitoria de Graduação (PROGRAD) pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de iniciação acadêmica e iniciação à docência ao longo da minha graduação.
“Já que não podemos ser enciclopédicos e saber tudo que há para saber de todas as coisas, devemos saber um pouco de cada coisa.”
RESUMO
O óleo residual de fritura é uma substância hidrofóbica que acarreta em prejuízos ambientais e na saúde humana quando descartado incorretamente. Surfactantes são compostos com características hidrofílicas (interagem com substâncias polares) e hidrofóbicas (interagem com substâncias apolares) e quando produzidos por microrganismos como bactérias, fungos e leveduras são chamados de biossurfactantes. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de biossurfactantes por bactérias Pseudomonas sp. e Oceanimonas baumannii na degradação do óleo residual de fritura. Para tal, foram realizados os testes do colapso da gota, volume de emulsificação e estabilidade da emulsão em cinco estirpes bacterianas, além da imobilização em alginato de cálcio de duas cepas utilizadas em microssistemas desenvolvidos para verificação da biodegradação do óleo residual. Como resultados, as cepas bacterianas apresentaram forte atividade na produção de biossurfactantes e boa estabilidade de emulsões formadas (61,84% ao final de 48 horas). A imobilização das estirpes também se mostrou eficaz ao ser verificada a atividade biossurfactante na utilização do óleo residual como substrato nos microssistemas. Por fim, a aplicação de células bacterianas produtoras de biossurfactantes e imobilizadas em alginato de cálcio na degradação do óleo residual de fritura mostra-se como uma biotecnologia promissora quanto a remoção deste resíduo no ambiente.
ABSTRACT
Residual frying oil is a hydrophobic substance that causes environmental damage and human health when discarded incorrectly. Surfactants are compounds with hydrophilic (interacting with polar substances) and hydrophobic (interacting with nonpolar substances) and when produced by microorganisms such as bacteria, fungi and yeasts are called biosurfactants. The present work had as objective to evaluate the production of biosurfactants by bacteria
Pseudomonas sp. and Oceanimonas baumannii in the degradation of residual frying oil. To do
this, tests of droplet collapse, emulsification volume and emulsion stability were carried out in five bacterial strains, in addition to the immobilization of calcium alginate from two strains used in microsystems developed to verify the residual oil biodegradation. As results, bacterial strains showed strong activity in the production of biosurfactants and good stability of emulsions formed (61.84% at the end of 48 hours). The immobilization of the strains was also effective when the biosurfactant activity was verified in the use of the residual oil as substrate in the microsystems. Finally, the application of bacterial cells producing biosurfactants and immobilized in calcium alginate in the degradation of the residual frying oil is shown as a promising biotechnology for the removal of this residue in the environment.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Produção e consumo de óleo vegetal no mundo ... 19
Figura 2 - Estruturas de biossurfactantes ... 23
Figura 3 - Esquema do processo de produção do biossurfactante em laboratório ... 27
Figura 4 - Óleo residual de fritura utilizado para o desenvolvimento da presente pesquisa .... 27
Figura 5 - Disposição das cepas bacterianas na tampa da microplaca de 96 poços ... 28
Figura 6 - Teste do volume de emulsificação e estabilidade da emulsão ... 29
Figura 7 - Imobilização das cepas bacterianas em matriz de alginato de cálcio ... 31
Figura 8 - Reativação das cepas bacterianas imobilizadas em alginato de cálcio ... 32
Figura 9 - Microssistemas simulando a disposição de óleo residual de fritura em corpos d’água ... 33
Figura 10 - Teste do colapso da gota com os caldos de fermentação ... 36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Teste qualitativo do colapso da gota dos caldos de fermentação e líquidos metabólicos extraídos a partir do óleo residual de fritura ... 35 Tabela 2 - Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES) com cepas crescidas em meio com 1% de óleo ... 38 Tabela 3 - Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES) com cepas crescidas em meio com 5% de óleo ... 39 Tabela 4 - Leitura dos microssistemas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 625 nm ... 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABIOVE Associação Brasileira das Indústrias de Óleos Vegetais ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
B.O.D Biochemical Oxygen Demand CaCl2 Cloreto de cálcio
CE Ceará
ECÓLEO Associação Brasileira para Sensibilização, Coleta e Reciclagem de Resíduos de Óleo Comestível
ES Estabilidade da emulsão GEE Gases de Efeito Estufa
HPAs Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos IP Percentual de inibição
LAMAP Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado
LB Luria Bertani
MT Muito tóxico
NaCl Cloreto de sódio PCA Ágar Padrão em Placa
SABESP Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo SDS Dodecil Sulfato de Sódio
T Tóxico
TSA Ágar Triptona Soja TSB Caldo Soja Tripticaseína UFC Unidade Formadora de Colônia
USDA Departamento de Agricultura dos Estados Unidos VE Volume de emulsificação
VEt Volume de emulsificação no tempo t VE0 Volume de emulsificação no tempo 0
LISTA DE SÍMBOLOS % Porcentagem g Grama mL Mililitro °C Grau Celsius µl Microlitro
rpm Rotação por minuto mm Milímetro
(v/v) Volume/volume nm Nanômetro n° Número
ppm Partícula por milhão h horas
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 16 2 OBJETIVOS ... 18 2.1 Objetivo Geral ... 18 2.2 Objetivos Específicos ... 18 3 REFERENCIAL TEÓRICO ... 19
3.1 Panorama do descarte de óleo vegetal mundial, no Brasil e no Ceará ... 19
3.2 Danos causados pelo óleo residual de fritura ... 20
3.3 Uso alternativo como matéria-prima para outros produtos ... 21
3.4 Biossurfactantes: base química, princípio de ação e aplicações ... 22
3.5 Microrganismos produtores de biossurfactantes ... 24
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 26
4.1 Microrganismos selecionados... 26
4.2 Avaliação da produção de biossurfactante ... 26
4.2.1 Produção de biossurfactante a partir do óleo residual de fritura ... 26
4.2.2 Teste do colapso da gota... 28
4.2.3 Teste de estabilidade da emulsão (ES) e volume de emulsificação (VE) ... 29
4.3 Procedimento de imobilização em alginato de cálcio das cepas ... 30
4.4 Teste de degradação do óleo residual de fritura ... 32
4.4.1 Reativação e contagem padrão em placa das cepas imobilizadas ... 32
4.4.2 Microssistemas para o teste de degradação do óleo residual ... 33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35
5.1 Teste do colapso da gota ... 35
5.2 Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES) ... 38
5.3 Reativação e aplicação das cepas bacterianas imobilizadas em alginato de cálcio 40 6 CONCLUSÃO ... 42
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1 INTRODUÇÃO
A sociedade moderna desenvolve de forma constante produtos que tornam o dia a dia mais prático. Contudo, nem sempre os impactos que estes podem causar no meio ambiente são objeto de atenção. A exemplo, tem-se o óleo vegetal amplamente utilizado no preparo de alimentos, com produção na casa dos 9 milhões de toneladas no Brasil em 2018/2019 e que só aumenta ao longo dos anos (USDA, 2019).
O óleo vegetal é uma substância insolúvel em água que pode ser extraída a partir de grãos, sementes e plantas, podendo ser usado na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica, em lubrificante para motores e combustível (BRITO, 2013; SILVA, 2013). No preparo de alimentos, somente cerca de 18% do óleo é absorvido e o resto torna-se resíduo (BESSA, 2015) que na maioria das vezes não possui um destino adequado causando impactos negativos ao meio ambiente.
O óleo residual de fritura, resíduo gerado no preparo de alimentos, está presente no dia a dia das pessoas e quando não descartado adequadamente pode causar a poluição das águas superficiais ou mesmo subterrâneas, impermeabilização do solo, interferências na vegetação, proliferação de insetos, obstrução nas tubulações de saneamento, encarecimento no tratamento de água e esgoto (GOMES et al., 2013; WEYNER; NORA, 2015; MORGAN-MARTINS et
al., 2016).
Contudo, este resíduo pode ser reaproveitado de diversas formas dando um viés sustentável a sua disposição no ambiente. Produção de biodiesel, sabão, detergentes, tintas, lubrificantes para motores são exemplos de como empregar o óleo residual de fritura como matéria-prima para outros produtos (MONTENEGRO et al., 2013; PAZ et al., 2015; GUABIROBA et al., 2017).
Além dos usos alternativos supracitados, tornou-se crescente o interesse em prospectar microrganismos capazes de utilizar os óleos residuais como fonte de energia ajudando a mitigar a poluição causada por estes na natureza (OLIVEIRA; GARCIA-CRUZ, 2013; CATTER et al., 2016; SILVA, 2017) e ainda produzir compostos com potencial aplicabilidade em diversas atividades humanas. Tais compostos são os biossurfactantes.
Os biossurfactantes são compostos anfipáticos, ou seja, possuem uma porção hidrofóbica (insolúvel em água) e outra hidrofílica (solúvel em água) em suas estruturas e são produzidas por microrganismos (JOY et al., 2016). Possuem uma ampla aplicabilidade como na biorremediação de ambientes impactados por poluentes hidrofóbicos, na remoção de metais
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pesados, nos setores de cosmético, alimentício, farmacêutico, em produtos de limpeza entre outros (SANTOS et al., 2016).
Os biossurfactantes são capazes de reduzir a tensão superficial na interface ar-água e criar emulsões (dispersão coloidal entre um líquido imiscível em outro líquido). Também apresentam vantagens consideráveis frente aos surfactantes de origem química, como biodegradabilidade, baixa toxicidade, tolerância à temperatura, variações de pH e biocompatibilidade (BEZERRA et al., 2018) tornando-os compostos ainda mais interessantes de serem estudados e desenvolvidos.
Tendo em vista os impactos causados pela disposição de óleo residual de fritura no meio ambiente e a capacidade que os microrganismos possuem em produzir biossurfactantes e utilizar esse resíduo como substrato, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a degradação do óleo residual de fritura por bactérias produtoras de biossurfactantes.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de degradação do óleo residual de fritura por bactérias produtoras de biossurfactantes.
2.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar a capacidade de produção de biossurfactantes pelas cepas bacterianas.
2. Verificar o potencial das cepas bacterianas em formar e estabilizar emulsões em óleo residual de fritura.
3. Otimizar o protocolo de imobilização das cepas como um sistema de baixo custo para tratamento de ambientes contaminados por óleo residual.
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3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Panorama do descarte de óleo vegetal mundial, no Brasil e no Ceará
O óleo vegetal é um produto amplamente consumido pela sociedade, podendo ser extraído a partir de sementes, grãos ou plantas, como soja, milho, mamona, linhaça e girassol (SILVA, 2013). Empregado nos mais diversos setores do mercado como na indústria alimentícia, indústria química, cosmética e farmacêutica, o descarte adequado deste produto é importante ambiental, social e economicamente.
Até o primeiro trimestre de 2019, foram produzidos cerca de 203,95 milhões de toneladas de óleo vegetal no mundo, sendo 200,43 milhões de toneladas destinadas ao uso doméstico, segundo dados do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2019). Entretanto dados acerca de quantidade descartada após a utilização desses óleos são escassos.
Os dados da figura 1 mostram que a produção do óleo vegetal mundial vem aumentando ao longo do tempo, assim como seu consumo, embora tenha ocorrido uma pequena queda nos anos 2015/2016 na qual o consumo ultrapassou a produção. Isso pode ser interpretado como um incentivo no aumento da produção nos anos seguintes, ou a não contabilização de estoque desse produto ou mesmo a ocorrência de erro na coleta desses dados.
Figura 1 - Produção e consumo de óleo vegetal no mundo
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Ainda de acordo com o USDA (2019), o Brasil produziu também até o primeiro trimestre de 2019 cerca de 9,48 milhões de toneladas de óleo vegetal, nos quais 8,80 milhões de toneladas foram destinadas à alimentação. A Associação Brasileira para Sensibilização, Coleta e Reciclagem de Resíduos de Óleo Comestível (ECÓLEO, 2019) estima que mais de 200 milhões de litros por mês são dispostos inadequadamente na natureza e que apenas 1% de óleo residual é coletado.
No Ceará, informações sobre descarte de óleo residual de fritura são ainda mais deficientes. Lago (2016) estimou um volume de 45.924 litros/mês de óleo residual de fritura descartados no município de Cascavel-CE. Barros et al. (2018) encontraram um volume aproximado de 289 litros/mês de óleo de cozinha descartados por lanchonetes na cidade de Forquilha-CE. Na capital cearense, Fortaleza, 46% de óleo doméstico é descartados na rede de esgoto e 18% são provenientes de áreas comerciais (REVISTA CARIRI, 2015).
Contudo, fica claro que a produção e consumo (doméstico) só aumentam ano após ano tornando o descarte inadequado deste resíduo preocupante uma vez que sua disposição pode acarretar em danos ambientais, na saúde humana e prejuízos econômicos, pontos que serão abordados a seguir.
3.2 Danos causados pelo óleo residual de fritura
O descarte correto ou a reutilização do óleo residual de fritura não dispõem de legislação específica no Brasil, o que potencializa a disposição inadequada deste resíduo. Entretanto, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) por meio do Informe Técnico nº 11, de 5 de outubro de 2004, que dispõe sobre a utilização e descarte de óleos e gorduras utilizados para fritura (ANVISA, 2004) orienta o uso e descarte deste resíduo em domicílios, restaurantes, bares, lanchonetes, dentre outros.
No Ceará a lei n°16.309, de 03 de agosto de 2017, que dispõe sobre medidas de coleta e reciclagem de óleos e gorduras usados, de origem vegetal e animal de uso culinário e seus resíduos, a fim de minimizar os impactos ambientais que seu despejo inadequado pode causar (CEARÁ, 2017), obriga empreendimentos que trabalham com refeições a darem uma destinação correta aos seus resíduos gerados.
Quando disposto incorretamente na natureza, o óleo residual de fritura interfere negativamente na saúde dos ecossistemas e, consequentemente no bem estar social. Segundo a Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo (SABESP, 2019) 1 litro de óleo descartado polui o equivalente a 20 mil litros em cursos d’água.
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Por se tratar de uma substância insolúvel em água, o óleo forma uma camada na superfície do corpo hídrico dificultando a entrada de luz e a troca de oxigênio entre a superfície da água e a atmosfera neste ecossistema, interferindo assim no metabolismo de organismos fotossintetizantes podendo levar a morte da biota local (RAMOS; SILVA, 2011; WEYNER; NORA, 2015).
Quando descartado no solo, a consequência é a impermeabilização do mesmo, o que contribui em enchentes nos centros urbanos, quando infiltrado pode contaminar vegetação e águas subterrâneas, além de ser um vetor na proliferação de insetos (devido aos resíduos de alimento no óleo, por exemplo) que pode acarretar em prejuízos à saúde humana (MORGAN-MARTINS et al., 2016).
O descarte em galerias pluviais, sanitárias e em rede coletora de esgoto danifica tubulações com obstruções retendo resíduos sólidos, o que encarece o tratamento das águas residuárias (GOMES et al., 2013; MORGAN-MARTINS et al., 2016). Em aterros sanitários, pode aumentar a carga orgânica do aterro e contribuir com a formação de Gases de Efeito Estufa (GEE), como o metano, além de dificultar na reciclagem quando em contato com outros resíduos orgânicos (SILVA, 2013).
Embora exista uma deficiência quanto a destinação adequada do óleo residual de fritura e uma quase inexistente legislação que regulamente a disposição deste resíduo, é possível reinserí-lo na cadeia produtiva como matéria-prima para outros produtos, o que pode trazer benefícios sustentáveis e que será abordado no próximo tópico (3.3).
3.3 Uso alternativo como matéria-prima para outros produtos
Já dizia Lavoisier, na natureza nada se cria ou se perde, tudo se transforma. Assim, também é possível converter o óleo pós-consumo em matéria-prima na fabricação de tintas, sabão, detergentes, ração animal, glicerina, lubrificantes para motores e biodiesel, entre outros produtos (VELOSO et al., 2012; STOCKER LAGO; SCHMIDT; CAMPOS, 2015).
O reaproveitamento do óleo residual de fritura pode ser visto como uma ação sustentável, podendo trazer vantagens sociais, ambientais e econômicas. A produção de sabão, por exemplo, é uma das formas mais simples de se trabalhar com o óleo pós-consumo. Trabalhos como de Azevedo et al. (2009) e Paz et al. (2015) buscaram por meio de conscientização e oficinas de produção de sabão a partir do óleo usado, mostrar os impactos que este resíduo pode causar na natureza, bem como seu reaproveitamento pode trazer retorno na renda de quem os fabrica.
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Outro uso alternativo do óleo residual de fritura está na produção de biodiesel. Biocombustíveis têm recebido ampla visibilidade por parte dos governos e da sociedade. Desde 2018, no Brasil, 10% de biodiesel é adicionado ao óleo diesel (BRASIL, 2016) garantindo assim a sua produção. Contudo, de acordo com dados da Associação Brasileira das Indústrias de Óleos Vegetais (ABIOVE, 2019) em 2018, 70% da matéria-prima usada na produção do biodiesel foi derivada da soja, enquanto que apenas 2% decorreu do óleo de fritura usado. Uma porcentagem que poderia ser bem maior se houvesse incentivos quanto a inserção na cadeia produtiva deste resíduo.
O aproveitamento em produtos com alto valor agregado como tintas para impressão, também podem viabilizar economicamente a reciclagem de óleos residuais (MONTENEGRO et al., 2013). Entretanto, no Brasil, uma pequena parcela da reciclagem desses passivos é aplicada na fabricação de tintas, massa de vidraceiro e outros produtos, estando mais concentrada na fabricação de sabão, biodiesel e ração animal (SILVA, 2013).
Mesmo com tantas aplicações para o reaproveitamento do óleo residual de fritura, o que se é descartado no ambiente é de alguma forma degradado. Trabalhos demonstram que os microrganismos são capazes de utilizar o óleo vegetal como substrato resultando na síntese de compostos anfipáticos, como os biossurfactantes (HABA et al., 2003; PEIXOTO, 2008; OLIVEIRA; GARCIA-CRUZ, 2013), assuntos que serão tratados a seguir.
3.4 Biossurfactantes: base química, princípio de ação e aplicações
Surfactantes são compostos com características ampifílicas oferecendo-lhes propriedades como: reduzir a tensão superficial da água, aumentar a solubilidade de moléculas hidrofílicas, ação detergente, emulsificante e dispersante (BOGNOLO, 1999; SANTOS et al., 2016). A maioria desses compostos são de origem química derivados do petróleo, entretanto existem microrganismos capazes de sintetizar esses compostos, os chamados biossurfactantes. Produtos metabólicos de microrganismos (bactérias, fungos filamentosos e leveduras), os biossurfactantes apresentam ampla variedade em suas estruturas hidrofílicas e hidrofóbicas quando comparados aos surfactantes sintéticos (COLLA; COSTA, 2003) e podem ser classificados de acordo com sua origem microbiana ou composição química em: glicolipídios, fosfolipídios, surfactina, lipossacarídios, lipopeptídios, ácidos graxos e lipídios neutros (BOGNOLO, 1999; VIJAYAKUMAR; SARAVANAN, 2015). A figura 2 mostra algumas das estruturas dos biossurfactantes.
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Fonte: adaptado de Bognolo (1999); Kowall et al. (1998); Sandoval, Karns e Torrents (1999).
Os biossurfactantes apresentam diversas vantagens comparados aos surfactantes químicos como: baixa toxicidade, biodegradabilidade, estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, produção a partir de substratos renováveis ou de baixo valor agregado, maior taxa de redução da tensão superficial e solubilidade em água alcalina (COLLA; COSTA, 2003; ANTUNES et al., 2013).
Compostos de superfície ativa, os biossurfactantes possuem potencial de serem aplicados em diversas áreas, como na indústria cosmética, farmacêutica, alimentícia, defensivos agrícolas, produtos de limpeza doméstica, biorremediação de solo contaminado por substâncias hidrofóbicas, mitigação em derramamentos de petróleo em corpos hídricos e na indústria petroquímica (LIMA e SILVA et al., 2010; SANTOS et al., 2016).
O aumento do conhecimento acerca dos impactos antrópicos causados ao meio ambiente e consequentemente maior rigor nas leis ambientais têm impulsionado pesquisas no campo da prospecção de microrganismos capazes de produzir substâncias usadas de forma Figura 2 - Estruturas de biossurfactantes
24
massiva pela sociedade e produzidas por fontes não renováveis. O composto tensoativo explanado neste tópico se enquadra na procura em substituir produtos agressivos à natureza.
3.5 Microrganismos produtores de biossurfactantes
Sabe-se que os microrganismos são capazes de sintetizar biossurfactantes e as vantagens apresentadas anteriormente demonstram que trabalhos nessa linha de pesquisa podem contribuir para o aprimoramento deste bioproduto.
Oliveira e Garcia-Cruz (2013) constataram que a bactéria Bacillus pumilus é capaz de crescer e produzir biossurfactante a partir do resíduo da vinhaça e do óleo residual de fritura, sendo capaz de reduzir a tensão superficial da água. Lima (2007) encontrou resultados promissores acerca da produção de biossurfactante por linhagens de Pseudomonas aeruginosa empregando óleo de soja residual como fonte de carbono.
Produção de biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia gladioli isoladas a partir de sedimento de Manguezal utilizando como substrato o óleo residual de fritura também foi constatada por Catter et al. (2016). Silva (2017) verificou a produção de compostos biossurfactantes por estirpes bacterianas do gênero Pseudomonas sp. e Oceanimonas
baumannii isoladas de água e sedimento marinhos utilizando como substrato o efluente da
agroindústria do caju e óleo vegetal residual.
Ostendorf et al. (2019) demonstraram o potencial biotecnológico na recuperação de poluentes à base de óleo do biossurfactante produzido pela cepa Bacillus cereus cultivada em melaço de cana-de-açúcar e licor de milho. Silva et al. (2018) otimizaram a produção de biossurfactante pela bactéria Pseudomonas aeruginosa por meio do cultivo em licor de milho e óleo vegetal em um reator biológico.
Lee et al. (2018) isolaram do sedimento de uma praia contaminada por derramamento de óleo cru uma estirpe de bactéria identificada pelos mesmos como
Oceanimonas marisflavi capaz de degradar Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs).
Brown, Sutcliffe e Cummings (2001) descreveram uma estirpe bacteriana degradadora de fenol isolada de água estuarina como sendo Oceanimonas baumannii. Embora estes trabalhos não tenham focado na produção de biossurfactantes, as bactérias do gênero Oceanimonas se mostraram capazes de utilizar compostos hidrofóbicos como substrato.
Além da síntese de biossurfactante pelos microrganismos é perceptível que existe um esforço por parte dos pesquisadores em utilizar fontes alternativas como substrato para a
25
produção deste que ainda se mostra bastante onerosa, oferecendo possibilidades em reduzir a disposição de resíduos poluentes no ambiente por um sistema de baixo custo.
26
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Microrganismos selecionados
As cinco cepas bacterianas utilizadas neste trabalho foram isoladas de amostras de sedimento e água do porto do Mucuripe, Fortaleza - CE e fazem parte da coleção bacteriológica do Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado (LAMAP). As culturas puras foram renovadas em Caldo Tripticaseína de Soja (TSB - BACTO) e incubadas a 35ºC por 24 horas. Posteriormente foram inoculadas em Ágar Padrão para Contagem (PCA - KASVI) e armazenadas em B.O.D. para os testes de produção de biossurfactante. As cinco cepas foram identificadas por Silva (2017) como produtoras de biossurfactantes e compreendem ao gênero
Pseudomonas sp. e Oceanimonas baumannii.
4.2 Avaliação da produção de biossurfactante
4.2.1 Produção de biossurfactante a partir do óleo residual de fritura
A metodologia utilizada com modificações foi descrita por Lima e Silva et al. (2010). Para a produção do biossurfactante (FIGURA 3), as cepas foram inoculadas em meio Luria Bertani (LB - DIFCO) e incubadas a 35ºC por 16 horas. Posteriormente, 1 mL do inóculo foi adicionado em 50 mL de meio LB agora acrescido da fonte de carbono, óleo residual de fritura, nas concentrações de 1% (v/v) e 5% (v/v). Os meios permaneceram sob agitação em incubadora shaker a 100 rpm a 30ºC por 48 horas. Após esse período, o líquido metabólico das bactérias foi extraído por centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos a 21ºC, seguido por pré-filtragem em filtro de papel e pré-filtragem em membranas de 0,22 μm (Millipore). O óleo residual utilizado também passou por duas filtragens em papel filtro para retirada de resíduos de fritura e não foi esterilizado afim de se obter resultados o mais próximo da realidade (FIGURA 4).
27
Fonte: adaptado de Silva (2014).
Fonte: autora.
A seguir, os testes do colapso da gota, volume de emulsificação e estabilidade da emulsão foram realizados para selecionar as bactérias que apresentassem melhor desempenho na produção de biossurfactante utilizando o óleo residual de fritura.
Figura 3 - Esquema do processo de produção do biossurfactante em laboratório
28
4.2.2 Teste do colapso da gota
A metodologia utilizada para o teste foi descrita por Bodour e Miller-Maier (1998). Foi untado na tampa de uma microplaca de 96 poços o óleo residual de fritura e deixado em repouso por 24 horas. Em seguida, em triplicata, 10 μL do caldo de fermentação (meio contendo células bacterianas) e 10 μL do líquido metabólico (meio isento de células) foram aplicados na superfície revestida com óleo (FIGURA 5). Transcorrido 1 minuto observou-se o comportamento da gota em contato com o composto hidrofóbico. Utilizou-se água destilada estéril como controle negativo. Foi considerado como resultado positivo o colapso da gota das substâncias testadas devido a redução da tensão interfacial causada pelo biossurfactante (YOUSSEF et al., 2004).
Fonte: elaborado pela autora.
CN = controle negativo; cor verde = cepas crescidas em meio com 1% de óleo; cor vermelha = cepas crescidas em meio com 5% de óleo.
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4.2.3 Teste de estabilidade da emulsão (ES) e volume de emulsificação (VE)
A metodologia utilizada foi descrita por Das, Das e Mukheryee (1998), com modificações. Foram adicionados em tubos (12 mm x 100 mm) 2 mL do líquido metabólico e 2 mL do óleo residual de fritura, em triplicata. Também em triplicata, foram adicionados 2 mL do líquido metabólico e 2 mL de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) um surfactante sintético utilizado neste experimento como controle positivo. Os tubos foram agitados por 2 minutos em agitador do tipo vortex e deixados em repouso pelo mesmo tempo (FIGURA 6). Transcorrido os 2 minutos, a altura da camada emulsificada foi medida.
Fonte: autora.
A emulsão foi medida após 24 horas para determinar o volume de emulsificação (VE) através da fórmula 1. Para se obter a estabilidade da emulsão (ES), a altura da camada emulsificada foi medida até esta se desfazer e utilizou-se a fórmula 2 para o cálculo. De acordo com Bento, Camargo e Gaylarde (2008) boas emulsões mantém após 24 horas VE maior ou igual a 50% da emulsão formada após os 2 minutos de agitação.
(1) Figura 6 - Teste do volume de emulsificação e estabilidade da emulsão
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(2)
Somente duas cepas foram utilizadas nos testes que serão descritos a partir de agora, tendo como base melhor crescimento em meio de cultura com o óleo residual e os melhores resultados no teste de colapso da gota e a estabilidade da emulsão na produção de biossurfactante.
4.3 Procedimento de imobilização em alginato de cálcio das cepas
A metodologia seguida foi descrita por Amarante (2016), com adaptações. As cepas foram inoculadas em Ágar Triptona de Soja (TSA - DIFCO) e incubadas em estufa a 35°C por 24 horas. Posteriormente, em espectrofotômetro com comprimento de onda de 625nm, as cepas foram ajustadas na escala de McFarland para se obter inóculos com concentração de 1,5x108 UFC/mL. Em seguida, 1 mL do inóculo foi adicionado em 200 mL de caldo LB com concentração de 5% de óleo (v/v) e colocado sob agitação em incubadora shaker a 30°C a 90 rpm por 24 horas. Importante ressaltar que para a cepa Oceanimonas baumannii os meios e soluções salinas utilizados no experimento continham NaCl 1%.
Para se obter o pellet (massa bacteriana) necessário para a imobilização, após as 24 horas, os meios inoculados foram centrifugados a 5000 rpm por 10 minutos a 21º C. Após a centrifugação o sobrenadante dos meios foi armazenado em geladeira para testes posteriores e o pellet foi ressuspendido em 50 mL de solução salina 0,85% (salina 1% para O. baumannii) para a imobilização em matriz de alginato de cálcio.
Foi preparado com água destilada estéril 150 mL de alginato de sódio 1% e deixado sob agitação magnética por 3 horas para melhor solubilização do alginato. Transcorrido o tempo, foram adicionados os 50 mL da solução salina contendo o pellet bacteriano ressuspendido, totalizando um volume de 200 mL de alginato de sódio. Foram preparados também com água destilada estéril 200 mL de cloreto de cálcio (CaCl2) 2%. Em seguida, na
cabine de fluxo laminar, foi misturado por aspersão o alginato de sódio na solução de CaCl2 e
incubado por 24 horas a temperatura ambiente (FIGURA 7). A ligação de íons Ca2+ do CaCl2
em contato com o guluronato presente no alginato de sódio, tem como resultado esferas de gel consistentes e insolúveis de alginato (GIESE, 2015) imobilizando as células bacterianas.
31
Fonte: autora.
Após o período de 24 horas, as células imobilizadas foram peneiradas, lavadas com água destilada estéril para retirar o excesso de CaCl2 e liofilizadas (desidratação por
sublimação) a fim de se obter uma conservação prolongada das micropérolas1 para o teste de
degradação do óleo residual. O material final foi armazenado em tubos estéreis em temperatura ambiente.
1 Micropérolas: cepas bacterianas imobilizadas na matriz de alginato de cálcio.
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4.4 Teste de degradação do óleo residual de fritura
4.4.1 Reativação e contagem padrão em placa das cepas imobilizadas
O método apropriado de imobilização celular deve ser realizado experimentalmente, considerando-se as características intrínsecas de cada microrganismo (BASSANI et al., 2019), assim também foram necessárias experimentações ao reativar os microrganismos para posterior aplicação.
A reativação do material liofilizado foi realizada por meio de duas vias. Uma utilizando solução salina e outra usando meio de cultura (caldo LB).
Uma quantidade de 0,01g das cepas imobilizadas foi inoculada em solução salina (0,85% para Pseudomonas sp. estirpe-9C e 1% para O. baumannii estirpe-12SC) e conservadas por um período de duas horas (FIGURA 8). Transcorrido o tempo, foram realizadas diluições até 10-6 das micropérolas. Em seguida, somente as diluições 10-3 a 10-6 foram plaqueadas em duplicata, pela técnica de Pour Plate (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017), dispensando alíquotas de 1mL das diluições em placas de Petri e em seguida adicionando 20 mL de ágar TSA fundido. As placas foram incubadas em estufa a 35°C por 48 horas para posterior contagem padrão em placa, obedecendo o intervalo de 25 a 250 unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL).
Fonte: autora.
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A mesma quantidade de cepa liofilizada foi inoculada em caldo LB e deixado em incubadora shaker por 48 horas a 30°C a 80 rpm. Em seguida, uma alíquota de 1 mL do caldo foi adicionada em solução salina para posterior diluição até 10-6 das micropérolas. Assim como
na reativação feita somente com solução salina, apenas as diluições 10-3 a 10-6 foram plaqueadas
em duplicata, pela técnica de Pour Plate, incubadas em estufa a 35°C por 48 horas para posterior contagem padrão em placa, também obedecendo o intervalo de 25 a 250 UFC/mL (DOWNES; ITO, 2001).
4.4.2 Microssistemas para o teste de degradação do óleo residual
Para cada cepa foram montados três sistemas com cinco repetições simulando o descarte inadequado do óleo em águas doce e marinha (FIGURA 9). Para a cepa Pseudomonas sp., o microssistema um (MS01) foi constituído com 100 mL de água doce estéril, adicionado 5% de óleo residual (não estéril) e 1 mL de solução salina com a cepa reativada. O inóculo foi ajustado na concentração de 1,5x108 UFC/mL na escala de McFarland com comprimento de onda de 625nm. O microssistema dois (MS02), utilizado como controle positivo no teste, foi composto por 100 mL de água doce, 5% de óleo residual e 1 mL de detergente neutro2 (Dinâmica). Enquanto que o microssistema três (MS03), utilizado como controle negativo, consistiu apenas em 100 mL de água doce com 5% de óleo.
Figura 9 - Microssistemas simulando a disposição de óleo residual de fritura em corpos d’água
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Os microssistemas montados para a cepa O. baumannii seguem o mesmo modelo da cepa anterior, mudando somente o tipo de água utilizada. Foram usados 100 mL de água do mar estéril (39 ppm) em todos os microssistemas com 5% de óleo residual (não estéril) e adicionado 1 mL de solução salina com a cepa reativada também ajustada na escala de McFarland (microssistema um). Os microssistemas dois e três foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente.
O crescimento das bactérias usando o óleo residual como substrato foi acompanhado através de leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 625nm após um período de 10 dias.
2 Detergentes contém compostos tensoativos em suas composições, além de também serem amplamente utilizados e descartados no ambiente.
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Teste do colapso da gota
O teste qualitativo do colapso da gota permite inferir de forma rápida a produção de biossurfactante pelos microrganismos por desestabilizar a gotícula do líquido quando em contato com a superfície hidrofóbica (BODOUR; MILLER-MAIER, 1998). Neste trabalho foram testadas 10 amostras do caldo de fermentação e 10 amostras do líquido metabólico extraído das cinco cepas. O resultado do teste está disposto na tabela 1.
Tabela 1 - Teste qualitativo do colapso da gota dos caldos de fermentação e líquidos metabólicos extraídos a partir do óleo residual de fritura
CEPA ÓLEO (1%) ÓLEO (5%) Caldo de fermentação Líquido metabólico Caldo de fermentação Líquido metabólico Pseudomonas sp. 7C +++ +++ +++ +++ Pseudomonas sp. 9B +++ +++ +++ +++ Pseudomonas sp. 9C +++ +++ ++- +++ Pseudomonas sp. 18D +++ ++- +++ +++ O. baumannii 12 SC +++ --- ++- ---
Fonte: elaborada pela autora.
Forte (+++); Moderada (++-); Fraca (+--); Negativa (---).
Quando testados (em triplicata) os caldos de fermentação das cinco cepas crescidas em meio com 1% de óleo todas apresentaram forte atividade na produção de biossurfactantes uma vez que houve o colapso ou espalhamento da gota em contato com a superfície hidrofóbica transcorrido 1 minuto (FIGURA 10). As cepas Pseudomonas sp. 9C e O. baumannii 12SC tiveram resultado moderado quando crescidas em meio com 5% de óleo. Resultado semelhante foi verificado por Silva (2017) ao testar o caldo de fermentação proveniente do crescimento
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bacteriano destas mesmas cepas com 1% de óleo vegetal residual. Catter et al. (2016) também constataram no teste do colapso da gota a produção de biossurfactantes por Pseudomonas
aeruginosa em meio acrescido com 5% de óleo residual de fritura.
Figura 10 - Teste do colapso da gota com os caldos de fermentação
Fonte: autora.
E1, E3, E5, E7, E9 e E11=Pseudomonas sp. 9C; G1, G3, G5, G7, G9 e G11= O. baumannii 12SC.
Quanto aos líquidos metabólicos, a cepa Pseudomonas sp. 18D crescida em meio com 1% de óleo residual de fritura teve resultado moderado, enquanto que as outras estirpes de
Pseudomonas sp. apresentaram forte atividade no teste. Das cinco cepas, apenas a O. baumannii
12 SC não obteve resultado detectável quanto a presença de biossurfactante tanto em meio acrescido com 1% quanto a 5% de óleo residual, apresentando comportamento semelhante ao controle negativo (FIGURA 11). Contudo, essa mesma cepa teve forte e moderada atividade na produção de biossurfactante quando testados seus caldos de fermentação. Esse resultado pode indicar que o biossurfactante produzido pela O. baumannii 12SC pode estar aderido às suas células uma vez que esses compostos podem ser excretados ou estarem aderidos às células dos microrganismos (SANTOS et al., 2016).
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Figura 11 - Teste do colapso da gota com os líquidos metabólicos
Fonte: autora.
E1, E3, E5, E7, E9 e E11=Pseudomonas sp. 9C; G1, G3, G5, G7, G9 e G11= O. baumannii 12SC.
Silva et al. (2017) isolaram 22 cepas bacterianas crescidas em meio com querosene, nas quais oito apresentaram resultados positivos no teste do colapso da gota indicando forte desempenho na produção de biossurfactante em meios com e sem células (líquido metabólico), resultado semelhante foi verificado neste trabalho para todas as cinco cepas.
Youssef et al. (2004) ao compararem três métodos para a detecção da síntese de biossurfactantes por bactérias constataram que quanto maior o grau do colapso das culturas testadas mais baixos seriam os valores de tensão superficial. Os mesmos autores ainda sugerem que este método pode não ser tão sensível em detectar baixas concentrações de biossurfactantes. Portanto, faz-se necessário que outros testes sejam realizados para resultados mais precisos.
Embora não se tenha mensurado valores de tensão superficial nesta pesquisa, é possível que o teste do colapso da gota não tenha captado a produção de biossurfactante presente no líquido metabólico da O. baumannii 12SC, visto que a cepa obteve os melhores valores de ES e que serão abordados a seguir.
38
5.2 Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES)
Os resultados do volume de emulsificação e estabilidade da emulsão do líquido metabólico das cincos cepas crescidas em meio com 1% e 5% de óleo residual de fritura se apresentam nas tabelas 2 e 3.
Tabela 2 - Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES) com cepas crescidas em meio com 1% de óleo
Cepas 24 horas 48 horas
VE (%) ES (%) VE (%) ES (%) Pseudomonas sp. 7C 4,70 43,93 4,40 41,12 Pseudomonas sp. 9B 4,60 42,20 3,90 35,78 Pseudomonas sp. 9C 4,30 ND 3,70 ND Pseudomonas sp. 18D 5,10 ND 4,10 ND O. baumannii 12SC 4,40 53,66 4,00 48,78
Fonte: elaborada pela autora. ND = não determinado.
Somente as cepas Pseudomonas sp. 7C, Pseudomonas sp. 9B e O. baumannii 12SC conseguiram manter um VE após os 2 primeiros minutos de camada emulsificada, 10,70%, 10,90% e 8,20%, respectivamente. Contudo, não tiveram boa estabilidade no período de teste, não chegando a manter 50% da emulsão nas primeiras 24 horas, exceto a O. baumannii 12SC que embora tenha apresentado valores inferiores de VE em relação as cepas restantes, teve o melhor resultado para ES (53,66%) nas primeiras 24 horas do teste. Quando passadas as 48 horas, porém a estabilidade da emulsão ficou em 48,78%.
Quanto as cepas crescidas em meio com 5% de óleo residual (TABELA 3), todas foram capazes de formar emulsões nos dois primeiros minutos com valores de VE semelhantes a condição de crescimento bacteriano com 1% de óleo. Das cinco estirpes, somente a O.
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baumannii 12SC conseguiu manter uma boa estabilidade (61,84%) ao final das 48 horas. A
estabilidade da emulsão desta cepa foi semelhante ao encontrado para o controle positivo SDS (64,29%).
Tabela 3 - Volume de emulsificação (VE) e estabilidade da emulsão (ES) com cepas crescidas em meio com 5% de óleo
Cepas 24 horas 48 horas
VE (%) ES (%) VE (%) ES (%) Pseudomonas sp. 7C 4,40 41,51 3,20 30,19 Pseudomonas sp. 9B 4,30 37,07 3,80 32,76 Pseudomonas sp. 9C 4,60 38,82 3,90 32,91 Pseudomonas sp. 18D 4,00 39,60 3,00 29,70 O. baumannii 12SC 4,80 63,16 4,70 61,84 SDS 6,90 70,41 6,30 64,29
Fonte: elaborada pela autora.
Fazendo uma relação entre o teste do colapso da gota e estabilidade de emulsão dos líquidos metabólicos, as cepas que apresentaram resultados do tipo “forte” quanto a produção de biossurfactante no teste do colapso (todas as Pseudomonas sp.), não conseguiram manter o percentual de 50% da camada emulsificada após as 48 horas. Em contrapartida, a cepa O.
baumannii 12SC obteve resultado negativo ao ter seu líquido metabólico exposto a uma
superfície hidrofóbica, mas apresentou bons valores de ES.
De acordo com Chen, Baker e Darton (2007) os biossurfactantes podem estabilizar (emulsionantes) ou desestabilizar (desemulsionantes) emulsões, o que poderia justificar uma forte atividade biossurfactante de algumas cepas no teste do colapso da gota e a boa estabilidade de emulsão em outras (PEIXOTO, 2008). Biossurfactantes com alta massa molecular, características do potencial emulsionante destes compostos, pode explicar o comportamento da
40
O. baumannii 12SC frente aos testes anteriormente citados (PACWA-PLOCINICZAK et al.,
2011).
5.3 Reativação e aplicação das cepas bacterianas imobilizadas em alginato de cálcio
A imobilização celular consiste em restringir a mobilidade das células em um espaço definido, retendo assim sua atividade catalítica por longos períodos de tempo (YAÑEZ-OCAMPO et al., 2009). Permitindo também que as células bacterianas sejam mais eficientes em diversas aplicações, além de protegê-las contra adversidades do meio, como flutuações de temperatura, umidade e pressão (BASSANI et al, 2019).
Para a aplicação nos microssistemas, as cepas passaram por reativações em solução salina e em meio de cultura (caldo LB), a fim de viabilizar as células bacterianas para posterior aplicação. Quando reativadas apenas por solução salina, ambas as cepas apresentaram pouco crescimento em placa, não chegando ao intervalo de 25-250 UFC/mL. No caso da O. baumannii 12SC, não chegando a haver crescimento nas últimas diluições (10-5 e 10-6). Tal resultado impossibilitou a utilização das cepas nos microssistemas pela baixa concentração de microrganismos.
Enquanto isso, a reativação feita ao disponibilizar uma fonte de nutriente (meio de cultura) obteve melhor resultado para ambas as cepas. Ao serem plaqueadas, observou-se crescimento em todas as diluições, chegando a ultrapassar o intervalo de 25-250 UFC/mL em algumas das placas. A cepa O. baumannii 12SC foi a que apresentou melhor crescimento no plaqueamento.
No que diz respeito à utilização de células imobilizadas em alginato, Alessandrello
et al. (2017) testaram a biomassa de uma co-cultura formada por duas bactérias degradadoras
de HPAs (Pseudomonas monteilii P26 e Gordonia sp. H19) imobilizadas em três suportes, sendo um deles alginato de cálcio. O objetivo dos autores foi produzir um sistema de remoção de HPAs de baixo custo e na pesquisa constataram que as células imobilizadas obtiveram bons resultados na remoção de naftaleno, fenantreno e pireno (chegando a remoção de até 88,9% do pireno em 12 dias).
Yañez-Ocampo et al. (2009) utilizaram um consórcio bacteriano imobilizados também em dois suportes para a remoção de compostos organofosforados (metil paration e tetraclorvinphos) e constataram a viabilidade do consórcio imobilizado em alginato mantida por até 11 dias.
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Em relação aos microssistemas compostos pelas cepas imobilizadas em alginato de cálcio utilizadas neste trabalho, o resultado da leitura em espectrofotômetro após um período de 10 dias de uma das cinco repetições está disposto na tabela 4.
Tabela 4 - Leitura dos microssistemas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 625 nm CEPAS Absorbância MS01 MS02 (controle positivo) MS03 (controle negativo) Pseudomonas sp. 9C 0,127 0,245 0,026 O. baumannii 12SC 0,098 0,142 0,067
Fonte: elaborada pela autora.
MS01=água (doce/mar) + 5% de óleo + cepa; MS02=água (doce/mar) + 5% de óleo + detergente neutro; MS03=água (doce/mar) + 5% de óleo.
O MS01 da Pseudomonas sp. 9C resultou em um valor maior de absorbância (0,127) comparado a O. baumannii 12SC, podendo indicar que esta cepa conseguiu utilizar o óleo residual como substrato com mais rapidez ao longo dos 10 dias. Os valores de MS01 de ambas as cepas representam 51,8% e 69,0%, respectivamente, dos valores encontrados em MS02 (controle positivo). Isso pode ser interpretado como um bom desempenho da biodegradação bacteriana frente ao surfactante comercial (detergente neutro) utilizado no experimento.
Contudo, comparando as porcentagens das cepas em relação ao controle positivo (51,8% e 69,0%,) a O. baumannii 12SC se mostra mais eficiente ao utilizar o óleo residual como substrato. Quanto ao MS03 (controle negativo) é possível verificar que a ausência de compostos anfipáticos como os surfactantes podem retardar a degradação do óleo residual no ambiente.
Sendo assim, constatou-se que a imobilização em alginato de cálcio aliado a liofilização foi eficiente para manter as cepas imobilizadas viáveis. O método oferece melhores condições em manter as células bacterianas menos expostas a contaminações, fácil manuseio e transporte (por estarem em estado sólido) e não requer constante manutenção (BASSANI et al., 2019).
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6 CONCLUSÃO
✓ Foi verificada a capacidade de bactérias produtoras de biossurfactantes (Pseudomonas sp. e Oceanimonas baumannii) em degradar o óleo residual de fritura assim como a capacidade de formar e estabilizar emulsões no óleo testado.
✓ O protocolo de imobilização em alginato de cálcio de células bacterianas foi eficaz para a proposta do trabalho. A reativação em caldo LB se mostrou rápida e eficiente e, ao ser aplicada nos microssistemas (MS01) foi possível constatar a biodegradação do óleo residual de fritura.
✓ A aplicação de microrganismos produtores de biossurfactantes imobilizados em alginato de cálcio na degradação de compostos hidrofóbicos como o óleo residual de fritura se mostra como uma boa maneira de retirar poluentes do ambiente. Para tal, a otimização tanto da produção do biossurfactante quanto na reativação das células imobilizadas, poderia tornar mais acessível essa biotecnologia.
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