AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE E FERMENTO BIOLÓGICO NA PRODUÇÃO DE ETANOL EM DIFERENTES TEMPERATURAS

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AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE E

FERMENTO BIOLÓGICO NA PRODUÇÃO DE ETANOL EM

DIFERENTES TEMPERATURAS

Ana Luisa Moreira Castro1; Mariana Lopes Cruz2; Felipe Thalles Moreira Silva² ; Miriam Maria de Resende3; Eloízio Júlio Ribeiro3.

1

Discente de Iniciação científica do curso de Engenharia Química da UFU

2

Discente de mestrado bolsista da Faculdade de Engenharia Química da UFU

3

Docente da Faculdade de Engenharia Química da UFU

1,2,3

Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av. João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica,

Uberlândia - MG, CEP 38408-100

e-mail: ejribeiro@ufu.br

RESUMO - O Brasil defronta-se com a ideia de expandir o proveito de etanol para saciar a crescente demanda do setor sucroalcooleiro. Para isso, estudam-se múltiplas alternativas de produtividade, em sua maioria, com o objetivo de conquistar a melhor taxa de desempenho dos fermentos utilizados e obter cada vez mais álcool de forma sustentável e, desencadeando, assim, inúmeras vantagens para a economia, meio ambiente e sociedade. Dessa maneira, neste trabalho, buscou-se comparar e avaliar o teor alcoólico usando diferentes concentrações de sacarose e fermento biológico, acúmulos de 180 e 300 g/L e de 3 e 30 g/L respectivamente, em fermentações batelada alimentada com diferentes temperaturas, 24 e 32ºC, e com diferentes tempos de alimentação, 2 e 10 horas. Visto que, em uma fermentação há obstáculos que o fermento deve passar, como, resistir ao álcool produzido por ele mesmo.

Palavras-Chave: fermentação, etanol, temperatura.

INTRODUÇÃO

Petróleo, gás natural e seus derivados participam de mais da metade do consumo mundial de ener-gia. Lamentavelmente, como combustíveis fos-seis, suas reservas são finitas e eles são fontes de muitos gases responsáveis, segundo estudos, por provocar mudanças climáticas. Na busca de encontrar substitutos para esses combustíveis, nada mais racional do que produzi-los com base em matéria orgânica renovável (biomassa). O etanol tem um grande potencial para substituir os combustíveis fósseis, principalmente pelo fato de ser um biocombustível renovável, podendo melhorar a segurança energética e reduzir os déficits comerciais. Além disso, a degradação ambiental resultante do excesso de consumo de derivados de petróleo está ameaçando a susten-tabilidade da sociedade humana (SMEETS et al., 2008; GOLDEMBERG et al., 2008; BAI et al, 2008; LIU et al., 2012).

O etanol surge como uma das opções, ele pode ser produzido a partir de qualquer vegetal que contenha grande quantidade de açúcar ou de amido, que pode ser prontamente convertido em

açúcar (RIBEIRO et al., 1987 ). No Brasil, o vege-tal mais utilizado é a cana-de-açúcar.

Várias etapas ocorrem desde o colhimento da cana. Aquecimento, decantação, evaporação e centrifugação são alguns exemplos. Contudo, é na fermentação, e posteriormente destilação do mosto, que se obtém o etanol a partir do açúcar. Leveduras realizam a tarefa de decompor o açú-car em álcool etílico e dióxido de açú-carbono, estas para serem consideradas eficientes devem apre-sentar capacidade de resistir aos outros micror-ganismos competidores que invadem o processo fermentativo, rendimento estável, alta eficiência fermentativa, um rápido crescimento, tolerância a grandes variações de temperaturas, aos baixos níveis de oxigênios e ao álcool que elas mesmas produzem (ANDRIETTA et al., 2007). Mesmo com pesquisadores se esforçando para obter novas opções de micro-organismos, a levedura que atualmente mais atende tais exigências con-tinua sendo Saccharomyces cerevisiae (GANCE-DO e SERRANO, 1989).

Diversos fatores físicos (temperatura, pressão osmótica), químicos (pH, oxigenação, nutrientes minerais e orgânicos, inibidores) e microbiológi-cos (espécie, linhagem e concentração da

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leve-dura, contaminação bacteriana), afetam o rendi-mento da fermentação e a eficiência da conver-são de açúcar em etanol (LIMA, BASSO E AMO-RIM, 2001).

Temperaturas elevadas afetam o comportamento da levedura e diminuem o teor alcoólico do mos-to, além de contribuir para a multiplicação bacte-riana. À medida que a temperatura aumenta, a contaminação bacteriana é favorecida e a levedu-ra fica mais sensível à toxidez do etanol causan-do perda de viabilidade celular, fator importante que define o desempenho de uma produção (STECKELBERG, 2001). Existem dispositivos apropriados para resfriamento de dornas e as linhagens industriais de S. cerevisiae são nor-malmente resistentes à alta temperatura, porém quando em sinergia com a presença de etanol ou meio com baixo pH sua viabilidade também é afetada (SILVA FILHO et al., 2005). A resistência da levedura ao etanol quando acaba a fermenta-ção em temperaturas menores, pode ser mais satisfatória e também gerar menos subprodutos do metabolismo celular, como o glicerol juntamen-te com o ácido succínico, devido à menor juntamen-tensão à qual as células são submetidas. Estes subpro-dutos são indesejados por consumirem de 3-5% de açucares e diminuírem o rendimento de eta-nol. (GANCEDO e SERRANO, 1989).

Desta forma, este trabalho pretende avaliar a viabilidade da levedura Saccharomyces

cerevisi-ae, bem como a produção de etanol empregando

processo fermentativo em batelada alimentada de 2 e 10 horas na temperatura de 24 e 32 ºC e con-centrações de sacarose 180 e 300 g/L e de fer-mento biológico 3 e 30 g/L.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados utilizando um mini fermentador, do modelo New Brunswick Multigen, munido de controle de agitação e de temperatura. O volume total de cada fermentação foi 1,5 L. Utilizou-se 3 ou 30g de levedura no inóculo. Tal inóculo consistiu de uma hidratação de 2 horas, em água e sob agitação, da levedura Saccharomyces cerevisiae. Esta cepa industrial Y -904 é produzida pela ABB Brasil. O meio de cultura para as leveduras foi composto de sacarose (180 g/L ou 300g/L), KH2PO4 (5 g/L), MgSO4∙7 H2O (1 g/L), NH4Cl (1,67 g/L), KCl (1 g/L) e extrato de levedura (6 g/L). Os reagentes utilizados foram todos de grau analítico, exceto a sacarose, a qual foi substituída por açúcar cristal comercial. O pH inicial de todas as fermentações executadas foi 4,5.

As concentrações de açúcares (sacarose, glicose e frutose), etanol e glicerol em todos os

experimentos foram determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

Na contagem de células, utilizou-se uma parte da espécime diluída e estimulou sua homogeneização através de agitação acentuada. Com a assistência de uma pipeta Pasteur, a solução foi posta entre a câmara de Neubauer e a lamínula, anteriormente limpas com álcool 70%. Por meio de microscópio óptico utilizando-se um aumento de 100 vezes, realizou-se a contagem das células na câmara de Neubauer.

Ao longo das fermentações, o crescimento celular foi assistido pelo recurso espectrofotométrico, que consistiu em diluir o meio fermentativo na proporção 1:50 para a leitura de sua absorbância a 650 nm em espectrofotômetro. A curva padrão, que relaciona absorbância com concentração celular em termos de massa seca em gramas por litro, ilustrada no gráfico abaixo, (Figura 1), foi utilizada para comparação com os valores lidos. O branco utilizado para leitura foi o meio fermentativo adequadamente diluído, sem células.

Figura 1 – Curva de calibração relativa à con-centração celular.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

O planejamento estatístico de experimentos é uma ferramenta útil para otimizar os processos onde muitas variáveis são envolvidas, possibilitando uma melhor manipulação dos parâmetros e uma analise mais representativa dos resultados. Neste trabalho o planejamento fatorial fracionado, estudou-se como o rendimento, açúcar residual e concentração de etanol são afetados pela temperatura, tempo de enchimento, concentração celular e de ART. Essas quatro variáveis independentes que afetam fortemente o desempenho da fermentação alcoólica foram avaliadas nas faixas determinadas de acordo com dados da literatura

y = 0,5748x R² = 0,9991 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8

X

(

g/

L)

Abs (nm)

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e industriais: temperatura (24 - 32°C), tempo de enchimento (2 - 10 horas), concentração celular no inoculo (3 - 30 g/L) e concentração de ART (180,4 - 322,1 g/L), todas estas variáveis foram analisadas durante 24 horas de processo fermentativo. No entanto, todos os experimentos foram conduzidos até completo consumo de sacarose.

Tabela 1 – Dados das fermentações do planejamento fatorial fracionado em 24 horas de fermentação.

Observa-se na Tabela 1 que o rendimento variou de 77,3% (Experimento 3) a 94,43% (Experimento 5) e a concentração de etanol esteve entre 54,96 g/L (Experimento 1) e 100,9 g/L (Experimento 8). Já a quantidade de açúcar residual variou de zero nos experimentos 6 e 7 em que a sacarose foi consumida totalmente em tempo menor que as 24 horas proposta, a 149,95 g/L (Experimento 3).

Com os resultados da Tabela 1, foi possível analisar estatisticamente o comportamento para cada resposta. Para isto, determinaram-se os coeficientes de regressão após a realização da regressão múltipla no programa Statistica 7.0. Devido a grande variabilidade inerente aos bioprocessos, foi considerado um nível de significância de 90%, ou seja, foram considerados significativos os parâmetros em que p<0,1. Rendimento

A Tabela 2 mostra os coeficientes de regressão das variáveis e interações com níveis de significância (p) menores que 10% para a resposta rendimento.

Tabela 2 – Regressão múltipla para a resposta rendimento

Como o modelo foi significativo, pois todos os valores de p foram menores que 0,1, foi possível construir as superfícies de resposta e definir regiões de interesse.

Por ser tratar de um planejamento que visa otimizar três variáveis de processo, serão apresentadas as regiões de interesse duas a duas junto a resposta avaliada. Para a resposta rendimento as regiões de interesse estão apresentadas na Tabela 3.

Temperatura (°C) Tempo de enchimento

(h) Concentração celular (g/L) Concentração de ART (g/L) Rendimento (%) Açúcar Residual (g/L) Concentração de Etanol (g/L) 1 24 2 3 180,4 79,74 47 54,96 2 32 2 3 322,1 87,03 141,57 79,29 3 24 10 3 322,1 77,3 149,95 68 4 32 10 3 180,4 77,6 3,59 70,11 5 24 2 30 322,1 94,43 154,4 80,92 6 32 2 30 180,4 92,02 0 84,8 7 24 10 30 180,4 84,1 0 77,52 8 32 10 30 322,1 88,2 98,6 100,9 Coeficiente

de Regressão Erro Padrão p - valores

Média 85,05250 0,457796 0,000000 Temperatura (°C) 1,16000 0,915592 0,085134 Tempo de Enchimento (h) -3,25250 0,915592 0,005737 Concentração Celular (g/L) 4,63500 0,915592 0,002053 Concentração de ART (g/L) 1,68750 0,915592 0,034609

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Tabela 3 – Regiões de interesse analisadas duas a duas para a resposta rendimento A partir das curvas de contorno geradas no

Statistica, definiu-se as faixas para cada variável.

A concentração de ART que maximiza o rendimento, indicou um valor maior que 160 g/L. Para a concentração celular o valor foi maior que 10g/L, para o tempo de enchimento maior que 2 horas e a faixa de temperatura foi de 24 a 32°C. Açúcar residual

A Tabela 4 apresenta os coeficientes de regressão das variáveis e interações com parâmetros significativos para a resposta açúcar residual. O modelo foi significativo, pois todos os valores de p foram menores que 0,1.

Tabela 4 – Regressão múltipla para a resposta açúcar residual

Para a resposta açúcar residual as regiões de interesse estão apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5 - Regiões de interesse analisadas duas a duas para a resposta açúcar residual

A concentração de ART que minimiza o açúcar residual esta entre 250 – 260 g/L. Para a concentração celular o valor encontrado foi maior que 8 g/L, para o tempo de enchimento maior que 2 horas e a faixa de temperatura foi de 24 a 32°C.

Concentração de Etanol

A Tabela 6 apresenta os coeficientes de regressão das variáveis e interações com parâmetros significativos para a resposta concentração de etanol.

Tabela 6 – Regressão múltipla para a resposta concentração de etanol

Para a resposta concentração de etanol as regiões de interesse estão apresentadas na Tabela 7.

Rendimento

Concentração celular X Tempo de enchimento

> 10 g/L > 2 horas

Concentração ART X Tempo de enchimento

> 160 g/L 2 – 7 horas

Concentração ART X Concentração celular

> 160 g/L > 15

Concentração de ART X Temperatura

> 200 g/L 24 – 32°C

Concentração Celular X Temperatura

> 15 g/L 24 – 32°C

Tempo de enchimento X Temperatura

< 5 horas 24 – 32°C

Coeficiente

de Regressão Erro Padrão p - valores

Média 74,3887 1,757659 0,000029 Temperatura (°C) -13,4487 3,515317 0,004636 Tempo de Enchimento (h) -11,3538 3,515317 0,007527 Concentração Celular (g/L) -11,1387 3,515317 0,007946 Concentração de ART (g/L) 61,7413 3,515317 0,000051 Açúcar residual

> 10 g/L > 5 horas

< 260 g/L > 2 horas

< 260 g/L > 10

> 250 g/L 24 – 32°C

> 8 g/L 27 – 32°C

> 4 horas 27 – 32°C

Coeficiente

de Regressão Erro Padrão p - valores

Média 77,06250 0,670107 0,000001 Temperatura (°C) 6,71250 1,340215 0,002118 Tempo de Enchimento (h) 2,07000 1,340215 0,053753 Concentração Celular (g/L) 8,97250 1,340215 0,000901 Concentração de ART (g/L) 5,21500 1,340215 0,004415

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A concentração de ART que maximiza a concentração de etanol indicou um valor maior que 160 g/L. Para a concentração celular o valor foi maior que 8 g/L, para o tempo de enchimento maior que 2 horas e a faixa de temperatura foi de 24 a 32°C.

Tabela 7 - Regiões de interesse analisadas duas a duas para a resposta concentração de etanol

CONCLUSÃO

A partir da análise estatística dos resultados obtidos no planejamento fatorial conclui-se que os fatores analisados - temperatura, concentração de sacarose e fermento biológico, tempo de enchimento do reator - interferem no desempenho da fermentação alcoólica.

A partir da interseção dos dados obtidos no planejamento foi possível obter as regiões de interesse onde pode-se otimizar as respostas do processo. A temperatura esta na faixa de 26 a 32°C, concentração celular na faixa de 15 a 30 g/L e concentração de ART entre 200 e 260 g/L. Para se obter valores que maximizam o processo é necessário a realização de um planejamento composto central nestas faixas encontradas.

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SMEETS, E.; JUNGINGER, M.; FAAIJ, A.; WAL-TER, A.; DOLZAN, P.; TURKENBURG, W. The sustainability of Brazilian ethanol—An assessment of the possibilities of certified

Concentração de etanol

> 15 g/L > 2 horas

> 220 g/L > 2 horas

> 160 g/L > 10

> 180 g/L 26 – 32°C

> 8 g/L 24 – 32°C

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production. Biomass and Bioenergy, v. 32, p. 781 – 813, 2008.

STECKELBERG, C., 2001. Caracterização de leveduras de processos de fermentação alcoólica utilizando atributos de composição celular e características cinéticas. Tese (Doutorado em Engenharia Química).

Faculdade de Engenharia de

Química,Universidade Estadual de Campinas. 215p.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Universidade Fe-deral de Uberlândia e a Faculdade de Engenha-ria Química pela oportunidade em realizar este trabalho. Agradecem também ao apoio financeiro da CAPES, CNPq e FAPEMIG.