Estrutura tridimensional da cutinase
Alunos:
Docente: Nuno Mendes nº 11998
Introdução
O objectivo deste trabalho prático consiste no estudo da produção de uma enzima, a cutinase.
A cutinase é uma lipase de massa molecular 22 a 25 kDa, produzida pelo fungo Fusarium solani que quebra a cutina (polímero insolúvel constituído por poliésteres de lípidos) da superfície das folhas das plantas. Não necessitando de activações interfaciais para trabalhar como uma lipase, a cutinase degrada ligações peptídicas e gorduras, tornando-a deste modo interessante do ponto de vista industrial.
O fungo Fusarium solani não produz cutinase em quantidades suficientes, sendo necessário a utilização da estirpe CY 000 de Saccharomyces cerevisiae como hospedeiro dos genes da cutinase.
Saccharomyces cerevisiae não foi seleccionada por ser uma óptima célula-fábrica para a produção de proteínas secretadas, mas sim devido à sua óptima performance quando ocorre uma mudança rápida de ambiente com muitos competidores. Esta é frequentemente usada como célula-fábrica para a produção de proteínas heterólogas, tendo a capacidade de excretá-las.
O promotor GAL7 de S.cerevisiae é utilizado para controlar a transcrição do gene que codifica a cutinase, transformando-o num gene quimérico. A transcrição não pode ser controlada por um promotor do fungo Fusarium solani visto este não possuir as enzimas que reconhecem os promotores de outras espécies. O promotor GAL7 é reprimido na presença glucose e fortemente induzido quando existe galactose no meio de cultura. Quando estas fontes de carbono não existem ocorre unicamente a transcrição basal, pois o promotor não é induzido nem reprimido.
A concentração de cutinase no meio não se mede directamente, mas sim através da variação da concentração do substrato sobre qual ela actua. Isto é, quanto maior a concentração de cutinase no meio, mais rápida será a degradação do substrato específico. Para este efeito, foram utilizados 10 μl de uma solução 56 mM de PNPB (para-nitrofenil-butirato, solução em etanol) exactamente antes da medição da absorvância.
A produção de cutinase atinge o seu auge quando o gene desta está induzido, ocorrendo um grande gasto de energia para as células, o que implica a baixa produção de biomassa. Quando o gene da cutinase está reprimido as células produzem essencialmente biomassa. Laboratorialmente a produção de cutinase tem duas etapas. Na primeira etapa reprime-se o promotor colocando as células num meio rico em glucose, influenciando o crescimento da cultura. Na segunda etapa (após esgotamento da glucose), o promotor é induzido pela presença de galactose o que proporciona a produção de cutinase.
A cutinase produzida pela célula é excretada para o exterior devido à introdução de uma pequena sequência de DNA entre o promotor e operão. Este último é responsável pela codificação de uma feromona que é excretada simultaneamente com a cutinase.
Material/reagentes Tampão de lise: Meios de cultura (YPD e YPG);
Vortex; − 0,15% SDS Copos de vidro e/ou Erlenmeyers;
Pipetas; − 20 mM Tris-HCL pH 7,4 Tubos de microcentrífuga (Eppendorfs);
Centrífuga; − 150 mM NaCl Cuvettes para espectrofotómetro (1 cm); − 0,5% Triton X-100
Densímetro; Espectrofotómetro;
− 1% Desoxicolato de sódio
Microcentrífuga; Tubos de centrífuga
− 1 mM EDTA
Esferas de vidro;
Cultura da estirpe CY000 de Saccharomyces cerevisiae;
Pipetas Gilson de P20, P200 e P1000 (20 μl, 200 μl e 1000μl respectivamente) e respectivas pontas; Meios de cultura com diferentes fontes de carbono: etanol, glucose, galactose e glucose+galactose; Substrato para a cutinase: solução 56 mM de PNPB (para-nitrofenil-butirato, solução em etanol).
Métodos/procedimento:
Foram feitas alterações ao procedimento constante do protocolo, daí que o método aqui descrito difira ligeiramente do original.
Este protocolo divide-se em três partes, que passamos a descrever:
Preparação da cultura:
1 - Inocular 200 ml de meio YPD com a estirpe produtora de cutinase. Incubar com agitação. 2 - Medir a DO (densidade óptica) da cultura
3 - Centrifugar o volume adequado de cultura para inocular 200 ml de meio a uma DO de 0.4. Recolher uma amostra de sobrenadante (1 ml) num tubo de microcentrífuga limpo. Deitar fora o resto do sobrenadante e lavar as células com água.
4 - Ressuspender as células em 1 ml de água e usar 500 μl inocular 100 ml e meio YPG e 100 ml do segundo meio a estudar. Incubar a 30ºc com agitação.
5 - Tirar amostras do meio de cultura ao longo do tempo e medir a densidade óptica. A) Preparação de extractos de proteína total
1. Sedimentar as células da suspensão fornecida por centrifugação num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 2. Transferir 0,5 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Guardar. Remover o resto do
sobrenadante para um copo de vidro.
3. Ressuspender as células em 300 μl de tampão de lise. 4. Adicionar as esferas de vidro.
5. Agitar no vortex 6x30 segundos, incubando 30 segundos no gelo ao fim de cada 30 segundos de agitação.
6. Centrifugar 5 minutos à velocidade máxima. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Guardar a -20ºC.
B) Determinação da actividade da cutinase
1. Transferir para uma cuvette de plástico a quantidade adequada* de amostra. Juntar tampão Tris 5 mM pH=7,5 de modo a perfazer 990 μl.
2. Imediatamente antes de iniciar as medições adicionar 10 μl de uma solução 56 mM de PNPB (para-nitrofenil-butirato, solução em etanol), de modo a totalizar 1ml total dentro da cuvette.
3. Medir a absorvância a 400 nm, de 20 em 20 segundos (ou de 30 em 30, caso a evolução da variação da absorvância seja muito lenta), durante 2 minutos.
4. Calcular a velocidade da reacção em nmol de produto formado/minuto, usando a expressão: A=ε x b x c
Em que A é a absorvância medida; b é o percurso óptico através da cuvette (1cm); c é a concentração que queremos obter; e ε é o coeficiente de extinção molar do PNPB a 400 nm = 37515 M-1 cm -1 5. Utilizando a curva de calibração fornecida (através da expressão y = 0,0185x + 0,0223), calcular a
concentração de cutinase na amostra (mg/ml)
Resultados:
1. Determinação da concentração de cutinase extracelular no meio com galactose
Após se ter extraído o sobrenadante da suspensão da cultura que foi incubada na presença de galactose, obteve-se a seguinte Tabela 1 de absorvâncias (pelo ponto B do protocolo):
A400 T(s) T(min) 0,062 0 0 0,109 20 0,333333 0,151 40 0,666667 0,191 60 1 0,229 80 1,333333 0,266 100 1,666667 0,304 120 2 mol/dm3 nmol/ml 1,6527E-06 1,652672264 2,9055E-06 2,905504465 4,0251E-06 4,025056644 5,0913E-06 5,091296815 6,1042E-06 6,104224977 7,0905E-06 7,090497134 8,1034E-06 8,103425297
Através da expressão A=ε x b x c (em que A é a absorvância medida; b é o percurso óptico através da cuvette (1cm); c é a concentração que queremos obter; e ε é o coeficiente de extinção molar do PNPB a 400 nm = 37515 M-1 cm –1), calcula-se a concentração de PNPB existente em cada instante de tempo, donde se obtém a Tabela 2 de concentrações de PNPB em função do tempo, podendo depois construir-se o Gráfico 1:
y = 3,193x + 1,8031 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0,5 Tempo (minutos)1 1,5 2 2,5 concentração do substrat o PN PB(nmol/ml)
Para calcular a velocidade de degradação do PNPB, podem utilizar-se dois métodos:
y = 0.0185x + 0.0223 0 1 2 3 4 0 50 100 150 200 ng de cutinase na reacção nmol PNPB/min
Gráfico 1 – Variação da concentração do PNPB no tempo
1 - tirando o declive da equação da recta obtida pelos pontos da tabela:
y = 3,193x + 1,8031 em que o declive é 3,193.
2 – calculando a partir de dois pontos do gráfico, pela expressão Gráfico 2– Recta de calibração da cutinase (Y2-Y1)/(X2-X1)=declive
O declive (velocidade) obtido é depois comparado com a recta de calibração da cutinase (em cima), e na expressão desta o valor 3,193 corresponde ao valor das imagens (velocidade de degradação do PNPB):
3,193 = 0,0185x + 0,0223
vem então que o valor da concentração de cutinase corresponde aproximadamente a 173,8 ng de cutinase/ml de cuvette, ou seja, 0,1738 microgramas cutinase/ml cuvette. Como o volume inicial de sobrenadante usado foi 2 microl, para 1 ml vem 86,9 microg cutinase/ml solução. Divide-se então esta massa de cutinase pela DO inicial do meio de cultura, para entrar em conta com o nº de células da suspensão inicial ( 86,9/0,48=181,04 ), donde se conclui que existiam aproximadamente : 181,04 microg cutinase/ml da solução inicial de sobrenadante da suspensão incubada com galactose. (Este valor difere do valor da tabela global dos outros grupos, uma vez que é resultado de cálculos auxiliados por computador que vieram substituir os valores obtidos na aula através do gráfico manual)
2. Determinação da concentração de cutinase extracelular no meio com galactose+glucose:
Para esta determinação, utilizaram-se os mesmos procedimentos quer experimentais quer matemáticos já referidos para o meio com galactose, julgando nós não ser essencial descrevê-los de novo, e referindo apenas o valor final obtido para a concentração de cutinase: 0,4 microg cutinase/ml na solução inicial de sobrenadante da suspensão incubada com galactose+glucose. Baseado nos valores obtidos pelos diferentes grupos, foi possível construir a seguinte tabela global:
Grupo\Meio Glucose
(μg/DO ml) (μg/DO ml) Galactose (μg/DO ml) EtOH (μg/DO ml) Glu/Gal DO 4,4 0,21 0,54 4,5 1 1,85 83,3 ⎯ ⎯ 2 ⎯ ⎯ 3 125 2,9 ⎯ 4 ⎯ 181,04 0,4* 5 0,782 43,75 ⎯
Tabela 3 - Resultados globais da produção de cutinase e da densidade óptica de cada meio
*(o turno da manhã obteve neste ensaio os valores de 136 e 44)
3. Indução por EtOH
Tabela 5 – Resultados globais da indução por EtOH Tabela 4 – volumes de sobrenadante utilizados
Tabela 7 – Concentrações de cutinase intracelular
4. Determinação da concentração intracelular de cutinase nas diferentes culturas
Utilizando o sobrenadante obtido no ponto A) do procedimento, foi possível efectuar a mesma técnica de medição e os mesmos cálculos utilizados no ponto 1. e no ponto 2. dos resultados, obtendo-se a seguinte tabela global:
Discussão/Conclusão:
Após análise detalhada dos resultados obtidos, chegámos a diversas conclusões, entre as quais sobressai que a produção de cutinase varia consoante a composição do meio de cultura, mais especificamente da fonte de carbono existente no mesmo.
A partir da tabela dos resultados globais da produção de cutinase e da densidade óptica de cada meio verifica-se o seguinte:
A densidade óptica nos meios com Glu(4,4) e com Glu/Gal(4,5) é semelhante, como seria de esperar, pois a glucose é o substracto preferencial das células, ou seja a produção de biomassa é idêntica nesta fase. No entanto se compararmos com a densidade óptica do meio com Gal (0,21), verificamos que o crescimento da cultura com Glu é muito superior ao da com Gal, o que confirma que a glucose é preferencial para crescimento da cultura, e isso verifica-se consequente na densidade óptica. Os valores obtidos para a concentração de cutinase vêm reforçar a ideia de que a glucose é um repressor dos genes de cutinase, e a galactose um poderoso indutor da produção da mesma. Deste modo, quando as células produzem grandes quantidades de cutinase, perdem muita energia, o que provoca a baixa produção de biomassa.
O meio Glu/Gal reproduz o que acontece laboratorialmente na produção de cutinase, distinguindo-se duas etapas. Na primeira etapa reprime-se o promotor colocando as células num meio rico em glucose, promovendo o aumento da biomassa (isto acontece enquanto houver glucose no meio). Na segunda etapa (após esgotamento da glucose), o promotor é induzido pela presença de galactose o que proporciona a produção de cutinase. É importante referir que o efeito do repressor se sobrepõe ao do indutor, pelo que no meio com Glu/Gal a produção de cutinase não é induzida enquanto houver Glucose no meio.
Outro aspecto importante é que o valor obtido para a produção de cutinase do meio Glu/Gal(0,4), no nosso turno(tarde), foi de uma ordem de grandeza diferente do turno da manhã(136 e 44). Esta discrepância de valores revela erros experimentais, provavelmente na pipetagem de volumes pequenos (2 μl) . Como o turno da manhã efectuou dois ensaios e o turno da tarde apenas um, será mais fiável tomar em conta a ordem de grandeza destes valores obtidos de manhã. Contudo se assim o é, concluímos que na altura de recolha e registo dos resultados a cultura de Glu/Gal já estaria numa fase avançada de produção de cutinase, o que implica que a
Amostra GAL EtOH
Do [cut] Do [ cut]
1 10,45 0,48 3,65 0,69 1,4
2 13,15 0,66 27,3 0,84 0,89
3 15,00 0,87 5 0,99 3,03
4 16,00 0,84 80 1,02 1,2
Amostra GAL EtOH
Do Vol (μl) Do Vol (μl) 1 10,45 0,48 50 0,69 50 2 13,15 0,66 20 0,84 50 3 15,00 0,87 2 0,99 50 4 16,00 0,84 2 1,02 50
Meio Volume utilizado na cuvette
Gal 2 μl sobrenadante + 988 μl de tampão +10 μl PNPB Gal/Glu 2 μl sobrenadante + 988 μl de tampão +10 μl PNPB Glu 10 μl sobrenadante + 980 μl de tampão +10 μl PNPB Etoh 30 μl sobrenadante + 960 μl de tampão +10 μl PNPB
Tabela 6 - volumes de sobrenadante utilizados na cuvette
Meio Concentração de cutinase (μg/ml) Glu 0,121 Gal 2160 EtOH 1,8 Gal/Glu 1
glucose já se encontrava esgotada e consequentemente o promotor GAL7 induzido, pelo que a concentração de cutinase no meio já era elevada.
Relativamente ao meio com EtOH, a densidade óptica é de 0,54, que se constata ser
superior ao meio com Gal e inferior ao meio com Glu. Isto acontece porque o etanol é uma fonte de carbono que não actua como repressor nem como activador do promotor da cutinase (GAL7), ocorrendo apenas a transcrição basal do gene produtor da cutinase. Isto leva a que haja alguma cutinase a ser produzida, mas em quantidades muitos inferiores às da indução.
A partir dos resultados da indução por EtOH, constata-se que logo ao fim do primeiro período de tempo registado (10:45 – 13:15) a Galactose já está a induzir fortemente a produção de cutinase, pois os valores registados da concentração da mesma já se encontram uma ordem de grandeza acima dos valores iniciais (medidos às 10:45). O valor obtido ao fim do segundo período (13:45 – 15:00) está em contradição com o esperado, pois revela-se menor que o anterior – logo impossível – pelo que deverá ter ocorrido um erro no procedimento da medição e/ou cálculos para obter este valor. O último valor, obtido às 16:00 horas já está de novo de acordo com os primeiros valores, revelando que a concentração de cutinase continua a aumentar. Por outro lado, a densidade óptica dessa cultura aumentou sempre, excepto no último período de tempo em que diminuiu, pelo que também aqui provavelmente terá ocorrido um erro experimental na medição da DO.
Quanto à cultura com EtOH, os valores da DO são coerentes (aumentam uniformemente) enquanto que os valores da concentração de cutinase são completamente díspares uns dos outros. Isto revela mais uma vez a ocorrência de erros experimentais. Ainda assim, deveria poder observar-se um crescimento da concentração de cutinase, se bem que a um ritmo muito inferior ao do meio com Gal, para poder confirmar-se pela prática aquilo que na teórica já se disse: que o EtOH, não é indutor nem repressor da transcrição do gene quimérico da cutinase, pelo que apenas ocorre transcrição basal do mesmo.
No ensaio da extracção da cutinase intracelular, pode observar-se que a cultura com Gal apresenta elevada concentração de cutinase intracelular, o que faz sentido, pois sendo a Galactose indutora da produção de cutinase, é natural que estas células estivessem em plena produção da enzima, que embora sendo quase imediatamente excretada, abunda no meio intracelular. A cultura com Glucose apresenta uma concentração ínfima de cutinase, o que está em consonância com os resultados obtidos anteriormente para meios com esta fonte de carbono. No meio com EtOH ocorre uma concentração intracelular de cutinase da mesma ordem de grandeza das outras culturas já observadas com esta fonte de carbono. Por fim, no meio com galactose e glucose temos uma concentração intracelular da enzima maior que no meio com glucose (uma ordem de grandeza acima). Daqui pode inferir-se que, sendo a glucose o substrato preferencial desta levedura, para ocorrer cutinase no meio seria porque a glucose já teria sido esgotada e as células já estariam a recorrer à galactose como fonte de carbono.
Os valores obtidos para as concentrações intracelulares de cutinase são naturalmente menores que os extracelulares, uma vez que (como já foi referido) a cutinase é quase imediatamente secretada para o meio após a sua produção.
