Ciência Animal, 17(2):91-100,2007
FRAÇÃO ATIVA DA ÁGUA DE COCO: CONSERVAÇÃO E FERTILIDADE DO SÊMEN DE SUÍNO
(Active fraction of coconut water: conservation and fertility of the swine semen)
Ricardo TONIOLLI1*, Michel COUROT2, Yves COMBARNOUS2, Jean BUSSIERE2 1FAVET/UECE, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen
2Station de Physiology de la Reproduction - INRA, Nouzilly-França RESUMO
O ácido 3-indol acético (IAA) foi identificado como a principal substância protetora do espermatozóide, presente na água do coco. Duas concentrações, de IAA (10 e 100 ng/mL) adicionadas ao diluente de Beltsville (BTS) foram estudadas in vitro e in vivo. A motilidade dos espermatozóides foi verificada durante um período de seis dias conservando-se o sêmen a 15°C. Para cada fêmea foram realizadas duas inseminações durante o estro, com um intervalo de 24 h. Nenhum efeito do IAA in vitro foi observado sobre a mobilidade espermática. A fertilidade e a prolificidade de porcas foram similares às de animais inseminados com espermatozóides conservados somente durante um dia com ou sem IAA. Com o sêmen congelado, os níveis de motilidade os mais elevados, após cinco minutos de incubação, foram obtidos com a dose de 100 ng/mL (2,7 vs 2,3 para o BTS, p<0,05). Em relação à percentagem de espermatozóides móveis, no mesmo período de incubação, o IAA em relação ao BTS obteve 29,7% vs 26,21% (p<0,05), respectivamente. A percentagem de marrãs gestantes aos 30 dias pós I.A. foi de 63% em presença de IAA e 48% com o diluente BTS (p>0,05).
PALAVRAS-CHAVE: sêmen, suíno, água de coco, conservação. ABSTRACT
The indol 3 acetic acid (IAA) extracted from the coconut water, was identified as the principal protector substance of spermatozoa. Two concentrations of IAA (10 and 100 ng/mL) added to BTS extender, were used to in vitro and in vivo studies. The spermatozoa motility was studied during six days with semen conservation at 15°C. For each female two inseminations were accomplished during the estrus, with an interval of 24 h. No effect of IAA in vitro was observed in spermatic motility. The sows fertility and prolificacy, are similar to animals inseminated with spermatozoa conserved during one day in absence or presence of IAA. Better motility levels of frozen semen were obtained after five minutes of incubation with a dose of 100 ng/mL (2.7 vs 2.3 to BTS, p<0.05) respectively. The percentage of mobile spermatozoa during the same incubation time in IAA or BTS obtained 29.7 vs 26.1% (p<0.05), respectively. The percentage of pregnant gilts at thirty days after artificial insemination was the 63% with IAA and 48% with BTS extender (p<0.05).
KEY WORDS: semen, swine, coconut water, conservation
*Endereço para correspondencia:
Universidade Estadual do Ceará/Faculdade de Veterinária Av. Paranjana, 1700
CEP 60740-000 Fortaleza, Ceará e-mail: toniolli@roadnet.com.br
INTRODUÇÃO
O aumento da utilização da inseminação artificial (IA) em nível mundial nos últimos anos, foi resultado de vários fatores, particularmente os econômicos (WENTZ et al., 2001; SILVEIRA & SCHEID, 2002). A IA suína, baseia-se na utilização
rotineira do sêmen diluído e conservado a 15°C, no máximo até três dias após a coleta. Após o terceiro dia, sua utilização não alcança os níveis de fertilidade e prolificidade obtidos com a monta natural (PAQUIGNON et al., 1987; BHUYAN et al., 1992). O desenvolvimento de uma técnica simples e confiável se faz necessário a fim de se poder utilizar o sêmen assim tratado por um tempo suficiente sem perda do seu poder fecundante, de maneira que os aspectos técnicos para o emprego da IA sejam controlados para não reverter a viabilidade econômica do processo (BORTOLOZZO & WENTZ, 1998). Este problema levou numerosos pesquisadores à procura de substâncias que poderiam ter um papel favorável na manutenção in vitro da motilidade dos espermatozóides, em vistas de sua utilização em inseminação artificial (PAQUIGNON et al., 1987 e SONE et al., 1992). A conservação por um período equivalente a uma semana de trabalho, parece ser um objetivo prático interessante sobre o qual serão concentrados os experimentos, não devendo entretanto, serem negligenciados as regras básicas de higiene e manipulação do material (PERESTRELO & PERESTRELO, 1998) e as duas inseminações por cio da fêmea (SILVEIRA et al., 2004).
No Brasil, os primeiros relatos sobre inseminação artificial (IA) na espécie suína, datam da década de quarenta, com um crescimento mais significativo a partir de 1993 (BROTOLOZZO & WENTZ, 1997). Trabalhos brasileiros mostraram o efeito benéfico da água de coco utilizada como diluente do sêmen do bode, do varrão (TONIOLLI, 1990 e 1991), do carneiro (FREITAS & NUNES, 1994) e do cão (BETINI et al., 2001). Este efeito foi evidenciado in vitro sobre as características de motilidade espermática e in vivo sobre os parâmetros de fertilidade. Um composto, inicialmente denominado JYP, foi identificado dentro da água de coco e que parece, ao menos em parte, responsável pelo efeito favorável deste meio de diluição (NUNES & COMBARNOUS, 1994). Em seguida, o JYP foi identificado como o ácido 3-indol acético (IAA), um hormônio vegetal conhecido pelo nome de auxina. Por isto tenta-se confirmar se este produto pode igualmente ser eficaz quando adicionado ao diluente BTS para a conservação do sêmen do varrão.
Os primeiros trabalhos de congelação de sêmen de varrão foram realizados durante a década de 1950-60. As taxas de espermatozóides móveis após a descongelação variavam de 25 a 50% segundo os autores e técnicas utilizadas (POLGE, 1956). As taxas de parição foram inferiores a 50%. A evolução das técnicas de congelação, associada ao aperfeiçoamento dos métodos de inseminação pela via cervical permitiu aumentar a taxa de partos em até 87% (WESTENDORF et al., 1975). Entretanto, os resultados médios das inseminações com sêmen congelado são ainda muito baixos e o custo desta técnica é muito elevado, não permitindo que ela possa ser utilizada em trabalhos de rotina pelos criadores. Levando-se em conta estes diversos aspectos, este trabalho teve por finalidade avaliar a capacidade da auxina (IAA) em proteger os espermatozóides do varrão.
MATERIAL E MÉTODOS Sêmen no estado líquido
Para o estudo in vitro, os machos utilizados neste trabalho se encontravam em serviço de coleta regular de sêmen. Todos os ejaculados apresentavam as qualidades exigidas para sua utilização em IA: motilidade (≥3,0), porcentagem de espermatozóides móveis (≥75%) e anomalias morfológicas totais (≤40%). Em seguida a coleta e o controle de qualidade, cada ejaculado foi dividido para que uma fração fosse diluída com o diluente de Beltsville (BTS - testemunho), adicionado ou não do IAA. As concentrações finais de IAA foram de 10ng/mL e 100ng/mL. Em todos os experimentos, in vivo e in vitro, o sêmen utilizou-se a concentração final de 35 x106 sptz/mL. As análises foram feitas a partir de alíquotas de 3 mL das amostras de sêmen assim tratados e estocados durante seis dias à uma temperatura de 15°C. A cada dia de conservação do sêmen uma amostra por lote foi retirada para as análises (D0 = dia da coleta). O efeito dos tratamentos foi medido por estimação ao microscópio óptico: 1) a motilidade (0 a 5); 2) a porcentagem de espermatozóides móveis (0 a 100%). As observações foram realizadas após cinco minutos e três horas de incubação a 39°C. Para as inseminações artificiais, as doses de sêmen (90 mL) foram preparadas e conservadas também a 15°C.
Para este experimento, um total de 59 machos e 109 ejaculados foram utilizados. No estudo in vivo, os ejaculados foram repartidos em doses para serem utilizados segundo a técnica de « ejaculados divididos » dentro de cada lote experimental. Os diluentes testados foram o BTS (controle) e o BTS adicionado de IAA a uma concentração final de 10 ng/mL. As porcas utilizadas foram na sua maioria multíparas, com somente 8,5% de nulíparas, divididas de modo equilibrado dentro dos cinco lotes de tratamento conforme descrito a seguir: 1) Diluidor BTS – D0/D1, sptz/IA = 3 x 109; 2) DTS/IAA – D0/D1, sptz/IA = 3 x 109; 3) DTS/ IAA – D5/D6, sptz/IA = 3 x 109; 4) DTS/IAA – D5/D6, sptz/IA = 6 x 109; 5) DTS/IAA – D5/D6, sptz/IA = 6 x 109.
Para cada fêmea, foram realizadas duas inseminações durante o cio, com um intervalo de 24 horas, sendo os primeiros dias escolhidos para as inseminações (D0 ou D5) e o dia seguinte (D1 ou D6). O dia da coleta do sêmen foi considerado como D0. Uma bisnaga de 90 mL (35 x106 sptz/ mL) foi utilizada para as inseminações simples e duas para as doses duplas.
Sêmen congelado
No estudo in vitro, o sêmen foi congelado segundo o método de PAQUIGNON et al. (1974). O diluente utilizado para congelação foi à base de gema de ovo, conforme descrito por POLGE et al. (1970). Inicialmente, após a coleta, um volume de sêmen contendo um total de 10 x109 sptz foi destinado a cada um dos lotes de congelação (com ou sem IAA), de modo a se obter uma concentração final de 100 x106sptz/mL. A concentração final do glicerol foi de 2% dentro de cada lote de sêmen a congelar (POLGE et al., 1970). O sêmen foi coletado com uma pipeta para a congelação sobre gelo seco (a -70°C) por depósito de gotas de 0,1 mL em forma de pastilhas (50 x106 sptz). Após quatro minutos sobre o gelo seco as pastilhas foram transferidas diretamente para dentro do nitrogênio líquido onde elas foram conservadas pelo menos durante sete dias.
Para cada análise in vitro, quatro pastilhas (0,4 mL) foram depositadas dentro de 1,6 mL de diluente a 50°C durante 30 segundos. Para cada inseminação, o conteúdo de 200 pastilhas foi
colocado dentro de 80 mL de diluidor BTS, adicionado ou não de IAA em uma concentração final de 100 ng/mL, e foram descongelados. As pastilhas foram então diluídas em uma proporção de 1/5 segundo a técnica de diluição de doses de sêmen congelado descrita por PAQUIGNON & du MESNIL du BUISSON (1973). Neste experimento, o IAA foi testado em duas concentrações finais: 10 e 100 ng/mL. A motilidade e a porcentagem de espermatozóides móveis foi controlada após 5 minutos e duas horas de incubação do sêmen a 39°C. O diluente de descongelação utilizado foi o BTS dentro do qual o IAA é adicionado conforme a seguir: 1) BTS lote = 0/0; 2) IAA a 10 ng/mL, adição de IAA a descongelação, lote 0/10 ; 3) IAA a 10 ng/mL, adição de IAA a 30°C, lote 10/0 ; 4) IAA a 10 ng/ mL, adição de IAA a 30°C/degelo, lote 10/10 ; 5) IAA a 100 ng/ml, adição de IAA a descongelação, lote 0/100; 6) IAA a 100 ng/ml, adição de IAA a 30°C, lote 100/0 ; 7) IAA a 100 ng/mL, adição de IAA a 30°C/degelo, lote 100/100.
No estudo in vivo, a adição de IAA ao diluidor de congelação (gema de ovo), foi feito a temperatura de 30°C e/ou ao diluente de descongelação (BTS), a uma concentração final de 100 ng/mL. Quatro tratamentos, cada um com 27 fêmeas cada um foram formados segundo a presença ou ausência de IAA: 1) ausência de IAA (controle = 0/0); 2) adição de IAA ao degelo (0// 100); 3) adição de IAA a 30oC (100/0); 4) adição de IAA a 30oC e ao degelo (100/100).
Cada fêmea em cio foi inseminada duas vezes com doze horas de intervalo e com uma dose de 10 x109 sptz total, sendo as duas doses provenientes de um mesmo reprodutor e do mesmo ejaculado. As inseminações foram feitas 24 horas após o início do cio, segundo o esquema abaixo: a) Primeiro caso: início do cio pela manhã (8h30), a IA foi realizada no dia seguinte pela manhã (1a) e à noite (2a); b) segundo caso: início do cio à noite (17h30), a IA no dia seguinte à noite (1a) e na manhã do segundo dia (2a). Se uma série de cios duvidosos se encontra antes dos cios positivos, o último cio duvidoso é considerado como início do cio. Antes de cada IA (1a e 2a), as marrãs receberam uma dose de plasma seminal de 50 mL para cada, IA utilizando-se a mesma pipeta usada para a
inseminação. Análise estatística
As análises de comparação de distribuição de freqüências foram feitas pelo teste de Student e teste de qui-quadrado corrigido. Os resultados são expressos como médias e desvios padrões para cada tratamento. A análise das diferenças entre médias foi realizada por uma análise de variância multifatorial com a ajuda do programa SYSTAT (Versão 5 - 1994).
RESULTADOS Sêmen no estado líquido
O IAA nas concentrações de 10 e 100 ng/ mL não teve efeito significativo (p>0,05) sobre a motilidade e a porcentagem de espermatozóides móveis durante os seis dias de conservação do sêmen a 15°C. Durante a estocagem do sêmen por um período de cinco a seis dias, os parâmetros de mobilidade espermática entre D0 e D6 (a cinco minutos de incubação) teve um pequeno decréscimo, estando o IAA presente ou não no meio de diluição. Este efeito não foi significativo sobre as duas características estudadas (Fig. 1 e 2).
Os lotes 1 e 2, não apresentam diferenças significativas nos resultados de fertilidade e de prolificidade. De forma semelhante, os lotes 4 (BTS + IAA) e 5 (BTS), nos quais as fêmeas foram inseminadas com uma dose de 6 x109 sptz conservados até 6 (D6) dias, as diferenças não foram significativas. Um resultado inesperado e interessante foi observado com o lote 5 nos quais a fertilidade e prolificidade não foram
significativamente inferiores aos do lote 1 (77,4% e 10,7 ± 2,8 vs 80,5% e 10,7 ± 2,9). Quando as fêmeas foram inseminadas com 3 x109 sptz, após 5 a 6 dias de estocagem do sêmen a 15°C em presença de 10 ng/mL de IAA (lote 3), não foi observado decréscimo em relação ao lote 1 para os resultados de fertilidade (81,4% vs 80,5%, NS) e de prolificidade (10,6 ± 3,2 vs 10,7 ± 2,9; NS). Dentro deste lote 3, o número de espermatozóides utilizado para as inseminações no D5 é o mesmo do lote 1 no D0 (2 vezes 3 x109 sptz). Nos resultados de fertilidade no D0, há uma tendência não significativa, a favor do BTS em relação ao BTS + IAA (80,5% vs 76,6%). Após cinco dias de conservação, a dose dupla de espermatozóides (6 x109) não apresentou resultados de partos significativamente diferentes para o BTS em relação ao BTS + IAA (77,4% vs 80,3%). O número total de leitões por barrigada foi idêntico em todos os lotes, mas após 5 a 6 dias de conservação em presença de IAA, uma dose simples de sêmen permitiu obter um número de leitões vivos (10,6 ± 3,2) equivalente ao obtido em D0/D1 (sem e com IAA) (Tab. 1).
Sêmen congelado
Após cinco minutos de incubação, verificou-se diferenças significativas entre as duas concentrações de IAA para a característica motilidade, qualquer que seja o momento de sua adição ao sêmen. A concentração de 100 ng/mL foi superior a de 10 ng/mL: 2,7 vs 2,5; respectivamente (p<0,05). A adição de IAA somente após o degelo mostra que, em relação ao testemunho (0/0), a diferença foi mais acentuada (2,7 vs 2,3; p<0,05).
5 minutos de incubação 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 Dias de Conservação P o rc e n ta g e m E s p e rm a to z ó id e s M ó v e is ( % ) BTS+IAA100 BTS+IAA10 BTS 3 horas de Incubação 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Dias de Conservação P o rc e n ta g e m E s p e rm a to z ó id e s M ó v e is ( % ) BTS+IAA100BTS+IAA10 BTS
Figura 1. Efeito do ácido 3-indol acético durante um período de conservação de 6 dias, sobre as características de porcentagem de espermatozóides móveis após 5 min e 3h de incubação do sêmen em banho-maria a 39°C.
A ação favorável do IAA a 100 ng/mL foi particularmente marcante após duas horas de incubação a 39°C (p<0,05).
Esta concentração de IAA reduziu de forma significativa a queda da motilidade espermática em relação a 0 ou 10 ng/mL de IAA durante este tempo de incubação do sêmen. Em relação à porcentagem de espermatozóides móveis, nos dois tempos de incubação, os valores do lote testemunho foram inferiores aos obtidos em presença de IAA (p<0,05). Para os lotes com IAA, houve uma equivalência de valores a cinco minutos de incubação, mas após duas horas, a concentração de 100 ng/mL, permite a manutenção de uma melhor porcentagem de espermatozóides móveis (p<0,05). Quando da adição de IAA (100 ng/mL) antes e após a congelação, resultados significativos foram obtidos para a motilidade e a porcentagem de espermatozóides móveis. Isto foi particularmente visível após duas horas de incubação (Tab. 2).
A adição de IAA ao diluente gema de ovo durante o processo de congelação a 30°C (100/0) não resultou em melhora nos resultados de fertilidade
em relação ao lote testemunho (48%, dentro dos dois casos, NS). Quando o IAA foi adicionado somente ao degelo (0/100) a porcentagem de fêmeas gestantes foi inferior (33%), mas as diferenças não foram significativas (p>0,05). A taxa mais elevada de fêmeas gestantes foi obtida quando o IAA foi adicionado antes da congelação (30°C) e após o degelo (100/100). Neste caso obteve-se 17 fêmeas prenhes (63%) sobre as 27 inseminadas. Entretanto, esta diferença em relação ao lote testemunho (0/0) não foi estatisticamente significativa (p>0,05) possivelmente em razão do número muito pequeno de animais inseminados. Quando foi avaliada a porcentagem de embriões vivos por fêmea, observou-se que o lote testemunho 0/0 mostrou um resultado menor (7,4 embriões por fêmea). Adicionando-se o IAA seja a 30°C, seja ao degelo, ou nos dois momentos, o número de embriões vivos melhorou (9,3; 10,1 e 8,8 embriões por fêmea, respectivamente) (p<0,05). Esta tendência foi também notada para o número total de embriões por fêmea (vivos e mortos) (p<0,05) (Tab. 3). Condições Resultados IA Lotes (n) IAA ng/mL Sptz x109 Fertilidade (%) Número Total de embriões Vivos D0/D1 1 (128) 0 2 x 3 80,5a 11,3 ± 2,9 10,7 ± 2,9 2 (128) 10 2 x 3 76,6a 11,5 ± 3,6 11,1 ± 3,1 D5/D6 3 (140) 10 2 x 3 81,4a 11,2 ± 3,5 10,6 ± 3,2 4 (132) 10 2 x 6 80,3a 11,4 ± 3,2 10,8 ± 2,9 5 (106) 0 2 x 6 77,4a 11,3 ± 3,1 10,7 ± 2,8
Tabela 1. Fertilidade e prolificidade de porcas inseminadas utilizando sêmen diluído em diluente de Beltsville adicionado ou não de ácido 3-indol acético.
Letras iguais na coluna indicam ausência de diferença estatísticamente significativa (p>0,05)
5 minutos Incubação 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0 1 2 3 4 5 6 Dias de Conservação V ig o r E s p e rm á ti c o ( 0 a 5 ) BTS+IAA100 BTS+IAA10 BTS 3 horas Incubação 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 1 2 3 4 5 6 Dias de Conservação V ig o r E s p e rm á ti c o ( 0 a 5 ) BTS+IAA100 BTS+IAA10 BTS
Figura 2. Efeito do ácido 3-indol acético durante um período de conservação de 6 dias, sobre as características de vigor espermático após 5 min e 3h de incubação do sêmen em banho-maria a 39°C.
DISCUSSÃO
No presente trabalho, as análises in vitro do sêmen do varrão indicam que não houve diferença significativa nos parâmetros de motilidade avaliados em presença ou em ausência de IAA no meio de diluição. Entretanto, durante o período de conservação do sêmen, e em particular após o terceiro dia, os lotes de sêmen contendo IAA mostraram uma motilidade média ligeiramente acima das do lote controle. Pode-se então esperar, com a utilização de um sêmen conservado mais de três dias após a coleta, uma melhoria dos resultados de fertilidade pela adição do IAA.
Em relação aos trabalhos de KUCIEL & SZEP (1994), os resultados deste trabalho foram encorajantes, os níveis de motilidade espermática permaneceram estáveis até o quarto dia de conservação do sêmen a 15°C dentro do diluente BTS sozinho ou contendo o IAA (75 a 80% de espermatozóides móveis e 2,5 a 3,0 de motilidade). Estes autores obtiveram apenas 35% de
espermatozóides móveis, com os diluentes SL97 e SL98 após 72 horas de conservação do sêmen. A água de coco bruta, já demonstrou sua ação estimulante sobre os espermatozóides do carneiro (OLIVEIRA et al., 1994), de cão (MONTEZUMA JÚNIOR et al., 1994) e de bode (SALLES & NUNES, 1994). Em relação ao IAA e sua ação in vitro sobre a motilidade de espermatozóides do varrão, outros componentes presentes na água de coco, foram aparentemente necessários para que ele exprimisse plenamente seu efeito favorável sobre a motilidade espermática. Numerosos fatores devem ser considerados para a análise de um sêmen e de suas possibilidades de fecundar: a qualidade do reprodutor (SILVEIRA & SCHEID, 2003a), a qualidade espermática (SILVEIRA & SCHEID, 2003b; ALONSO, 2003), o choque térmico (PURSEL et al., 1973); enquanto na fêmea, a idade, o estado de saúde, e momento de ovulação em relação ao momento da IA, bem como a pressão exercida sobre a dose inseminante, forçando a entrada do sêmen no trato reprodutivo (FLORES
IAA Vigor Espermático Motilidade Espermática
(ng/mL) Tempo de incubação 5 mn 2 h 5 mn 2 h 0/0 (107) 2,3 ± 0,4a 1,7 ± 0,8a 26,2 ± 8,0a 14,6 ± 9,4a 0/10 (75) 2,5 ± 0,4b 1,7 ± 0,7a 30,3 ± 7,4b 15,5 ± 9,9ab 10/0 (107) 2,5 ± 0,4b 1,8 ± 0,8a 29,3 ± 7,4b 16,8 ± 9,9ab 10/10 (107) 2,5 ± 0,5b 1,9 ± 0,8a 30,4 ± 7,1b 17,4 ± 10,3b 0/100 (32) 2,7 ± 0,4c 2,4 ± 0,5b 29,5 ± 5,4b 22,2 ± 6,5c 100/0 (62) 2,6 ± 0,4bc 2,3 ± 0,4b 28,9 ± 5,9b 23,9 ± 7,2c 100/100 (62) 2,7 ± 0,5c 2,3 ± 0,5b 29,8 ± 6,2b 24,5 ± 6,5c
Tabela 2. Efeito da dose e do momento de adição do ácido 3-indol acético (10 e 100 ng/mL) sobre as características de mobilidade espermática do sêmen congelado do varrão (média ± desvio padrão).
Em cada tempo de incubação, as diferenças significativas entre os lotes são expressas por letras diferentes (p<0,05).
Lotes Gestantes Embriões
IAA (ng/mL) (n) (%) Total Vivos
1 - (0/0) 13ab 48 7,9 ± 4,0a 7,4 ± 3,5a 2 - (0/100) 9a 33 10,0 ± 3,0b 9,3 ± 2,7b 3 - (100/0) 13ab 48 10,4 ± 4,3b 10,1 ± 2,8b 4 - (100/100) 17b 63 9,1 ± 3,6ab 8,8 ± 3,6ab
Tabela 3. Resultados de fertilidade e de prolificidade de marrãs inseminadas com o sêmen congelado diluído em diluente de Beltsville adicionado ou não do composto ácido 3-indol acético em uma concentração final de 100 ng/mL.
et al., 2000) e a total interação entre as fêmeas e os reprodutores (QUEVEDO, 2000).
Não se pode esquecer a influência do meio ambiente (barulho, calor, etc) sobre o comportamento dos animais, em particular do varrão (SILVEIRA & SCHEID, 2003a). O presente trabalho sugeriu ser possível a utilização do sêmen suíno após o terceiro dia de conservação mantendo a qualidade dos resultados de fertilidade e de prolificidade. TONIOLLI (1991) demonstrou o efeito benéfico da água de coco para a diluição do sêmen do varrão. A partir destes resultados, foi testado se o produto ativo (IAA) que ela contém é igualmente eficaz sobre o poder fecundante dos espermatozóides do varrão. Testes in vivo, a adição do composto IAA ao diluente BTS nos permitiu a manutenção de níveis de fertilidade (81,4%) e de prolificidade (10,6 leitões vivos por barrigada) tão bons quanto os obtidos a D0 com o diluente controle. Isto foi conseguido com doses simples de sêmen (3 x109 sptz) conservados durante seis dias a 15°C. Estes resultados foram superiores aos encontrados por vários autores (WABERSKI et al., 1994; TONIOLLI et al., 2001) que trabalharam com o sêmen suíno estocado entre três e cinco dias e com vários diluentes (BTS, Modena, Kiev, BL1, Androhep e Zorlesco). Outro aspecto a ser considerado é uma tendência de que fêmeas cobertas com um intervalo maior entre as inseminações possam apresentar uma menor produtividade (CASTAGNA, 2001).
Os resultados de fertilidade e de prolificidade obtidos não ultrapassaram valores médios de 69,2% e 9,3 leitões por barrigada. Os diluidores BL-1 (PURSEL et al., 1973) e Guelph (PAQUIGNON et al., 1987) permitem conservar o sêmen suíno sem diminuição do seu poder fecundante até dois a três dias após a coleta (PAQUIGNON et al., 1980). Após este período, a eficiência destes diluentes pode ser prolongada de um dia à condição de se utilizar uma dose dupla de sêmen por inseminação. MACHATY et al. (1992) utilizando o diluente BTS e doses de cinco bilhões de espermatozóides conservados durante quatro dias, obtiveram uma porcentagem de partos de 74,5% e uma prolificidade de 9,5 leitões por barrigada. O uso de inseminação intra-uterina permite uma diminuição do número de
espermatozóides por dose (DALLANORA, 2004; MEZALIRA et al., 2004).
O resultado prático mais interessante foi a possibilidade de se conservar o sêmen do varrão durante seis dias a 15°C dentro do diluente BTS em presença de 10 ng/mL de IAA. Assim, em presença de IAA, com doses simples (3 x106 sptz) ou duplas (6 x106 sptz) de sêmen, os resultados de fertilidade e de prolificidade observados a D5/D6 foram idênticos aos encontrados no D0/D1 com o uso de doses simples. Isto permite a visualização de uma maior utilização do sêmen de reprodutores selecionados, uma vez que não será mais necessário de se dobrar as dose quando das inseminações com o sêmen conservado até seis dias. Entretanto, não se sabe se o IAA é a única molécula responsável pelo efeito protetor da água de coco sobre a conservação do sêmen do varrão. A composição do líquido endospérmico deste fruto é muito complexa e compreende numerosos elementos: minerais, açúcares, proteínas, hormônios. A concentração do IAA utilizada neste trabalho (10 ng/mL) é próxima da concentração da auxina ativa (40 ng/mL) encontrada dentro do líquido endospérmico do coco à idade de nove meses do seu desenvolvimento (DUA & CHANDRA, 1993). Não se pode excluir que outras moléculas presentes na água de coco possam agir sobre a viabilidade do sêmen do varrão. O IAA pareceu ser responsável por uma parte desta ação estimulante.
O fato de que o sêmen congelado do varrão possa guardar seu poder fecundante e manter um nível de prolificidade correto, é um problema ainda não resolvido até o presente momento. Assim, o desenvolvimento de um diluente capaz de manter um bom nível de motilidade do espermatozóide após o degelo se faz necessário. Devido a estes problemas, a IA com o sêmen congelado do varrão não é utilizada em rotina de trabalho em nenhum país até o presente momento (XIN & JIAN, 1991). Com efeito, os resultados de fertilidade e de prolificidade são ainda bem inferiores aos níveis obtidos com o sêmen no estado líquido (GUTHRIE & WELCH, 2005). A adição do IAA ao diluente BTS mostra boas perspectivas para sua utilização nos processos de congelação do sêmen de suíno, porque ele tem um efeito estimulante sobre a motilidade e a porcentagem de espermatozóides
móveis em particular à concentração de 100 ng/ mL. Este efeito foi significativo nos dois tempos de incubação do sêmen e igualmente quando ele é adicionado simplesmente ao diluente de degelo (0/ 100).
Apesar disto, ainda foi observada uma queda considerável da porcentagem de espermatozóides móveis após o degelo e mesmo às vezes apresentando valores inferiores aos encontrados por outros autores (BWANGA et al., 1992). Isto é provavelmente devido à variações individuais entre reprodutores. A dose de 100 ng/ mL por mililitro permitiu uma redução significativa da queda da motilidade e da porcentagem de espermatozóides móveis durante o teste de termorresistência entre cinco minutos e duas horas de incubação em relação ao lote controle. As opiniões em relação á análise de um sêmen in vitro e a correlação com a fertilidade são muito divergentes.
Os resultados deste trabalho permitem visualizar melhorias nos programas de IA com o sêmen suíno em estado líquido e obter níveis de fertilidade superiores aos observados atualmente. Pelo fato de uma conservação mais longa, as doses de sêmen à fresco podem ser expedidas até centros mais distantes da central de produção. Em adição torna-se possível de organizar as coletas de maneira que o sêmen de todos os varrões esteja disponível em doses de sêmen a fresco.
Os resultados de fertilidade com o sêmen congelado são encorajadores, mas ainda insuficientes, devendo ser confirmados sobre um efetivo maior. Novas possibilidades de aplicação desta tecnologia estão assim abertas para o sêmen congelado. A utilização da água de coco ou de seus derivados biotecnológicos, como diluente do sêmen suíno, abre novas possibilidades de pesquisa no Brasil onde a matéria prima é abundante e a IA pode ajudar na melhoria genética do rebanho.
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