EXTD02 EXTRAcell - Kit Extração DNA de amostras celulares

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EXTD02

EXTRAcell - Kit Extração DNA de amostras celulares

Instruções de Uso USO PRETENDIDO

O produto <<Extracell>> é um sistema de extração de DNA viral e celular de amostras eucarióticas e procarióticas presente em amostras celulares como sangue total (periférico e medula óssea), leucócitos periféricos, Monócitos, granulócitos, amostras cervicais, swabs uretrais, swabs faríngeos, swabs nasais. Lavado broncoalveolar, escarro, saliva, gargarejo, fluído amniótico, urina e fluído cefalorraquidiano (liquor).

O produto é indicado para extração de DNA de amostras celulares. O DNA deve ser usado para testes de diagnóstico baseados na amplificação de ácidos nucleicos com enzima DNA polimerase (assim como DNA polimerase termoestável).

MATERIAIS FORNECIDOS

O kit contém os seguintes componentes:

• Reagente para pré-tratamento de amostras, LYSIS BUFFER 10X, 40 mL da solução devem ser reconstituídos em 360 mL de água bidestilada esterilizada. • Reagente para pré-tratamento de amostras, CELL BUFFER 10X, 40 mL da

solução devem ser reconstituídos em 360mL de água bidestilada esterilizada. • Microtubos de extração, 50 microtubos vazios de 0,5 mL para uso em Biologia

molecular.

• Reagente de extração TALC BUFFER, 3 mL da solução pronta para uso. • Reagente de extração RESINA, 3 mL de solução pronta para uso.

• Reagente de extração NEUTRL BUFFER, 3mL de solução pronta para uso. • 9 tubos contendo 1,9 mL de água ultrapura para uso em Biologia Molecular.

O kit é capaz de realizar 50 extrações, incluindo controles positivo e negativo.

Componentes Descrição Quantidade Composição

Lysis Buffer 10X

Solução de lise de eritrócitos, deve ser reconstituída em água ultrapura 40 mL Carbonato de Potássio, Cloreto de Amônio e EDTA Cell Buffer 10X

Solução Isotônica, deve ser reconstituída em água

ultrapura

40 mL Cloreto de Sódio, TRIS base e TRIS

hidrocloreto Microtubos

de extração

Microtubos de 0,5mL, vazios para uso em Biologia

Molecular

50 Talc Buffer Solução Alcalina de para

termolise 3 mL Hidróxido de Potássio

Resina Resina Quelante 3 mL Chelex 100

Neutral

Buffer Solução neutralizadora 3 mL

TRIS hidrocloreto, ácido Hidroclorídrico Água

Ultrapura

Água para Biologia

Molecular 9 X 1,9 mL • Armazenar entre 2 e 8°C.

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2 MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS

- Água bidestilada esterilizada (água de injeção ou equivalente) - Câmara de fluxo laminar

- Luvas descartáveis livres de talco ou similar - Microtubos esterilizados de 1,5 mL

- Agitador do tipo “Vórtex”

- Microcentrífuga de 12000 a 14000RPM,

- Micropipetas com dispensação positiva e ponteiras com filtro de 2 – 20 µL, 5 – 50 µL, 50 – 200 µL e 200 – 1000 µL

- Banho seco para microtubos de 0,5 mL

ACESSÓRIOS

Controles positivos para extração não estão inclusos neste kit. Para realizar esta análise os seguintes acessórios produzidos pela Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. são requeridos:

• <<CPE DNA – controle interno>> (código CTREXTG) Controle positivo de extração, contém, plasmídeos de DNA, usados na extração de amostras não celulares, capaz de realizar até 50 extrações.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES

Este kit é para uso exclusivo em diagnóstico “in vitro” Cuidados e precauções gerais

- Manusear e descartar as amostras biológicas como capazes de transmitir agentes infecciosos. Impedir o contato direto com a amostra biológica. Impedir aerossóis e respingos. O material que entrar em contato com as amostras biológicas deve ser tratado com hipoclorito de sódio 3% por pelo menos 30 minutos ou autoclavados a 121°C por uma hora e depois descartados.

- Manusear e descartar todos os reagentes usados como capazes de transmitir agentes infecciosos. Impedir o contato direto com os reagentes. Impedir aerossóis e respingos. O lixo deve ser tratado e descartado dentro dos padrões de segurança. Possíveis materiais combustíveis devem ser incinerados. Lixos contendo líquidos ácidos ou alcalinos devem ser neutralizados e depois descartados.

- Usar roupas protetoras, luvas, óculos e proteção para o rosto. - Nunca pipetar soluções com a boca,

-_{Não comer, beber, fumar e aplicar cosméticos nos locais de trabalho,} -_{Lavar as mãos com cuidado depois de manusear amostras e reagentes,} -_{Descartar lixo e reagentes conforme regulamentações vigentes.}

-_{Seguir a regulamentações do kit enquanto correr o teste.} - Não usar o kit após a data de expiração,

- Somente usar os reagentes inclusos no kit ou os recomendados pelo fabricante,

-_{Não misturar reagentes de lotes diferentes,}

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3 Cuidados e precauções em Biologia Molecular

Procedimentos de biologia molecular, como extração, transcrição reversa, amplificação e detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal treinado e qualificado para evitar-se liberação de resultados errôneos, especialmente devido à degradação de ácidos nucleicos contido nas amostras ou devido à contaminação das amostras por outros produtos de amplificação.

São necessárias áreas separadas para extração / preparação de reações de amplificação e amplificação / detecção de amplificação. Nunca colocar produtos de amplificação na área de extração /preparação de reações de amplificação.

É necessário dispor de jalecos, luvas e ferramentas exclusivas para a área de extração / preparação de reações de amplificação / detecção de produtos de amplificação. Nunca transferir jalecos, luvas e ferramentas da área designada para amplificação / detecção de produtos de amplificação para as áreas designadas para extração / preparação de reações de amplificação.

As amostras devem ser usadas para exclusivamente este tipo de análise. Amostras devem ser manuseadas dentro da câmara de fluxo laminar. Os tubos contendo as amostras nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. Pipetas usadas para manusear amostras devem ser exclusivas para este propósito. É necessário o uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As ponteiras devem ser esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA.

Reagentes devem ser manuseados dentro da câmara de fluxo laminar. Os reagentes requeridos para amplificação devem ser preparados na sua área e devem ser usados em uma única sessão. As pipetas usadas para manusear os reagentes devem ser usadas com este único propósito. É necessário o uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As ponteiras devem ser esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA.

Os produtos de amplificação devem ser manuseados em sua área para reduzir-se ao máximo a dispersão dos mesmos pelos ambientes, na intenção de reduzir a s contaminações. Pipetas usadas para manusear os produtos de amplificação devem ser usadas para este único propósito.

Cuidados e precauções específicas dos componentes

LYSIS BUFFER 10X, não apresenta frases de risco (R) e requer os seguintes cuidados de segurança (S):

• S23-25. Não emite gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos.

CELL BUFFER 10X, não apresenta frases de risco (R) e requer os seguintes cuidados de segurança (S):

• S23-25. Não emana gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos.

TALC BUFFER, requer os seguintes riscos (R) e cuidados de segurança (S): • Xi – Irritante

• Contém Hidróxido de Potássio • R36/38. Irritante para olhos e pele.

• S26/27. Em eventual contato com os olhos, lavar imediatamente com água em abundância e procurar serviço médico. Usar luvas especiais.

NEUTRAL BUFFER não apresenta frase de risco (R) e deve-se tomar os seguinte cuidados de segurança (S):

• S23 – 25. Não inalar gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos.

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4 AMOSTRAS E CONTROLES

Amostras

As seguintes amostras celulares podem ser usadas com este kit: -Sangue total (periférico e medula óssea)

-Leucócitos -Monócitos -Granulócitos,

-Amostras de secreção endocervical, -Swabs uretrais, -Lavado broncoalveolar, -Escarro -Saliva -Gargarejo -Swabs faríngeos -Swabs nasais -Fluido amniótico -Fluído cérebro-espinhal (LCR)

As amostras devem ser provenientes de células eucarióticas e procarióticas, devem ser coletadas e concentradas por centrifugação.

Usuários de testes de amplificação quantitativa como “Duplex real time amplification” e “Monoreagent Duplex real Time Amplification”, são orientados para observar constantemente o número de células presente na amostra fracionada e que será processada nos microtubos de extração, para permitir o calculo quantitativo dos alvos analisados.

Os tubos contendo as amostras transferidas para extração devem ser claramente marcados usando-se uma caneta marcadora permanente.

Para uma ótima conservação das amostras, é necessário observar os procedimentos de extração descritos, para obter o pellet celular nos microtubos de extração. As amostras devem se congeladas em uma temperatura de -20°C por no máximo 30 dias ou a -70°C por períodos mais longos.

Quando usar amostras congeladas, descongelar imediatamente antes da extração para prevenir uma possível degradação dos ácidos nucleicos.

Substâncias interferentes

Heparina, mucoproteína ou hemoglobina são inibidores de enzimas como a DNA polimerase (assim, como a DNA polimerase termoestável) o qual estão presentes nas amostras iniciais e devem conduzir a resultados inválidos ou incorretos em etapas subsequentes à extração de DNA.

Heparina, mucoproteínas e hemoglobina devem estar presentes no pellet celular do qual o DNA será extraído. Para evitar estes resultados, atentar para as instruções providas em “Procedimentos” nos parágrafos descrevendo o pré-tratamento de amostras e da extração de DNA.

Qualquer efeito inibitório causado por drogas devem estar contidas nas amostras iniciais, e devem ser avaliados uma a uma, de acordo com as intenções de uso do produto. Controles de qualidade

É recomendado que para avaliar cada sessão total de extração, sejam corridos controles negativos e positivos durante a extração.

Para o controle negativo, usar uma amostra negativa que já tenha sido testada para o alvo ou então simular uma extração sem amostra.

Para controle Positivo, usar uma amostra que já tenha sido testada para o alvo ou uma amostra de referência.

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5 PROCEDIMENTOS

Reconstituição do “LYSIS BUFFER 10X”:

(deve ser realizado na área de extração / preparação da reação de amplificação) Antes de iniciar a sessão de extração, reconstituir o LYSIS BUFFER 1X como a seguir. Diluir o Lysis Buffer 10X (40 mL) em uma embalagem contendo 360 mL de água bidestilada para obter o Lysis Buffer 1x. O Lysis Buffer 1X pode ser estocado a 2°C a 8°C por no máximo 6 meses.

Reconstituição de CELL BUFFER 1X:

(deve ser realizado na área de extração / preparação da reação de amplificação) Antes de iniciar a sessão de extração, reconstituir o CELL BUFFER 1X como a seguir. Diluir o Cell Buffer 10X (40 mL) em uma embalagem contendo 360 mL de água bidestilada para obter o Cell Buffer 1x. O Lysis Buffer 1X pode ser estocado a 2°C-8°C por no máximo 6 meses.

Coleta, Transporte, estocagem e processamento das amostras

(deve ser realizado na área de extração / preparação da reação de amplificação) NOTA: Amostras biológicas podem transmitir agentes infecciosos

Preparação de amostras de sangue total (periférico e medula óssea)

(deve ser realizado na área de extração / preparação da reação de amplificação) O sangue total (periférico ou medula óssea) que são usados para extração de DNA devem ser coletados em EDTA de acordo com os procedimentos do laboratório, transportados a 2°C a 8°C e estocados na mesma temperatura por no máximo 3 dias. NOTA: Somente no caso de ser usado para detecção de mutações ou polimorfismos no DNA genômico humano, o sangue periférico total que for usado para extração de DNA pode ser congelado a -20°C por n o máximo 30 dias.

Deve ser coletado em EDTA de acordo com os procedimentos do laboratório, transportados a 2°C-8°C e estocados na mesma temperatura por no máximo 3 dias; de outra maneira será tempo demasiado.

a. Em um tubo de 1,5 mL (não incluso no kit) transferir 100 µL de sangue total contendo aproximadamente 500000 leucócitos.

NOTA: Amostra de sangue periférico normal contém em média 5000 leucócitos por µL. Naqueles casos em que a amostra de sangue apresentar uma contagem inferior a 4000 leucócitos / µL ou mais de 6000 leucócitos / µL o volume da amostra a ser extraída e de Lysis buffer devem ser recalculados, baseados na contagem celular.

b. Adicionar 500 µL de Lysis Buffer 1X, misturar por inversão e incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.

c. Centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a 12000 a 14000 RPM. d. Remover o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não

remover o pellet depositado, que é visível no fundo do microtubo teste. e. Transferir 500 µL de Lysis Buffer para o microtubo teste e vórtex por 15

segundos.

f. Centrifugar em temperatura ambiente por 1 minuto a 12000-14000 RPM. g. Remover o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não

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6 h. Diluir o pellet presente no fundo do microtubo em 500 µL de CELL BUFFER 1X. i. Proceder como no parágrafo intitulado “Extração de Suspensões celulares”. Preparação de leucócitos, monócitos e granulócitos:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) Para usuários de produtos como “Nested Amplification”, “Ibridoquant Amplification” e “Duplex Real Time Amplification” produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. (Detecção de DNA de vírus, bactérias, fungos, protozoários)

As suspensões de leucócitos periféricos, monócitos ou granulócitos que são usados para extração de DNA devem ser preparados de acordo com os procedimentos do laboratório, diluir em solução fisiológica esterilizada ou PBS, mensurada e estocada de 2°C a 8°C por no máximo 4 horas.

a. Em um microtubo de 1,5 mL (não incluso no kit) transferir a amostra de leucócitos, monócitos ou granulócitos que contém 500000 células.

b. Centrifugar em temperatura ambiente por 30 segundos a 12000 a 14000 RPM. c. Eliminar o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não

remover o pellet depositado no microtubo. d. Diluir o pellet celular em 500 µL de Cell Buffer 1X

e. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “Extração de suspensões celulares”.

Preparação de Swabs Uretrais e endocervicais:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) Para usuários de produtos como “Single Round Amplification”, “Nested Amplification” and “Duplex Real Time Amplification” da empresa Nanogen Advanced (Detecção de DNA de vírus, bactérias, fungos, protozoários).

Suspensões celulares de swabs endocervicais e uretrais que serão usadas para extração de DNA, devem ser preparadas conforme descrito nos procedimentos do laboratório, diluir em meio de transporte para cultura celular, PBS esterilizado ou solução fisiológica esterilizada, transportar de 2°C a 8°C e estocar na mesma temperatura por no máximo 3 dias.

a. Em um microtubo de 1,5 mL transferir 1 mL da suspensão celular, proveniente de swabs uretrais ou endocervicais.

b. Centrifugar por 1 minuto a 12000 a 14000 RPM.

c. Eliminar o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não remover o pellet formado no fundo do tubo.

NOTA: As figuras abaixo apresentam uma escala 1:1, ilustrando o tamanho do pellet depositado, na presença de 1000000 , 500000 ou 250000 células no pellet.

d. Diluir o pellet da seguinte forma:

i. Se o pellet contiver 1000000 células, adicionar 1mL de Cell Buffer 1X

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7 ii. Se o pellet contiver 500000 células, adicionar 500uL de Cell Buffer

1X

iii. Se o pellet contiver 250000 células, adicionar 250uL de Cell Buffer 1X

e. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “extração de suspensões celulares” na página 9/15.

Preparação de amostra de escarro ou lavado broncoalveolar

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) Para usuários de produtos como “Nested Amplification” e “Duplex real Time Amplification” produzidos pela Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. (detecção do DNA de vírus, bactérias, fungos e protozoários)

O lavado broncoalveolar ou o escarro que serão usados para extração de DNA devem ser coletados seguindo os procedimentos do laboratório, este deve ser em solução fisiológica esterilizada, transportada de 2°C a 8°C, estocadas na mesma temperatura e por no máximo 3 dias.

a. Em um tubo de 15 mL (não incluso no kit) transferir 5mL do lavado broncoalveolar ou do escarro,

b. Transferir 50 µL de DTT (ditiotreitol) para cada mL de amostra (1/20) ou 1mL de N acetil cisteína para cada mL de amostra (1:1), dentro do tubo cônico de 15 mL.

c. Vórtex por 15 segundos e incubar por 10 minutos em temperatura de 2°C a 8°C.

d. Vórtex por 15 segundos e centrifugar por 15 minutos a 2500 a 3000 RPM. e. Eliminar o máximo possível do sobrenadante, incluindo depósitos de muco,

tomando cuidado para não mover o pellet

f. Transferir 5ml de Cell buffer 1X para o tubo de 15 mL e misturar por inversão. g. Vórtex por 15 segundos e centrifugar por mais 15 minutos a 2500 a 3000 RPM. h. Eliminar o máximo do sobrenadante, incluindo depósitos de muco, tomar

cuidado para não mover o pellet formado no fundo do tubo cônico.

NOTA: As figuras abaixo apresentam uma escala 1:1, ilustrando o tamanho do pellet depositado, na presença de 1000000 , 500000 ou 250000 células no pellet.

i. Diluir os pellets formando segundo as informações a seguir:

a. Se o pellet possuir aproximadamente 2000000 de células, deve-se usar 2 mL de Cell buffer 1X

b. Se o pellet possuir aproximadamente 1000000 de células, deve-se usar 1 mL de Cell Buffer 1X

c. Se o pellet possuir aproximadamente 500000 células, deve-se usar 500 µL de Cell buffer 1X.

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8 j. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “extração de suspensões

celulares”.

Preparação de amostra de saliva e gargarejo:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) Para usuários de produtos como “Nested Amplification” e “Duplex real Time Amplification” produzidos pela Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.(detecção do DNA de vírus, bactérias, fungos e protozoários).

As amostras de saliva e gargarejo que serão usadas na extração de DNA devem ser coletadas conforme os procedimentos do laboratório, devem ser transportadas a 2°C a 8°C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 3 dias.

a. Em um microtubo de 1,5 mL transferir 1 mL da amostra de saliva ou gargarejo,

b. Centrifugar em temperatura ambiente por 1 minuto a 12000-14000 RPM. c. Eliminar o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não

mover o pellet formado no fundo do microtubo.

d. Transferir 1 mL de cell Buffer 1X para o microtubo e misturar por inversão. e. Vórtex por 15 segundos e centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a

12000-14000 RPM.

f. Eliminar o máximo possível do sobrenadante, tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo.

g. Diluir o pellet depositado no fundo do microtubo em 500 µL de Cell Buffer 1X. h. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “extração de suspensões

celulares”.

Preparação de amostras de swabs nasais e faríngeos:

Suspensões celulares provenientes de swabs nasais e faríngeos que serão usados para extração de DNA devem ser preparadas seguindo os procedimentos determinados pelo laboratório, diluindo o swab em meio de cultivo celular, solução fisiológica esterilizada ou PBS, transportando a amostra de 2°C a 8°C e estocando na mesma temperatura por no máximo 3 dias.

a. Em um microtubo de 1,5 mL (não incluso no kit) transferir 1 mL da suspensão celular proveniente de swabs nasais ou faríngeos,

b. Centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a 12000-14000 RPM.

c. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade, tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo. d. Diluir o pellet formado em 500 µL de Cell Buffer 1X.

e. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado (extração de suspensões com baixa contagem celular).

Preparação de amostras de fluído amniótico:

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9 As amostras de liquido amniótico devem ser coletadas de acordo com as normativas estabelecidas pelos pelo laboratório, evitando a contaminação da amostra com o sangue da mãe, transportando a amostra a 2°C-8°C e a estocando na mesma temperatura por no máximo 3 dias.

a. Em um tubo de 15 mL (não incluso no kit) transferir 10mL da amostra de liquido Amniótico.

b. Centrifugar por 15 minutos a 2500-3000 RPM.

c. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade, tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo. d. Diluir o pellet em 500 µL de Cell Buffer 1X,

e. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “extração de suspensões com baixa contagem celular”.

Preparação de amostras de urina:

Amostras de urina que serão usadas para extração de DNA devem ser coletadas em frascos livres de conservantes seguindo os padrões do laboratório, transportando a amostra em temperatura ambiente (18°C a 25°C) e estocando-a na mesma temperatura por no máximo 4 horas.

Nota: Transportar e estocar a amostra em temperaturas de 2°C a 8°C podem causar a formação de precipitados que podem ocasionar problemas nos estágios subsequentes do teste.

a. Em um tubo cônico de 15 mL (não incluso no kit) transferir 10 mL de urina, b. Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos a 2500-3000 RPM.

c. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade, tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo, d. Diluir o pellet em 500 µL de Cell Buffer.

e. Proceder conforme descrito no parágrafo intitulado “extração de suspensões com baixa contagem celular”.

Preparação de amostras de Liquido cefalorraquidiano:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) Para usuários de produtos como “Nested Amplification” e “Duplex real Time Amplification” produzidos pela Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. (detecção do DNA de vírus, bactérias, fungos e protozoários).

As amostras de liquido cefalorraquidiano que serão usadas para extração de DNA devem ser coletas de acordo com as normativas estabelecidas pelo laboratório evitando a contaminação da amostra com o sangue do paciente, transportando a amostra a 2°C a 8°C e estocando-a na mesma temperatura por no máximo 4 horas.

Liquido cefalorraquidiano não requer pré-tratamento e deve ser usado diretamente para extração seguindo as descrições do parágrafo intitulado “extração de amostras com baixa contagem celular”.

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10 Procedimento de extração:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação)

Antes de iniciar a extração é importante:

-_{Observar a programação do termociclador com bloco para tubos de 0,5 mL ou} o banho seco com bloco com poços cônicos para microtubos de 0,5 mL e programa-lo para 95°C, esperar que o mesmo alcance a temperatura programada.

- Separar 1 tubo de extração para cada amostra que será analisada e marca-la com a identificação da amostra com caneta de marcação permanente.

- Certifique-se que a resina esteja separada devidamente: metade do frasco com resina e metade com água. Se o volume de água é menor ou se a resina estivar seca, adicione água bidestilada esterilizada (não inclusa no kit) até que as condições ideais se restaurem. Para prevenir que a resina seque após o primeiro uso, é recomendado vedar o frasco com filme plástico (não incluso no kit).

Extração de amostras celulares:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) 1. Transferir 500 µL da suspensão celular para o tubo de extração de 0,5 mL. 2. Centrifugar a temperatura ambiente for 1 minuto a 12000-14000 RPM.

3. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade, tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo, Nota: Se o deposito celular apresenta-se escuro (marrom), é devido a uma intensa contaminação com eritrócitos, seguir conforme descrito:

a. Transferir 100 µL de Lysis Buffer para o microtubo de extração, b. Diluir o pellet celular nos volume adicionado,

c. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos,

d. Adicionar 300 µL de Cell Buffer 1X e homogeneizar gentilmente,

e. Centrifugar em temperatura ambiente por 1 minuto a 12000-14000 RPM. f. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade,

tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo, g. Reiniciar a extração a partir no ponto 4.

4. Transferir 35 µL e TALC BUFFER para o microtubo de extração (Nota: o TALC BUFFER é considerado como irritante).

5. Agitar o pellet e o TALC BUFFER vigorosamente. Nota: Evitar o respingo na tampa do microtubo

6. Colocar o microtubo no termo bloco (nota: o termo bloco está quente) e incubar por 5 minutos.

7. Agite a resina vigorosamente e transfira 35 µL da resina diluída para o microtubo.

8. Misturar o lisado e a resina vigorosamente dentro do microtubo. Nota: Evitar o respingo na tampa do microtubo.

9. Colocar o microtubo no termo bloco (nota: atenta, pois, o termo bloco esta quente) e incubar a reação por 10 minutos.

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11 10. Adicionar 35 µL de Neutral Buffer e agitar a reação vigorosamente,

11. Centrifugar em temperatura ambiente por 5 minutos a 12000-14000 RPM. 12. Escolher o procedimento apropriado seguindo a Tabela abaixo

NOTA: O produto da extração esta presente na fase aquosa. Certifique-se que somente a fase aquosa esta na ponteira quando o produto da extração esta sendo removido do microtubo durante a preparação da reação de amplificação. Não pegue material do botão de resina de dentro do microtubo com a ponteira, isto pode causar problemas de inibição na reatividade da DNA polimerase (TAQ Polimerase).

NOTA: O produto de extração pode ser estocado de -20°C a -70°C por um período máximo de 30 dias. Quando o microtubo descongelar homogeneíze vigorosamente e centrifugue em temperatura ambiente por 5 minutos a 12000 a 14000 rpm para separar a fase aquosa da resina.

NOTA: Ácidos nucleicos extraídos podem contaminar outros testes. Adequadamente feche os depósitos de ácidos nucleicos residuais e o lixo produzido durante o manuseio.

Extração de suspensões com baixa contagem celular:

(Deve ser realizada na área de extração / preparação de reações de amplificação) 1. Transferir 500 µL da suspensão celular para o microtubo de 0,5 mL.

2. Centrifugar em temperatura ambiente por 10 minutos a 12000-14000 RPM. 3. Eliminar o máximo do sobrenadante, retirando qualquer mucosidade,

tomando cuidado para não mover o pellet formado no fundo do microtubo. Nota: O pellet normalmente é muito pequeno e muitas vezes não visível e olho nu.

4. Transferir 15 µL de TALC BUFFER para o microtubo (nota: não esquecer que o TALC BUFFER é considerado irritante).

5. Homogeneíze o pellet junto ao TALC BUFFER vigorosamente dentro do microtubo.

Nota: Evitar os respingos na tampa.

6. Colocar o microtubo no bloco térmico (nota: não esqueça que o bloco térmico está quente) e incubar por 5 minutos a 95°C.

7. Misturar a resina vigorosamente e adicione 15 µL da resina diluída ao microtubo contendo a reação.

8. Misturar o lisado e a resina dentro do microtubo. Nota: evite os respingos na tampa.

9. Colocar o microtubo no termo bloco (nota: não esqueça que o termo bloco está quente) e incubar por 10 minutos a 95°C.

10. Transferir 15 µL de Neutral Buffer para o microtubo.

11. Adicionar 10 µL de <<CPE DNA ®>> controle interno e agite a reação vigorosamente.

NOTA: O <<CPE DNA ®>> Controle interno é usado para validar internamente o teste em caso de extração de DNA de amostras com baixa contagem celular.

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12 13. Escolher o procedimento apropriado seguindo a tabela abaixo:

NOTA: O produto da extração esta presente na fase aquosa. Certifique-se que somente a fase aquosa esta na ponteira quando o produto da extração esta sendo removido do microtubo durante a preparação da reação de amplificação. Não pegue material do botão de resina de dentro do microtubo com a ponteira, isto pode causar problemas de inibição na reatividade da DNA polimerase (TAQ Polimerase).

NOTA: O produto de extração pode ser estocado de -20°C a -70°C por um período máximo de 30 dias. Quando o microtubo descongelar homogeneíze vigorosamente e centrifugue em temperatura ambiente por 5 minutos a 12000-14000 RPM para separar a fase aquosa da resina.

NOTA: Ácidos nucleicos extraídos podem contaminar outros testes. Adequadamente feche os depósitos de ácidos nucleicos residuais e o lixo produzido durante o manuseio.

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

Usar somente as seguintes amostras biológica humanas com este produto: sangue total (periférico ou medula óssea), leucócitos periféricos, monócitos, granulócitos, amostras cervicais, swabs uretrais, faríngeos, nasais, Lavado broncoalveolar, escarro, saliva, gargarejo, fluido amniótico, urina e liquido cefalorraquidiano.

Heparina, mucoproteína ou hemoglobina não devem estar presentes no pellet do qual o DNA será extraído. Para evitar estes resultados, siga as instruções.

Não realizar a extração com este produto em caso de presença de heparina no pellet: A heparina inibe a enzima DNA polimerase (TAQ Polimerase por exemplo) comprometendo e distorcendo os resultados das etapas subsequentes da analise do DNA extraído.

Não realizar a extração de DNA com este produto em caso de presença de mucoproteínas ou hemoglobina no pellet: As mucoproteínas e a hemoglobina inibem a enzima DNA polimerase (TAQ Polimerase, como por exemplo) comprometendo e distorcendo os resultados das etapas subsequentes da analise do DNA extraído.

Qualquer fenômeno de inibição por drogas que pode estar contido na amostra inicial deve ser avaliado de acordo com o uso pretendido do kit de extração.

Os resultados obtidos com este produto estão sujeitos a uma correta coleta, transporte, estocagem e preparação das amostras. Para evitar resultados errados é necessário tomar cuidados especiais durante estas fases e seguir as instruções cuidadosamente.

Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado no processamento de amostras com potencial infeccioso e preparações químicas classificadas como perigosas para evitar acidentes com consequências potencialmente sérias ao usuário a outras pessoas.

Este produto requer o uso de roupas especificas de trabalho e premissas de que avaliarão os processos com amostras potencialmente - infecciosas e preparações químicas classificadas como perigosas para evitar acidentes com consequências potencialmente sérias ao usuário a outras pessoas.

Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado em Biologia Molecular, como a extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos para impedir resultados errados em subsequentes estágios da análise conduzidos na extração de DNA das amostras com potencial consequências ao paciente.

Este produto deve ser manuseado em áreas separadas para extração / preparação das reações de amplificação e amplificação / detecção dos produtos de amplificação

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13 para evitar resultados falso positivos, em passos subsequentes da análise conduzida no DNA extraído evitando-se com sérias consequências ao paciente.

Este produto requer roupas e instrumentos específicos para áreas de extração / preparação de reações de amplificação e amplificação / detecção de produtos de amplificação com intenção de evitar resultados falso positivos nos passos subsequentes da análise deste DNA extraído, evitando-se sérias consequências ao paciente.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Eficiência de extração:

Este sistema de extração permite o uso de 500000 células da amostra analisada e libera 100% do DNA inicial da amostra celular.

A eficiência do método de extração por lise alcalina em alta temperatura, libera o DNA da amostra, como o verificado na literatura (observar o parágrafo “referências”) e foi verificado durante as validações da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A., usando amostras clínicas positivas para Aspergillus spp, Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumonie, CMV, EBV, HHV6, HHV8.

Por enquanto, apresenta-se os dados referentes à Chlamydia trachomatis. O teste foi realizado usando-se um material de referência de um painel de diluições de Chlamydia trachomatis (QCMD 2008 Chamydia trachomatis Proficiency panel, QCMD, Scitland, UK) cada amostra do painel foi usada em duplicata , a análise total incluindo extração e amplificação, foram realizadas com kits da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. A validação do alvo foi avaliada pela determinação do “cycle threshold” (cT) o qual depende de um número de cópias dos “crypt plasmid" presentes na reação provenientes da bactéria Chlamydia trachomatis.

Os resultados estão relatados na tabela a seguir: Testes com material de referência AMOSTRA PATÕGENO RESULTADO

ESPERADO

REPLICATAS /

POSITIVAS cT MÉDIO CTB08-01 C. trachomatis,

urina Positivo forte 2/2 34,08

CTB08-02 C. trachomatis,

urina Positivo forte 2/2 30,17

CTB08-03 C. trachomatis,

urina Positivo fraco 2/2 38,41

CTB08-04 Urina negativa Negativo 0/2 Indeterminado CTB 08-05 C.trachomatis e N. gonorreae, urina Positivo fraco 2/2 37,06 CTB08-06 C. trachomatis, urina Positivo 2/2 33,95 CTB08-07 C. trachomatis (isolado sueco) urina Positivo fraco 2/2 19,23 CTB08-08 C. trachomatis, swab Positivo 2/2 39,35 CTB08-09 C. trachomatis,

swab Positivo forte 2/2 32,35

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14 Todas as amostras foram corretamente detectadas, a amostra CTV08-07 um isolado de origem Sueca de Chlamydia trachomatis é um positivo forte, o qual foi facilmente detectado pelo produto da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.

Os resultados de reprodutibilidade do sistema de extração, como comparação das cópias da mesma sessão, foram verificados usando amostras de sangue periférico coletado em EDTA.

O teste foi realizado usando-se como amostra um material de referência de sangue periférico coletado em EDTA contendo em torno de 5000 leucócitos / µL. A amostra foi usada em 10 alíquotas, cada contendo aproximadamente 2000 leucócitos, então o procedimento de extração foi realizado em condições de estresse pelo excesso de células. Cada produto de extração foi analisado em 3 cópias utilizando-se o método de amplificação Real Time (Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.) A viabilidade do DNA genômico foi avaliado pela determinação do “cycle Threshold” (cT) que depende do número de cópias do gene da Beta globina humana presente na reação.

Os resultados estão expressos na tabela abaixo:

Alíquota Cópia cT médio Desvio padrão CV %

1 3 23,53 0,18 0,76 2 3 23,14 0,13 0,56 3 3 23,03 0,10 0,42 4 3 23,10 0,07 0,28 5 3 23,22 0,06 0,25 6 3 23,14 0,04 0,15 7 3 23,58 0,09 0,38 8 3 23,36 0,13 0,54 9 3 23,42 0,19 0,79 10 3 23,60 0,14 0,59

Os valores calculados nas 30 análises foram as seguintes: AMOSTRA

REPETIÇÕES cT MÉDIO DESVIO PADRÃO CV%

2 X 106 30 23,31 0,23 0,99

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ROLFS, A et al. (1992) PCR : Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin. Chapter7, pp74 – 77 and 79 – 80.

(15)

15 SOLUÇÃO DE PROBLEMAS

Falso negativo

CAUSAS POSSÍVEIS SOLUÇÕES

Degradação do ácido nucleico contido na

amostra.

Usar uma nova amostra, estocar devidamente a amostra.

Perda do pellet celular. Após a centrifugação, tomar cuidado quando drenar o sobrenadante e não remover pellet

Pellet celular fortemente contaminado

com eritrócitos.

Realizar um novo tratamento com tampão de lise celular.

Extração não eficiente.

Certificar-se que a amostra não respingou para a tampa do microtubo teste durante a extração, certificar-se que

o termo bloco esta na temperatura de 95°C, completar o tempo de incubação em 95°C, certificar-se que os

poços são os corretos para o tipo de microtubo. Incorreta dispensação

dos reagentes de extração.

Tomar cuidado quando dispensar os volumes, que sejam de forma igual para TALC BUFFER, RESINA e NEEUTAL

BUFFER. Resina transferida para a

reação de amplificação.

Com cuidado remover somente a fase aquosa do microtubo de extração.

Degradação dos ácidos

nucleicos extraídos. Usar plásticos livres de DNAses. Falso Positivo:

CAUSAS POSSÍVEIS SOLUÇÕES

Contaminação da amostras durante a

extração.

Abrir um tubo de cada vez, evitar o derramamento dos conteúdos dos microtubos, sempre mudar a ponteira entre as amostras, certificar-se de que a amostra não

tocou na tampa do microtubo de extração. Contaminação na área

de extração / preparação de reações

de amplificação.

Limpar as superfícies e instrumentos usando detergentes aquosos, lavar os jalecos, trocar os tubos e ponteiras

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16 IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR

Biometrix Diagnóstica Ltda.

Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360 Tel.: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800-7260504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br Website: www.biometrix.com.br CNPJ: 06.145.976/0001-39 INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.

C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO) - Itália

REGISTRO ANVISA 80298490117

RESPONSÁVEL TÉCNICA

Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: 09302336 Aprovação: 20/12/2013

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Maurício Cichon Laboratório