Adenovirus IgG ELISA
Imunoensaios enzimáticos (tiras de microtitulação) para a determinação
qualitativa e quantitativa dos anticorpos IgG contra o Adenovírus em
soro e plasma humanos.
RE56571
12x8
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1.
APLICAÇÕES
Imunoensaios enzimáticos (tiras de microtitulação) para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos IgG contra o Adenovírus em soro e plasma humanos.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
O adenovírus é um patogénio omnipresente nos seres humanos e animais. Podem ser diferenciados muitos sorotipos diferentes. Os adenovírus são endémicos em todas as populações ao longo do ano. A infecção espalha-se quer por infecção por via aérea por contacto. Os adenovírus infestam principalmente a mucosa respiratória e intestinal, mas também a córnea. Acumulam-se nas células epiteliais e os nódulos linfáticos regionais. O adenovírus provoca a mais alargada variedade de doenças virais respiratórias conhecidas: Doenças do trato respiratório, pneumonia, febre faringeoconjuntival associada a piscinas e epidemias de kerato-conjuntivite. A forma intestinal da infecção adenoviral ocorre principalmente em crianças menores de um ano. É caracterizada pela prevalência de sintomas de gastroenterite aguda e geralmente é causada pelos tipos 40 e 41. A infecção aguda por adenovírus pode ser detectada por isolamento viral e / ou sorologia. Os testes sorológicos são particularmente importantes porque documentam a infecção real do paciente e podem ser aplicados em grande escala nas investigações epidemiológicas. Os testes ELISA medem predominantemente os anticorpos dirigidos contra os determinantes específicos de grupo sobre a componente hexon. Os testes recomendados para detecção de anticorpos específicos são a inibição de hemaglutinina e de soroneutralização. Dada a omnipresença do adenovírus e numerosas reacções cruzadas entre os sorotipos relacionados, a soroconversão envolvendo um aumento de quatro vezes ou mais nos casos de infecção do anticorpo é necessária para documentar a infecção. A IgG é a categoria predominante de anticorpos medidos nos testes sorológicos.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente utilizando uma curva de calibração.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
10. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos
ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN3 pode reagir com o chumbo e o cobre da
canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos.
11. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.
Os reagentes não abertos permanecem estáveis até a data de validade indicada. O kit é estável até 3 meses após a primeira abertura, quando a Placa de Microtitulação é embalada num saco bem fechado, as garrafas são fechadas as respectivas com tampas e o kit é armazenado a 2-8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro, Plasma (EDTA, Heparina)
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento: 2-8 °C -20 °C Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Estabilidade: 7 dias > 7 dias
7.
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos. 1 x 15 mL
ENZCONJ IgG
Conjugado Enzimático IgG
Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgG, conjugado com peroxidase (coelho), tampão contendo proteína, 0.01 % Metilisotiazolinona, 0.01 % Bromonitrodioxane e 5 mg/L ProClin.
1 x 4 x 2 mL CAL A-D Padrão A-D 1; 10; 35; 150 U/mL. Pronto a usar.
Padrão A = Controlo Negativo Padrão B = Controlo „Cut-off“ Padrão C = Controlo positivo fraco. Padrão D = Controlo Positivo
Contêm: Soro com IgG anticorpos contra Adenovirus, PBS, 0.01 % Metilisotiazolinona e 0.01 % Bromonitrodioxane.
1 x 60 mL DILBUF Tampão de Diluição
Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN3.
1 x 60 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Contêm: PBS Tampão, Tween 20.
1 x 15 mL TMB SUBS Solução de Substrato TMB
Pronto a usar. Contêm: TMB. 1 x 15 mL TMB STOP Solução de Paragem TMB
Pronto a usar. 0.5 M H2SO4.
2 x FOIL Película Aderente
Para tapar a Microplaca durante a incubação.
1 x BAG Saco Plástico
Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas.
8.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µL 2. Proveta
3. Tubos (1 mL) para diluição de amostras
4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm
9.
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços.
6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. Preparação de Componentes
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
Diluir /
dissolver Componente Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade
20 mL WASHBUF
CONC 180 mL
agua
bidest. 1:10
Aquecer até 37°C para dissolver cristais. Misturar energicamente.
2-8 °C 8 semanas
10.2. Diluição de Amostras
Amostra diluir com Relação Observações
Soro / Plasma geralmente DILBUF 1:101 p.ex. 5 µL + 500 µL DILBUF
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas.
11.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
1. Pipetar 100 µL de cada Padrão e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. No
teste qualitativo apenas é utilizado o Padrão B.
2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a 18-25 °C.
3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 μL de Solução de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
4. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.
5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a 18-25 °C.
6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
8. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço. 9. Incubar 20 min a 18-25 °C no escuro (sem película aderente).
10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço.
Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo.
11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
A avaliação do teste pode ser feita quer quantitativamente quer qualitativamente.
13.1. Avaliação Qualitativa
O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a partir das densidades ópticas médias da amostra e do Valor do Cut-off. Se a densidade óptica da amostra estiver num intervalo de 20% á volta do Valor de Cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas.
O Índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da
seguinte forma: COI =
DO Amostra DO Padrão B
13.2. Avaliação Quantitativa
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Ao utilizar um programa de computador, são recomendados os métodos "Cubic-Spline" ou "Ponto a Ponto", uma vez que fornecem a máxima precisão na avaliação dos dados de medição comparando com outros modelos de avaliação.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão U/mL DO Média
A 1 0.071
B 10 0.506 C 35 0.833 D 150 1.640
14.
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Método Intervalo Interpretação Os resultados por si só não devem ser
a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. Quantitativa (Curva Padrão) < 8 U/mL negativo 8 – 12 U/mL indeterminado > 12 U/mL positivo Qualitativa (Índice de Cut-off, COI) < 0.8 negativo 0.8 – 1.2 indeterminado > 1.2 positivo
15.
VALORES ESPERADOS
Num estudo interno, indivíduos aparentemente saudáveis evidenciaram os seguintes resultados:
Ig Isotípico n Interpretação
positivo indeterminado negativo
IgG 56 94.6 % 1.8 % 5.4 %
16.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos. Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito
significativo (+/- 20% do esperado nos resultados do teste até às concentrações descritas em baixo:
Hemoglobina 8.0 mg/mL Bilirrubina 0.3 mg/mL Triglicéridos 5.0 mg/mL
17.
DESEMPENHO
Intra-Ensaio Precisão 7.8 %
Inter-Ensaio Precisão 12.3 %
Inter-lotes Precisão 10.3 – 14.9 % Sensibilidade Analítica 1.00 U/mL
Recuperação 90 – 121 %
Linearidade 81 – 117 %
Reactividade Cruzada Não foram detectadas reactividade cruzadas com: Influenza A e RSV.
Especificidade clínica 100 %
Sensibilidade clínica 100 %
18.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
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Symbols Version 4.5 / 2015-12-07
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
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