Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761
Influência do meio de cultura nas características morfológicas das colônias
de algumas bactérias capazes de degradarem a lactose e o glúten
Influence of the culture medium on the morphological characteristics of
the colonies of some bacteria capable of degrading lactose and
Gluten
DOI:10.34117/bjdv6n6-294
Recebimento dos originais:08/05/2020 Aceitação para publicação:12/06/2020
Cassiane Minelli-Oliveira
Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Paulista
Endereço: Av. Mário Ypiranga, 4390 – Parque 10 de Novembro - Manaus/AM E-mail: cassyminelli@gmail.com
Nathasha Fernandes de Oliveira
Mestranda em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Universidade Federal do Amazonas
Endereço: Av. Rodrigo Otávio, 6200 – Coroado - Manaus/AM E-mail: nathhfer@gmail.com
Mirna Sayuri Farias Miyamoto
Mestre em Biotecnologia pela Universidade Federal do Amazonas Instituição: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Endereço: Av. André Araújo, 2936 – Petrópolis - Manaus/AM
E-mail: mirna.miyamoto@inpa.gov.br
Luiz Antonio de Oliveira
Doutor em Solos pela University of Minnesota, USA Instituição: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Endereço: Av. André Araújo, 2936 – Petrópolis - Manaus/AM
E-mail: luiz.oliveira@inpa.gov.br
RESUMO
Os microrganismos têm um metabolismo bastante diversificado e podem reagir de forma diferente quando colocados em condições diferentes de meios de cultura, temperatura, pH e pressão de oxigênio. Conhecer essas variações pode ser importante para entender como usam os nutrientes dos meios de cultura, principalmente quando se altera a fonte de carbono, de proteínas para carboidratos, e vice e versa. Esse trabalho teve como objetivo, avaliar o crescimento e as modificações das colônias de 20 bactérias capazes de degradar a lactose (carboidratos) e o glúten (proteínas) como forma de melhor entender seus metabolismos e potenciais biotecnológicos. Além disso, foi avaliado o Índice de Degradação do Glúten (IDG) de seis dessas bactérias. A morfologia das colônias das 20 bactérias capazes de degradar a lactose e o glúten nos dois meios de cultura usados pode ser usada para diferenciar uma das
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 outras. Os diâmetros das colônias e do halo de degradação do glúten, bem como o Índice de Degradação do Glúten (IDG) também permitem diferenciar esse grupo de bactérias. Essas diferenças de características podem ser usadas para facilitar futuros estudos com essas bactérias. O meio cuja fonte de carbono é constituída de proteínas (glúten) foi o que mais favoreceu o crescimento das bactérias INPA BLG01, BLG22, BLG28, BLG52.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano; Biotecnologia; Morfologia bacteriana;
Microbiota amazônica.
ABSTRACT
Microorganisms have a very diverse metabolism and can react differently when placed under different conditions of culture media, temperature, pH and oxygen pressure. Knowing these variations can be important to understand how nutrients are used in the culture media, especially when changing the carbon source, from proteins to carbohydrates, and vice versa. This work aimed to evaluate the growth and modifications of the colonies of 20 bacteria capable of degrading lactose (carbohydrate) and gluten (proteins) to better understand their metabolisms and biotechnological potentials. In addition, the Gluten Degradation Index (GDI) of six of these bacteria was evaluated. The morphology of the colonies of the 20 bacteria capable of degrading lactose and gluten in the two culture media can be used to differentiate one from the other. The diameters of the colonies and the halo of gluten degradation, as well as the Gluten Degradation Index (GDI) also allow to differentiate this group of bacteria. These differences in characteristics can be used to facilitate future studies with these bacteria. The medium whose carbon source consists of proteins (gluten) was the one that most favored the growth of INPA BLG01, BLG22, BLG28, BLG52 bacteria.
Keywords: Microbial metabolism; Biotechnology, Bacterial morphology, Amazonian
microbiota.
1 INTRODUÇÃO
A grande diversidade microbiana faz com que os microrganismos reajam de forma diferente quando cultivados em condições diversas de meios de cultura, tais como fontes de carbono, nitrogênio, pH, temperatura, pressão de oxigênio (SALANITRO et al., 1974; PAYNE; MORTON, 1992; SON et al., 2002; CHO; GIOVANNONI, 2004; OLIVEIRA et al., 2004; LEITE, 2012).
Ao longo do tempo, essas respostas, de acordo com os meios de cultivo, serviram para separar e identificar com mais precisão, determinados microrganismos, resultando na publicação de manuais e artigos relatando meios de cultura capazes de identificar grupos de microrganismos de acordo com suas características bioquímicas e fisiológicas (ZIMBRO et al., 2009; ATLAS, 2010), facilitando o isolamento, seleção e caracterização dos que podem ser úteis ao ser humano.
Apesar da relevância da morfologia de colônias bacterianas para o seu reconhecimento, poucos estudos são realizados com esse objetivo (SOUSA et al., 2013). Conhecer e identificar
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 as mudanças das características das colônias e dos microrganismos em diferentes meios de cultura facilitam o trabalho de seleção e identificação dos que apresentam alguma importância econômica e ou ecológica, como também, nos estudos sobre biodiversidade microbiana de cunho eminentemente científico.
Esse trabalho avaliou as características das colônias de 20 bactérias em dois meios diferentes, contendo lactose ou glúten e, quais foram alteradas de acordo com o meio de cultura utilizado.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Foram usadas 20 bactérias, que em testes iniciais, mostraram mudanças de características quando colocadas para crescer em meios contendo lactose ou glúten como fontes de carbono (MINELLI-OLIVEIRA, 2017). As bactérias foram repicadas em placas de Petri contendo meio YMA (VINCENT, 1970), substituindo o manitol pela lactose ou pelo glúten.
Foi retirada uma porção da colônia bacteriana usando a ponta de palitos de dentes esterilizados, realizando-se um leve toque no meio de cultura, colocando em cada placa de Petri, cinco colônias como repetições. As placas foram incubadas a 37 ºC e avaliadas 24 e 48 horas depois quanto ao crescimento microbiano e características das colonônias. A avaliação a 37 °C teve como finalidade, verificar a habilidade dessas bactérias em crescer e produzir metabólitos capazes de degradar o glúten na temperatura corporal humana.
A caracterização visual das colônias bacterianas foi realizada segundo as metodologias de Vincent (1970), Hungria e Araújo (1994), Prescott et al. (2004) e Malajovich (2015), como forma de conhecer melhor cada uma delas quando crescidas em cada um dos dois meios de cultura.
As avaliações das colônias dessas bactérias foram realizadas nos dois meios sólidos em placas de Petri, quanto ao crescimento lento (colônias visíveis apenas depois de quatro dias) e rápido (colônias visíveis em até três dias), diâmetro (pequena, média ou grande), forma da colônia (circular, irregular, rizoide, filamentosa ou puntiforme), elevação (côncava, elevada, ondulada, protuberante, achatada ou convexa), bordos (lisos, lacerados, lobados, filamentosos ou ondulados), estrutura (lisa, granulosa, filamentosa ou rugosa), brilho (transparente, translúcida ou opaca), coloração (incolor ou pigmentada) e aspecto (viscosa, úmida, membranosa, gelatinosa ou leitosa).
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 Além da morfologia das colônias, foram escolhidas seis das 20 bactérias para exemplificar suas habilidades de degradação do glúten usando um paquímetro digital para medir os diâmetros das colônias e dos seus respectivos halos de degradação. Com essas duas medições foram obtidos os Índices de Degradação do Glúten (IDG) de cada bactéria pela fórmula: DD (diâmetro da zona de degradação em mm)/DC (diâmetro da colônia em mm), adaptando-se os critérios e cálculos de Berraquero et al. (1976). Desse modo, as bactérias foram classificadas de acordo com a capacidade de degradação do glúten em: baixa (IDG<2), média (2≤IDG<4) e alta (IDG≥4).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todas as bactérias apresentaram crescimento rápido (menos de 48 horas) em ambos os meios de cultura. Com base nas tabelas 1 e 2, pôde-se observar que o meio de cultura influenciou nas características morfológicas das bactérias.
Quanto ao tamanho das colônias (Tabela 1), 11 das 20 bactérias foram influenciadas pelo meio de cultura; com relação à forma das colônias, essa influência foi observada em 7 bactérias; com relação à elevação das colônias, 11 foram influenciadas pelos dois meios; e nos bordos das colônias, 11 mostraram alteração de acordo com o meio, podendo-se observar nas Figuras 1, 2, 3 e 4, exemplos de bactérias que mostraram características diferentes em cada um dos meios de cultura.
Na figura 1, por exemplo, a diferença de tamanho das colônias da bactéria BLG28 nos dois meios de cultura pode ser vista claramente. No meio contendo glúten, além de produzir colônias maiores, ela mostrou uma elevação ondulada, bordos lobados e aspecto gelatinoso e no meio com lactose, ela apresentou uma elevação achatada, bordos ondulados e aspecto membranoso.
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Figura 1. Modificação de tamanho, formas, elevação e bordos das colônias da bactéria INPA BLG 28 em meio com glúten ou lactose.
Outro exemplo de modificações morfológicas que os diferentes meios de culturas podem ocasionar nas bactérias está na Figura 2 com outra das bactérias, a BLG38. No meio contendo glúten ela apresenta maior tamanho, mostrando também, elevação achatada, brilho translúcido, e cor amarela; no meio contendo lactose seu tamanho é pequeno, bem como elevação ondulada, transparente e incolor.
Figura 2. Modificação de tamanho, formas, elevação e bordos das colônias da bactéria INPA BLG 38 em meio com glúten ou lactose.
A BLG18 (Figura 3 e tabela 2) mostrou brilho opaco no meio com glúten e transparente no meio com lactose e, cor verde e incolor respetivamente nos dois meios. Por outro lado, a
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 BLG35 (Figura 4), mostrou elevação ondulada e elevada, bordos lobados e lisos respectivamente (Tabela 1) nos meios com glúten e lactose e, cores verde e branca, aspecto membranoso e leitoso respectivamente (Tabela 2) em ambos os meios de cultura.
Figura 3. Aspectos das colônias da bactéria BLG18 em meios contendo glúten ou lactose.
Figura 4. Aspectos das colônias da bactéria BLG35 em meios contendo glúten ou lactose.
Na tabela 2 pôde-se observar quanto à estrutura das colônias, que 9 foram influenciadas pelo meio de cultura; quanto ao brilho, 17 foram influenciadas; quanto à cor, 14 mostraram mudança nos dois meios de cultura e, quanto ao aspecto das colônias 10 foram influenciadas pelos meios.
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 Outra forma de diferenciar bactérias degradadoras de lactose e glúten é avaliar os diâmetros das colônias em ambos os meios e, dos halos de degradação no meio com glúten, como também na relação entre esses dois diâmetros, resultando nos Índices de Degradação do Glúten (IDG), conforme exemplificado com seis das 20 bactérias (Tabela 3). Pode-se observar nessa tabela, que os diâmetros das colônias no meio contendo lactose variaram de 1,8 a 5,8 mm nas primeiras 24 horas e, 1,9 a 10,6 mm após 48 horas de crescimento. No meio contendo glúten, os diâmetros das colônias dessas seis bactérias variaram de 3,8 a 13,3 mm após 24 horas e, de 4,7 a 30,6 mm após 48 horas de crescimento, facilitando suas diferenciações morfológicas. Em adição a isso, pode-se observar no meio com glúten, as diferenças entre elas quanto aos diâmetros dos halos de degradação do glúten, que variaram de 0,0 a 20,5 mm após 24 horas de crescimento e, de 10,2 a um valor superior a 40,0 mm após 48 horas de crescimento. Finalmente, é possível também, diferenciá-las pelos valores do IDG (Índice de Degradação do Glúten), que variou de 0,0 a 2,42 após 24 horas e, de 1,45 a 3,55 após 48 horas.
Essas diferenças de comportamentos das bactérias são devido às características intrínsecas da lactose e do glúten. A lactose (Galactose β-1,4 glucose) é um carboidrato encontrado no leite, sendo o menos variável da sua matéria seca. É o mais importante em quantidade dos sólidos não graxos (VEISSEYRE, 1988, MATTAR; MAZO, 2010). É um dissacarídeo redutor produzido nas células alveolares das glândulas mamárias, contendo uma molécula de α-d-glicose e uma de β-d-galactose. Além do seu uso direto na alimentação, a lactose pode ser convertida em galacto-oligossacarídeos, com propriedades prebióticas (NUNES et al., 2020). Essa conversão é extremamente importante quando se trata do uso do leite por pessoas intolerantes à lactose (RODRIGUES et al., 2019).
O glúten, por outro lado, é um termo geral para definir as proteínas da farinha de trigo que são pouco solúveis em água, formado por uma mistura de quatro tipos de proteínas: albuminas, globulinas, gliadinas e gluteninas. As albuminas e globulinas correspondem a aproximadamente 15 % das proteínas, com os restantes 85 % sendo formado por proteínas monoméricas e poliméricas, denominadas gliadina e glutenina, dos quais 40 % são gliadinas (MORÓN et al., 2008). Sua presença em alimentos é um grande problema para as pessoas que possuem a Doença Celíaca (SDEPANIAN et al., 2001; RODRIGUES et al., 2019).
Percebe-se, portanto (Tabela 3), que é possível diferenciar as bactérias usando os dois meios, observando que as estirpes INPA BLG01, BLG22 e BLG28 metabolizam as proteínas que constituem o glúten com mais eficiência do que o dissacarídeo lactose. Essa diferença de metabolismo também foi observada com menos intensidade na bactéria INPA BLG52, mas
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 não houve diferença de metabolismo desses dois compostos pelas bactérias INPA BLG56 e BLG70.
Quando avaliadas pelos seus Índices de Degradação do Glúten (IDG), observa-se que a INPA BLG56 apresentou os maiores índices. Com base nos critérios de Berraquero et al. (1976), esses valores são considerados como baixos ou médios, mas esse método não leva em conta, os tamanhos das colônias. As altas taxas de crescimento das bactérias INPA BLG01, BLG22 e BLG28 no meio contendo glúten indicam que elas apresentam altas capacidades de degradar esse complexo proteico, apesar de seus IDG não refletirem esses potenciais.
Assim, o uso desses dois meios de cultura permitiu diferenciar melhor as 20 bactérias degradadoras de glúten e lactose, o que pode ser útil no futuro, independente do uso ou não de metodologias de biologia molecular, que podem agregar informações se utilizadas para uma caracterização bioquímica e/ou taxonômica.
O uso de meios diferentes para facilitar a diferenciação entre microrganismos semelhantes é conhecido há décadas. Lee et al. (1974), por exemplo, ao comparar os crescimentos de Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus, verificaram que S.
thermophillus fermenta sacarose, enquanto o L. bulgaricus não conseguiu usar esse
dissacarídeo. Outra informação importante de diferenciação entre essas duas bactérias foi o fato de que quando se adicionou sacarose e lactose a um meio básico, S. thermophillus produziu ácido suficiente para mudar a cor do azul de bromotimol, formando colônias amareladas, enquanto o L. bulgaricus cresceu mais lentamente, produzindo colônias esbranquiçadas, sendo assim facilmente diferenciadas uma da outra.
Payne e Morton (1992) não só testaram cinco estirpes de Francisella tularensis, a bactéria responsável pela tularemia, em meios de cultura diferentes, mas também em três diferentes temperaturas, observando que seus crescimentos foram diferentes nos meios testados, havendo também, influência das temperaturas em cada uma delas, facilitando separá-las distintamente.
Em outro estudo, Shapiro (1995) verificou que células de Escherichia coli mostraram dois comportamentos distintos. Em um meio semi-sólido, as células formaram padrões organizados devido à autoagregação quimiotática, mas em um meio pobre de nutrientes, formaram colônias ramificadas usando motilidade grupal e sinais químicos de ampla variação. Segundo esse autor, os padrões das colônias bacterianas são importantes para que se possa aprofundar o entendimento da biologia e evolução procariótica e em sistemas experimentais, para estudar sua morfologia e organização.
Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.6, p.37017-37030 jun. 2020. ISSN 2525-8761 Bereswill et al. (1998) usaram meios de cultura diferentes para identificar estirpes de
Erwinia amylovora, a bactéria causadora da queima de fogo em maçãs, peras e outras espécies
de plantas. Eles verificaram que as estirpes formaram colônias amarelas em um meio mínimo contendo asparagina e sulfato de cobre, mas apresentaram coloração branca na ausência desse. Segundo esses autores, a pigmentação amarela na presença do sulfato de cobre permitiu estabelecer um novo método de identificação desse grupo de bactérias que causa a queima de fogo, sendo superior ao meio semi-seletivo com sacarose anteriormente usado com essa finalidade.
Segundo Sousa et al. (2013), a taxa de crescimento, densidade de colônias nas placas, meios de cultura, formação de biofilme, características genéticas da bactéria podem interferir no aspecto das colônias. Com base nessas variáveis, esses autores identificaram 18 morfotipos diferentes em duas estirpes de Pseudomonas aeruginosa, que mostraram variações nos tamanhos, formas, cores, texturas e margens, permitindo-lhes caracterizar com mais detalhes, as estirpes bacterianas. Usar essas informações, portanto, pode facilitar a identificação de bactérias e possíveis mutações que possam ocorrer, além de evitar a presença de contaminantes em culturas puras.
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Tabela 1. Caracterização fenotípica das bactérias em meios com glúten e lactose (a).
Bactéria Crescimento Tamanho Forma Elevação Bordos
INPA BLG GLU LAC GLU LAC GLU LAC De c LAC GLU LAC
01 Rápido Grande Irregular Achatada Lisos Ondulados
02 Rápido Grande Irregular Achatada Lobados
06 Rápido Grande Irregular Circular Achatada Lisos
10 Rápido Grande Pequeno Irregular Circular Achatada Ondulados Lisos
16 Rápido Grande Médio Irregular Circular Elevada Achatada Lisos Lobados
18 Rápido Médio Circular Achatada Lisos
22 Rápido Grande Irregular Elevada Achatada Lobados Ondulados
23 Rápido Médio Grande Circular Elevada Achatada Lobados Lisos
25 Rápido Médio Pequeno Irregular Circular Elevada Achatada Lisos
28 Rápido Grande Irregular Ondulada Achatada Lobados Ondulados
32 Rápido Grande Circular Irregular Achatada. Elevada Lobados
33 Rápido Grande Pequeno Circular Achatada Ondulada Lisos
35 Rápido Grande Médio Circular Ondulada Elevada Lobados Lisos
38 Rápido Grande Pequeno Circular Irregular Ondulada Achatada Lobados Ondulados
40 Rápido Médio Pequeno Circular Ondulada Achatada Lisos
45 Rápido Grande Médio Irregular Elevada Lobados Ondulados
52 Rápido Pequeno Circular Elevada Achatada Lisos
56 Rápido Grande Médio Circular Ondulada Lisos
70 Rápido Grande Médio Circular Achatada Lobados Lisos
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Tabela 2. Caracterização fenotípica das bactérias em meios com glúten e lactose (b).
Bactéria Estrutura Brilho Cor Aspecto
INPA BLG GLU LAC GLU LAC GLU LAC GLU LAC
01 Rugosa Lisa Opaco Translúcido Branca Incolor Membranoso
02 Rugosa Lisa Opaco Translúcido Branca Incolor Leitoso Membranoso
06 Lisa Translúcido Transparente Verde Incolor Leitoso
10 Rugosa Lisa Translúcido Opaco Branca Membranoso Leitoso
16 Lisa Opaco Transparente Branca Incolor Leitoso Membranoso
18 Lisa Opaco Transparente Verde Incolor Leitoso
22 Rugosa Opaco Translúcido Verde Azulado Branca Membranoso
23 Rugosa Lisa Opaco Transparente Branca Incolor Leitoso
25 Rugosa Lisa Opaco Transparente Branca Incolor Leitoso Membranoso
28 Lisa Opaco Branca Gelatinoso Membranoso
32 Lisa Opaco Transparente Verde Azulado Incolor Membranoso
33 Lisa Translúcido Transparente Amarela Incolor Membranoso
35 Lisa Translúcido Verde Branca Membranoso Leitoso
38 Rugosa Lisa Opaco Translúcido Branca Membranoso
40 Lisa Translúcido Branca Leitoso Membranoso
45 Rugosa Lisa Opaco Transparente Branca Incolor Gelatinoso Membranoso
52 Lisa Opaco Transparente Branca Incolor Leitoso Membranoso
56 Rugosa Lisa Opaco Translúcido Branca Leitoso Membranoso
70 Rugosa Opaco Translúcido Branca Membranoso
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Tabela 3. Crescimento das colônias e Índice de Degradação do Glúten das bactérias em meios contendo lactose e glúten. Bactér ia INPA BLG 24 horas 48 horas
Lactose Glúten Lactose Glúten
Diâmet ro colônia Diâmet ro colônia Diâmet ro halo IDG Diâmet ro colônia Diâmet ro colônia Diâmet ro halo ID G --- mm --- --- mm --- 01 5,8 b 13,3 a 16,9 1,27 10,6 b 17,6 a 25,5 1,45 22 4,2 b 13,3 a 19,5 1,47 10,3 b 30,6 a >40,0* --- 28 5,2 b 10,5 a 20,5 1,95 9,3 b 13,2 a 28,5 2,16 52 1,8 b 3,8 a 0,0 0,0 1,9 b 4,7 a 10,2 2,17 56 4,9 a 4,8 a 11,6 2,42 5,6 a 5,1 a 18,1 3,55 70 5,0 a 5,3 a 6,9 1,30 6,5 a 6,2 a 11,6 1,87 Média s 4,5 b 8,5 a 12,6 1,40 7,4 b 12,9 a 18,8** 2,24**
* Halos se juntaram sem possibilidade de medição exata. ** Média sem o valor da INPA BLG22. As letras mostram as diferenças de crescimento de cada bactéria em cada um dos meios (lactose e glúten) pelo teste de
Tukey a 5 %, isto é, comparações entre as médias numa mesma linha.
4 CONCLUSÕES
A morfologia das colônias das 20 bactérias capazes de degradar a lactose e o glúten nos dois meios de cultura usados pode ser usada para diferenciar uma das outras.
Os diâmetros das colônias e do halo de degradação do glúten, bem como o Índice de Degradação do Glúten (IDG) também permitem diferenciar esse grupo de bactérias.
Essas diferenças de características podem ser usadas para facilitar futuros estudos com essas bactérias.
O meio cuja fonte de carbono é constituída de proteínas (glúten) foi o que mais favoreceu o crescimento das bactérias INPA BLG01, BLG22, BLG28, BLG52.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e à FAPEAM (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas), pelo apoio financeiro que permitiu realizar essa pesquisa.
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