Sistema melatonérgico como alvo do peptídeo β-amiloide

Sistema melatonérgico como alvo do

peptídeo β

-amiloide

The melatonergic system as a target of

amyloid-β

peptide

São Paulo

Sistema melatonérgico como alvo do

peptídeo β

-amiloide

The melatonergic system as a target of

amyloid-β

peptide

Tese apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade de São

Paulo, para a obtenção de Título de

Doutor em Ciências, na Área de

Fisiologia Geral.

Orientadora:

Prof

Dr

Regina Pekelmann Markus

São Paulo

!!

!! !!!!!!!Cecon,!Erika!!

!!!!!!!!!!!!Sistema!Melatonérgico!como!Alvo!do!Peptídeo!β;Amiloide!/!Erika!! !!!!!!!Cecon!;!orientadora!Dra.!Regina!P.!Markus.!;;!São!Paulo,!2014.! !!!!!!!!!!!157!f.!!

!!!!!!!!!!!!Tese!(Doutorado)!–!Instituto!de!Biociências!da!Universidade!de!! !!!!!!!São!Paulo.!Departamento!de!Fisiologia.!

!

1.!!Glândula!pineal.!2.!Doença!de!Alzheimer.!3.!Melatonina.!I.!!! !!!!!!!!Universidade!de!São!Paulo.!Instituto!de!Biociências.!Departamento!de!! !!!!!!!!Fisiologia.!II.!Título.!!

_________________________

_________________________

Prof.(a) Dr.(a)

Prof.(a) Dr.(a)

_________________________

_________________________

Prof.(a) Dr.(a)

Prof.(a) Dr.(a)

“Agir, eis a inteligência verdadeira. Serei o que quiser.

Mas tenho que querer o que for.

O êxito está em ter êxito, e não em ter condições de êxito.

Condições de palácio tem qualquer terra larga,

mas onde estará o palácio se não o fizerem ali?”

tem colocado em meu caminho e por iluminar minha trajetória.

Agradeço a todos da minha

família

, que sempre me ofereceram apoio e amor

incondicionais e compreenderam a distância que por vezes se fez necessária durante

a execução deste projeto. Tenho muito orgulho em fazer parte desta família tão

unida, vocês são meu porto-seguro. Agradeço principalmente ao meu pai

Antonio

Carlos

e à minha mãe

Sueli

por todo incentivo, apoio e por serem meu maior

exemplo de que não existem limites nas conquistas quando há esforço e dedicação. À

minha irmã

Letícia

e meu cunhado

Chicão

, por serem também exemplos de

dedicação e por compartilharem comigo o gosto pela ciência, sempre me apoiando.

Ao meu afilhado

Luigi

, por alegrar e iluminar nossas vidas com sua presença. E ao

meu noivo

Elton

, por toda a paciência, companheirismo, cumplicidade e

compreensão ao longo de todos esses anos.

Agradeço especialmente a todos aqueles que em algum momento

participaram desta jornada no

laboratório de Cronofarmacologia

. Aos amigos

Pedro, Eduardo, Daiane, Marina, Camila, Marco, Cláudia, Leila, Sanseray, Michelle,

Eliana, Flávia, Adriessa, Eugênia, Gabis, Letícia, Luis e Luciana, por todos os

momentos compartilhados e pelos diferentes ensinamentos que me proporcionaram.

Aos técnicos Eduardo e Débora, por todo o auxílio prestado, pela amizade e por

tornarem o laboratório um lugar muito agradável de se trabalhar. A todos os novos

membros desta família, obrigada pela compreensão nesses últimos meses. Agradeço

ainda a todos do laboratório do

Institut Cochin

, pela hospitalidade e por todo

aprendizado durante os 4 meses de convivência, e ao professor

Ralf Jockers

, por

todo apoio, orientação, auxílio e contribuição a este trabalho.

Agradeço aos professores Pedro, Luciana e Zulma, pelas contribuições no

desenvolvimento deste projeto, por toda orientação e amizade. E agradeço em

especial à professora

Regina

, pela orientação ao longo de todos esses anos e também

por tantos outros ensinamentos que contribuíram muito para meu crescimento

pessoal e profissional, muito obrigada pela amizade e confiança.

Agradeço aos demais laboratórios e funcionários de Dep. de Fisiologia por

todo o auxílio prestado e pela ótima convivência.

Agradeço ainda ao apoio financeiro das agências FAPES, CAPES e CNPq,

INTRODUÇÃO

 ... 13

1.

_A

 ... 14 

1.1 A glândula pineal

 ... 14

1.2 Efeitos da melatonina

 ... 20

1.3 Mecanismos de ação da melatonina

 ... 23

2.

_I

_:

-

 ... 29 

2.1 Fator de transcrição NFKB

 ... 32

3.

_S

_–

_D

A

 ... 37 

3.1 Peptídeo

β

-amiloide

 ... 40

CONCLUSÕES

 ... 46

RESUMO

 ... 47

ABSTRACT

 ... 49

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 ... 52

ANEXO 1 ... 82

Aβ peptídeo beta amiloide

APP proteína precursora amiloide

AA-NAT enzima arilalquilamina N-acetiltransferase

ACh acetilcolina

ASMT enzima acetilserotonina metiltransferase

AD doença de Alzheimer

AFMK N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina

AMK N1-acetil-5-metoxiquinuramina

AMPA receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico

AMPc monofosfato cíclico de adenosina

AP-1 proteína ativadora 1

AT2 receptor de angiotensina II

ATP adenosina trifosfato

BCG Bacilo Calmette-Guerin

BRET transferência de energia bioluminescente por ressonância

COX enzima ciclooxigenase

CREB proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc

DAMPs padrões moleculares associados a dano

DMEM do inglês, Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DNA ácido desoxirribonucleico

EMSA ensaio de eletromobilidade em gel

GABA ácido gama-aminobutírico

GAPDH enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GPCR receptor acoplado à proteína G

GSK3 enzima glicogênio sintase quinase

HIOMT enzima hidroxindol-O-metiltransferase

HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol

ICAM molécula de adesão intercelular

I-Mel 2-iodomelatonina

IFN interferon

IκB proteína inibitória kappa B

IKK enzima quinase de IKB

IL interleucina

IP3 inositol trifosfato

MAPK enzimas quinases ativadas por mitógenos

MEK enzima MAP quinase-quinase regulada por sinal extracelular

ERK enzima quinase regulada por sinal extracelular

mACh receptor colinérgico muscarínico

µM micromolar

mM milimolar

MTR receptor de melatonina

NAS N-acetilserotonina

nACh receptor colinérgico nicotínico

NF-κB fator nuclear kappa B

NK células natural killers

nM nanomolar

NMDA receptor de N-metil D-aspartato

NSQ núcleo supraquiasmático

PAMPs padrões moleculares associados a patógenos

PDTC pirrolidinaditiocarbamato

PKA proteína quinase dependente de AMPc

PKC proteína quinase depende de cálcio

PLC enzima fosfolipase C

pM picomolar

PVN núcleo paraventricular hipotalâmico

RNA ácido ribonucleico

RNAm RNA mensageiro

RLuc enzima Renilla luciferase

ROR/RZR família de receptores nucleares do ácido retinóico

ROS espécies reativas de oxigênio

SNC sistema nervoso central

TAD domínio de transativação

TLR receptores do tipo toll

TNF fator de necrose tumoral

VCAM molécula de adesão de célula vascular

INTRODUÇÃO

“Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco; à medida que vamos

adquirindo conhecimentos, instala-se a dúvida.”

INTRODUÇÃO

A melatonina é o hormônio produzido pela glândula pineal de maneira

rítmica, em sincronia com a informação luminosa ambiental. A função cronobiótica

da melatonina, atuando no ajuste de processos fisiológicos rítmicos ao ciclo

claro/escuro ambiental é certamente sua função mais conhecida. No entanto, as

propriedades desta molécula vão muito além de seus efeitos cronobióticos,

apresentando uma grande variedade de ações, muitas das quais são de grande

potencial terapêutico. A glândula pineal, o hormônio melatonina e os receptores

específicos que medeiam as ações da melatonina compõem o chamado sistema

melatonérgico. Diversos estudos têm demonstrado que este sistema encontra-se

alterado em diversas patologias, especialmente no caso da doença neurodegenerativa

conhecida como a doença de Alzheimer (AD, do inglês

Alzheimer’s disease

), em que é

relatada uma redução drástica na produção de melatonina pela glândula pineal

desde os primeiros estágios da doença e alteração na expressão dos receptores de

melatonina em algumas áreas encefálicas. Ampliar o entendimento dos mecanismos

de ação que mediam a disfunção do sistema melatonérgico permitirá não só uma

melhor compreensão da fisiopatologia de AD, como também uma caracterização de

possíveis marcadores biológicos dos estágios iniciais da doença. Além disso, o

conhecimento das alterações do sistema melatonérgico nesta patologia é

fundamental para o desenvolvimento de protocolos terapêuticos com o uso

coadjuvante de melatonina ou seus análogos no tratamento de pacientes com doença

1.

Anatomia e fisiologia do sistema melatonérgico

1.1 A glândula pineal

A glândula pineal foi primeiramente descrita por Galeno, no século II, com

base nas descrições prévias feitas pelo anatomista grego Herophilus (325-280 a.C.). O

nome “pineal” advém da descrição de seu formato de pinha,

pinea

em latim. Por ser

uma estrutura única no cérebro, contrapondo-se às demais estruturas que são

bilaterais, e pela sua posição central no cérebro de humanos, foi postulado que a

pineal exercesse um papel também central, controlando o fluxo dos pensamentos

entre os hemisférios cerebrais (revisto por Axelrod, 1974). Séculos depois, já em 1662,

o filósofo francês René Descartes (1596-1650) também atribuiu à pineal uma função

metafísica, segundo a qual este órgão ímpar seria a sede da alma, o local onde o

espírito animal se integraria ao corpo físico, controlando seus movimentos e

percepções. Seu relato dizia ainda que a glândula pineal recebia as informações

provenientes dos nossos olhos sobre o mundo real, gerando e transmitindo ao resto

do corpo a resposta adequada que deveria ser executada (revisto por Arendt, 1995).

Nota-se que a descrição feita por Descartes pelo método dedutivo estava bem

adequada ao que sabemos atualmente sobre a função da pineal, na medida em que a

considerou um importante elo de ligação entre o mundo exterior e o meio interno.

Por muito tempo acreditou-se que a pineal de humanos era somente um

órgão vestigial, correspondente ao órgão parietal (ou “terceiro olho”) que tem função

de fotorrecepção nos vertebrados inferiores (Dandy, 1915; Oksche, 1965). A primeira

função da pineal foi descrita em 1917, com a observação de que extratos de pineais

dermatologista Aaron B. Lerner isolou o composto ativo presente nestes extratos e o

denominou de melatonina (Lerner

et al.

, 1958, 1960). Estudos subsequentes

caracterizaram rapidamente a via de síntese e metabolização desse novo hormônio,

os locais onde ocorre sua produção e até mesmo o caráter rítmico com que a pineal o

produz (Lerner

et al

., 1960; Axelrod & Weissbach, 1961; Quay, 1963, 1964; Klein &

Weller, 1970).

A glândula pineal é um órgão neuroendócrino, diferenciado durante o

desenvolvimento embrionário a partir de uma evaginação do teto do terceiro

ventrículo. A pineal corresponde também a um dos órgãos circunventriculares, o que

implica que está localizada fora da barreira hematoencefálica. Anatomicamente, a

pineal é descrita como parte do epitálamo e, portanto, do diencéfalo. Na maioria dos

mamíferos a glândula pineal situa-se dorsalmente à região caudal do diencéfalo,

entre as comissuras habenular e posterior, ocupando uma posição bem centralizada

no encéfalo, conforme observa-se na figura 1. Nos roedores, a glândula apresenta

uma forma mais alongada e localização mais superficial devido a uma migração do

órgão na direção dorso-caudal, mas sua porção profunda mantém-se na região

circunventricular (Møller & Baeres, 2002). Estruturalmente, a glândula pineal é

composta por diversos tipos celulares, sendo que aproximadamente 80% das células

são neuroendócrinas, denominadas de pinealócitos. Essas células têm a mesma

origem ectodérmica que células neuronais e são responsáveis pela produção de

melatonina (Arendt, 1995; Ekström & Meissl, 2003). Também fazem parte da pineal

as células gliais, mais especificamente astroglia e microglia (Pedersen

et al

., 1993; Sato

Figura 1 –Posição central da glândula pineal no cérebro humano. À esquerda, corte sagital com visualização lateral do encéfalo; à direita, corte horizontal e visualização pela face superior (adaptado de Wurtman & Axelrod, 1965).

A glândula pineal é um dos componentes do sistema de temporização interno

dos verterbrados, seu hormônio – a melatonina – é uma importante eferência do

relógio biológico central. Esse sistema garante organização temporal nas funções

fisiológicas, permitindo ao organismo antecipação e adaptação aos fenômenos

cíclicos ambientais, como o dia e noite e as estações do ano (Menaker

et al

., 1997). A

produção de melatonina pela glândula pineal obedece um ritmo circadiano,

apresentando concentrações plasmáticas baixas na fase de claro ambiental e altas na

fase de escuro. O pico de melatonina noturno é, portanto, o sinal endócrino que

traduz a presença e a duração do escuro ambiental, permitindo que o organismo

distinga entre dia e noite e entre as estações do ano.

Anatomicamente, a regulação da atividade da glândula pineal depende de

conexões multissinápticas que transmitem a informação fótica ambiental até a pineal.

Através do trato retino-hipotalâmico a informação luminosa captada pela retina é

transmitida

aos

núcleos

supraquiasmáticos

hipotalâmicos

(NSQs),

que

correspondem ao relógio biológico central de mamíferos (Inouye & Kawamura,

passando pela coluna intermédio lateral da medula. Essa informação chega então à

glândula pineal através das fibras simpáticas que a inervam, provenientes do gânglio

cervical superior (Teclemariam-Mesbah

et al.

, 1999). Durante a fase de claro

ambiental, a sinalização GABAérgica (ácido gama-aminobutírico) entre os neurônios

dos NSQs e do PVN inibe a propagação da via neste ponto, enquanto que na fase de

escuro este bloqueio deixa de ocorrer e as fibras simpáticas que inervam a glândula

liberam os neurotransmissores noradrenalina e ATP (adenosina trifosfato) (Klein

et

al

., 1983; Mortani-Barbosa

et al

., 2000). A sinalização desencadeada pela

noradrenalina nos pinealócitos induz a síntese de melatonina e é reponsável pelo

caráter rítmico da atividade endócrina da pineal.

A ativação de receptores

β

-adrenérgicos pela noradrenalina, que são

receptores de membrana acoplados à proteína G estimulatória (G

), induz aumento

nos níveis intracelulares de AMPc (monofosfato cíclico de adenosina), ativando a

proteína kinase A (PKA) e o fator de transcrição CREB (do inglês,

cAMP response

element binding protein

). Nos pinealócitos de roedores, este fator regula positivamente

a transcrição gênica da enzima arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT),

essencial na via biossintética da melatonina (Baler

et al

., 1997). Já em primatas, o gene

de AA-NAT é constantemente transcrito e a proteína é rapidamente degradada.

Neste caso, a cascata de sinalização β-adrenérgica leva à fosforilação da enzima

AA-NAT por PKA, possibilitando sua ligação à proteína chaperona 14-3-3, formando um

complexo funcionalmente ativo e protegido contra ação proteassomal durante o

escuro ambiental (Schomerus

et al

., 2000). Além da indução da atividade da AA-NAT

ocorrer somente no escuro, a luz exerce efeito inibitório sobre esta enzima, visto que

exposição à luz durante a fase de escuro induz rapidamente sua degradação na

portanto, resultante da regulação transcricional (no caso de roedores) ou

pós-traducional (no caso de primatas) da enzima AA-NAT. A noradrenalina pode ainda

ativar receptores do tipo α

-adrenérgicos que, embora não sejam capazes de induzir

a síntese de melatonina por si só, potenciam o efeito induzido pela ativação

β-adrenérgica, via sinalização pela proteína G

e aumento de cálcio intracelular (Klein

et al

., 1983; Ho

et al

., 1988). A ativação de receptores purinérgicos do tipo P2Y

pelo

co-transmissor ATP também pontencia a atividade neuroendócrina da pineal

induzida por noradrenalina via aumento de cálcio intracelular (Ferreira

et al

., 1994,

2003).

A melatonina é uma indolamina derivada do aminoácido triptofano. Sua

síntese inicia-se com a captura do triptofano da corrente sanguínea, que é

hidroxilado a 5-hidroxitriptofano (5-HTP), cuja descarboxilação dá origem à

serotonina (5-hidroxitriptamina), neurotransmissor relevante em várias sinapses

centrais e no trato gastrointestinal (revisto por Domínguez-López

et al

., 2012;

Gershon, 2013). Na presença da enzima-chave AA-NAT a serotonina é convertida em

N-acetilserotonina (NAS), precursora da melatonina que também é liberada na

corrente sanguínea. Por fim, sob ação da enzima acetilserotonina metiltransferase

(ASMT), também conhecida como hidroxindol-O-metiltransferase (HIOMT), a NAS é

metilada e forma a melatonina (Simonneaux & Ribelayga, 2003). A figura 2 detalha a

cascata enzimática que compõe a via de biossíntese de melatonina, apresentando a

estrutura bioquímica de cada molécula, enquanto que a figura 3 ilustra o caráter

rítmico dessa produção, seja em animais de hábito diurno, como os humanos, ou de

Figura 2 – Via de biossíntese da melatonina. Cascata enzimática da metabolização do aminoácido triptofano até a formação de melatonina.

1.2 Efeitos da melatonina

Conforme mencionado anteriormente, a melatonina foi primeiramente

descrita em 1958, nos estudos sobre a alteração na coloração da pele de anfíbios

(Lerner

et al

., 1958). O primeiro efeito cronobiótico da melatonina foi evidenciado

ainda nessa época, com observações de que a exposição de roedores a diferentes

fotoperíodos (relação entre o comprimento da fase de claro e da fase de escuro)

induzia alterações no tamanho e função das gônadas, e que a extirpação da glândula

pineal e/ou administração de melatonina mimetizavam essas alterações (Wurtman &

Axelrod, 1965). A atividade reprodutiva desses animais apresenta variação sazonal

bem definida e foi então detectado que a melatonina é o hormônio capaz de

transduzir humoralmente a informação fótica ambiental e sincronizar a função

reprodutiva às estações do ano (Reiter, 1980). Como diferentes espécies apresentam

diferentes épocas de reprodução, o efeito da melatonina sobre a reprodução é

espécie-específico, podendo ser tanto anti- quanto pró-gonadotrófico. Estabelecia-se,

portanto, um dos principais papéis da melatonina: o de sincronizar ritmos

endógenos às variações ambientais diárias ou anuais, contribuindo para o sistema de

temporização interno.

A melatonina é uma molécula conservada filogeneticamente, sendo

encontrada desde organismos unicelulares até vertebrados superiores (revisto por

Pandi-Perumal

et al

., 2006). Acredita-se que sua função mais antiga,

evolucionariamente, seja como molécula fotoprotetora, atuando como antioxidante e

protegendo os organismos unicelulares, e também tecidos especializados de plantas,

verificados em alguns organismos primitivos, embora os dados a esse respeito sejam

escassos (Hardeland & Poeggeler, 2003). Nos vertebrados não-mamíferos a glândula

pineal é fotossensível, sendo a produção de melatonina regulada diretamente pela

informação fótica ambiental. A glândula pineal de aves, por exemplo, é um dos

componentes do relógio biológico central desses animais, juntamente com a retina e

os NSQs, sendo a melatonina importante regulador de funções rítmicas diárias, como

o ritmo de atividade/repouso, de funções retinianas, de orientação espacial e de

vocalização, assim como funções rítmicas sazonais, como a reprodução e migração

(revisto por Cassone, 2014).

Em mamíferos, os efeitos cronobióticos da melatonina incluem a regulação de

diversos ritmos fisiológicos, como por exemplo: ritmo comportamental de

atividade/repouso, pressão arterial, fotorrecepção retiniana, proliferação celular na

medula óssea e no sistema linfoide, e a produção de citocinas por células do sistema

imunológico (Haus

et al

., 1983; revisto por Pandi-Perumal

et al

., 2006). Em humanos,

a produção dessincronizada de melatonina está relacionada a distúrbios como

insônia e mal-estar causados por trabalho noturno ou pelo efeito “jet-lag”, referente à

adaptação a um novo fuso horário em viagens trans-meridionais.

A melatonina apresenta também diversos outros efeitos que não estão

necessariamente relacionados à sincronização de ritmos circadianos ou sazonais e

que não dependendem da produção hormonal rítmica da pineal. Tais efeitos são,

portanto, classificados como efeitos não-cronobióticos e podem ser decorrentes de

produção de melatonina extra-pineal. A produção de melatonina por outros órgãos

que não a pineal ocorre geralmente de forma não-rítmica e dependente de estímulos

específicos. Produção extra-pineal de melatonina já foi detectada em células

killers

), timócitos, linfócitos, macrófagos e endoteliais (revisto por Kvetnoy, 1999;

Conti

et al

., 2000), no trato gastrointestinal e na retina (Iuvone

et al

., 2005; Konturek

et

al

., 2007). A produção local de melatonina pode atingir concentrações na faixa de

µ

M

a mM, contrastando com a concentração plasmática de melatonina produzida pela

pineal, que ocorre na faixa de pM a nM. De modo geral, as ações antioxidante,

oncostática e imunomodulatória são exemplos de efeitos não-cronobióticos da

melatonina.

Como antioxidante, a melatonina possui capacidade tanto de sequestrar

diretamente radicais livres quanto de aumentar a expressão e atividade de enzimas

antioxidantes, auxiliando também na regeneração dessas enzimas pelos processos

redox. Curiosamente, os metabólitos gerados pela oxidação da melatonina, o AFMK

(N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina) e o AMK

(N1-acetil-5-metoxiquinu-ramina), são também moléculas com propriedades antioxidantes ainda mais potentes

que da própria melatonina (Hardeland

et al

., 2003, 2006; Silva

et al

., 2006). Portanto, a

melatonina é considerada um potente modulador do estado redox celular.

As ações oncostáticas da melatonina devem-se principalmente às suas

propriedades anti-proliferativa e anti-angiogênica (Lissoni

et al

., 2001; Blask

et al

.,

2002, 2005). Tais efeitos estão relacionados, respectivamente, ao fato da melatonina

prolongar o ciclo celular nas células tumorais e inibir as vias de sinalização

relacionadas à hipóxia, que normalmente ativam a angiogênese. Além disso, embora

seja comumente descrito que a melatonina inibe a apoptose (revisto por Luchetti

et

al

., 2010), o efeito oposto é observado em células tumorais. Estudos demonstraram

indução de apoptose por melatonina em vários tipos tumorais, tais como em

linfomas, tumores de glândula mamária, colo-retal e de próstata (revisto por

danos ao DNA, tendo efeito altamente carcinogênico. Dessa forma, a característica

antioxidante da melatonina também contribui para seu papel protetor no câncer. O

uso de antioxidantes, incluindo a melatonina, como coadjuvantes no tratamento

quimioterápico tem demonstrado resultados promissores tanto com relação à maior

eficácia do tratamento quanto à diminuição dos efeitos colaterais (Vijayalaxmi

et al

.,

2002; Anisimov

et al

., 2006; Jung & Ahmad, 2006; revisto por Block

et al

., 2008).

Um número crescente de estudos têm comprovado o papel da melatonina

como importante modulador da resposta imune (revisto por Carrillo-Vico

et al

.,

2013). Foi demonstrado que a melatonina aumenta a proliferação de linfócitos-T, a

apresentação de antígenos pelos macrófagos e a atividade fagocitária destes

(Carrillo-Vico

et al

., 2005; Pontes

et al

., 2006; Pires-Lapa

et al

., 2013); aumenta ainda a

atividade celular no sistema linfoide, no baço e na medula óssea; estimula a síntese

de algumas citocinas, como as interleucinas (IL)-2, IL-6, IL-12 e o interferon-gama

(IFN-γ) (revisto por Miller

et al

., 2006); e regula a síntese de óxido nítrico (NO) em

células endoteliais vasculares (Tamura

et al

., 2009), o que pode ser um mecanismo

adicional pelo qual a melatonina modula a tensão dos vasos sanguíneos (Geary

et al

.,

1997). Por outro lado, a ausência de melatonina endógena diminui tanto a imunidade

celular quanto humoral (Maestroni, 2001).

Pelo exposto acima, nota-se a característica altamente pleiotrópica desta

molécula, exercendo importantes papéis moduladores, principalmente no que diz

respeito ao sistema de defesa do organismo.

1.3 Mecanismos de ação da melatonina

Uma molécula com tanta variedade de efeitos como a melatonina também

seus efeitos principalmente pela ativação de receptores de membrana de alta

afinidade, mas também apresenta capacidade de ligação a diversas moléculas

intracelulares, acarretando em modulação de cascatas de sinalização. Além disso,

também tem sido sugerida ação nuclear da melatonina, ativando direta ou

indiretamente receptores nucleares que regulam a transcrição de genes alvos.

Em mamíferos existem dois tipos de receptores de alta afinidade à melatonina

(MTRs, do inglês

melatonin receptors

), sendo ambos receptores de sete domínios

transmembrânicos acoplados à proteína G (GPCR), denominados MT

e MT

. Assim

como na história da descoberta das funções da melatonina, os anfíbios também

tiveram participação importante na história da descoberta destes receptores. Os

primeiros indícios da existência de tais receptores vieram dos estudos em

melanóforos de sapo, em que tanto indolaminas de estrutura semelhante à

melatonina quanto a toxina pertussis inibiram o efeito da melatonina sobre a

agregação dos pigmentos nos melanóforos (Heward & Hadley, 1975; White

et al

.,

1987). Esta última observação evidenciou a presença de receptores acoplados à

proteína G mediando o efeito da melatonina, pois a toxina pertussis inativa o

acoplamento do receptor à proteína G

. De forma semelhante, estudos com retina de

aves também sugeriram que o efeito inibitório da melatonina sobre a liberação de

[

_{H]-dopamina deveria ser mediado por receptor, uma vez que ocorria com baixas}

concentrações de melatonina e que era mimetizado ou anulado pelo uso de outras

moléculas de estrutura similar – agonistas ou antagonistas, respectivamente

(Dubocovich, 1985). Nessa mesma época, o desenvolvimento da molécula de

melatonina ionizada com

_{I (2-[}

_{I]-iodomelatonina) (Vakkuri}

_{et al}

_{., 1984)}

possibilitou a detecção de sítios de ligação de alta afinidade à melatonina em

Takahashi, 1987; Vanecek

et al

., 1987; Duncan

et al

., 1988; Laudon

et al

., 1988;

Dubocovich

et al

., 1989; Weaver

et al

., 1989). Devido às diferenças nas características

farmacológicas dos sítios de ligação à melatonina presentes em retinas de coelho ou

aves e as presentes no cérebro de roedores, os receptores de melatonina foram

inicialmente subdivididos em duas classes: ML

e ML

(Dubocovich, 1988).

O receptor de melatonina de sapo, que apresenta características

farmacológicas da classe 1 dos receptores de melatonina (ML

), foi o primeiro a ser

clonado (Ebisawa

et al

., 1994). Em mamíferos, foram clonados outros dois subtipos

de receptores do tipo ML

(Reppert

et al

., 1994, 1995), de modo que essa classe foi

subdivida em ML

, ML

e ML

(Dubocovich, 1995). Estudos subsequentes

comprovaram que os receptores ML

e ML

estão presentes em diversos mamíferos

enquanto que o ML

, o primeiro a ser clonado, é exclusivo de vertebrados

não-mamíferos. Essa nomenclatura original foi posteriormente normatizada pela União

Internacional de Farmacologia Básica e Clínica (IUPHAR, do inglês

International

Union of Basic and Clinical Pharmacology

), que regulamenta os receptores de

mamíferos, de modo que os receptores ML

e ML

são hoje denominados de MT

e

MT

, respectivamente, enquanto que o ML

não sofreu alterações em sua

nomenclatura (Dubocovich

et al

., 2000). O receptor ML

chegou a ser denominado de

MT

, porém, ficou demonstrado que não se trata de um receptor acoplado à proteína

G, e sim de uma enzima, a quinona redutase 2 (Nosjean

et al

., 2000). A família de

receptores de melatonina de mamíferos conta ainda com um receptor órfão, o GPR50

que, embora não seja capaz de se ligar à melatonina, apresenta 45% de identidade

com MT

e MT

na sequência de aminoácidos, além de similaridades filogenéticas e

acordo com alguns estudos filogenéticos, acredita-se que seja o ortólogo do receptor

Mel

de não-mamíferos (Dufourny

et al.

, 2008).

Os receptores MT

e MT

são amplamente distribuídos, tendo sido detectados

praticamente em todos os tipos celulares de mamíferos (revisto por Zlotos

et al

.,

2014). Classicamente, ambos receptores sinalizam via proteína G

(inibitória),

resultando,

portanto,

em

inibição

do

segundo

mensageiro

AMPc

e,

consequentemente, da sinalização mediada pela via AMPc-PKA-CREB. Acoplamento

destes receptores à proteína G

também já foi descrito e, neste caso, está

relacionado à ativação da via de sinalização mediada pela proteína fosfolipase C

(PLC), induzindo aumento nos níveis intracelulares do segundo mensageiro inositol

trifosfato (IP

) e de cálcio, e ativação da proteína quinase C (PKC) (Brydon

et al

., 1999;

Mackenzie

et al

., 2002). Foi também demonstrada a ativação da via das MAP

quinases (MAPK, do inglês

mitogen-activated protein kinases

) pelos receptores de

melatonina, levando à fosforilação de MEK 1/2 e ERK 1/2 (Chan

et al

., 2002; revisto

por Hardeland, 2009).

Embora as vias de sinalização de MT

e MT

sejam aparentemente

redundantes, não havendo sinalização específica que os diferencie, a distribuição e o

padrão de expressão desses dois receptores pode ser tecido-específicos. Foram

descritos inclusive papéis antagônicos dos receptores de melatonina, como por

exemplo na mediação dos efeitos da melatonina na vasoconstrição e vasodilatação

arteriais (Masana

et al

., 2002). Nos NSQs ambos receptores estão presentes, mas a

ativação de PKC induzida por melatonina ocorre somente via MT

, e não por MT

(Hunt

et al

., 2001). A melatonina atua na sincronização da atividade rítmica desses

neurônios, sendo que sua ação via o receptor MT

inibe a taxa de disparos de

de fase do ritmo de disparos, o que reflete no adiantamento de fase no ritmo

comportamental de atividade/repouso desses animais (Hunt

et al

., 2001; revisto por

Dubocovich & Markowska, 2005). Nas células mononucleares do sistema

imunológico, o aumento da atividade fagocitária induzido pela melatonina é

mediado pelo receptor MT

(Pires-Lapa

et al

., 2013), enquanto que a indução da

expressão de IL-2 ocorre via ativação de receptores MT

(Carrillo-Vico

et al

., 2003). Já

o efeito anti-apoptótico da melatonina sobre as células do sistema imunológico pode

ser tanto dependente (Radogna

et al

., 2007; Maldonado

et al

., 2013) quanto

independente (Hardeland, 2009; Espino

et al

., 2010) da ativação de receptores de

melatonina.

A especificidade tecidual na ação dos MTRs pode também depender da

formação de complexos diméricos entre os mesmos. A dimerização ou mesmo

oligomerização de GPCRs tem sido cada vez mais descrita e confere maior

diversidade e complexidade aos mecanismos de regulação e sinalização desses

receptores de membrana (Tadagaki

et al

., 2012). O desenvolvimento de técnicas como

a de transferência de energia bioluminescente por ressonância – BRET (do inglês

bioluminescence resonance energy transfer

) permitiu uma melhor compreensão a

respeito das interações dos GPCRs entre si, bem como das interações destes com seus

acopladores intracelulares, possibilitando a detecção de alterações nas propriedades

farmacológicas e nas sinalizações intracelulares dependendo da conformação em que

determinado receptor se encontra (Jockers

et al

., 2008).

Com relação aos receptores de melatonina, foi demonstrado em células de

linhagem derivadas de rim de embrião humano (HEK293), expressando quantidades

fisiológicas de MT

e MT

recombinantes, que estes receptores formam

que a propensão para formação de homodímeros de MT

é de 3 a 4 vezes menor

(Ayoub

et al

., 2004). Mais recentemente, a relevância fisiológica da formação do

heterodímero MT

/MT

foi comprovada em células fotorreceptoras da retina (Baba

et

al

., 2013). A melatonina aumenta a fotossensibilidade destas células e este efeito é

mediado pela ativação do heterodímero MT

/MT

, que induz cascata de sinalização

específica a este complexo, via enzimas PLC e PKC. Por fim, a heterodimerização

pode ainda modular a funcionalidade dos receptores. Foi demonstrado em células

HEK293 que a interação de MT

com o receptor órfão GPR50 inibe completamente a

ligação de alta afinidade dos agonistas a MT

, bem como a formação do complexo

heterotrimérico entre MT

e as subunidades da proteína G, e também sua ligação à

β-arrestina (Levoye

et al

., 2006).

A melatonina também pode atuar diretamente sobre alvos intracelulares e

nucleares (Finocchiaro & Glikin, 1998). Por ser uma molécula anfifílica, a melatonina

atravessa facilmente as membranas celulares (Shida

et al

., 1994). Dentre as moléculas

intracelulares às quais a melatonina se liga estão a calmodulina (Benítez-King

et al

.,

1991), uma proteína reguladora de diversas enzimas quinases; e os receptores

nucleares da família do ácido retinoico (RORα1, RORα2, RZRα, RZRβ), embora

ainda existam dúvidas se o efeito da melatonina sobre esses receptores é direto ou

indireto (revisto por Hardeland, 2009). A interação da melatonina com a calmodulina

inibe a formação do complexo cálcio-calmodulina resultando em inibição da

atividade de enzimas dependentes desse complexo, como a adenilil ciclase (de

Almeida-Paula

et al

., 2005) e enzimas quinases (Benítez-King & Antón-Tay, 1993).

Embora esta seja uma interação de baixa afinidade, esta via de sinalização da

melatonina está envolvida, por exemplo, nos efeitos da melatonina sobre o

nicotínicos (de Almeida-Paula

et al

., 2005), e sobre a sinalização dos receptores de

estrógeno em células tumorais (Mediavilla

et al

., 2010).

2.

Interações entre o sistema melatonérgico e o sistema imunológico: o

eixo imune-pineal

Desde os primeiros estudos a respeito da função pineal ficou evidenciada a

existência de uma relação entre essa glândula e o sistema imunológico. Foi

observado que a retirada cirúrgica da glândula pineal gerava alterações em órgãos

relevantes ao sistema imune, como o timo e a glândula adrenal (Vaughan & Reiter,

1971; Csaba & Baráth, 1975). Estudos posteriores confirmaram o papel modulatório

do hormônio da pineal sobre os componentes do sistema imunológico, conforme

mencionado anteriormente. Entretanto, a detecção da via inversa, ou seja, de uma

modulação exercida pelo sistema imune sobre a glândula pineal, é mais recente.

Estudos do nosso grupo da década de noventa demonstraram que o tamanho

da pata de camundongo infectada cronicamente com BCG (Bacilo Calmette-Guerin)

varia ao longo das 24 horas, sendo menor durante a fase de escuro (Lopes

et al

.,

1997). Este ritmo é imposto pela melatonina, sendo abolido com a retirada da

glândula pineal. A retirada da glândula adrenal também abole o ritmo da espessura

da pata e reduz a concentração plasmática de melatonina (Lopes

et al

., 2001). Tais

resultados sugeriram, portanto, a existência de uma modulação da atividade da

pineal pela glândula adrenal. De fato, estudos posteriores confirmaram que o

hormônio da adrenal de roedores, a corticosterona, é capaz de potenciar a síntese de

melatonina pela glândula pineal, tanto em condições

in vitro

quanto

in vivo

(Ferreira

em resposta a uma condição de estresse moderado também resulta em potenciação

da síntese de melatonina (Couto-Moraes

et al

., 2009).

Como a corticosterona exerce papel anti-inflamatório na resposta imune,

questionou-se em seguida se agentes pró-inflamatórios também seriam capazes de

modular a atividade da pineal e se teriam efeito oposto ao observado com a

corticosterona. Ensaios

in vitro

demonstraram que a citocina pró-inflamatória TNF

(

tumor necrosis factor

) inibe a expressão gênica da enzima AA-NAT e,

consequentemente, a síntese de melatonina (Fernandes

et al

., 2006). O mesmo efeito

inibitório sobre a síntese de melatonina foi observado em pineais incubadas na

presença do agente patogênico LPS, um lipopolissacarídeo de membrana de

bactérias gram-negativas, e também em condição in vivo, na qual a concentração

plasmática noturna de melatonina foi significativamente reduzida em ratos injetados

com LPS (da Silveira Cruz-Machado

et al.

, 2010; Tamura

et al

., 2010). O efeito

inibitório de TNF foi corroborado em estudos

in vivo

, analisando respostas

inflamatórias em humanos. Mulheres que desenvolvem mastite, um processo

inflamatório não infeccioso causado pela sucção durante a amamentação,

apresentam altos níveis circulantes de TNF e ausência de ritmo diário de melatonina,

sendo este restaurado somente quando os níveis da citocina diminuem (Pontes

et al

.,

2006, 2007). Similarmente, mulheres submetidas a procedimento cirúrgico de retirada

do útero (histerectomia) apresentam drástica redução nos níveis plasmáticos

noturnos de melatonina no dia da cirurgia e, mesmo quando estes retornam aos

valores basais, observa-se que os níveis desse hormônio são menores nas pacientes

que apresentam altos níveis de TNF (de Oliveira Tatsch-Dias

et al

., 2013). Dessa

forma, substâncias anti e pró-inflamatórias (corticosterona e TNF, respectivamente)

glândula pineal. A existência de uma retroalimentação do sistema imunológico sobre

a glândula pineal foi inicialmente hipotetizada como um mecanismo relevante à

manutenção da homeostase, visto a importância do papel da melatonina sobre os

componentes imunológicos (Skwarlo-Sonta, 1996; Skwarlo-Sonta

et al

., 2003; Tsai

et

al

., 2001).

A continuidade dos estudos por nosso grupo possibilitou uma melhor

caracterização do papel da melatonina e da glândula pineal durante uma resposta

imune. Um dos efeitos imunomodulatórios da melatonina em concentrações

fisiológicas é o de inibir o rolamento e a adesão de leucócitos sobre a camada

endotelial dos vasos, limitando a migração celular da circulação sanguínea para os

tecidos (Lotufo

et al

., 2001, 2006). Entretanto, na vigência de uma resposta imune, tais

etapas são necessárias para que as células imunocompetentes circulantes alcancem o

local afetado. Analisados em conjunto, esses dados indicam que no início da

montagem de uma resposta imune inata, os altos níveis de TNF produzidos inibem a

síntese de melatonina pela pineal. Essa inibição transiente condiz com uma ativação

apropriada do sistema imunológico, permitindo que as células imunocompetentes

migrem para o tecido. Concomitantemente, essas mesmas células passam a produzir

melatonina em altas concentrações no local da resposta, o que auxilia na proliferação,

atividade fagocitária e apresentação de antígenos por essas células (conforme

mencionado no item 1.2). Já na fase anti-inflamatória da resposta, a síntese de

melatonina pela pineal é restaurada. Isso ocorre tanto pela diminuição na

concentração dos fatores inibitórios (como o TNF, por exemplo), quanto pelo

aumento da corticosterona circulante, que potencia a atividade endócrina da pineal.

Portanto, além do controle da síntese de melatonina pelo oscilador circadiano central

pode ter sua atividade biossintética modulada em determinadas situações de injúria,

independentemente do ciclo claro/escuro ambiental. Essas interações entre o sistema

imunológico e a glândula pineal formam as bases do conceito do

Eixo Imune-Pineal

(fig. 4) (Markus

et al

., 2007, 2013; Markus & Ferreira, 2011).

Hoje sabemos que a glândula pineal é de fato instrumentada para responder

a moléculas ativadoras da resposta imune e relacionadas ao reconhecimento de

padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) ou de substâncias endógenas

associadas a dano (DAMPs). Pinealócitos expressam receptores que reconhecem

citocinas, como o receptor de TNF (TNFR) (Carvalho-Sousa

et al

., 2011), e receptores

da família

toll

(TLRs, do inglês

toll-like receptors

), como o TLR4 (da Silveira

Cruz-Machado

et al

., 2010, 2012). Os TLRs são receptores especializados no

reconhecimento de PAMPs, como polissacarídeos de bactérias e RNA viral, e

também de algumas substâncias endógenas (DAMPs) como as

heat shock proteins

,

ácidos graxos, lipoproteínas, ácidos nucléicos, glicosaminoglicanos, ATP, dentre

outros, que sinalizam a ocorrência de dano celular ou tecidual (revisto por Bianchi,

2007).

Em resumo, a obtenção de tais dados estabeleceu o conceito de que a síntese

de melatonina pela glândula pineal depende não só do fator ambiental, mas também

da condição fisiopatológica do organismo.

2.1 Fator de transcrição NFKB

O mecanismo de ação de TNF, LPS e corticosterona na modulação da síntese

de melatonina pela pineal, descrito anteriormente, envolve o fator de transcrição

NF-κB (do inglês,

nuclear fator kappa B

). A indução da translocação nuclear das

que sua inibição por corticosterona gera uma potenciação na produção hormonal

pela pineal (Ferreira

et al.

, 2005; Fernandes

et al

., 2006; da Silveira Cruz-Machado

et

al.

, 2010; Carvalho-Sousa

et al

., 2011).

O NF-κB foi descrito primeiramente como fator de transcrição regulador do

gene que transcreve a cadeia leve

κ de imunoglobulinas em linfócitos B (Sen &

Baltimore, 1986), mas atualmente sabe-se que está presente nos mais diversos tipos

celulares. Em mamíferos, a família NF-κB engloba 5 proteínas distintas que têm em

comum o domínio de homologia REL e que atuam sob a forma de homo- ou

heterodímeros. As subunidades de NF-κB são: RelA (ou p65), Rel B, c-Rel, p50 e p52,

sendo que p50 e p52 provém do processamento proteassomal de precursores maiores

- p105 e p100, respectivamente (Ghosh

et al

., 1998). As subunidades RelA, c-Rel e Rel

B são tidas como ativadoras da transcrição gênica, pois apresentam um domínio de

transativação (TAD), enquanto que as demais são tidas como repressoras da

transcrição de seus genes alvos quando na forma de homodímeros (Hayden &

Ghosh, 2008, 2012). De modo geral, a via do NF-κB é classicamente ativada por

estímulos imunogênicos, como bactérias e vírus, ou moléculas sinalizadoras como

citocinas, sinais apoptóticos, fatores de crescimento, dentre outros (Traenckner

et al.

,

1995; Baeuerle & Baltimore, 1996). Quando a via não está ativada, as subunidades do

NF-κB encontram-se no citoplasma, ligadas à proteínas inibitórias da família IκB.

Frente a um desses estímulos citados, um complexo específico de enzimas quinases

(IKK) é ativado, fosforilando a IκB, que é então ubiquitinada e sinalizada para

degradação por proteassomas. Com isso, os dímeros de NF-κB livres migram para o

núcleo e ligam-se às sequências promotoras responsivas a este fator nos diversos

oscilatório ao longo do tempo, sendo caracterizada como uma resposta de ativação

rápida mas que pode reverberar e apresentar fases tardias (Nelson

et al

., 2004).

Este fator de transcrição compreende uma via central dentro do contexto do

eixo imune-pineal, mediando a alteração entre as diferentes fontes de produção de

melatonina durante uma resposta imune inata (Markus

et al

., 2013). Estudos

in silica

(Markus

et al

., 2007) e de ensaios de gene-repórter (Muxel

et al

., 2012) demonstraram

a presença e a funcionalidade de elementos responsivos ao NF-κB na região

promotora e no primeiro intron do gene

Aanat

, enzima-chave na síntese de

melatonina. Conforme mencionado anteriormente, a ativação da via NF-κB na

glândula pineal resulta em inibição da síntese de melatonina. Por outro lado, a

ativação de outras subunidades de NF-κB nas células imunocompetentes tem efeito

oposto sobre este mesmo gene, acarretando em indução da expressão de

Aanat

e,

consequentemente, da síntese de melatonina por estas células (Muxel

et al

., 2012).

Dessa forma, a via NF-κB é diretamente responsável pela alternância entre a

produção pineal e extra-pineal de melatonina na presença de um mesmo estímulo

A via do NF-κB é uma via clássica na mediação da resposta imune inata,

sendo que seus principais genes-alvos são aqueles que codificam proteínas

relacionadas a respostas inflamatórias, como os de citocinas (TNF, IL-2, IL-6) e seus

respectivos receptores, moléculas de adesão (VCAM, ICAM), além de enzimas que

também participam da resposta imune inata, como a sintase de óxido nítrico

induzida (iNOS) e a ciclooxigenase 2 (COX-2) (O’Neill & Kaltschmidt, 2007). Além

disso, as próprias proteínas IκBs são reguladas positivamente pelo NF-κB,

constituindo um mecanismo de retroalimentação negativa, essencial para finalizar e

limitar a resposta inflamatória (Hayden & Ghosh, 2008).

O crescente estudo desta via de sinalização constatou que diversos tipos

celulares apresentam ativação constitutiva de NF-κB, o que ampliou a gama de

funções dessa família de fatores de transcrição, não mais restringindo-os às células

do sistema imunológico. Essa ativação basal tem função na diferenciação e

maturação de células plasmáticas, macrófagos, linfócitos B e até mesmo em

mecanismos de neuroproteção (Ghosh

et al

., 1998; Kaltschmidt & Kaltschmidt, 2000;

Bhakar

et al

., 2002; O’Neill & Kaltschmidt, 2007). Na própria glândula pineal foi

constatada a ativação constitutiva de homodímeros da subunidade p50 de NF-κB,

exibindo um padrão rítmico de maneira inversa ao de produção de melatonina, o

que sugere um papel fisiológico desta via na atividade da glândula (Cecon

et al

.,

2010). A importância dos processos fisiológicos nos quais o NF-κB participa requer

um controle fino de sua atividade. De fato, qualquer alteração na ativação desta via,

seja para mais ou para menos, pode acarretar em níveis patológicos de NF-κB que

têm sido relacionado com diversas patologias, como doenças neurodegenerativas e

No sistema nervoso central, as respostas neuroinflamatórias são mediadas

pela ativação e proliferação de células gliais, principalmente microglia, e o NF-κB é

um fator central nessas respostas. A ativação do NF-κB em células neuronais

desafiadas com estímulo tóxico tem papel neuroprotetor (Kaltschmidt

et al

., 1999;

2005), ativando vias anti-apoptóticas. Já a ativação de NF-κB em microglia e em

astrócitos está relacionada à produção de citocinas e outros mediadores inflamatórios

que, em última instância, podem ser nocivos às células neuronais (Qin

et al

., 1998).

A maioria das patologias neurodegenerativas envolve um componente

inflamatório, claramente evidenciado pela detecção morfológica de microglia ativada

nas análises

post-mortem

de cérebros humanos e de modelos animais (Terai

et al

.,

1996). Embora essas primeiras observações tenham induzido a interpretação de que a

ativação microglial seja uma das causas da morte neuronal em tais patologias, hoje

sabe-se que essas células são essenciais à manutenção do tecido cerebral, removendo

debris celulares e modulando as conexões sinápticas (revisto por Aguzzi, 2013). Por

outro lado, a prolongação da resposta neuroinflamatória e sua não-resolução resulta

em acúmulo de moléculas neurotóxicas, levando então à morte neuronal (Mattson &

Camandola, 2001). Essa resposta neuroinflamatória intermitente, mediada pelo

NF-κB nas células gliais, tem sido considerada um dos fatores causais dos processos

neurodegenerativos em diversas patologias (Glass

et al.

, 2010).

3.

Sistema melatonérgico em condições patológicas – Doença de

Alzheimer

Dentre as doenças neurodegenerativas relacionadas ao envelhecimento, as

mais comuns são: doença de Alzheimer (AD), Parkinson, Huntington e a esclerose

neuronal em áreas cerebrais específicas e depósitos de proteínas em conformações

anormais em neurônios ou no espaço extracelular (revisto por Ross & Poirier, 2004).

A doença de Alzheimer é o tipo de demência mais comumente observado em todo o

mundo, afetando mais de 40 milhões de pessoas atualmente (www.who.int). Por ser

uma patologia relacionada ao envelhecimento, o risco de desenvolver AD chega a ser

de quase 50% para indivíduos acima de 85 anos, sendo que o número de casos

deverá dobrar nos próximos 20 anos, conforme aumenta a expectativa de vida da

população. Embora não haja estudos epidemiológicos no Brasil, sabe-se que a

prevalência de AD é maior nos países em desenvolvimento e isso tende a aumentar

ainda mais nos próximos anos (www.alz.co.uk/research/statistics).

A doença de Alzheimer foi primeiramente descrita em 1906, pelo médico

Alois Alzheimer, que observou a presença de agregados anormais no cérebro de uma

paciente, cuja perda de memória progressiva chamou-lhe a atenção. Apesar de ainda

hoje não existir método diagnóstico precoce desta doença, os principais sintomas

compreendem confusão mental, perda de memória recente e da capacidade de

aprendizado, que avançam progressivamente até a demência. Estes sintomas são

consequência da neurodegeneração massiva em múltiplas áreas encefálicas, como o

hipocampo e amígdala (Choonara

et al

., 2009). As alterações moleculares

características dessa doença e que têm sido relacionadas ao processo de

neurodegeneração compreendem a formação das placas senis, compostas por

agregados do peptídeo beta-amiloide (Aβ, do inglês

amyloid-beta peptide

) de

diferentes tamanhos (39 a 43 aminoácidos), e a formação de novelos neurofibrilares

intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada. Esta é uma proteína

novelos que podem estar relacionados à defasagem sináptica da AD (Cárdenas

et al

.,

2012).

Muitos trabalhos relatam que a concentração noturna de melatonina dosada

no sangue, no líquor ou ainda na urina (pela dosagem do principal metabólito da

melatonina – 6-sulfatoximelatonina) decaem de 20% a 80% com o avançar da idade

(Skene

et al

., 1990; Magri

et al

., 1997; Liu

et al

., 1999). Por outro lado, também existem

autores que defendem que essas alterações não ocorrem em um envelhecimento

saudável (Zeitzer

et al

., 1999; Ackermann & Stehle, 2006). De qualquer forma, há uma

redução ainda maior na produção de melatonina em pacientes com AD comparados

a indivíduos controle de mesma idade (Liu

et al

., 1999). O trabalho de Wu e

colaboradores (2003) relata que essa redução é observada já nos primeiros estágios

da AD, denominados estágios Braak I-II. Esta escala de estagiamento foi

desenvolvida por análise

post-mortem

das alterações moleculares observadas no

cérebro de pacientes com diferentes graus de comprometimento cognitivo, sendo

que os estágio I-II referem-se a indivíduos com as primeiras alterações moleculares

mas sem nenhum sintoma de déficit cognitivo, enquanto que os estágios Braak V-VI

referem-se aos estágios mais avançados da doença (Braak & Braak, 1995). Como o

declínio da produção de melatonina antecede os sintomas da demência, foi ainda

sugerido o uso dessa dosagem hormonal como um marcador biológico primário do

início da doença (Wu & Swaab, 2005). Além da produção de melatonina reduzida,

pacientes de estágios avançados de AD apresentam também considerável redução na

expressão dos receptores de melatonina MT

e MT

em algumas áreas cerebrais,

como no hipocampo e hipotálamo (Savaskan

et al

., 2005; Wu

et al

., 2007).

A administração de melatonina a pacientes de AD tem-se mostrado efetiva

e alterações comportamentais (Brusco

et al

., 2000; Mahlberg

et al

., 2004; Wang &

Wang, 2006; Wu & Swaab, 2007). Em modelos animais da doença, a melatonina

também foi capaz de melhorar parâmetros cognitivos (Feng

et al

., 2004a,b; Cheng

et

al

., 2006; Olcese

et al

., 2009). Entretanto, existem também estudos que não foram bem

sucedidos na demonstração dos efeitos benéficos da melatonina (Serfaty

et al

., 2002;

Singer

et al

., 2003; Dowling

et al

., 2008; Gehrman

et al

., 2009; Cardinali

et al.

, 2010), o

que pode ser devido ao estágio avançado do comprometimento do sistema

melatonérgico nestes pacientes.

Em face do conceito do eixo imune-pineal, no qual este sistema está

intimamente relacionado à processos inflamatórios, levantamos a hipótese de que o

sistema melatonérgico poderia compreender um dos primeiros alvos das alterações

moleculares desencadeadas em AD.

3.1 Peptídeo

β

-amiloide

Uma das hipóteses mais aceitas atualmente quanto à etiologia da AD

considera como fator principal a resposta neuroinflamatória induzida pela produção

exacerbada e má conformação dos peptídeos Aβ (Hardy & Selkoe, 2002; Mucke, 2009;

Glass

et al

., 2010). O peptídeo Aβ origina-se a partir da clivagem da proteína

precursora amiloide (APP, do inglês

amyloid precursor protein

), uma proteína

transmembrânica encontrada preferencialmente nas terminações nervosas. Os

fragmentos de

β-amiloide compostos de 40 a 42 aminoácidos (Aβ

e Aβ

,

respectivamente) são os produtos predominantemente formados no cérebro pelo

processamento proteolítico da APP por um complexo de enzimas secretases (α,

β e

γ). Estes fragmentos diferem entre si não só quanto ao comprimento como também