Detecção Bacteriana e de Genes de Resistência a
Antimicrobianos pela Técnica de PCR em Tempo Real em
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes Submetidos
a Transplante de Órgãos Sólidos
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Detecção Bacteriana e de Genes de Resistência a
Antimicrobianos pela Técnica de PCR em Tempo Real em
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes Submetidos
a Transplante de Órgãos Sólidos
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Processo nº 2008/04761-8
São Paulo
2011
ROCCHETTI, Talita Trevizani
Detecção bacteriana e de genes de resistência a antimicrobianos pela técnica de PCR em Tempo Real em infecções de corrente sanguínea de pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos – Talita Trevizani Rocchetti - São
Paulo, 2011. xx, 156 p.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Real-time Polymerase Chain Reaction for Detection of
Bacterial and Antimicrobial Resistance Genes in Blood Cultures of Solid Organ Transplanted Patients.
1. Diagnóstico molecular; 2. Bacteremia; 3.PCR em Tempo Real; 4. Transplante de órgãos; 5. Genes de resistência.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
CHEFE DO DEPARTAMENTO: Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO: Prof. Dr. Ricardo Sobieh Diaz
São Paulo
2011
iv
TALITA TREVIZANI ROCCHETTI
Detecção Bacteriana e de Genes de Resistência a
Antimicrobianos pela Técnica de PCR em Tempo Real em
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes
Submetidos a Transplante de Órgãos Sólidos
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Prof. Dr Luis Fernando Aranha Camargo Titular: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino Titular: Prof. Dr Eliezer Silva
v
Não se deve ir atrás de objetivos fáceis.
É preciso buscar o que só pode ser alcançado
por meio dos maiores esforços.”
vi
Dedico este trabalho
ao meu amado pai Vanderlei (in memoriun),
a minha amada mãe, Maria Regina e
aos meus amados irmãos Thiago e Taisa...
Vocês são além da minha razão de vida,
minha inspiração profissional!!
vii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por todo crescimento profissional que tive, pelas oportunidades de aprendizado, os ensinamentos e pela grande orientação. Tenho no senhor uma imensa adimiração e inspiração profissional.
À Liana Carbalo Menezes, por todos os ensinamentos, paciência e carinho que recebi. Se eu aprendi um pouco do que você sabe de Biologia Molecular, saio vitoriosa dessa primeira etapa no LEMC.
À Profª Dra. Ana Cristina Gales, pelos constantes ensinamentos, pelo
exemplo de caráter e profissionalismo.
Ao André Doi, por toda orientação, atenção, ajuda e amizade ao longo da elaboração deste trabalho.
À equipe do Laboratório Central, Dra. Antonia, Eliete, Thomas, Flavia,
Fernando, Clarice, por todo aprendizado, paciência e dedicação na coleta e
separação das amostras deste projeto.
Ao grupo de Transplantes do Hospital São Paulo e Hospital do Rim, em especial ao Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo e ao Dr. Moacyr Silva Jr, por todo apoio e colaboração quanto ao rumo e perfil que este trabalho deveria tomar.
A equipe do SCIH do Hospital do Rim, principalmente à Dra Lucy Corrêa, por toda ajuda e por me abrir as portas para acessar ao programa TASY onde pude selecionar meu material de estudo.
Aos meninos do SAME do Hospital do Rim, por toda dedicação e ajuda na coleta dos prontuários.
À Jussimara Monteiro, que proporcionou meu primeiro contato e meus primeiros aprendizados dentro da Biologia Molecular. Você faz parte da inspiração que tenho profissional.
Ao Paulo Bispo, um grande amigo que fiz e que me ensinou com todo seu conhecimento, agradeço por toda confiança depositada em mim.
À Eloiza Helena Campana, minha amiga, vizinha, companheira de laboratório e de baladas. Você me apoiou em cada momento que tive ao longo dessa minha
viii
jornada no mestrado. Conhecê-la foi uma das melhores coisas que me aconteceu desde meu regresso a São Paulo.
À Karen Bauab, amiga querida, que tive prazer em conhecer. Deu-me todo apoio que precisei, nos meus experimentos, na viajem ao Rio de Janeiro, com conversas, você é uma grande amiga e companheira de laboratório.
Luiz Roberto Chirotto Filho, meu primeiro amigo do laboratório e que faço
questão de preservar. Fico feliz de podermos nos ajudar em nossos projetos e de podermos manter essa nossa amizade. Você terá sempre meu apoio.
À Renata Picão, por todo ensinamento e ajuda valiosa que me proporcionou. Tenho grande admiração por você e tive o prazer de ter convivio fora do laboratório. Ao Danilo Elias, por toda amizade, momentos de conversa e descontração que tive ao seu lado, fico triste de você não estar aqui para prestigiar esse momento comigo.
Às amigas Cynthea, Paula Peraro, Adryella, Thaís, Jéssica por toda conversa e apoio que tive de vocês. Aos meus grandes amigos e colegas do LEMC/ALERTA, Adriana Nicoletti, Lorena, Milene, Ana Carolina, Fernanda Inoue,
Raquel Girardello, Thiago, Rodrigo Cayô, Anderson, Loren, Kelly, Martha, Zonta, Fernanda Marques, Vinicius, Thomas, Cecília Cergole, Cecília Godoy, Paula Ignez, Paula Koga, Alinne, Katia, Mirian e Amilton e aos que recentemente
entraram para o nosso grupo, pelo convívio agradável e carinho demonstrado durante a realização deste trabalho.
À Rosana Capecce, pela dedicação e valioso apoio em todos os momentos.
Ao Charles, por toda colaboração eu tive ao longo do meu mestrado.
Aos professores da DIPA por todo aprendizado.
Á minha prima Gabriela, e aos meus amigos Ademar e Monica, por acreditarem em mim quando eu havia desacreditado.
A Rosalina, por todo companheirismo, carinho e apoio, durante toda essa etapa da minha vida.
À minha família, Vanderlei, Maria Regina, Thiago e Taisa, obrigada por sempre estarem ao meu lado.
A todos que participaram diretamente ou indiretamente do meu trabalho, o meu muito obrigada!
ix SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 13
ÍNDICE DE TABELAS ... 16 ÍNDICE DE FIGURAS ... 19 RESUMO... 21 1. INTRODUÇÃO ... 22 2. OBJETIVOS ... 24 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 25
3.1. Transplante de Órgão Sólido ... 25
3.1.1. Transplante no Brasil ... 25
3.1.2. Epidemiologia em Transplantados ... 26
3.2. Infecões de Corrente Sanguínea ... 28
3.2.1. Infecção de Corrente Sanguínea em Transplantados de Órgãos Sólidos ... 29
3.3. Genes de Resistência a Antimicrobianos ... 32
3.3.1. Gene mecA ... 32
3.3.2. Genes vanA e vanB ... 33
3.3.3. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs) ... 36
3.3.5. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) ... 41
3.3.4. Metalo--Lactamases ... 43
3.4. Sistemas Automatizados no Processamento de Hemoculturas ... 47
3.5. Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico ... 50
3.5.1. Reação de Polimerização em Cadeia - PCR, PCR Multiplex e PCR em Tempo Real ... 50
x
4 - MATERIAIS E MÉTODOS ... 54
4.1. Casuística ... 54
4.1.1. Variáveis Clínicas ... 54
4.2. Coleta das Hemoculturas de Acesso Periférico ... 57
4.2.1. Coleta das Hemoculturas de Acesso Central – Cateteres ... 57
4.3. Processamentos das Amostras pelo Método Fenotípico ... 57
4.3.1. Determinação da positividade e negatividade das hemoculturas pelo aparelho Bactec® ... 57
4.3.2. Resultado Parcial da Hemocultura Positiva pela Coloração de Gram ... 58
4.3.3. Resultado Final da Hemocultura pelo Sistema Automatizado Phoenix® ... 58
4.4. Pdronização da PCR em Tempo Real ... 59
4.4.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ... 62
4.4.2. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff” ... 65
4.4.3. Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) ... 66
4.5. Aplicação nas Amostras de Hemocultura ... 67
4.5.1. Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura ... 68
4.5.2. Aplicação da PCR em Tempo Real para o Gene HFE de Controle Interno de Extração ... 69
4.5.3. Detecção do DNA Bacteriano PCR em Tempo Real pelo Sistema TaqMan ... 69
4.5.4. Detecção dos Genes que Conferem Resistências aos Antimicrobianos por PCR em Tempo Real pelo Sistema SYBR Green .... 70
4.6. Testes Direto do Isolado Bacteriano Referente à Hemocultura ... 71
4.6.1. Teste de Triagem com Disco-Difusão para Ertapenem ... 72
4.6.2. Teste de Hidrólise para Detecção de Metalo-β-Lactamases ... 73
4.6.3. Detecção Fenotípica de ESβL ... 74
4.6.4. Determinação da Suscetibilidade a Vancomicina ... 75
4.6.5. Determinação da Suscetibilidade a Oxacilina ... 76
4.6.6. PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano ... 76
xi
5. RESULTADOS ... 79
5.1. Amostras de Hemoculturas Incluídas no Estudo ... 79
5.2. Validação Analítica da PCR em Tempo Real ... 79
5.2.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ... 80
5.2.2. Padronização da PCR em Tempo Real Sistema TaqMan para o Gene Bacteriano 16S rDNA ... 82
5.2.3. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff” ... 84
5.2.4. Determinação do Limite de Detecção – LoD ... 84
5.2.5. Determinação da Curva ROC para as Reações dos Genes de Resistência a Antimicrobianos e para a Reação Multiplex Gram-positivo e Gram-negativo por PCR em Tempo Real ... 86
Na Figura 4 encontram-se as curvas Roc dos genes estudados. ... 86
5.3. Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de Hemocultura ... 89
5.3.1. Detecção do Gene HFE de Controle Interno da Extração ... 89
5.3.2. Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA ... 89
5.3.3. Detecção PCR dos Genes que Conferem Resistência aos Antimicrobianos em Bactérias Gram Negativas ... 93
5.3.4. Detecção PCR dos Genes que Conferem Resistência aos Antimicrobianos em Bactérias Gram Positivas ... 96
5.4. Testes Direto do Isolado Bacteriano ... 99
5.4.1. Confirmação de Susceptibilidade a Oxacilina e Gene de Resistência mecA pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ... 99
5.4.2. Confirmação da Produção de Carbapenemase e Gene de Resistência blaKPC pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ... 100
5.4.3. Confirmação da Produção de Metalo-β-Lactamases e Genes de Resistência blaIMP, blaVIM e blaSPM pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ... 101
5.4.4. Confirmação da Produção de ESβL e Genes de Resistência blaSHV, blaTEM e blaCTX-M pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ... 102
xii
5.5. Variáveis Clínicas, Análise e Comparação do Tempo de Liberação dos Resultados pelo Método Fenotipico e Tratamentos antes e Após os Resultados
em Relação ao Resultado Obtido pela PCR em Tempo Real ... 105
5.5.1. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Positivos ... 106
5.5.2. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Negativos ... 109
6. DISCUSSÃO ... 113
7. CONCLUSÕES ... 127
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 128
9. ABSTRACT ... 149
10. ANEXOS ... 151
ANEXO 1. Dados referentes aos 117 pacientes e 185 hemoculturas incluídas no estudo... 151
ANEXO 2. Drogas Testadas para os respectivos Painéis do Sistema automatizado Phoenix. ... 154
xiii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTO – Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos AIM – Australian Imipenemase
ATCC - American Type Cuture Collection
CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC – Center for Disease Control
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute Ct – Ciclo threshold
CTX-M – Cefotaximase
CVC – Cateter Venoso Central DD – Disco Difusão
DM – Diabete Mellitus
DNA – Ácido Desoxirribonucleico DIM – Dutch Imipenemase
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético ESL - Extended Spectrum -Lactamase
EUA – Estados Unidos da América GIM – German Imipenemase HAS – Hipertensão Arterial HFE – Hemocromatose
ICS – Infecção de Corrente Sanguínea IMP – Imipenemase
IS - Insertion Sequence
xiv
KHM – Kyorin Health Science metallo-β-lactamase KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LB - Luria Bertani
LED – Diodos emissores de luz
LEMC – Laboratório Especial de Microbiologia Clínica ML – Metallo--Lactamase
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina NDM – New Delhi metallo-β-lactamase
OMP – Outer Membrane Protein PBP – Penicillin Binding Protein
PBP2a – Proteína Ligadora de Penicilina Adicional PCR – Polymerase Chain ReaCtion
PFGE – Pulsed Field Gel EleCtrophoresis
SCOPE – Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance SCoN – Staphylococcus coagulase negativo
SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel EleCtrophoresis SIM – Seul Imipenemase
SNT – Sistema Nacional de Transplantes SPM – São Paulo metallo-β-lactamase SUS – Sistema Único de Saúde
TBE – Tris-Borato-EDTA TSB – Tryptone Soy Broth TM – Temperatura de Melting TMB – Tripoli metallo-β-lactamase UFC – Unidade formadora de colônia
xv
UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo UTI – Unidade de Terapia Intensiva
UV – Ultravioleta
VIM – Verona Imipenemase
VRE – Enterococcus Resistente a Vancomicina
xvi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Lista de iniciadores de amplificação da região codificadora dos genes estudados...
60 Tabela 2. Relação dos microrganismos testados para validação das
reações de PCR em Tempo Real... 64
Tabela 3. Resultados dos controles dos genes de resistência e os Tm dos produtos amplificados... 80
Tabela 4. Desvio Padrão e media do Tm, Eficiência da reação de PCR,
Ct e Tm da ultima diluição... 82
Tabela 5. Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo Real utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram especificas... 83
Tabela 6. Resultados de cutoff e LoD para cada gene especifico dos microrganismos avaliados...
85 Tabela 7. Sensibilidade, especificidade e Ct delimitado pela curva ROC para os genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo... 88
Tabela 8. Sensibilidade, especificidade pela curva ROC de acordo com o LoD para os genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo... 88
xvii
Talela 9. Resultado da PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan para o gene 16S rDNA nas 126 hemoculturas positivas pelo Bactec®... 91
Talela 10. Resultado da PCR em tempo real sistema SYBR Green para os genes de resistência em Gram negativos e resultado do sistema Phoenix®... 95
Talela 11. Resultado da PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para os genes de resistência de Gram positivos e resultado do Phoenix®... 97
Tabela 12. Resultado do Etest para Oxacilina e PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para o gene de resistência mecA direto da colônia e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura... 99
Tabela 13. Resultado do método de disco difusão e PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para o gene de resistência blaKPC direto da
colônia e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura... 101
Tabela 14. Resultado do teste de hidrólise e PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para os genes de resistência blaSPM, blaVIM e blaIMP
direto da colônia e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura... 102
Tabela 15. Resultado do disco aproximação para ESβL e PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os genes de resistência
blaSHV, blaCTX-M e blaTEM direto da colônia e comparação com a PCR
xviii
Tabela 16. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da PCR em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do tratamento recebido pelos pacientes... 107
Tabela 17. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da PCR em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do tratamento recebido pelos pacientes... 110
xix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações cruzadas nas cadeias peptídicas... 34
Figura 2. A - Amplificação do DNA de Gram positivo (curva em amarelo) e Gram negativo (curva em vermelho); B- Sonda Gram Positivo (GP) e Sonda Gram Negativo (GN)... 62
Figura 3. Fluxograma do processamento das amostras... 67
Figura 4. Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos e sondas Gram Positivo e Sonda Gram Negativo: A – Gram Positivo; B- Gram Negativo; C - blaTEM; D - vanA; E - vanB; F - blaCTX; G - blaSHV; H - mecA; I - blaKPC... 87
Figura 5. Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema automatizado Phoenix®... 92
Figura 6. Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema automatizado Phoenix®... 93
Figura 7. Total de amostras positivas pela metodologia da PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os respectivos genes de resistência estudados... 98
xx
Figura 8. Número e porcentagem de pacientes referentes a hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram positivas, recebendo tratamento inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura... 108
Figura 9. Número e porcentagem de pacientes referentes a hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram negativas não fermentador, recebendo tratamento inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura... 111
Figura 10. Número e porcentagem de pacientes referentes a hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram negativas enterobacteriaceas, recebendo tratamento inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura... 112
21 RESUMO
Pacientes transplantados de órgãos sólidos apresentam alto risco para infecção da corrente sanguínea. A instituição da terapia antimicrobiana apropriada guiada por um diagnóstico rápido e preciso das infecções da corrente sangüínea está relacionada a um resultado satisfatório. O objetivo deste estudo foi a detecção de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas em hemocultura automatizada (Bactec®, Becton Dickinson), com a utilização do multiplex para reação da polimerase em cadeia (PCR) em Tempo Real e detecção de genes de resistência. Métodos: Um total de 185 hemoculturas, 126 positivas e 59 negativas, foram obtidos de 117 pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos, dois centros de transplante na cidade de São Paulo, Brasil, Hospital São Paulo e Hospital do Rim e Hipertensão. DNA das culturas de sangue foi extraído pelo método fenol clorofórmio (Brazol®, LGC, Brasil). A detecção do DNA bacteriano foi realizada utilizando iniciadores universais do gene 16S rRNA. A diferenciação entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi feito por hibridização com sondas específicas por multiplex TaqMan em Tempo Real. Os genes de resistência: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB e mecA foram detectadas utilizando iniciadores específicos, em Tempo Real sitema SYBR Green. A adequação do tratamento antimicrobiano foi avaliada pela revisão do prontuário dos pacientes. Resultados: Cinqüenta e nove amostras foram positivas para bactérias Gram-positivas e sessenta e sete amostras foram positivas para bactérias Gram-negativas. Todas as amostras (100%) foram concordantes entre hemocultura e PCR. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene mecA, cinco para o gene blaCTX-M, uma para o gene blaKPC, uma para o gene blaSHV e uma para blaTEM. Oitenta e oito foram negativas para todos os genes. A detecção de genes de resistência a antimicrobianos favoreceria a adequação da antibioticoterapia, particularmente no descalonamento no tratamento de bacteremias causadas por bactérias Gram positivas e na adequação precoce no tratamento de bacteremias por bacilos Gram negativas multiresistentes em pacienetes tranplantados de órgãos sólidos. Conclusão: A PCR multiplex “in house” para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos por PCR em Tempo Real poderia ser útil para o diagnóstico rápido da infecção da corrente sangüínea em pacientes submetidos a transplante de órgão sólidos.
22 1. INTRODUÇÃO
A introdução de técnicas moleculares na medicina diagnóstica e sua aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas estabelecem uma nova era na detecção e caracterização de microrganismos na rotina de processamento de amostras clínicas.
A presença de bacteremia agrava o quadro clínico do paciente e quando se trata de pacientes transplantados há a necessidade do diagnóstico precoce e rápido de Infecções de Corrente Sanguínea (ICS), uma vez que a taxa de mortalidade relacionada a esta infecção nesta população é alta, principalmente quando ocorre o agravamento do quadro clínico como o choque séptico (Ferraresso & Berardineli, 2005).
Normalmente, as hemoculturas levam em média 24 a 36 h após a coleta para positivar. A terapia antimicrobiana pode ser otimizada com base na identificação presuntiva do agente bacteriano. Porém a completa identificação do microrganismo e perfil de susceptibilidade normalmente não está disponível antes de 24 a 72h. O uso da PCR tem sido sugerido em diagnóstico molecular, pois além de ser uma técnica sensível também diminui o tempo de liberação dos resultados quando comparado com o método fenotípico (Valones et al., 2009).
A PCR convencional em pesquisa já é usada habitualmente e seu uso no diagnóstico clínico cresce a cada dia. Porém no diagnóstico clínico a sensibilidade e a rapidez na liberação dos resultados podem ser otimizados pela técnica da PCR em Tempo Real, já que a amplificação e leitura são feitos simultanemente.
23 Em um recente trabalho, realizado por Lehmann e colaboradores (2010), foi elaborado um método de detecção bacteriana, usando o gene 16s rDNA diretamente da hemocultura. Os resultados apontaram que a técnica da PCR foi duas vezes mais sensível que o método convencional, sugerindo assim a importância e aplicabilidade da PCR nesses casos. Entretando, apesar da disponibilidade de Kits comerciais para detecção de microrganismos e de genes de resistência direto de amostras clínicas, até o momento, nenhum trabalho relata a aplicação da PCR em Tempo Real, e a padronização “in house” para o diagnóstico rápido de ICS em transplantados de órgãos sólidos.
24 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Principal
1. Padronizar a técnica de PCR em Tempo Real para a pesquisa de bactérias e dos principais genes que codificam resistência aos antimicrobianos;
2.2. Objetivos Secundários
1. Aplicar a técnica de PCR em Tempo Real padronizada para a pesquisa de bactérias e dos principais genes que codificam resistência aos antimicrobianos em amostras de frascos de hemocultura coletada de pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos;
2. Correlacionar os resultados obtidos com a detecção molecular de bactérias e de genes de resistência aos antimicrobianos, realizada diretamente da amostras clínica com os resultados de identificação bacteriana e teste de sensibilidade automatizado obtidos com o isolado da respectiva hemocultura;
3. Avaliar o possível impacto dos testes moleculares no tratamento de Infecções de Corrente Sanguínea nos pacientes submetidos a transplantes de órgão sólidos;
25 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Transplante de Órgão Sólido
3.1.1. Transplante no Brasil
O Brasil tem o maior programa público de transplantes de órgãos e tecidos do mundo, sendo o Sistema Único de Saúde (SUS) responsável por 92% dos procedimentos. Este programa é composto por uma rede de 1.376 equipes médicas e 548 unidades credenciadas, porém, 63.866 pacientes aguardam por um órgão no Brasil, de acordo com o Sistema Nacional de Transplantes (SNT) em 2009 (Ministério da Saúde, 2009).
Em 2009, foram notificados 42.783 transplantes no Brasil, sendo 5.998 de órgãos sólidos. Destes, 4.259 foram transplantes de rim, ocupando o primeiro lugar no número de transplantes nacionais, seguido por fígado (1.322), coração (200), pâncreas (158) e pulmão (59) (Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos - ABTO, 2009).
Entre os centros de transplantes no Brasil, encontram-se o Hospital São Paulo/Unifesp (HSP) e o Hospital do Rim e Hipertensão (HRH). No HSP são realizados transplantes de rim, medula óssea, coração, osso, pulmão, córnea e fígado. Sola e colaboradores (2007), em estudo retrospectivo, registraram 81 transplantes de órgãos sólidos no período de janeiro de 2004 a março de 2005. Destes, 35 foram de rim-pâncreas, 17 apenas de rim, 17 de fígado, 20 de coração.
O programa de transplante de rim do HSP teve início em 1976 como uma modalidade de tratamento renal, pela divisão de Nefrologia da
26 Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Na época, menos de 10 transplantes eram realizados. Este número aumentou para 178 em 1998, mesmo ano em que foi inaugurado o HRH filiado a UNIFESP, e em 2004 foram realizados 654 transplantes (Medina-Pestana, 2006), ocupando o primeiro lugar no ranking mundial em transplantes de rim. Hoje o setor de transplantes do Hospital do Rim e Hipertensão é referência em todo país.
O último levantamento de 2009 aponta que foram realizados 352 transplantes de rim, equivalente a 8,3% do total realizado em todo Brasil (Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos, 2009).
3.1.2. Epidemiologia em Transplantados
O transplante de órgãos sólidos representa hoje a melhor terapia substitutiva para pacientes com doença crônica terminal. Apesar de o rim ser o órgão mais transplantado no país, os transplantes de outros órgãos sólidos tem crescido gradativamente nos últimos anos (Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos, 2009).
O transplante renal é uma alternativa terapêutica para pacientes com doenças renais em estágio terminal, oferecendo assim melhor qualidade de vida para aproximadamente 77.589 indivíduos registrados em programas de diálise no Brasil (Sesso, 2010). No país, 6.500 pessoas apresentam doença hepática avançada, risco de morte ou qualidade de vida comprometida e aguardam na fila de transplante de fígado. No estado de São Paulo foram realizados 200 transplantes de coração no ano de 2009. Entretanto, 305 pessoas se encontravam na lista de espera, sendo que aproximadamente 50% não foram atendidos reservando-se o procedimento àqueles indivíduos com
27 alto risco de falecer de doença cardíaca em menos de um ou dois anos (Ministério da Saúde, 2009).
O número de transplantes realizados por doadores falecidos se sobrepõe ao numero realizado por doadores vivos. Este dado pode parecer óbvio, porém há 10 anos, o número de doadores vivos para transplante de rim era maior. Esse aumento se deve a inúmeras campanhas em todo país para com intuito de incentivar a população à doadoção de órgãos (Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos, 2009). O transplante de rim, pâncreas, medula óssea, fígado e pulmão intervivos pode ser realizado somente se não trouxer prejuízo ou representar riscos à saúde do doador (Sistema Nacional de Transplantes, 2011).
Os transplantes de órgãos sólidos apresentam alto risco de rejeição. As rejeições agudas e crônicas são as principais causas de perda de órgãos transplantados. A resposta imune pode ser tanto mediada por células T, sendo a mais importante em rejeição aguda de órgãos transplantados, ou por anticorpos produzidos por linfócitos B, que tem grande contribuição no processo de rejeição (La Rosa et al., 2007).
Os avanços das técnicas cirúrgicas e dos tratamentos com terapia imunossupressora levaram a diminuição nos índices de rejeição aguda, com a sobrevivência dos enxertos após um ano em cerca de 90% dos transplantes. (Danovitch, 2001; Mies, 1998). Os imunossupressores, apesar de reduzir substancialmente as taxas de rejeição, apresentam efeitos colaterais indesejáveis como imunodeficiência e toxicidade em outros órgãos (Halloran, 2004).
28 Apesar da excelente evolução na sobrevida dos pacientes e do enxerto, o transplante de órgão sólido não é isento de complicações. A infecção é a principal complicação no pós-transplante (Fishman & Rubin, 2005), sendo as infecções de corrente sanguinea, uma das mais prevalentes (Nusair et
al.,2008). No primeiro mês pós-transplante, as infecções bacterianas são
responsáveis por 90% das complicações infecciosas, sendo que o risco destas infecções ocorrerem varia com o tempo, principalmente em decorrência da imunossupressão (Fishman, 2007).
3.2. Infecões de Corrente Sanguínea
Infecção de Corrente Sanguínea (ICS) é caracterizada pela presença de bactéiras ou fungos em uma ou mais amostras de hemoculturas associada a um quadro clínico compatível com sepse (Bone et al., 1992).
A microbiota humana normalmente não causa infecção e pode proteger o organismo humano contra outros patógenos por competir pelos nutrientes e locais de ligação nas superfícies celulares (Donnelly & De Paum, 2005). O responsável pelo controle desta microbiota é o sistema imunológico. Quando a imunidade celular e humoral encontra-se intacta, oferece uma proteção contra a maioria dos microrganismos agressores devido a boas condições clínicas, bom estado nutricional e função normal dos órgãos (Donnelly & De Paum, 2005). Entretanto um déficit específico de imunidade aumenta a suscetibilidade a infecções, que seriam erradicadas em um organismo íntegro normalmente pelo mecanismo de defesa (Halloran, 2004).
Como consequência da resposta imune celular deficitária, os pacientes estão mais sujeitos a infecção por patógenos e apresentam também maior
29 gravidade no quadro clínico. Alguns dos fatores que agravam as condições de imunossupressão são a dose e duração da terapia imunossupressora, doenças auto-imunes, deficiências imunológicas funcionais, neutropenia e linfopenia, condições metabólicas como diabetes, desnutrição e infecção por vírus imunomoduladores como citomegalovírus (Fishman & Rubin, 1998; Halloran, 2004).
3.2.1. Infecção de Corrente Sanguínea em Transplantados de Órgãos Sólidos
A incidência de infecção em transplantados é determinada pela interação entre a exposição a agentes infecciosos e a terapia imunossupressora. Esta varia devido a inúmeros fatores, tais como o tipo de órgão transplantado, a quantidade de medicamento imunossupressor usado, a necessidade do uso de terapia adicional contra rejeição e complicações pós-cirurgicas (Patel & Paya, 1997).
ICS é considerada uma das causas mais importantes de mortalidade em pacientes que realizaram transplante de órgãos sólidos (Singh et al, 2000; Rodriguez et al., 2006; Husain et al., 2006). Estima-se que a incidência de bacteremia seja de 28 a 30% em transplante hepático, 5 a 11% em transplante renal e 10% em transplantados cardíacos (McClean et al., 1994; Moreno, et al,, 1994).
Moreno e colaboradores (2007), em um estudo realizado na Espanha, no período de julho de 2003 a abril de 2005, incluíram 3.926 casos de transplantes, sendo que destes, 2.935 eram de órgão sólido e 991 de células hematopoiéticas. Dos 2.935 casos de transplantes, 321 (10%) apresentaram
30 ICS, sendo que 134 foram em transplantados hepáticos, 121 em transplantados de rim, 32 em transplantados cardíacos, 17 em transplantados de pulmão e 17 em transplantados de pâncreas. Com exceção do transplante de rim, Staphylococcus coagulase negativo (SCoN) foi o microrganismo mais isolado seguido de Escherichia coli. Outros patógenos como Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Corynebacterium spp. e Stenotrophomonas maltophilia também
foram identificados mas em menor freqüência. Entre os isolados de S. aureus, 16% eram resistentes a meticilina (MRSA), 14,5% das enterobactérias eram resistentes a cefalosporinas e 10% dos bacilos gram negativos eram multiresistentes.
Um estudo retrospectivo realizado em um hospital terciário da cidade de São Paulo avaliou 81 transplantes de órgãos sólidos realizados no período de janeiro de 2004 a março de 2005. Dos pacientes avaliados, 9% adquiriram ICS. O transplante hepático apresentou a maior taxa de ICS (29%) e nenhum caso foi relatado em transplantados renais. Os agentes infecciosos mais prevalentes foram K. pneumoniae (33,3%), P. aeruginosa (33,3%) e A. baumannii (33,3%). Porém, diferente do estudo de Moreno e colaboradores (2007), não foi encontrado nenhum caso de infecção por bactéria Gram positiva (Sola et al., 2007).
Em um recente estudo, realizado no Brasil, Silva Jr e colaboradores (2010) avaliaram 3.308 tranpslantes realizados no HRH e HSP, entre os anos de 2000 e 2006 e constataram uma incidência de 4,11% de ICS nestes transplantes, sendo E. coli (30,3%) o principal agente isolado nessas infecções.
31 Cinco isolados de E. coli, 8 K.pneumoniae e 8 E. aerogenes foram multiresistêntes aos antimicrobianos. Entre os Gram positivos, 5 SCoN e 6 S.
aureus foram resistentes a meticilina. Nenhum VRE foi relatado.
Alguns trabalhos demonstram um maior número de bactérias Gram negativas isoladas (Candel et al, 2005; Rodriguez et al, 2006) enquanto outros relatam um maior número de bactérias Gram positivas (Berger et al, 2006). Entretanto há concordância entre as principais espécies encontradas e a resistência aos antimicrobianos (Linares et al., 2007).
A ICS representa uma falência do hospedeiro em controlar a infecção de um foco primário. Choque séptico é a complicação mais severa no contexto da bacteremia, aumentando a chance de morte em até 50% (Candel et al, 2005). Michalak e colaboradores (2005) estudaram 102 pacientes transplantados de rim-pâncreas. Bacteremia ocorreu em 13 dos pacientes e destes, 5 (38%) tiveram choque séptico, sendo que, 100% dos pacientes foram a óbito. Dentre os sítios de infecção primária, o catéter venoso central aparece em maior frequência em transplantados de órgão sólido (Rodriguez et al., 2006; Singh et
al., 2000). Outros trabalhos relatam que o órgão doado proveniente de um
doador apresentando infecção ou sendo um doador cadáver, aumenta a possibilidade do paciente receptor apresentar infecção (Battaglia et al., 2004; Dantas et al., 2006).
A presença de bacteremia em pacientes transplantados em vigência de terapia imunossupressora requer atenção dos profissionais da área da saúde, uma vez que é frequente a presença de microrganismos multirresistentes, o que restringe a escolha da terapia antimicrobiana apropriada.
32 3.3. Genes de Resistência a Antimicrobianos
3.3.1. Gene mecA
Os antibióticos betalactâmicos produzem um efeito bactericida pela inibição das enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do peptideoglicano, principal componente da parede celular das bactérias Gram positivas (Giesbrecht et al., 1998).
A resistência apresentada pelos estafilococos aos antibióticos betalactâmicos deve-se principalmente a dois mecanismos distintos, porém não dissociados, pois ambos podem interagir. O primeiro mecanismo desenvolvido pela bactéria é produção da enzima betalactamase que hidrolisa o antibiótico. O segundo mecanismo está associado à alteração do sítio de ação do antibiótico betalactâmico pela produção de uma proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a (também denominada PBP2’), que está ausente nos
Staphylococcus spp. sensíveis à meticilina (Hackbarth et al., 1989).
A codificação desta nova PBP está relacionada à aquisição do gene
mecA por Staphylococcus spp. Este gene faz parte de um elemento genético
móvel encontrado em todos os isolados de S. aureus e Staphylococcus Coagulase Negativo (SCoN) resistentes a meticilina. Katayama e colaboradores, em 2000, demonstraram que o gene mecA faz parte de um elemento genômico designado cassete estafilocócico do cromossomo mec (“staphylococcal cassette chromosome mec” - SCCmec), integrado ao cromossomo de S. aureus .
Atualmente, o gênero Staphylococcus compreende 40 espécies. (Cunha
33 mais virulento e importante, mas a incidência de infecções causadas por SCoN vem aumentando em todo o mundo (Sakai, 2004).
Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY ("SENTRY “Antimicrobial Surveillance Program”) realizado com 3.907 amostras de bactérias Gram positivas coletadas de centros médicos no Brasil, entre o perído de janeiro de 2005 a setembro de 2008, constatou-se que S. aureus foi o microrganismos mais prevalente em infecções de corrente sanguínea seguido por SCoN. Neste mesmo estudo, 31% dos isolados de S. aureus e 80% dos SCoN apresentaram resistência a meticilina (Gales et al., 2009). Em um estudo realizado em pacientes transplantados de órgãos sólidos, esta prevalência também foi observada. Diversos autores relataram alta incidência de infecção de corrente sanguínea por Staphylococcus spp. resistentes a meticilina. (Linares et al., 2009; Bert et al., 2010).
3.3.2. Genes vanA e vanB
Da mesma maneira que os antimicrobianos β-lactâmicos, a classe dos glicopepitideos (vancomicina) agem no metabolismo de construção da parede celular bacteriana, através da ligação da porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano, interferindo na etapa de transpeptidação (Figura 1) (Silveira et al., 2006; Eggert et al., 2001).
34 Figura 1. Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações cruzadas nas cadeias peptídicas (Eggert et al., 2001).
A resistência bacteriana à vancomicina em enterococos ocorre através de uma modificação genética no gene bacteriano, sintetizando, como exemplo, D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac) ao invés do dipeptídeo D-alanina-D-alanina (Ala-Ala) (Silveira et al., 2006). A modificação do aminoácido terminal D-alanina por D-lactato introduz uma interação eletrostática repulsiva no lugar da ligação de hidrogênio. Em conseqüência, a afinidade da vancomicina com a camada de peptidoglicano diminui em uma escala superior a 1000 vezes (MacComas et al., 2003).
A aquisição do mecanismo de resistência a vancomicina é mediada por vários genes (Werner et al., 2008). Embora a origem da sensibilidade de enterococos frente à teicoplanina envolva mecanismos diferentes daquele da vancomicina, essas características de sensibilidade e resistência frente aos dois glicopeptídeos servem como base para uma classificação clínica (Silveira
et al., 2006).
Dos sete fenótipos descritos atualmente (A,B,C,D,E,G,L), os genes vanA e vanB são, de longe, os mais prevalentes no mundo e são descritos
35 principalmente entre as espécies E. faecalis e E. faecium. Cepas de enterococcus com fenótipo vanA apresentam alto grau de resistência a vancomicina e teicoplanina e a resistência pode ser induzida pela presença de glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina, avorpacina, ristocetina) e por agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e polimixina B (Cetinkaya et al., 2000). O fenótipo vanB apresenta altos níveis de resistência a vancomicina enquanto a sensibilidade a teicoplanina é mantida. Ambos os genes podem ser encontrados em plasmídeos ou no cromossomo bacteriano e ser transferidos entre espécies enterocócicas (Cetinkaya et al., 2000).
Uma situação mais preocupante foi o temor de que genes que conferem resistência à vancomicina presentes nos VRE (Enterococcus Resistente a Vancomicina) fossem transmitidos para os MRSA. Isto foi recentemente confirmado em alguns casos isolados (n=7) surgidos na América do Norte, sendo conhecidos como VRSA (S. aureus Resistente a Vancomicina) (Tenove, 2008; Zhu et al., 2008).
Em uma publicação de 2003, Chang e colaboradores reportaram em um isolado de VRSA de uma ponta de cateter, a presença concomitante do gene de resistência mecA e do gene vanA. Tal evidência foi confirmada através da PCR localizado em um plasmídeo de 60 kb e a seqüência de DNA do gene
vanA VRSA foi idêntica à de uma amostra de E. faecalis resistente à
vancomicina isolada a partir da mesma cultura de ponta cateter (Chang et al., 2003).
A consolidação da vancomicina como um antimicrobiano importante frente a bactérias Gram positivas multiresistentes, trouxe um período de certa tranqüilidade para a contenção destes agentes e tratamento nos centros
36 médicos. Entretanto, com o surgimento dos primeiros isolados de enterococos resistentes a vancomicina e a emergência da sua disseminação no ambiente hospitalar, levou a necessidade da busca de novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et al., 2008).
Este fato se agrava quando estes microrganismos são isolados em infecções de corrente sanguínea. Dentre os Gram positivos, as espécies de
Enterococcus spp. aparecem entre os primeiros microrganismos mais isolados
nestas infecções (Cervera et al.,2009; Erdem et al.,2009). No Brasil Gales e colaboradores, em um estudo multicêntrico em 2009, apontaram estes microrganismos como oitavo entre todas as epécies encontradas e terceiro entre os Gram positivos. De todos os isolados de enterococcus, 7,7% eram VRE.
Enterococcos é frequentemente isolado em pacientes transplantados, especialmente em transplantes de rim e fígado (Patel et al., 2001). Nestes pacientes, infecções de corrente sanguínea é uma das mais comuns infecções causadas por VRE. Esta infecção frequentemente é severa e associada a uma bacteremia recorrente e persistente, e maior risco de morte (Nusair et al., 2008; Asensio et al., 2008; Bhavinani et al., 2000; Lodise et al., 2002; Ghanen et al., 2007).
3.3.3. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs)
Os -lactâmicos são os agentes antimicrobianos utilizados com maior frequência para o tratamento de infecções bacterianas. A ampla utilização destes agentes principalmente das cefalosporinas de segunda e terceira gerações, para o tratamento de infecções causadas por enterobactérias, foi
37 acompanhada pelo surgimento e disseminação de cepas bacterianas resistentes produtoras de enzimas do tipo ESβL. A resistência aos -lactâmicos dificulta o tratamento das infecções causadas por estes patógenos, aumentando a morbi-mortalidade dos pacientes acometidos assim como os custos diretos e indiretos relativos às internações (Tumbarello et al. 2006).
ESLs são enzimas capazes de hidrolisar todos os antimicrobianos β-lactâmicos com exceção das cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e dos carbapenenêmicos (imipenem, meropenem) e são inibidas pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam. Pertencem à classe molecular A de Ambler (1980) e estão distribuídas no grupo 2be de Bush e Jacoby (2010). As ESL apresentam um resíduo serina no seu sítio ativo e são codificadas por genes localizados em plasmídeos que podem também codificar resistência aos aminoglicosídeos, tetraciclina, cloranfenicol, quinolonas e trimetoprim/sulfametoxazol (Rossolini et al. 2008d;Winokur et al. 2001).
Outras ESLs tais como PER, VEB, BES, GES, BEL, TLA e SFO, também foram descritas, porém SHV, TEM e CTX-M são as mais prevalentes entre as enterobactérias (Harada et al.,2008).
3.3.3.1. TEM
As ESBLs do tipo TEM são derivadas das beta-lactamases de espectro restrito do tipo TEM-1 e TEM-2. A descrição da primeira β-lactamase desta classe, denominada TEM-1 ocorreu em 1960. Esta enzima foi encontrada em uma amostra clínica de Escherichia coli isolada da corrente sanguínea de uma jovem paciente grega chamada Temoniera, origem da sigla da β-lactamase TEM (Turner 2005). A β-lactamase TEM-2 foi a primeira derivada da TEM-1
38 (Barthelemy et al. 1985). Já a β-lactamase TEM-3, reportada em 1988, foi a primeira a apresentar o fenótipo ESβL (Sougakoff et al. 1988). Atualmente
existem mais de 160 derivados de TEM
(http://www.lahey.org/Studies/temtable.asp) sendo que algumas são resistentes
aos inibidores de β-lactamase e a grande maioria apresenta o fenótipo ESβL (Bradford 2001b). Esta enzima é codificada por genes localizados, usualmente, em elementos genéticos móveis, plasmídeos e transposons, que por meio de uma série de eventos de transposição e rearranjos, migram para diferentes plasmídeos que circulam entre microrganismos da mesma espécie ou de espécies diferentes. Devido à grande facilidade de disseminação, esta enzima tem sido descrita em diversas espécies de Enterobactérias, e em outras espécies bacterianas (Paterson and Bonomo 2005). Embora essas β-lactamases sejam mais frequentemente relatadas em E. coli, Klebsiella spp.,
EnterobaCter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, e Salmonella spp. (Bonnet et al. 1999;Marchandin et al. 1999;Morosini et al. 1995;Palzkill et al. 1995;Perilli et al. 2000;Tessier et al. 1998), têm sido,
também, reportadas entre bactérias Gram negativas não Enterobacteriaceae.
3.3.3.2. SHV
A denominação da sigla SHV vem de uma propriedade bioquímica da enzima variável sulfidrila (“sulphydryl variable”) (Tzouvelekis and Bonomo 1999a). O fenótipo ESβL é caracterizado a partir de substituições de aminoácidos que ocorrem no gene blaSHV-1, e estas alterações assemelham-se
39 Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro ampliado, denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K.
pneumoniae, K. ozaenae e Serratia marcescens (Knothe et al. 1983). Em 1988,
SHV-3 e SHV-4 foram descritas por Jarlier e colaboradores (Jarlier et al. 1988) e Buré e colaboradores (Bure et al. 1988), respectivamente. Ambas foram encontradas em amostras clínicas de K. pneumoniae recuperadas de hospitais franceses. SHV-5 foi descrita na Grécia e Tailândia (Chanawong et al., 2001; , Neonakis et al., 2003; Poirel et al., 2004a), enquanto SHV-12 foi identificada, até o momento, somente na Tailândia (Chanawong et al., 2001). Desde 1982, quando a ceftazidima foi disponibilizada para o uso clínico, até o presente momento, foram descritas mais de 140 variantes da β-lactamase da classe SHV (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV).
A enzima SHV já foi relatada em vários membros da família Enterobacteriaceae e em Acinetobacter spp. (Poirel et al., 2004a, Zavascki et
al., 2010). Em P. aeruginosa, poucos isolados foram descritos como produtores
dessa (Bush et al.,1995) enzima. Em K. pneumoniae, a enzima SHV-1 é responsável por até 20% da resistência a ampicilina mediada por plasmídeos nesta espécie (Tzouvelekis and Bonomo 1999b). Em muitas cepas de K.
pneumoniae o gene blaSHV-1, ou outro gene relacionado, apresenta-se integrado ao cromossomo bacteriano (Livermore 1995). Inúmeros relatos de surtos envolvendo K. pneumoniae produtoras de -lactamases de espectro ampliado têm sido reportados (Coque et al. 2008).
Apesar de grande parte das -lactamases do tipo SHV apresentar fenótipo ESβL, algumas, como por exemplo, SHV-10 e SHV-11, possuem fenótipo de resistência aos inibidores das -lactamases e apesar de hidrolisar
40 as penicilinas, essa enzima apresenta uma hidrólise reduzida para as cefalosporinas e, dessa forma, não é classificada como ESβL (Bradford 2001a).
3.3.3.3. CTX-M
As ESBL do tipo cefotaximase (CTX-M) são codificadas por genes localizados em plasmídeos. Essas β-lactamases têm a propriedade de conferir resistência a todas as cefalosporinas de espectro ampliado, porém, apresentam como substratos preferenciais a cefotaxima e a ceftriaxona (Bonnet 2004a;Cartelle et al. 2004;Rossolini et al. 2008c).
O primeiro relato da produção de CTX-M ocorreu em 1990, a partir de um isolado clínico de E. coli recuperado na Alemanha (Bauernfeind et al., 1990). Desde então, essas enzimas vêm se disseminando mundialmente em diferentes gêneros de enterobactérias (Bonnet 2004b;Rossolini et al. 2008e). Atualmente, encontram-se descritos na literatura mais de 80 tipos de CTX-M diferentes (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
No início da década de 1990, a β-lactamase CTX-M-2 disseminou-se rapidamente na Argentina e em países vizinhos (Rossolini et al. 2008b). Outros membros da família CTX-M estão distribuídos em diversos lugares do mundo; CTX-M-9 e CTX-M-14 predominantemente na Ásia e na Espanha (Hernandez
et al. 2005;Munday et al. 2004), CTX-M-3 e CTX-M-15 na Europa. Apesar de
não ter sido isolada no Reino Unido antes de 2001, a enzima CTX-M-15 é atualmente a ESβL mais prevalente em amostras bacterianas de E. coli e K.
pneumoniae nesta região (Livermore and Hawkey 2005).
Durante muitos anos, a identificação da enzima CTX-M esteve restrita aos membros da família Enterobacteriaceae. Porém em isolados clínicos de P.
41
aeruginosa já foram descritas as enzimas CTX-M-1, CTX-M-43 (al Naiemi et al., 2006; Celenza et al., 2006) e CTX-M-2 (Picão et al., 2009a; Picão et al.,
2009b). A disseminação das β-lactamases do tipo CTX-M está causando importantes e imprevisíveis mudanças na epidemiologia da resistência aos antibióticos β-lactâmicos (Rossolini et al. 2008a).
3.3.5. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Os carbapenêmicos são considerados os agentes mais potentes contra infecções causadas por bactérias Gram negativas devido à sua elevada afinidade pelas PBPs, estabilidade diante da maioria das β-lactamases e pela excelente permeabilidade através da membrana externa bacteriana (Woodford
et al., 2004). No entanto, nos últimos anos, o isolamento de bactérias Gram
negativas resistentes também aos carbapenêmicos vêm se tornando mais frequente em diversas partes do mundo (Nordmann and Poirel 2002).
Em enterobactérias, a resistência a esta classe de antimicrobianos pode ser causada pela produção de carbapenemases. As carbapenemases do tipo KPC (sigla para “Klebsiella pneumoniae carbapenemase”), incluídas na classe A (Ambler 1980b) ou grupo 2f de Bush (Bush et al. 1995b) são enzimas que são capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (Queenan and Bush 2007b).
A primeira descrição da enzima KPC-1 ocorreu no ano de 2001, na Carolina do Norte (EUA), a partir de um isolado de K. pneumoniae coletado em 1996, durante um estudo de vigilância denominado ICARE (“Intensive Care Antimicrobial Resistance pidemiology”). No entanto, uma recente correção na sequência de nucleotídeos do gene blaKPC-1 indicou que as enzimas KPC-1 e
42 KPC-2 são idênticas (Yigit et al., 2001). A partir de então, relatos de KPC-2 tornaram-se frequentes na Costa Leste dos Estados Unidos e rapidamente expandiu-se, sendo descrito em diversas partes do mundo (Queenan and Bush 2007a). Até o momento, onze variantes de KPC foram descritas
(http://www.lahey.org/studies).
O gene que codifica a enzima KPC está frequentemente localizado em um elemento genético móvel com grande potencial para disseminar-se. Esta característica somada ao fato deste gene ser, frequentemente, encontrado em cepas de K. pneumoniae, que é conhecida por sua capacidade de acumular e transferir determinantes de resistência, é motivo de muita preocupação pelas agências nacionais de saúde (Queenan and Bush 2007c). Embora as carbapenemases do tipo KPC sejam predominantemente descritas em cepas de K. pneumoniae, existem relatos dessa enzima em cepas de Enterobacter spp. (Hossain et al. 2004); (Bratu et al. 2005b), Escherichia coli (Navon-Venezia et al. 2006), Salmonella spp. (Miriagou et al. 2003), Citrobacter
freundii, Pseudomonas aeruginosa (Villegas et al. 2007), entre outras espécies
(Sacha et al., 2009). O tratamento de infecções causadas por microrganismos que expressam esse determinante de resistência é extremamente difícil, resultando muitas vezes em altas taxas de mortalidade, devido à resistência a múltiplos agentes antimicrobianos (Bratu et al. 2005a).
A enzima KPC-2 foi primeiramente descrita no Brasil por Monteiro e colaboradores (2009), em quatro amostras de K. pneumoniae isoladas entre setembro e novembro de 2006 em um hospital de Recife. Desde então, isolados de K. pneumoniae e E. cloacae produtores de KPC-2 também foram descritas no Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, revelando que a
43 emergência deste mecanismo de resistência em hospitais brasileiros vem ocorrendo desde o ano de 2005 (Pavez et al., 2009; Peirano et al., 2009; Zavascki et al., 2009a).
Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY (SENTRY- “Antimicrobial Surveillance Program”), realizado com 3.220 amostras de bactérias Gram negativas, coletadas de centros médicos no Brasil, entre o período de janeiro de 2003 a maio de 2008, constatou-se que Klebsiella spp. foi o segundo microrganismo mais prevalente em infecções de corrente sanguínea, porém nenhum isolado apresentou KPC (Andrade et al., 2008). Em 2010, Linares e colaboradores, avaliaram 1.057 transplantes de órgão sólidos realizados em um centro Médico na Espanha, entre o período de julho de 2003 a dezembro de 2007,e observaram 116 episódios de infecções por K.
pneumoniae sendo que mais de 50% desses eram ICS. Dos isolados desse
estudo, nenhum apresentou produção de carbapenemase. O mesmo fato se repetiu em outro estudo, agora realizado no Brasil, no qual K. pneumoniae foi a segunda espécie de Gram negativo mais prevalente em ICS e nenhum isolado de KPC foi relatado (Silva JR et al.,2010).
3.3.4. Metalo--Lactamases
As metalo-β-lactamases (MBL) são pertencentes ao grupo 3 de Bush (Bush et al. 1995a) e à classe molecular B de Ambler (Ambler 1980a). Apresentam potente atividade contra carbapenêmicos e hidrolisam todos os -lactâmicos comercialmente disponíveis, exceto os monobactâmicos (aztreonam). Este grupo requer íons Zn+2 ou outros cátions divalentes como cofatores no sítio ativo. São resistentes à ação dos inibidores das
serino-β-44 lactamases como ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Queenan and Bush 2007d), embora sofram inibição por agentes quelantes (EDTA, derivados de tiol e do ácido dipicolínico); (Payne et al., 1997a; Payne et al., 1997b; Laraki
et al., 1999; Bebrone, 2007).
As MBLs, como todas as β-lactamases, podem ser divididas em cromossomais e codificadas por genes móveis. As MLs intrínsecas são normalmente mediadas por cromossomo (Walsh et al. 1994) e são encontradas em um número limitado de espécies, como: Bacilus cereus, Aeromonas
hydrophila, Flavobacterium odoratum, Legionella gormanii, Bacteroides fragilis, Stenotrophomonas maltophilia (Hirakata et al. 1998). MLs adquiridas apresentam-se em estruturas genéticas móveis que fornecem mobilidade ao gene, facilitando a disseminação dessa enzima entre diferentes espécies bacterianas. Atualmente, são conhecidas 10 sub-classes de MBLs adquiridas: IMP (imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM (São Paulo metallo-
β-laCtamase), GIM (German imipenemase), SIM (Seul imipenemase), AIM
(Australian imipenemase), KHM (Kyorin Health Science MBL), NDM (New Delhi
laCtamase), DIM (Dutch Imipenemase) e TMB (Tripoli metallo-β-laCtamase) (Osano et al., 1994; Lauretti et al., 1999; Toleman et al., 2002;
Castanheira et al., 2004; Lee et al., 2005; Yong et al., 2007a, Sekiguchi et al., 2008; Salabi et al., 2009; Poirel et al., 2009).
Embora essas enzimas sejam mais frequentemente isoladas em espécies de bactérias Gram negativas não-fermentadoras, como Pseudomonas
aeruginosa e Acinetobacter baumannii, cada vez mais estas enzimas têm sido
reportadas em membros da família Enterobacteriaceae, incluindo K.
45 O primeiro relato de MβLs adquirida ocorreu em 1994 (Osano et al. 1994), sendo descrito como uma subclasse denominada IMP-1. Esta enzima foi encontrada em uma cepa clínica de Serratia marcescens isolada no Japão, a qual apresentava fenótipo de resistência a imipenem e cefalosporinas de amplo espectro. Diversas variantes dessa enzima foram então descritas em P.
aeruginosa, Acinetobacter spp. e enterobactérias de praticamente todos os
continentes (Walsh et al., 2005; Walsh et al., 2008). As variantes IMP-1, IMP-16 e IMP-18 já foram reportadas em isolados clínicos brasileiros de P. aeruginosa (Mendes et al., 2004; Mendes et al., 2007b; Xavier et al., 2007). Em 2005, Lincopan e colaboradores relataram o primeiro caso de K. pneumoniae produtora de IMP-1 isolada de uma única amostra, na América Latina (Lincopan et al. 2005a).
Em 1999, a segunda subclasse descrita de MBL adquirida foi denominada VIM foi observada em uma amostra de P. aeruginosa originária de Verona, Itália (Lauretti et al., 1999). Muitas variantes de VIM já foram descritas, tanto em microrganismos fermentadores da glicose, quanto em não fermentadores. Embora a maioria das descrições tenha ocorrido na Europa, algumas 25 variantes já foram identificadas na América e Ásia (Queenan & Bush, 2007; Walsh et al., 2005; Walsh et al., 2008).
Em 2002, foi descrita uma nova subclasse de MBL, a SPM-1 (São Paulo Metalo-β-lactamase). Esta enzima foi isolada de uma P. aeruginosa recuperada do trato urinário de uma paciente de quatro anos hospitalizada no complexo HSP/UNIFESP (Toleman et al., 2002). Esta enzima parece estar especificamente relacionada à espécie de P. aeruginosa, uma vez que, até então, não foi encontrada em demais patógenos. Amostras produtoras desta
46 enzima foram isoladas em diversas cidades brasileiras, tais como São Paulo, Brasília, Salvador, Fortaleza, Santo André, Londrina, Maringá, Curitiba, Recife, Rio de Janeiro, Porto Alegre e São Luiz (Gales et al., 2003; Pellegrino et al., 2002; Poirel et al., 2004b; Nouér et al., 2005; Vieira et al., 2005; Zavascki et al., 2005), sendo que na maioria destas descrições foi encontrado um perfil clonal predominante, denominado clone SP. A única descrição da produção de SPM-1 fora do Brasil ocorreu em 20SPM-10, na Suiça. Entretanto, a amostra de P.
aeruginosa, em que o gene blaSPM-1 foi detectado, foi isolada de um paciente que havia sido atropelado e possuía internação prévia no Hospital Geral Regional, em Recife (Salabi et al., 2010).
Em 2002, cinco isolados de P. aeruginosa foram recuperados de diferentes pacientes de um centro médico em Dusseldorf, Alemanha. Estes isolados codificavam uma nova β-lactamase da classe B, denominada GIM-1 (German imipenemase) (Castanheira et al., 2004). Em 2005, Lee e colaboradores reportaram uma nova enzima do tipo MBL, SIM-1 que foi identificada em sete isolados clínicos de Acinetobacter baumannii na Coréia, os quais haviam sido isolados entre setembro de 2003 e novembro de 2004.
Recentemente, foram descritas novas subclasses de MBLs adquiridas: AIM-1(Australian imipenemase), recuperada de um isolado clínico de P.
aeruginosa, em 2007, na Austrália (Yong et al., 2007b); KHM-1 (Kyorin Health
Science metalo-β-lactamase), descrita em 2008, no Japão, em um isolado clínico de C.freundii (Seikiguchi et al., 2008); NDM-1 (MIM- 1) (New Delhi metalo-β-lactamase), descrita em 2008, na Índia, em um isolado clínico de K.
pneumoniae, e posteriormente, sua ocorrência também foi relatada em
47 (Tripoli MBL), recuperada de um isolado clínico de P. aeruginosa detectado da Libia (África), em 2008 (El Salabi et al., 2009) e DIM-1 (Dutch Imipenemase), descrita em 2009 a partir de um isolado de P. stutzeri originário da Holanda (Poirel et al., 2010).
3.4. Sistemas Automatizados no Processamento de Hemoculturas O sangue é um dos espécimes clínicos mais importantes dentro de um laboratório de microbiologia. A hemocultura permite a identificação de microrganismos na corrente sanguínea e é o método disponível mais sensível na detecção da bacteremia.
A automação no laboratório de microbiologia ocorreu inicialmente em 1970 com a introdução do primeiro sistema semi-automatizado de hemocultura. Posteriormente, em 1990 estes sistemas foram aperfeiçoados e criados os equipamentos de hemocultura que realizam monitoramento contínuo do crescimento microbiano.
Os métodos dos sistemas automatizados disponíveis comercialmente baseiam-se na inoculação de amostra de sangue dentro de um frasco hermeticamente fechado e estéril que contêm meio de cultura enriquecedor que favorece o crescimento dos microrganismos, acrescido de substâncias que inativam ou adsorvem os antibióticos.
Cada frasco possui meios específicos que, por suas características químicas, permitem a seleção do microrganismo que deseja-se isolar: aeróbios, anaeróbios, fungos ou micobactérias.
Os frascos de hemocultura são incubados a 37C dentro de equipamentos automatizados que vão promover a agitação contínua do meio
48 de cultura. Na base do frasco de hemocultura existe um sensor de CO2 que
monitora a quantidade e CO2 no meio. Dentro do equipamento, próximo à base
onde o frasco de hemocultura é colocado, um diodo emissor e receptor de luz é posicionado e vai detectar alterações de cor e/ou fluorescência.
Com o crescimento bacteriano e conseqüente produção de CO2, o
sensor localizado dentro do frasco promove, através de uma reação química, alteração de cor ou emissão de fluorescência, com conseqüente alteração da luz refletida detectada pelo diodo presente no equipamento. Este sinal é transmitido a um computador acoplado ao equipamento. O computador possui diversos algorítimos para reportar a detecção de um frasco positivo: (a) quando a reflectância excede o ponto de corte estabelecido, (b) quando o instrumento reconhece um aumento linear nos níveis de CO2 ou (c) quando ococrre
alteração nas taxas de CO2 produzido (Nolte et al.,1993).
Algumas metodologias, além de utilizar detecção colorimétrica ou fluorimétrica podem também utilizar detecção manométrica da produção do CO2.
Apesar do aperfeiçoamento das metodologias automatizadas para aumentar a sensibilidade e reduzir o tempo de detecção do crescimento microbiano a técnica é dependente de condições pré-analíticas ideais como: volume da amostra, quantidade de amostras, momento e técnica de coleta.
Estudos revelam que 0,20 a 6% das amostras apresentam resultados falso-negativos, onde o paciente apesar de apresentar episódio de bacteremia o agente não é isolado (Shiguei et al., 1995; Smith et al., 1995; Ziegler et al., 1998).
