FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES LIPOGÊNICAS NO TECIDO ADIPOSO BRANCO
RETROPERITONEAL DE RATOS MACHOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA MODERADA
José Tiago Funabashi dos Santos
Cuiabá – Mato Grosso
2008
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES LIPOGÊNICAS DO TECIDO ADIPOSO BRANCO
RETROPERITONEAL DE RATOS MACHOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA MODERADA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Área de concentração Cirurgia, Nutrição e Metabolismo, da Universidade Federal de Mato Grosso, como pré-requisito para a obtenção do título de Mestre.
Orientando: José Tiago Funabashi dos Santos
Orientadora: Profª Dra Nair Honda Kawashita
Cuiabá – Mato Grosso
2008
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada pelo Bibliotecário Carlos Henrique T. de Freitas. CRB-1: 2.234
Permitida a reprodução parcial ou total desde que citada a fonte.
S237a Santos, José Tiago Funabashi dos.
Alterações lipogênicas no tecido adiposo branco retroperitoneal de ratos machos em crescimento submetidos à restrição protéica moderada / José Tiago Funabashi dos Santos. -- 2008.
xii, 49 f. : il. (algumas color.) ; 30 cm.
Orientadora: Nair Honda Kawashita.
Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Mato Grosso. Faculdade de Ciências Médicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2008.
“Querer não é poder. Quem pôde, quis antes de poder só depois de poder. Quem quer nunca há de poder, porque se perde em querer” “No fundo, só se sabe que sabemos pouco; com o saber cresce a dúvida” Johann Goethe
DEDICATÓRIA Aos meus pais Tânia e Luis pelos ensinamentos, carinho e apoio proporcionados. A Vanessa pelos momentos de alegria vividos juntos, pelo incentivo e respeito a um sonho e todo amor dedicado a mim. Aos meus irmãos Fabrício, Fabiano e Tatiana pelo carinho e admiração.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora Profa. Dra. Nair Honda Kawashita, por dispor do
seu tempo e seu conhecimento, caminhando ao meu lado ao longo desenvolvimento deste trabalho;
À Deus por conceder-me serenidade necessária para aceitar as coisas que não
posso modificar, coragem para modificar as coisas que posso e sabedoria para distinguir uma da outra, aceitando que as dificuldades constituem o caminho da paz;
As minhas amigas lipogênicas Maísa Pavani e Suélem Aparecida de França pela
sincera amizade, agradável convívio e indispensável ajuda para o desenvolvimento deste trabalho;
Ao Air Francisco, pelo apoio amizade e conversas agradáveis e pelos momentos de
descontração;
Ao Prof. Dr. Fabrício Stoppiglia pelos auxílios prestados e pela boa vontade em
ajudar;
Ao meu sócio e amigo Jaime de Figueiredo Neto pela amizade, cooperação e pelo
desenvolvimento de nossos projetos na minha ausência, obrigado pelo incrível trabalho realizado;
A profa. Msc. Ângela Nolasco pelo carinho, adimiração e incentivo para a
realização deste trabalho;
Aos meus amigos do laboratório de bioquímica Gustavo, Andressa, Samira, Paula,
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, meu
muito obrigado!
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3H - Trítio 3H
2O – Água triciada
ACTH – Hormônio adrenocorticotrópico ACX – Acetil CoA Carboxilase
AG – Ácido Graxo
AGL – Àcido Graxo Livre
AgRP – Peptídeo relacionado ao agouti AGs – Ácidos Graxos
AG-TAG – Ácido Graxo de triacilglicerol AIN – American Institute Nutrition AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ARQ – Núcleo arqueado
ATP – Adenosina trifosfato ATP-CL – ATP-Citrato Liase
CART – Transcrito regulado por cocaína e anfetamina CoA – Coenzima A
CRF – corticotropin releasing factor DM – Dorsomedial
EM – Enzima málica EMP – Erro médio padrão G3P – Glicerol-3-fosfato
G3PD – Glicerol-3-fosfato desidrogenase G6PD – Glicose 6-fosfato desidrogenase GABA – Ácido gama aminobutírico GK – Gliceroquinase
GLI – Glicerol
GLI-TAG – Glicerol de triacilglicerol H - Hipoprotéica
H+ - Prótons
HVM – Hipotálamo ventromedial
k – Velocidade de renovação fracional LHS – Lipase hormônio sensível LPL – Lipase lipoprotéica N – Normoprotéica
NAD - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH + H+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
NADPH + H+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido NOR – Noradrenalina
NPY – Neuropeptídeo Y
PKA – Proteína quinase dependente de AMPc
PPAR – Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma PV – Paraventricular
SNS – Sistema nervoso simpático t1/2 – Meia vida
TAB – Tecido Adiposo Branco TAG – Triacilglicerol
TAM – Tecido Adiposo Marrom
VLDL – Lipoproteína de densidade muito baixa VR – Velocidade de renovação
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Vias para transferência do grupo acetil da mitocôndria para o citosol... 5
Figura 2: Vias de geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco... 7
Figura 3: Velocidade de síntese de ácidos graxos (µmol/g.h) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias... 27
Figura 4: Velocidade de síntese de glicerol (µmol/g.h) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias... 28
Figura 5: Atividade das enzimas Málica, Glicose 6-fosfato desidrogenase e ATP citrato liase (nmol/ mg de prot. min) no Tecido Adiposo Branco Retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias... 30
Figura 6 = Atividade in vitro da enzima Lípase Lipoprotéica (LPL) no tecido adiposo branco retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias... 30
Figura 7: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias... 31
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Alterações do peso dos animais e peso dos tecidos , dos parâmetros bioquímicos e hormonais de ratos machos em crescimento submetidos à dieta hipoproteíca (6%) em comparação aos ratos que receberam dieta normoprotéica (11% de proteína)... 9
Tabela 2 – Composição da dieta normoprotéica e hipoprotéica (g/Kg)... 15
Taela 3 : Velocidade de síntese de ácidos graxos e glicerol de novo (µmol/g.h) e velocidade do ciclo de reesterificação de ácidos graxos (AGs) no tecido adiposo branco retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias... 29
Tabela 4 : Atividade da enzima Málica, Gicose-6-fosfato desidrogenase e ATP citrato liase (µmol/ mg de prot. min) e lipase Lipoprotéica (nmol AG. Mg ptn-1.min-1) no tecido
adiposo branco retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias... 31
Tabela 5: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao final de 15 dias... 32
Tabela 6: Concentração de noradrenalina, velocidade de renovação fracional (k) e velocidade de renovação (VR) de noradrenalina no TABR de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) e hipoprotéica (H) durante de 15 dias... 33
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar o metabolismo de lipídeos no Tecido Adiposo Branco Retroperitoneal de ratos machos submetidos à dieta hipoprotéica (H - 6% de proteína) na fase de crescimento. Estudos anteriores em nosso Laboratório mostram que 15 dias neste nível de restrição protéica, nesta fase de desenvolvimento do animal é suficiente para que sejam observadas profundas alterações na composição química corporal com acúmulo de lipídeos e redução de proteínas e água, quando comparado aos animais submetidos à dieta normoprotéica (N – 17% de proteína). Em nosso estudo sobre o metabolismo lipídico neste modelo experimental, foram avaliadas as sínteses de ácidos graxos e glicerol de novo em triacilglicerol, as enzimas que participam da síntese de AG (ATP-Citrato liase, Glicose-6-P desidrogenase e Enzima málica), a lipase lipoprotéica (LPL), o turnover de noradrenalina e a concentração sérica de corticosterona. Pudemos constatar que as vias de síntese de novo de AG e GLI, avaliadas in vivo pela incorporação de 3H2O, foi alterada apenas na síntese de
ácidos graxos. Da mesma forma, não constatamos nenhuma diferença na atividade das enzimas da síntese de AG. No entanto, a atividade da Lípase lipoprotéica foi aumentada em 107% nos animais que receberam a dieta H. O alto nível de corticosterona encontrado nestes animais, parece contribuir para a redução da síntese de AG no TABR. Estes achados nos levam a concluir que mais do que a síntese de ácidos graxos, um melhor aproveitamento dos AG circulantes e uma maior reesterificação do glicerol resultante da lipólise intracelular e fosforilado pela gliceroquinase pode ser responsável pelo acúmulo de TAG neste tecido, nestas condições.
ABSTRACT
The purpose of this work was to study the lipid metabolism in the Retroperitoneal White Adipose Tissue of growing male rats fed a hypoproteic diet (H- 6% protein). Previous studies by our group showed that 15 days of protein restriction in this particular age is sufficient to induce profound alterations at the level of body chemical composition, with lipid accumulation and decrease of protein and water contents, when compared to animals fed a normoproteic diet (N- 17% protein). In this experimental design, there were evaluated the fatty acids and glycerol synthesis and its sterification into triacylglycerol, the enzymes that participate in fatty acid synthesis (ATP-citrate lyase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase and Malic enzyme), the lipoprotein lipase (LPL) activity, the norepinephrin turnover and the serum concentration of corticosterone. We observed that the de novo synthesis of fatty acids and glycerol - evaluated in vivo by 3H2O incorporation - was modified in fatty acid synthesis. We also found no
differences in the activity of enzymes from the fatty acid synthesis pathway. These results led us to conclude that much more than the fatty acid synthesis can cause the triacylglycerol accumulation in the WAT, such as a better uptake of circulating fatty acids and an increased reesterification of the glycerol produced by intracellular lipolysis and phosphorylated by glycerokinase.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 1 2. OBJETIVOS... 11 2.1. Objetivos Gerais... 12 2.2. Objetivos Específicos... 12 3. MÉTODOS... 13 3.1. Animais e Dieta... 14
3.2. Determinação in vivo da síntese de ácidos graxos de novo e glicerol... 16
3.3. Medida da atividade das enzimas da síntese de ácidos graxos de novo... 18
3.3.1. Glicose 6-P desidrogenase... 19
3.3.2. Enzima málica... 19
3.3.3. ATP-citrato liase... 19
3.4. Atividade da Lipase lipoprotéica... 20
3.5. Velocidade de renovação de noradrenalina... 21
3.6. Determinação de corticosterona plasmática... 23
3.7. Análise Estatística... 25
4. RESULTADOS... 26
4.1. Síntese de ácidos graxos e glicerol... 27
4.1.1. Síntese de ácidos graxos... 27
4.1.2. Síntese de glicerol... 28
4.2. Atividade enzimática no TABR... 29
4.3. Concentração sérica de corticosterona... 31
4.4. Turnover de noradrenalina... 32
5. DISCUSSÃO... 34
1. INTRODUÇÃO
A principal função do tecido adiposo branco (TAB) é contribuir para o controle do metabolismo energético mobilizando ou estocando energia na forma de triacilglicerol (TAG), estruturalmente formado pela união de três moléculas de ácidos graxos (AGs) a uma molécula de glicerol por meio de ligações ésteres. Uma reserva adequada de TAG é necessária para o tecido adiposo exercer sua função de mobilizar AGs de acordo com a demanda energética dos outros tecidos, no caso do TAB, ou de suas próprias necessidades no caso do Tecido Adiposo Marrom (TAM), em que os AGs são os principais combustíveis para a termogênese no próprio tecido.
Para o TAB atender as necessidades energéticas dos tecidos periféricos nas diversas situações fisiológicas, os TAGs são continuamente hidrolisados. Essa hidrólise ocorre em grau variável, de acordo com a demanda, liberando os AGs na forma livre (AGL), que são transportados na circulação ligados à albumina, que podem ser captados e oxidados pelos tecidos.
Os ácidos graxos livres (AGL) e a glicose constituem os principais substratos utilizados pelos tecidos periféricos para a produção de energia. Tanto a produção hepática de glicose como sua utilização pelos tecidos são controladas. Os AGL, no entanto, parecem ser controlados apenas a nível de produção, não sendo conhecido nenhum fator que regule sua utilização. Portanto, um aumento nos níveis de AGL, ocorre por um aumento da sua mobilização decorrente da hidrólise de TAG1.
O conteúdo de TAG armazenado no TAB é decorrente do balanço entre sua velocidade de síntese (lipogênese) e sua velocidade de degradação (lipólise). Em período de balanço energético negativo, como durante o jejum, a lipólise é estimulada com o objetivo de liberar AGs e glicerol que serão utilizados como fonte de energia em diversos tecidos corporais como o fígado, músculo esquelético e cardíaco. Em contraste, em
períodos de balanço energético positivo, como por exemplo, após a ingestão alimentar, a lipogênese e o armazenamento de TAG no TAB estão estimulados.
O controle na lipólise no TAB é bastante complexo e envolve a interação de diversos fatores. As catecolaminas são as ativadoras primárias da mobilização de AGs do TAB induzida pelo jejum. A noradrenalina atua nos tecidos alvos, em uma classe de receptores de membrana denominados receptores adrenérgicos. Dependendo da afinidade e do mecanismo de transdução de sinal que estes receptores estão acoplados, estes ainda podem ser classificados em duas categorias, com diversos subtipos: os receptores α-adrenérgicos (α1 e α2) e os receptores β-α-adrenérgicos (β1, β2, β3). A noradrenalina ao se ligar aos receptores β-adrenérgico, que são acoplados as proteínas Gs localizados na membrana plasmática dos adipócitos, transmitem o sinal estimulatório à enzima adenilato ciclase, que catalisa a conversão de ATP em AMPc (adenosina monofosfato cíclico). O AMPc gerado se liga a proteína quinase dependente de AMPc (PKA) que é ativada pela dissociação das subunidades regulatórias e catalíticas. Uma vez estimulada, a PKA fosforila a lípase hormônio sensível (LHS), induzindo a ativação desta enzima e, subseqüentemente, sua translocação do citosol para o glóbulo de gordura, desencadeando a hidrólise dos TAGs estocados2. Além da LHS, as perilipinas, proteínas que recobrem a superfície do glóbulo de lipídeos protegendo-os da hidrólise, também são fosforiladas pela PKA durante o estímulo lipolítico. Estas proteínas, quando fosforiladas, sofrem modificação conformacional permitindo o acesso da LHS ao glóbulo de gordura3,4.
Estudos em camundongos Knockout para perilipinas mostraram que estes animais, embora consumam a mesma quantidade de alimentos, apresentam uma redução de 30% do tecido adiposo, quando comparado aos controles5. Além disso apresentam uma lipólise basal (não estimulada) elevada e são resistentes à obesidade induzida pela dieta6.
O controle da lipogênese é bastante complexo e está relacionada a fatores neurais, hormonais e nutricionais. Embora seja a causa primária das alterações da atividade lipogênica, os fatores nutricionais controlam a síntese de AGs não apenas diretamente, pelas alterações de fluxo de metabólitos, como também através de hormônios que estimulam ou inibem a síntese de AGs7.
A insulina é, provavelmente, o mais importante fator hormonal envolvido na regulação da lipogênese. Os efeitos da insulina são iniciados pela ligação da insulina ao seu receptor na superfície celular, ativando a atividade tirosinaquinase do receptor e iniciando a cascata de transdução do sinal, que culminará com a estimulação da lipogênese por mais de um mecanismo: a) aumento da captação de glicose pelos adipócitos via recrutamento dos transportadores de glicose (GLUT-4) para a membrana plasmática; b) ativação das enzimas glicolíticas e lipogênicas por modificação covalente e/ou estimulação da expressão gênica8,9,10.
Durante o processo de lipogênese, o AG esterificado pode ser proveniente de duas possíveis fontes: os sintetizados de novo a partir da glicose ou de outros compostos produtores de acetil-CoA; e os pré-formados, reciclados da hidrólise dos triacilgliceróis endógenos ou captados da circulação através da hidrólise da lípase lipoprotéica (LPL) dos triacilgliceróis presentes nos quilomicrons e nas lipoproteínas de muito baixa intensidade (VLDL) secretadas pelo fígado.
A síntese de novo de ácidos graxos ocorre no citosol de células adiposas e hepáticas (principalmente) e necessita de unidades de dois carbonos na forma de acetil CoA e de equivalentes redutores provenientes do NADPH + H+. A principal fonte de geração de acetil CoA, no citosol, é através da enzima ATP-Citrato liase (ATP-CL) que atua sobre o citrato (figura 1) proveniente da mitocôndria (forma de transporte destas unidades da mitocôndria para o citosol). Parte deste acetil CoA no citosol entra na formação de AG na
forma de malonil CoA numa reação catalisada pela acetil CoA carboxilase (ACX). As principais reações geradoras de NADPH + H+ na célula são as catalisadas pela enzima Málica (EM) e pela Glicose-6-P desidrogenase (G6PD) da via das pentoses.
Figura 1: Vias para transferência do grupo acetil da mitocôndria para o citosol. Fonte: Lehninger Principles of Biochemistry 4ª edição69.
Uma série de evidências indica que a atividade da LPL no TAB pode ser controlada pela insulina e pela noradrenalina. Ratos jejuados, diabéticos e expostos ao frio apresentam diminuição na atividade da LPL no TAB quando comparados ao controle11,12,13. A administração de uma dieta rica em carboidratos ou a adição de sacarose (32%) na água ingerida pelos ratos induz uma elevação nos níveis plasmáticos de insulina e um aumento
significativo na atividade da LPL do TAB14,15. A administração de insulina à animais expostos ao frio e ao jejum, bem como a adição de insulina e glicose ao meio de incubação de fragmentos de TAB de ratos jejuados elevam a atividade da LPL11,12,16,17. Os efeitos estimulatórios da glicose e da insulina na atividade da LPL no TAB de ratos jejuados são completamente bloqueados in vivo ou in vitro pela adição de inibidores da síntese protéica, indicando que a manutenção da atividade da LPL elevada requer uma síntese protéica contínua18,19,20,21. Apesar dos baixos níveis plasmáticos de insulina em ratos expostos ao frio, alguns trabalhos indicam que o efeito da exposição ao frio é mediado em parte pelo SNS, resultando em diminuição na atividade da LPL no TAB12. De fato a administração de noradrenalina ou isoprotenerol mimetiza o efeito in vivo da exposição ao frio e pode ser bloqueado por antagonista β-adrenérgicos22,23.
Estudos realizados com a técnica de dupla marcação (administração simultânea de
3H
2O e de glicose-U-14C) desenvolvidos por Botion e cols.24 indicam que os AGs
provenientes da síntese de novo constituem uma fração menor dos AGs totais utilizados pelo TAB para a síntese de TAG. Em animais adaptados à dieta balanceada, cerca de 37% do glicerol é utilizado para a esterificação de AGs sintetizados de novo. O restante do glicerol (63%) é utilizado para a esterificação de AGs pré-formados (captados na circulação ou reciclados da hidrólise de TAG endógenos.
Independentemente da origem dos AGs, a geração de glicerol-3-fosfato (G3P) é essencial para o funcionamento adequado do TAB e formação de TAG. Existem três vias de geração de G3P: a via clássica de obtenção de G3P pelo TAB é a sua síntese a partir de carbonos de glicose, pela conversão de diidroxiacetona, um intermediário da Via Glicolítica, a G3P catalisada pela enzima glicose-3-fosfato desidrogenase (G3PD). Além da formação através da glicose, a geração de G3P no TAB pode ocorre através da fosforilação direta do glicerol pela gliceroquinase (GK)e pela via da gliceroneogênese que
envolve a carboxilação do piruvato a oxaloacetato, descarboxilação do oxaloacetato a fosfoenolpiruvato e a formação da G3P por reversão parcial da via glicolítica.
Figura 2: Vias de geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco.
A geração de G3P pelas três vias, em diversas situações fisiológicas sofre influência de fatores metabólicos - nutricionais, hormonais e da atividade do sistema nervoso simpático (SNS). Assim como a quantidade de AG, a disponibilidade de G3P é determinante no tamanho dos estoques de TAG armazenados.
A influência da dieta sobre o metabolismo lipídico é uma linha de investigação que vem sendo conduzida, em vários modelos experimentais, por nosso grupo de trabalho. Dando continuidade a estes estudos, o modelo utilizado em trabalhos mais recentes deste Laboratório, são ratos com desnutrição protéica na fase de crescimento; que apresentam
aumento na ingestão de alimento e calorias, com proporcional aumento do gasto energético e ganho energético, além de acúmulo de lipídeos na carcaça, fígado e Tecidos Adiposos35.
Os dados da literatura são bastante contraditórios quanto ao efeito da desnutrição protéica sobre os componentes do balanço energético. Estudos avaliando o efeito da restrição protéica sobre a ingestão de alimentos em particular, reforçam a hipótese de que mais que o teor absoluto de proteínas na dieta, a ingestão de alimento está relacionada com a relação entre a quantidade de proteínas da dieta e o requerimento protéico do animal (12-15%)25,26. Níveis extremos de proteína na dieta, muito acima ou abaixo do requerimento, parecem diminuir a ingestão25.
Uma das hipóteses mais aceitas para justificar a hiperfagia observada em algumas condições de desnutrição protéica, é a tentativa do organismo em obter aminoácidos para a síntese de proteínas e outras finalidades26. No entanto, o que se constata é que mesmo com a hiperfagia, o aumento na ingestão de alimentos, nunca atende o requerimento protéico27 Segundo Meyer, o limite da ingestão é estabelecido pela capacidade do organismo em estocar/dissipar uma maior quantidade de energia28. Isto explicaria o maior consumo de alimentos em situações de exercício ou exposição ao frio (onde temos um aumento no gasto de energia)29 e a hiperfagia dos ratos submetidos à restrição protéica moderada (6%) em fase de crescimento (que trata o nosso trabalho), uma vez que este período se caracteriza por aumento no gasto energético.
Estudos posteriores no TAM destes animais, conduzidos por FRANÇA e cols, mostram aumento da atividade simpática e o aumento da síntese de AG de novo neste tecido, e a possibilidade da contribuição desta via para o aumento dos estoques de TAG; uma vez que a atividade da LPL não foi alterada pela restrição protéica. Paralelamente a estes achados, a constatação do aumento da sensibilidade à insulina e da resistência à leptina, reafirmam a relação direta da insulina e da atividade simpática com a síntese de
AG no TAM, já evidenciado em animais submetidos à dieta normoprotéica e hiperprotéica livre de carboidratos62.
Sob o ponto de vista metabólico, o acúmulo de lipídeos decorrente da hiperfagia, com maior ingestão de calorias e com resistência à leptina, em muito se assemelha às causas da obesidade humana, se apresentando como um interessante modelo para estudos sobre a regulação do metabolismo energético. Após ter iniciado a investigação sobre o metabolismo lipídico neste modelo experimental no TAM, o nosso objetivo é estender estes estudos a outros tecidos, particularmente no TABR e fígado, uma vez que a manutenção da homeostase no organismo é obtida pelas diferenças metabólicas entre os tecidos e as diferentes formas de regulação tecido-específica. Com isto, além de contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos de acúmulo de TAG, possibilitará ampliar as informações sobre a resposta do organismo frente à restrição protéica na fase de crescimento.
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
2.1.1. Avaliar a contribuição dos ácidos graxos circulantes e dos ácidos graxos e glicerol sintetizados de novo na formação de triacilgliceróis, no tecido adiposo branco retroperitoneal de ratos machos em crescimento, submetidos à restrição protéica moderada.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1. Avaliar a síntese de novo de ácidos graxos e glicerol de triacilglicerol (AG-TAG e GLI-TAG), pela incorporação de 3H2O, do tecido adiposo branco retroperitoneal.
2.2.1 Determinar a atividade das enzimas Lípase lipoprotéica, Málica, ATP-citrato liase e Glicose-6-fosfato desidrogenase no TABR.
2.2.3. Determinar o turnover de noradrenalina no TABR
3. MÉTODOS
A parte experimental deste trabalho foi desenvolvida no Laboratório de Bioquímica do Departamento de Química, vinculado ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Mato grosso (UFMT). Os experimentos foram dirigidos por princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), adotadas pela UFMT.
3.1. Animais e Dieta
Foram utilizados ratos machos, albinos (Rattus norvegicus), variedade Wistar, pesando entre 90-100g no início dos experimentos, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá – Brasil. Os animais foram mantidos em gaiola metabólica, à temperatura controlada (24˚±1˚C), umidade relativa de 55% e ciclo claro/escuro de 12 horas recebendo água ad libitum durante todo o período experimental. O peso corporal, o consumo alimentar e a água ingerida foram monitorados diariamente.
Após o desmame, os animais receberam dieta comercial Labina®, até atingirem o peso aproximado de 100g, quando então eram distribuídos em dois grupos experimentais, passando a receber dieta normoprotéica (grupo N) com 17% de proteína, ou dieta hipoprotéica (grupo H) com 6% de proteína (TABELA 1). A diferença em calorias resultante da redução de proteínas na dieta H foi compensada com o equivalente em carboidratos, mantendo-a isocalórica. A dieta normoprotéica segue as recomendações do Instituto Americano de Nutrição27 (AIN – 93G) para roedores na fase de crescimento, gravidez e lactação
Ingredientes Normoprotéica (17% de proteína) g/Kg Hipoprotéica (6% de proteína) g/Kg Caseína (84% de proteína)* 202 71,5 Amido 397 480 Dextrina 130,5 159 Sacarose 100 121 Óleo de Soja 70 70 Fibra (microcelulose) 50 50
Mistura se Sais AIN 93G** 35 35
Mistura de Vitaminas AIN 93G** 10 10
L-cistina 3 1
Bitartarato de Colina 2,5 2,5
*Valores corrigidos em função do conteúdo de proteína desejada
** Composição detalhada dada por REEVES, NIELSEN & FAHEY, 1993
As dietas N e H foram ministradas na forma de pó, sendo os ingredientes secos, pesados em balança analítica da marca Marte (modelo A 500, com precisão de 0,01 g), peneirados (malha 200) e homogeneizados. As dietas foram preparadas em quantidade suficiente para todo o estudo, acondicionadas em recipiente de polipropileno hermeticamente fechados e armazenadas a 5˚C.
Todos os procedimentos experimentais tiveram início as 7:00 horas e se estenderam por toda a manhã. As coletas de sangue para as determinações bioquímicas e hormonais, bem como a coleta de tecidos para as análises foram realizadas com os animais no estado alimentado ao final de 15 dias de dieta N ou H. Os animais foram eutanasiados por decapitação e amostras de sangue foram coletadas em heparina sódica para a obtenção de
plasma e sem anticoagulantes para a obtenção de soro. Após a coleta, o sangue com heparina foi centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos para obtenção do plasma. O soro foi separado por centrifugação a 700 rpm durante 15 minutos. Os tecidos adiposos brancos retroperitoneal (TABR) foram coletados por laparotomia mediana, pesados e congelados imediatamente em Nitrogênio e armazenados a -80°C para análises posteriores.
3.2. Determinação in vivo da síntese de ácidos graxos de novo e glicerol
A determinação da síntese de ácidos de novo e de glicerol foi avaliada pela incorporação de trício da 3H2O em ácidos graxos e glicerol de triacilgliceróis (AG-TAG e
GLI-TAG). A distribuição da água tritiada pela água corporal e a manutenção da atividade específica constante, tanto no plasma como nos tecidos por longo período, faz com que ela seja a substância radioisotopicamente marcada, de preferência para estudos da lipogênese
in vivo. A incorporação do trítio durante a síntese de ácidos graxos em ligações estáveis C-H, ocorre por meio da troca de 3H com os H dos nucleotídeos de pirimidinas reduzidos (NADPH). A fórmula utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de ácidos graxos é a seguinte:
ppm de 3H incorporados em AG 109 1 nmol de AG/h= _________________________________ X _____ X ____ ppm 3H/átomo - g de H na água corporal 13,3 t2-t1
A fórmula acima é baseada nas premissasde WINDMUELLER E SPAETH33. A atividade específica da água tritiada (ppm de 3H/ml de H2O) é obtida a partir da
radioatividade plasmática, considerando que cada ml de plasma contém 0,94 ml de água. O fator 109/13,3 corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em nmol de ácido graxos com 16 átomos de carbono. O cálculo pressupõe que metade de
todos os átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese de ácidos graxos a partir de todas as unidades de dois carbonos, independentemente do tipo de substrato utilizado.
Para avaliar a síntese de GLI-TAG, considera-se que a incorporação de 3H da 3H2O
e hidrogênios da glicose e de nucleotídeos de piridina reduzidos53. Dessa forma o 3H-glicerol-TAG reflete a síntese a partir de glicose e de intermediários de três carbonos (gliceroneogênese), mas não da gliceroquinase. JUNCAS (1968)54 demonstrou que o tecido adiposo incubado com 3H2O, U14C-glicose (5mm) na presença de insulina, apresenta
uma relação 3H/14C no GLI-TAG de 1,1. Como o glicerol tem três carbonos, 3,3 átomos de 3H são incorporados para cada molécula de glicerol-TAG formada. Desta forma, o fator que converte átomos-grama de H em nmoles de glicerol é 109/3,3.
Para determinação da lipogênese foi administrada água tritiada (3mCi/rato, i.p) nos animais normoprotéicos e hipoprotéicos. Uma hora após, os animais foram eutanasiados por decapitação e o sangue coletado em tubos heparinizados para obtenção do plasma para determinação da atividade específica. O TABR foi retirado e pesado. A extração de lipídeos foi realizada empregando-se clorofórmio:metanol 2:1 completando-se o volume para 10 ml.31 Após a extração, o material foi filtrado e para cada 8 ml de filtrado foram adicionados 1,6 mL de salina. Em seguida, os tubos foram centrifugados à baixa rotação por alguns minutos. A fase superior foi aspirada e a fase inferior (clorofórmica) lavada 3 vezes com mistura da fase superior preparada com clorofórmio, metanol e mistura salina na proporção de 21,1:337:330 (ml), respectivamente. A mistura salina foi preparada com 0,528g de CaCl2.2H2O + 0,732g de MgCl2.6H2O + 5,8g de NaCl + 940 ml de H2O. Uma
fração da fase clorofórmica (2mL) foi retirada para evaporação e contagem da radioatividade dos lipídeos totais. Após evaporada, o resíduo era ressuspenso com coquetel de cintilação para determinação da radioatividade Para determinação dos ácidos graxos
4mL da fase clorofórmica foi evaporada e os lipídeos saponificados com 2 ml de KOH etanólico (1ml de KOH saturado para 20 ml de etanol). Os tubos eram fechados com tampa de vidro e submetidos a aquecimento em banho Maria a temperatura de 70-80˚C por duas horas. Após a saponificação foram adicionados 3 ml de água milli-Q, e o tubo mantido a temperatura de 40-50˚C até a evaporação total do álcool. O material saponificado foi então lavado 3 vezes com 8 ml de éter de petróleo para a remoção dos lipídeos não saponificáveis. Posteriormente o material foi acidificado com ácido perclórico 6% e os ácidos graxos extraídos com éter de petróleo. Após a evaporação do conteúdo etéreo, o resíduo foi dissolvido em 10 ml de coquetel de cintilação para contagem de ácidos graxos-TAG. A diferença entre a radioatividade dos lipídeos totais e a incorporada em ácidos graxos foi utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de GLI-TAG. Para a medida da radioatividade foi utilizado o aparelho de cintilação líquida Tri Carb 2100 TR (Packard).
3.3. Medida da atividade das enzimas da síntese de ácidos graxos de novo
Para ensaio das enzimas, Glicose 6-P Desidrogenase, ATP-Citrato Liase e Enzima Málica, foi utilizado o mesmo homogenado. A homogeneização do TABR foi realizado em tampão TRIS 10mM, pH 7,4, sacarose 0,32M, EDTA 2mM e 2-β-mercaptoetanol 5mM seguido de centrifugação a 5.000 rpm por 10 minutos a 4°C. A camada gordurosa superior foi descartada e a fração sobrenadante transferida para outro tubo sendo centrifugada a 13.000 rpm por 2 horas a 4˚C para obtenção da fração citossólica. O conteúdo protéico do homogenado foi determinado pelo método de Lowry 34.
A atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase foi seguida espectrofotometricamente a 340nm, de acordo com o método de LEE (1982)35 A mistura da reação continha TRIS 0,1M pH 8,0, NADP+ 1mM e D-glicose-6-fosfato 1mM. A reação foi iniciada pela adição de glicose-6-fosfato que foi omitida do branco.
3.3.2. Enzima málica
A atividade da enzima málica foi avaliada medindo-se a formação de NADPH a partir de L-malato e NADP+. O método utilizado é essencialmente o descrito por OCHOA,
36 modificado por HSU e LARDY.37.Estas modificações fornecem melhor estabilidade e
linearidade em ampla faixa de concentrações de proteína e tempo. A formação de NADPH foi monitorada em espectrofotômetro (340nm) e o ritmo de sua formação, proporcional à concentração de enzimas. O sistema de ensaio continha tampão Trietanolamina 67mM (pH 7,4), L-malato 5mM, MnCl2.4H2O 4mM, NADP+ 0,2mM. A reação era iniciada com
L-malato, que era omitida do branco.
3.3.3. ATP-citrato liase
O ensaio da ATP-citrato liase foi realizado de acordo com o método descrito por SRERE, acompanhando a oxidação do NADH espectrofotometricamente a 340 nm. A mistura de reação continha, tampão Trietanolamina 50mM (pH 7,7) contendo ATP-Mg 7mM, citrato de potássio 10mM, NADH 0,1mM, Coenzima A 0,24mM, 2-mercaptoetanol 10mM, NAD-malato desidrogenase (1U/ml). A reação era iniciada pela adição de citrato de potássio. O NADH foi omitido no branco.
O ensaio da atividade enzimática da LPL foi baseado no método de Nilsson-Ehle & Schotz,38 e se fundamenta na reação, onde os ácidos graxos liberados (14C-oleato) foram separados usando um sistema de partição líquido-líquido. Tomando uma alíquota dos AGL situados na fase polar, e medindo-se a radioatividade correspondente foi calculado o grau de hidrólise dos triacilgliceróis e a atividade da enzima.
LPL
TAG (glicerol tri-14C-oleato) glicerol + (14C-oleato)
O TABR foi homogeneizado em tampão contendo 250mM de sacarose, 1mM de EDTA e 20U/ml de heparina, pH 7,4, mantendo a relação de 0,1:1 (m/v). O homogenado foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante, abaixo da camada gordurosa foi utilizado na avaliação.
O substrato foi preparado no dia anterior ao ensaio e continha 78 µmoles de trioleína fria, 4mg de lisolecitina em clorofórmio e 12,5 µCi de trioleína-14C em tolueno. Após a evaporação todo os solvente orgânico foi evaporado sob corrente de nitrogênio. Posteriormente foram adicionados 5 ml de glicerol e agitados vigorosamente. Ao final do procedimento, a mistura apresentava-se turva, mas voltava à transparência após 10 a 20 horas. Esse substrato é estável a temperatura ambiente e no escuro por 3 meses. Entre as propriedades da lípase lipoprotéica (LPL) importantes para a determinação da sua atividade, estão: inibição por NaCl 5M e requerimento de cofator específico (apolipoproteína C-II).
No dia do ensaio foi preparado a mistura de reação, contendo 2 partes de tampão para LPL (pH 8,8) contendo TRIS 0,2M, albumina bovina livre de ácidos graxos (6%) e cloreto de sódio 0,15 M; 2 partes do substrato e uma parte de soro de rato jejuado (36 horas). A mistura de reação foi agitada em vórtex e 100 µl adicionados em todos os tubos,
inclusive nos tubos “inibidos” que continham 50 µl de NaCl 5M, (reação inibida pelo NaCl). A reação foi iniciada pela adição de 100 µl do homogenado e incubados por 60 minutos a 37˚C, sob agitação (80 ciclos/min). Ao final do período de incubação foram adicionados 3,25 ml de mistura de extração de VAUGHAN (clorofórmio: heptana: etanol na proporção de 1,25 : 1 : 1,41) sob agitação;40 e em seguida 1 ml de tampão carbonato-borato 0,1M pH 10,5 também sob agitação em vórtex. Os tubos de ensaio foram então centrifugados àtemperatura ambiente a 1.000g por 15 minutos. Uma alíquota de 0,8 ml da fase superior aquosa foi colocada em líquido de cintilação SX20 Fischer, para contagem da radioatividade. Para o cálculo da atividade da enzima, foi descontada da radioatividade da amostra, a radioatividade do inibido.
3.5. Velocidade de renovação de noradrenalina
A velocidade de renovação de noradrenalina no TABR de ratos controles e submetidos à dieta hipoprotéica foi avaliada medindo-se o ritmo de queda na concentração de noradrenalina após 6 e 12 horas de administração intraperitoneal de α-metil-tirosina (300mg/Kg de peso corporal), um inibidor da síntese de noradrenalina, que bloqueia a atividade da tirosina hidroxilase. O grupo 12h recebeu uma segunda dose (250mg/kg de peso corporal) da droga, 6 horas após iniciado os experimentos
Após o sacrifício dos animais por deslocamento cervical, o TABR foi rapidamente removido e congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80˚C até o momento da avaliação.
Para determinar o conteúdo de noradrenalina, o tecido foi homogenado em 5,5 ml de ácido perclórico 0,2N (deaerado) contendo metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1 mM. O homogenado foi centrifugado a 3000g por 10 minutos a 4˚C e 4 ml do sobrenadante foi transferido para um tubo contendo 1 ml de tampão TRIS 2M (pH 8,9) com 0,5% de
metabissulfito de sódio e 2,5% de EDTA, previamente deaerado, contendo 50 mg de alumina ativada (30 minutos a 100˚C) e 20 µl de padrão interno (3,4-diidroxibenzilamina, DHBA). Após 20 minutos de agitação em banho Dubnoff, as amostras foram centrifugadas a 7500g por 3 minutos a 4˚C e o sobrenadante foi aspirado. Ao precipitado foram adicionados 3 ml de água milli-Q deaerada contendo 0,5 ml de EDTA 20mM, 100 µl de metabissulfito de sódio 1M e 0,25 ml de TRIS 2M seguido de aspiração do sobrenadante. Esta etapa foi realizada duas vezes. Após a última aspiração foi adicionado ao precipitado, 0,5 ml de ácido perclórico 0,1M contendo metabissulfito de sódio 1mM e EDTA 0,02%. Após 10 minutos de agitação em banho Maria Dubnoff, o sobrenadante foi separado para determinação do conteúdo de noradrenalina por cromatografia líquida de alta performance (HPLC LC-7ª) em coluna de fase reversa.41
A noradrenalina e o padrão interno foram quantificados com o auxílio de um detector eletroquímico (LC-ECD-6ª, Shimadzu).
A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da concentração de noradrenalina no tempo zero (NOR0) e a velocidade de renovação fracional (k).
VR = k . [NOR]0
Após o bloqueio da síntese pela α-metil-tirosina, o declínio na concentração de noradrenalina é dado pela seguinte equação:
[NE] = [NEo] e kt
O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos logarítmos naturais da concentração noradrenalina versus o tempo.42
O intervalo de confiança de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina foi determinado da seguinte maneira:
a) O intervalo de confiança do erro padrão médio da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR0) foi estabelecido.
b) Os limites inferiores da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR0) foram multiplicados para determinação do limite
inferior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina.
c) Os limites superiores da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR0) foram multiplicados para determinação
do limite superior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina.43
O tempo médio de desaparecimento de noradrenalina (t1/2) foi calculado
dividindo-se 69,3 pelo valor da velocidade de renovação fracional (k).
3.6. Determinação de corticosterona plasmática
Foi adicionado 1 mL de acetato de etila para cada 1 mL de amostra que foi agitado vigorosamente. Após a separação das fases, a fase orgânica superior foi transferida para um tubo de ensaio. Foi repetida a adição de acetato de etila e separação das fases mais duas ou três vezes, para remover toda a corticosterona da amostra.
O acetato de etila foi evaporado na capela, sob jato de N2. A corticosterona extraída
foi dissolvida em 250 µL de tampão de ensaio (10 mL de concentrado do Kit mais 90 mL de água deionizada), agitado e deixado descansar por 5 minutos a temperatura ambiente. Esse procedimento foi repetido mais 2 vezes e as amostras foram usadas imediatamente. Todas as amostras foram feitas em duplicata.
Foram adicionados 100 µL do tampão ensaio numa dupla de poços denominados B0, 100 µL dos padrões 1 a 5 nos respectivos poços (em duplicata), 100 µl das amostras
(em duplicata) nos respectivos poços, 50 µL de tampão de ensaio em poços denominados NSB (ligação não-específica) e 50 µL de conjugado azul em todos os poços, exceto no atividade total (TA) e o branco. Depois foi adicionado 50 µl de anticorpo amarelo em cada poço, exceto no TA, branco e NSB. Todos os poços apresentaram a cor verde, exceto os NSBs, que se apresentaram azuis.
A placa foi incubada em temperatura ambiente, por 2:00 horas sob agitação de 500 rpm. A placa foi selada, por precaução, com o material fornecido. Os poços foram esvaziados e adicionou-se 400 µL de tampão de lavagem (5 mL de concentrado do kit mais 95 mL de água deionizada) em cada poço. Esvaziou-se os poços e a placa foi agitada vigorosamente para remover todo o tampão, depois disso, adicionou-se 5 µL de conjugado azul aos poços TA e 200 µL do substrato de paranitrofenilfosfato (pNpp), onde foi Incubado por 1:00 hora em temperatura ambiente, em repouso.
Após o repouso, foi adicionado 50 µL de solução de parada em cada poço para interromper a reação. A absorbância foi lida em 405 nm, com correção em 570-590 nm. Após a leitura foi subtraído à leitura do branco de todas as amostras.
Cálculo
Absorbância líquida = Absorbância da amostra – Absorbância do NSB
Absorbância líquida
Ligação ao Anticorpo = __________________ × 100
Absorbância B0
Foi montado um gráfico das concentrações dos padrões 1 a 5 versus a ligação ao anticorpo e calculado a corticosterona das amostras por interpolação.
3.7. Análise Estatística
Os resultados foram analisados utilizando-se o Teste t de Student para a comparação das médias dos diferentes tratamentos experimentais. O nível de significância adotado foi de 5%. Para análise dos resultados utilizou-se o programa Statistic for
4. RESULTADOS
4. RESULTADOS
A síntese de AGs a partir de todas as fontes, avaliada pela incorporação in vivo de
3H
2O foi 50% menor nos animais submetidos à restrição protéica (6% de proteína), quando
comparados com o grupo controle que recebeu dieta normoprotéica (17% de proteína).
N
H
0 1 2 3 4 5V
e
l
s
in
te
s
e
A
G
(
µ
m
o
l/
g
.h
)
*
Figura 3: Velocidade de síntese de ácidos graxos (µmol/g.h) “in vivo” de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias. Valores representam a média ± EPM de 14 animais por grupo. Diferença estatística em relação aos animais controle (*p˂0,05)
4.1.2. Síntese de glicerol
A velocidade de síntese de glicerol avaliada pela incorporação de 3H2O in vivo em
N
H
0
2
4
6
8
10
V
e
l
s
in
te
s
e
G
li
(
µ
m
o
l/
g
.h
)
Figura 4: Velocidade de síntese de glicerol em ratos machos t ao final de 15 dias de tratamento com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H). Valores representam a média ± EPM de 14 animais por grupo.
Tabela 2 : Velocidade de síntese de ácidos graxos e glicerol de novo (µmol/g.h) e velocidade do ciclo de reesterificação de AGs, no TABR de ratos machos tratados com dieta N ou H ao final de 15 dias de tratamento.
Grupos
Parâmetros N (14) H (14)
Ácido Graxo 3,6 ± 0,76 1,8± 0,23*
Glicerol 8.3 ± 1,5 6,3 ± 1,1
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças estatísticas em relação aos controles (*p<0,05).
4.2. Atividade enzimática
As enzimas lipogênicas ATP Citrato Liase, Málica e Glicose-6-fosfato Desidrogenase não apresentaram alteração na sua atividade quando comparadas com os grupos controles (Figura 5).
No entanto, a atividade da enzima Lipase Lipoprotéica nos animais submetidos à dieta hipoprotéica (H), apresentaram um aumento de mais de 100%, sugerindo uma maior captação de AGs da circulação.
N LP N LP N LP 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
µ
m
o
l/
m
g
d
e
p
ro
t/
m
in
ATP Citrato Málica G-6-P
N
H
Figura 5: Atividade das enzimas Málica, Glicose 6-fosfato desidrogenase e ATP citrato liase (nmol/ mg de prot. min) no TABR, de ratos machos, ao final de 15 dias de tratamento com a dieta N ou H. Os valores representam a média ± EPM de 7 animais por grupo.
N 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
n
m
o
l
A
G
.
m
g
p
tn
-1.m
in
-1*
HFigura 6 - Atividade da enzima Lípase Lipoprotéica no TABR, de ratos machos, ao final de 15 dias de tratamento com dieta N ou H. Os valores representam a Média ± EPM de 7 animais por grupo. Diferença estatística em relação aos animais controle (*p˂0,05).
Tabela 3 : Atividade da enzima Lipase Lipoprotéica (nmol AG/ mg de prot. min), Málica, Gicose-6-fosfato desidrogenase e ATP Citrato liase (µmol/ mg de prot. min) no TABR, de ratos machos, ao final de 15 dias de tratamento com dieta N ou H.
Grupos Parâmetros
N (7) H (7)
ATP Citrato Liase 0,65 ± 0,13 0,36 ± 0,06
Enzima Málica 1,15 ± 0,19 1,39 ± 0,11
Glicose-6-fosfato Desidrogenase 1,31 ± 0,24 1,88 ± 0,19 LPL – TAB (nmol AG. mg ptn-1.min-1) 1,3 ± 0,24 2,7 ± 0,48* Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças estatísticas em relação aos controles (*p<0,05).
4.3. Concentração sérica de corticosterona
A concentração sérica de corticosterona nos animais H teve aumento superior a 100% quando comparada com ao grupo controle (N).
N
H
0
100
200
300
400
C
o
rt
ic
o
s
te
ro
n
a
(
µµµµ
g
/m
l)
**
Figura 7: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) em ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias. Valores representam a média ± EPM de 11 a 12 animais. Diferença estatística em relação aos animais controle (**p˂0,01).
Tabela 4: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao final de 15 dias.
Grupos
Parâmetros N (11) H (12)
Corticosterona (µg/ml) 145,47 ± 1,52 304,12 ± 1,94**
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças estatísticas em relação aos controles (**p<0,01).
4.4. Turnover de noradrenalina
Nenhuma diferença significativa foi encontrada na concentração de noradrenalina no TABR entre os grupos avaliados. No entanto o grupo H apresentou velocidade de renovação de noradrenalina de 5,84 ng. Tecido-1. Hora-1 e o grupo N de 3,98 ng. Tecido-1. Hora-1. A diferença na velocidade de renovação de 1,86 ng. Tecido-1. Hora-1 foi estatisticamente significativa (p˂0,01). O tempo de decaimento (meia vida) da noradrenalina foi de 9,5 horas para o grupo H e 14,9 horas para o grupo N.
0
6
12
20
55
Dieta N
t
1/2=14,9 h
Dieta H
t
1/2=9,5 h
[N
E
]
n
g
.
te
c
id
o
-1T
A
B
R
Tempo (h)
Figura 8: Velocidade de renovação de noradrenalina no TABR após a aplicação intraperitoneal de α-metil-ester-tirosina em ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias. Cada ponto representa a média de 4 a 5 animais em cada tempo.
Tabela 5: Concentração de noradrenalina, velocidade de renovação fracional (k) e velocidade de renovação (VR) de noradrenalina no TABR de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) e hipoprotéica (H) durante de 15 dias.
Grupos
Parâmetros N (4) H (5)
Noradrenalina (ng. tecido-1) 86,0 ± 4,9 80,5 ± 5,7
k (%h-1) 4,6 ± 3,43 7,3 ± 3,78
VR (ng. tecido-1. hora-1) 4,0 (3,27-4,70) 5,8 (4,69-6,99)**
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças estatísticas em relação aos controles (**p<0,01).
5. DISCUSSÃO
5. DISCUSSÃO
Além dos parâmetros relacionados à geração de ácidos graxos e glicerol, foram determinados neste trabalho, os níveis de corticosterona sérica e o turnover de noradrenalina no TABR. A coleta destes dados, juntamente com outros obtidos em experimentos anteriores, teve por finalidade caracterizar o modelo experimental (ratos em crescimento submetidos à restrição protéica) e conhecer o contexto neural e hormonal em que se processam as alterações metabólicas nestes animais.
O aumento no turnover de noradrenalina no TABR dos animais do grupo H e apresentado na Tabela 5, é a primeira constatação do aumento da atividade simpática neste tecido em animais com restrição protéica. Estes dados se opõem aos encontrados no TAB Epididimal de ratos adultos submetidos à dieta com 5% de caseína (muito próximo ao conteúdo de 6% de proteína administrado a nossos animais) por Kevonian et al71. Além de uma possível diferença tecido-específica, não podemos descartar que este resultado aparentemente contraditório entre os dois tipos de tecido adiposo branco, poderia ser resultado da diferente etapa de desenvolvimento em que os mesmos foram submetidos à restrição protéica (fase de crescimento e adultos, respectivamente), já que este fato leva à diferença na ingestão de alimento (calorias), e balanço nitrogenado tendo como
conseqüência, diferente respostas simpática nos tecidos. Segundo White et al.26 o aumento da ingestão em situações de restrição protéica é uma tentativa do organismo em repor a deficiência de aminoácidos, sendo, no entanto limitada, pelo próprio gasto energético; de tal forma que o aumento do gasto energético levaria a um aumento na ingestão de alimento. O fato do grupo H (nosso grupo experimental) se encontrar em fase de crescimento, onde ocorre aumento no gasto energético, pode ter sido o fator fundamental para o diferente comportamento alimentar entre os dois grupos acima mencionados, mesmo submetidos a um grau de restrição protéica muito próximos. A associação entre a maior ingestão de calorias e maior atividade simpática no TABR encontrado em nossos experimentos foi observada também por outros autores: Chaves et al.1 observou aumento na atividade simpática no TABR após administração de dieta hipercalórica por 3 semanas e Young et al.61,em animais submetidos à dieta padrão suplementado com solução de glicose ou frutose por 6 dias, entre outros. Estudos em ratos adaptados à dieta hiperprotéica (HP) livre de carboidratos, mostram uma diminuição na atividade simpática no TABR62. Esta diminuição é provavelmente induzida pela ausência de carboidratos na dieta38 ou pelo aumento da concentração de proteínas39,40,41,42. Com isso, concluímos que a atividade simpática aumentada no TABR no grupo H é coerente com a maior ingestão de calorias e carboidratos e menor concentração de proteínas na dieta.
Classicamente o SNS desempenha um papel importante na regulação da lipólise no TAB. Dados de Migliorini et al.63 e Garófalo et al.64 mostraram que o jejum e a exposição ao frio são situações onde constatamos simultaneamente aumento da atividade simpática e da lipólise. No entanto, é difícil justificar a necessidade da ativação da lipólise em animais com maior ingestão calórica. Mais recentemente, Carey et al.65 e Lafontan et al.66 constataram que as catecolaminas através dos receptores α2 adrenérgicos e inibição da produção de AMPc, podem também prevenir a mobilização lipídica. Diante disto, para
uma melhor interpretação do objetivo finalístico do aumento da atividade simpática nestes animais, outros experimentos, confirmando ou não o aumento da lipólise neste tecido, serão necessários.
Se considerarmos, no entanto, uma ação lipolítica do SNS no TABR nestes animais, somente o aumento na reesterificação, poderia justificar o aumento do conteúdo de TAG neste tecido, processo este dependente da disponibilidade de G3P, fundamental no ciclo lipólise/reesterificação, regulando a taxa de liberação de AG pelo tecido e conseqüentemente o seu armazenamento na forma de triacilgliceróis (TAG).
Quanto à geração de AG, pudemos constatar que a síntese de AG de novo no TABR do grupo N, utiliza apenas cerca de 15% do G3P sintetizado pelas vias da gliceroneogênese e a partir da glicose (incorporação de 3H2O em GLI-TAG). Para esta
determinação a velocidade de síntese de AG de novo dividido por 3, nos dá o quanto de G3P foi utilizado para esterificar estes AG, uma vez que cada molécula de G3P esterifica 3 moléculas de AG. Isto significa que a maior parte dos G3P (85%) foram utilizados para esterificar AG pré formados, sejam eles provenientes da hidrólise dos TAG no próprio tecido ou captado das lipoproteínas circulantes pela ação da LPL. Estes resultados reforçam a importância da reesterificação dos AGs observado em animais adultos por Botion et al.24 em que cerca de 63% do GLI-TAG sintetizado pela gliceroneogênese e a partir da glicose, é utilizado para reesterificar AG pré-formados, aumentando para 80% em animais submetidos à dieta hiperprotéica24. Nos animais com restrição protéica dos nossos experimentos, observamos um aumento na contribuição dos AG pré-formados (circulantes e endógenos) para 90%. Este resultado explica o aumento dos estoques de TAG nestes animais, mesmo com redução significante da síntese de AG de novo (50% da síntese do grupo N). O aumento de 100% na atividade da LPL observado neste grupo sugere que o
aumento dos estoques de TAG, tem relação direta com a maior contribuição dos AG circulantes captados da circulação do que os AG provenientes dos TAG endógenos. O aumento da sensibilidade à insulina constatada no grupo H em relação ao grupo N poderia justificar o aumento da atividade da LPL no TABR35, suprimindo os possíveis efeitos inibitórios da noradrenalina sobre a enzima (uma vez que o tecido nesta condição tem, como já relatado anteriormente, um aumento na atividade simpática).
Outra fonte de geração de G3P, que não é contabilizada pela técnica da 3H2O é o
glicerol reciclado por fosforilação pela GK. Embora a atividade desta enzima tenha sido considerada nula no TAB durante muito tempo, mais recentemente foi constatado que a sua atividade é perfeitamente detectável, sendo em torno de 1/10 da atividade da GK no TAM sendo ativada pelo SNS70. Como nos animais H a atividade simpática está aumentada (não se conhece outro fator que regule a atividade desta enzima), podemos supor que a síntese de G3P a partir da gliceroquinase estará possivelmente mais elevada nos animais H em relação à N, contribuindo para maior formação de G3P por esta via e como conseqüência maior esterificação de AG, o que elevaria a percentagem do glicerol utilizado para reesterificar ácidos graxos pré-formados.
O alto nível de corticosterona sérica encontrada nos animais H em nossas experimentações (Tabela 4) são corroborados por Herbert & Carilloo43 que constataram aumento no peso da glândula adrenal e maiores níveis de corticosterona em animais com restrição protéica. Adicionalmente, houve aumento de 63,8% no número de células secretoras de ACTH em relação aos animais submetidos à dieta normoprotéica. Estes resultados sugerem que a secreção de ACTH e a fisiologia adrenocortical estão estimuladas sob condições de restrição protéica, condição esta, semelhante às situações de stress crônico. Achados semelhantes (inclusive em outras espécies animais) foram encontrados
em ratos machos com restrição protéica na dieta (8% de proteína) por trinta dias consecutivos a partir do 20° dia de vida50.
A regulação por feedback pelos níveis de glicocorticóides plasmáticos inibindo a secreção de ACTH pelo hipotálamo, tem sido revisto ao longo das últimas décadas. Este modelo clássico de retroalimentação é observado agudamente, nas primeiras 18h após o stress, onde os níveis de glicocorticóides exercem uma ação inibitória sobre este sistema. Entretanto em situações de stress crônico ou um simples stress de alta intensidade, a ação direta dos glicocorticóides (em altos níveis) é estimulatória51,52. Dados recentes relacionam também o stress crônico com desarranjos da homeostase metabólica que contribui em manifestações clínicas como a obesidade visceral, diabetes tipo 2, aterosclerose e síndrome metabólica; ressaltando a importância fisiológica desta relação.
Tudo indica que o mecanismo primário que estabelece estas alterações é o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e o componente central e periférico do Sistema Nervoso Central. A hiperleptinemia dos animais H, mencionada anteriormente, poderia também contribuir nestas alterações, uma vez que esta condição aumenta a expressão de
corticotropin releasing factor (CRF) (secretado pelo hipotálamo, estimulando a secreção de ACTH que estimula o córtex adrenal na hipófise), resultando em maior secreção de ACTH pela hipófise, maior estimulação das adrenais e aumento na secreção de corticosterona37.
O papel deste hormônio na lipogênese está ainda por ser estabelecido. Até a década de 80, os glicocorticóides eram vistos como hormônios catabólicos68, entretanto a compreensão de seu mecanismo de ação e de seus efeitos estimuladores na síntese de muitas enzimas das vias de síntese faz com que atualmente, se atribua a ele, também funções anabólicas.
As ações metabólicas dos glicocorticóides são bastante amplas e o seu papel no metabolismo de lipídeos ganha interesse cada vez maior, frente a sua associação com a obesidade em humanos e roedores, sugerindo que os glicocorticóides podem ter papel importante na gênese da obesidade. Além de estimular o acúmulo de lipídeos, este hormônio participa também da distribuição corporal entre os vários depósitos.
Os efeitos finais dos GC sobre o metabolismo parecem ter duas características: a especificidade tecidual e a interação com outros sistemas hormonais, que pode ser ilustrado por sua ação permissiva sobre a ação estimulatória da insulina sobre a LPL e pela ação inibitória sobre a ação anti-lipolítica da insulina. Esta interação pode também explicar a maior ingestão de alimento no grupo H apesar dos elevados níveis de leptina sérica (anorexígeno), já que a redução na ingestão é tamponada por altos níveis de corticosterona (orexígeno) como constatado nos animais do grupo H60.
As interações dos GC se estende também a fatores de transcrição, como o receptor ativado por proliferador de peroxissomos (PPARγ) que é expresso predominantemente no
Tecido Adiposo e modula a expressão gênica de proteínas envolvidas no metabolismo de
glicose e lipídeos. Entre estas interações podemos ressaltar a ativação do PPARγ pelos GC
e a sua associação com o fenótipo adiposo, que é definido pelo acúmulo de lipídeos e genes marcadores específicos de lipídeos, como proteína ligadora de ácidos graxos nos adipócitos (aP2), lipase lipoprotéica e adipsina67.
Dados da literatura sustentam ainda, a possibilidade da participação dos glicocorticóides no controle das vias de geração de G3P, como a redução de 80% da expressão gênica da fosfoenolpiruvato carboxiquinase citoplasmática (PEPCK-C) observada após a incubação de adipócitos brancos com dexametasona por 4h55. Estes resultados mostram uma ação diferente do hormônio no tecido adiposo e fígado, já que os glicocorticóides estimulam a expressão da PEPCK-C hepática56. Esta enzima regulada a
nível transcricional, apresenta diferentes funções tecido-específicas, sendo a enzima chave da gliconeogênese no fígado, enquanto no Tecido Adiposo sua função esteja associada unicamente à geração de G3P através da gliceroneogênese. Esta participação da enzima em vias com diferentes finalidades justificam as diferentes respostas da enzima ao hormônio57. Estudos semelhantes mostram aumento da atividade da Gliceroquinase (GK) depois de prolongada incubação de adipócitos brancos de ratos com dexametasona58. Por fim, estas associações podem ser estabelecidas em outros vertebrados, onde o aumento da atividade da glicerol 3-P desidrogenase (conversão da diidroxiacetona-P da Via glicolítica em glicerol-P) e GK foram observadas após implantes de glicocorticóides em peixes59.
Estes achados isolados podem ser indicativos, ou não, de um possível controle dos glicocorticoides sobre as vias relacionadas a estas enzimas. Experimentos posteriores serão necessários para estabelece a real contribuição dos altos níveis de Corticosterona no acúmulo de TAG no tecido adiposo branco retroperitoneal de animais submetidos à restrição protéica na fase de crescimento.
Conclusão
Tendo em vista os resultados e as considerações anteriormente expostas, podemos concluir que:
• As adaptações metabólicas determinadas pela restrição protéica ocorreu dentro de um quadro de resistência à leptina, sensibilidade à insulina, hipercorticosterolemia e aumento na atividade simpática no TABR;
• O aumento no conteúdo de TAG no TABR se deve mais, ao aumento na captação de AG circulantes, decorrente em parte pelo aumento da sensibilidade à insulina e independente da possível ação inibitória da LPL pelo Sistema Nervos Simpático;
• O alto nível de corticosterona parece contribuir para a redução da síntese de AG no TABR e aumento do G3P, aumentando a velocidade de reesterificação;
