A parte experimental deste trabalho foi desenvolvida no Laboratório de Bioquímica do Departamento de Química, vinculado ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Mato grosso (UFMT). Os experimentos foram dirigidos por princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), adotadas pela UFMT.
3.1. Animais e Dieta
Foram utilizados ratos machos, albinos (Rattus norvegicus), variedade Wistar, pesando entre 90-100g no início dos experimentos, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá – Brasil. Os animais foram mantidos em gaiola metabólica, à temperatura controlada (24˚±1˚C), umidade relativa de 55% e ciclo claro/escuro de 12 horas recebendo água ad libitum durante todo o período experimental. O peso corporal, o consumo alimentar e a água ingerida foram monitorados diariamente.
Após o desmame, os animais receberam dieta comercial Labina®, até atingirem o peso aproximado de 100g, quando então eram distribuídos em dois grupos experimentais, passando a receber dieta normoprotéica (grupo N) com 17% de proteína, ou dieta hipoprotéica (grupo H) com 6% de proteína (TABELA 1). A diferença em calorias resultante da redução de proteínas na dieta H foi compensada com o equivalente em carboidratos, mantendo-a isocalórica. A dieta normoprotéica segue as recomendações do Instituto Americano de Nutrição27 (AIN – 93G) para roedores na fase de crescimento, gravidez e lactação
Ingredientes Normoprotéica (17% de proteína) g/Kg Hipoprotéica (6% de proteína) g/Kg Caseína (84% de proteína)* 202 71,5 Amido 397 480 Dextrina 130,5 159 Sacarose 100 121 Óleo de Soja 70 70 Fibra (microcelulose) 50 50
Mistura se Sais AIN 93G** 35 35
Mistura de Vitaminas AIN 93G** 10 10
L-cistina 3 1
Bitartarato de Colina 2,5 2,5
*Valores corrigidos em função do conteúdo de proteína desejada
** Composição detalhada dada por REEVES, NIELSEN & FAHEY, 1993
As dietas N e H foram ministradas na forma de pó, sendo os ingredientes secos, pesados em balança analítica da marca Marte (modelo A 500, com precisão de 0,01 g), peneirados (malha 200) e homogeneizados. As dietas foram preparadas em quantidade suficiente para todo o estudo, acondicionadas em recipiente de polipropileno hermeticamente fechados e armazenadas a 5˚C.
Todos os procedimentos experimentais tiveram início as 7:00 horas e se estenderam por toda a manhã. As coletas de sangue para as determinações bioquímicas e hormonais, bem como a coleta de tecidos para as análises foram realizadas com os animais no estado alimentado ao final de 15 dias de dieta N ou H. Os animais foram eutanasiados por decapitação e amostras de sangue foram coletadas em heparina sódica para a obtenção de
plasma e sem anticoagulantes para a obtenção de soro. Após a coleta, o sangue com heparina foi centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos para obtenção do plasma. O soro foi separado por centrifugação a 700 rpm durante 15 minutos. Os tecidos adiposos brancos retroperitoneal (TABR) foram coletados por laparotomia mediana, pesados e congelados imediatamente em Nitrogênio e armazenados a -80°C para análises posteriores.
3.2. Determinação in vivo da síntese de ácidos graxos de novo e glicerol
A determinação da síntese de ácidos de novo e de glicerol foi avaliada pela incorporação de trício da 3H2O em ácidos graxos e glicerol de triacilgliceróis (AG-TAG e GLI-TAG). A distribuição da água tritiada pela água corporal e a manutenção da atividade específica constante, tanto no plasma como nos tecidos por longo período, faz com que ela seja a substância radioisotopicamente marcada, de preferência para estudos da lipogênese
in vivo. A incorporação do trítio durante a síntese de ácidos graxos em ligações estáveis C-H, ocorre por meio da troca de 3H com os H dos nucleotídeos de pirimidinas reduzidos (NADPH). A fórmula utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de ácidos graxos é a seguinte:
ppm de 3H incorporados em AG 109 1 nmol de AG/h= _________________________________ X _____ X ____ ppm 3H/átomo - g de H na água corporal 13,3 t2-t1
A fórmula acima é baseada nas premissasde WINDMUELLER E SPAETH33. A atividade específica da água tritiada (ppm de 3H/ml de H2O) é obtida a partir da radioatividade plasmática, considerando que cada ml de plasma contém 0,94 ml de água. O fator 109/13,3 corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em nmol de ácido graxos com 16 átomos de carbono. O cálculo pressupõe que metade de
todos os átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese de ácidos graxos a partir de todas as unidades de dois carbonos, independentemente do tipo de substrato utilizado.
Para avaliar a síntese de GLI-TAG, considera-se que a incorporação de 3H da 3H2O e hidrogênios da glicose e de nucleotídeos de piridina reduzidos53. Dessa forma o 3H-glicerol-TAG reflete a síntese a partir de glicose e de intermediários de três carbonos (gliceroneogênese), mas não da gliceroquinase. JUNCAS (1968)54 demonstrou que o tecido adiposo incubado com 3H2O, U14C-glicose (5mm) na presença de insulina, apresenta uma relação 3H/14C no GLI-TAG de 1,1. Como o glicerol tem três carbonos, 3,3 átomos de 3H são incorporados para cada molécula de glicerol-TAG formada. Desta forma, o fator que converte átomos-grama de H em nmoles de glicerol é 109/3,3.
Para determinação da lipogênese foi administrada água tritiada (3mCi/rato, i.p) nos animais normoprotéicos e hipoprotéicos. Uma hora após, os animais foram eutanasiados por decapitação e o sangue coletado em tubos heparinizados para obtenção do plasma para determinação da atividade específica. O TABR foi retirado e pesado. A extração de lipídeos foi realizada empregando-se clorofórmio:metanol 2:1 completando-se o volume para 10 ml.31 Após a extração, o material foi filtrado e para cada 8 ml de filtrado foram adicionados 1,6 mL de salina. Em seguida, os tubos foram centrifugados à baixa rotação por alguns minutos. A fase superior foi aspirada e a fase inferior (clorofórmica) lavada 3 vezes com mistura da fase superior preparada com clorofórmio, metanol e mistura salina na proporção de 21,1:337:330 (ml), respectivamente. A mistura salina foi preparada com 0,528g de CaCl2.2H2O + 0,732g de MgCl2.6H2O + 5,8g de NaCl + 940 ml de H2O. Uma fração da fase clorofórmica (2mL) foi retirada para evaporação e contagem da radioatividade dos lipídeos totais. Após evaporada, o resíduo era ressuspenso com coquetel de cintilação para determinação da radioatividade Para determinação dos ácidos graxos
4mL da fase clorofórmica foi evaporada e os lipídeos saponificados com 2 ml de KOH etanólico (1ml de KOH saturado para 20 ml de etanol). Os tubos eram fechados com tampa de vidro e submetidos a aquecimento em banho Maria a temperatura de 70-80˚C por duas horas. Após a saponificação foram adicionados 3 ml de água milli-Q, e o tubo mantido a temperatura de 40-50˚C até a evaporação total do álcool. O material saponificado foi então lavado 3 vezes com 8 ml de éter de petróleo para a remoção dos lipídeos não saponificáveis. Posteriormente o material foi acidificado com ácido perclórico 6% e os ácidos graxos extraídos com éter de petróleo. Após a evaporação do conteúdo etéreo, o resíduo foi dissolvido em 10 ml de coquetel de cintilação para contagem de ácidos graxos-TAG. A diferença entre a radioatividade dos lipídeos totais e a incorporada em ácidos graxos foi utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de GLI-TAG. Para a medida da radioatividade foi utilizado o aparelho de cintilação líquida Tri Carb 2100 TR (Packard).
3.3. Medida da atividade das enzimas da síntese de ácidos graxos de novo
Para ensaio das enzimas, Glicose 6-P Desidrogenase, ATP-Citrato Liase e Enzima Málica, foi utilizado o mesmo homogenado. A homogeneização do TABR foi realizado em tampão TRIS 10mM, pH 7,4, sacarose 0,32M, EDTA 2mM e 2-β-mercaptoetanol 5mM seguido de centrifugação a 5.000 rpm por 10 minutos a 4°C. A camada gordurosa superior foi descartada e a fração sobrenadante transferida para outro tubo sendo centrifugada a 13.000 rpm por 2 horas a 4˚C para obtenção da fração citossólica. O conteúdo protéico do homogenado foi determinado pelo método de Lowry 34.
A atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase foi seguida espectrofotometricamente a 340nm, de acordo com o método de LEE (1982)35 A mistura da reação continha TRIS 0,1M pH 8,0, NADP+ 1mM e D-glicose-6-fosfato 1mM. A reação foi iniciada pela adição de glicose-6-fosfato que foi omitida do branco.
3.3.2. Enzima málica
A atividade da enzima málica foi avaliada medindo-se a formação de NADPH a partir de L-malato e NADP+. O método utilizado é essencialmente o descrito por OCHOA,
36 modificado por HSU e LARDY.37.Estas modificações fornecem melhor estabilidade e
linearidade em ampla faixa de concentrações de proteína e tempo. A formação de NADPH foi monitorada em espectrofotômetro (340nm) e o ritmo de sua formação, proporcional à concentração de enzimas. O sistema de ensaio continha tampão Trietanolamina 67mM (pH 7,4), L-malato 5mM, MnCl2.4H2O 4mM, NADP+ 0,2mM. A reação era iniciada com L-malato, que era omitida do branco.
3.3.3. ATP-citrato liase
O ensaio da ATP-citrato liase foi realizado de acordo com o método descrito por SRERE, acompanhando a oxidação do NADH espectrofotometricamente a 340 nm. A mistura de reação continha, tampão Trietanolamina 50mM (pH 7,7) contendo ATP-Mg 7mM, citrato de potássio 10mM, NADH 0,1mM, Coenzima A 0,24mM, 2-mercaptoetanol 10mM, NAD-malato desidrogenase (1U/ml). A reação era iniciada pela adição de citrato de potássio. O NADH foi omitido no branco.
O ensaio da atividade enzimática da LPL foi baseado no método de Nilsson-Ehle & Schotz,38 e se fundamenta na reação, onde os ácidos graxos liberados (14C-oleato) foram separados usando um sistema de partição líquido-líquido. Tomando uma alíquota dos AGL situados na fase polar, e medindo-se a radioatividade correspondente foi calculado o grau de hidrólise dos triacilgliceróis e a atividade da enzima.
LPL
TAG (glicerol tri-14C-oleato) glicerol + (14C-oleato)
O TABR foi homogeneizado em tampão contendo 250mM de sacarose, 1mM de EDTA e 20U/ml de heparina, pH 7,4, mantendo a relação de 0,1:1 (m/v). O homogenado foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante, abaixo da camada gordurosa foi utilizado na avaliação.
O substrato foi preparado no dia anterior ao ensaio e continha 78 µmoles de trioleína fria, 4mg de lisolecitina em clorofórmio e 12,5 µCi de trioleína-14C em tolueno. Após a evaporação todo os solvente orgânico foi evaporado sob corrente de nitrogênio. Posteriormente foram adicionados 5 ml de glicerol e agitados vigorosamente. Ao final do procedimento, a mistura apresentava-se turva, mas voltava à transparência após 10 a 20 horas. Esse substrato é estável a temperatura ambiente e no escuro por 3 meses. Entre as propriedades da lípase lipoprotéica (LPL) importantes para a determinação da sua atividade, estão: inibição por NaCl 5M e requerimento de cofator específico (apolipoproteína C-II).
No dia do ensaio foi preparado a mistura de reação, contendo 2 partes de tampão para LPL (pH 8,8) contendo TRIS 0,2M, albumina bovina livre de ácidos graxos (6%) e cloreto de sódio 0,15 M; 2 partes do substrato e uma parte de soro de rato jejuado (36 horas). A mistura de reação foi agitada em vórtex e 100 µl adicionados em todos os tubos,
inclusive nos tubos “inibidos” que continham 50 µl de NaCl 5M, (reação inibida pelo NaCl). A reação foi iniciada pela adição de 100 µl do homogenado e incubados por 60 minutos a 37˚C, sob agitação (80 ciclos/min). Ao final do período de incubação foram adicionados 3,25 ml de mistura de extração de VAUGHAN (clorofórmio: heptana: etanol na proporção de 1,25 : 1 : 1,41) sob agitação;40 e em seguida 1 ml de tampão carbonato-borato 0,1M pH 10,5 também sob agitação em vórtex. Os tubos de ensaio foram então centrifugados àtemperatura ambiente a 1.000g por 15 minutos. Uma alíquota de 0,8 ml da fase superior aquosa foi colocada em líquido de cintilação SX20 Fischer, para contagem da radioatividade. Para o cálculo da atividade da enzima, foi descontada da radioatividade da amostra, a radioatividade do inibido.
3.5. Velocidade de renovação de noradrenalina
A velocidade de renovação de noradrenalina no TABR de ratos controles e submetidos à dieta hipoprotéica foi avaliada medindo-se o ritmo de queda na concentração de noradrenalina após 6 e 12 horas de administração intraperitoneal de α-metil-tirosina (300mg/Kg de peso corporal), um inibidor da síntese de noradrenalina, que bloqueia a atividade da tirosina hidroxilase. O grupo 12h recebeu uma segunda dose (250mg/kg de peso corporal) da droga, 6 horas após iniciado os experimentos
Após o sacrifício dos animais por deslocamento cervical, o TABR foi rapidamente removido e congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80˚C até o momento da avaliação.
Para determinar o conteúdo de noradrenalina, o tecido foi homogenado em 5,5 ml de ácido perclórico 0,2N (deaerado) contendo metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1 mM. O homogenado foi centrifugado a 3000g por 10 minutos a 4˚C e 4 ml do sobrenadante foi transferido para um tubo contendo 1 ml de tampão TRIS 2M (pH 8,9) com 0,5% de
metabissulfito de sódio e 2,5% de EDTA, previamente deaerado, contendo 50 mg de alumina ativada (30 minutos a 100˚C) e 20 µl de padrão interno (3,4-diidroxibenzilamina, DHBA). Após 20 minutos de agitação em banho Dubnoff, as amostras foram centrifugadas a 7500g por 3 minutos a 4˚C e o sobrenadante foi aspirado. Ao precipitado foram adicionados 3 ml de água milli-Q deaerada contendo 0,5 ml de EDTA 20mM, 100 µl de metabissulfito de sódio 1M e 0,25 ml de TRIS 2M seguido de aspiração do sobrenadante. Esta etapa foi realizada duas vezes. Após a última aspiração foi adicionado ao precipitado, 0,5 ml de ácido perclórico 0,1M contendo metabissulfito de sódio 1mM e EDTA 0,02%. Após 10 minutos de agitação em banho Maria Dubnoff, o sobrenadante foi separado para determinação do conteúdo de noradrenalina por cromatografia líquida de alta performance (HPLC LC-7ª) em coluna de fase reversa.41
A noradrenalina e o padrão interno foram quantificados com o auxílio de um detector eletroquímico (LC-ECD-6ª, Shimadzu).
A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da concentração de noradrenalina no tempo zero (NOR0) e a velocidade de renovação fracional (k).
VR = k . [NOR]0
Após o bloqueio da síntese pela α-metil-tirosina, o declínio na concentração de noradrenalina é dado pela seguinte equação:
[NE] = [NEo] e kt
O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos logarítmos naturais da concentração noradrenalina versus o tempo.42
O intervalo de confiança de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina foi determinado da seguinte maneira:
a) O intervalo de confiança do erro padrão médio da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR0) foi estabelecido. b) Os limites inferiores da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração
de noradrenalina (NOR0) foram multiplicados para determinação do limite inferior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina.
c) Os limites superiores da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR0) foram multiplicados para determinação do limite superior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina.43
O tempo médio de desaparecimento de noradrenalina (t1/2) foi calculado dividindo-se 69,3 pelo valor da velocidade de renovação fracional (k).
3.6. Determinação de corticosterona plasmática
Foi adicionado 1 mL de acetato de etila para cada 1 mL de amostra que foi agitado vigorosamente. Após a separação das fases, a fase orgânica superior foi transferida para um tubo de ensaio. Foi repetida a adição de acetato de etila e separação das fases mais duas ou três vezes, para remover toda a corticosterona da amostra.
O acetato de etila foi evaporado na capela, sob jato de N2. A corticosterona extraída foi dissolvida em 250 µL de tampão de ensaio (10 mL de concentrado do Kit mais 90 mL de água deionizada), agitado e deixado descansar por 5 minutos a temperatura ambiente. Esse procedimento foi repetido mais 2 vezes e as amostras foram usadas imediatamente. Todas as amostras foram feitas em duplicata.
Foram adicionados 100 µL do tampão ensaio numa dupla de poços denominados B0, 100 µL dos padrões 1 a 5 nos respectivos poços (em duplicata), 100 µl das amostras
(em duplicata) nos respectivos poços, 50 µL de tampão de ensaio em poços denominados NSB (ligação não-específica) e 50 µL de conjugado azul em todos os poços, exceto no atividade total (TA) e o branco. Depois foi adicionado 50 µl de anticorpo amarelo em cada poço, exceto no TA, branco e NSB. Todos os poços apresentaram a cor verde, exceto os NSBs, que se apresentaram azuis.
A placa foi incubada em temperatura ambiente, por 2:00 horas sob agitação de 500 rpm. A placa foi selada, por precaução, com o material fornecido. Os poços foram esvaziados e adicionou-se 400 µL de tampão de lavagem (5 mL de concentrado do kit mais 95 mL de água deionizada) em cada poço. Esvaziou-se os poços e a placa foi agitada vigorosamente para remover todo o tampão, depois disso, adicionou-se 5 µL de conjugado azul aos poços TA e 200 µL do substrato de paranitrofenilfosfato (pNpp), onde foi Incubado por 1:00 hora em temperatura ambiente, em repouso.
Após o repouso, foi adicionado 50 µL de solução de parada em cada poço para interromper a reação. A absorbância foi lida em 405 nm, com correção em 570-590 nm. Após a leitura foi subtraído à leitura do branco de todas as amostras.
Cálculo
Absorbância líquida = Absorbância da amostra – Absorbância do NSB
Absorbância líquida
Ligação ao Anticorpo = __________________ × 100
Absorbância B0
Foi montado um gráfico das concentrações dos padrões 1 a 5 versus a ligação ao anticorpo e calculado a corticosterona das amostras por interpolação.
3.7. Análise Estatística
Os resultados foram analisados utilizando-se o Teste t de Student para a comparação das médias dos diferentes tratamentos experimentais. O nível de significância adotado foi de 5%. Para análise dos resultados utilizou-se o programa Statistic for