UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANDERSON DO ESPIRITO SANTO PEREIRA
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE SISTEMAS
NANOCARREADORES PARA O REGULADOR DE
CRESCIMENTO VEGETAL ÁCIDO GIBERÉLICO
DEVELOPMENT AND EVALUATION OF NANOCARRIES
SYSTEMS FOR THE PLANT GROWTH REGULATOR
GIBBERELLIC ACID
CAMPINAS (2017)
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE SISTEMAS
NANOCARREADORES PARA O REGULADOR DE CRESCIMENTO
VEGETAL ÁCIDO GIBERÉLICO
DEVELOPMENT AND EVALUATION OF NANOCARRIES SYSTEM
FOR THE PLANT GROWTH REGULATOR GIBBERELLIC ACID
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de doutor em Biologia Funcional e Molecular na área de Bioquímica.
Thesis Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor in Functional and Molecular Biology in the field of Biochemistry.
Orientador: LEONARDO FERNANDES FRACETO
CAMPINAS (2017)
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA [TESE / DISSERTAÇÃO] DEFENDIDA PELO ALUNO ANDERSON DO ESPIRITO SANTO PEREIRA E ORIENTADA PELO
PROFESSOR LEONARDO FERNANDES
Campinas, 13 de fevereiro de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto Prof. Dr. Halley Caixeta de Oliveira. Profa. Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer Prof.(a) Dr(a). Gerson de Aráujo Medeiros Dr. Cláudio Chrysostomo Wernek
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico minha tese para o Prof. Leonardo Fraceto, meus pais e aos meus avos Horácio e Maria José, João e Maria
(Frida Khalo)
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por toda força e luz que tem me dado nos dias bons e difíceis, por ser meu apoio e segurança, meu amigo eterno, e me guiar sempre no caminho de paz.
Agradecer ao meu orientador Prof. Dr Leonardo Fraceto, pelo apoio durante os últimos anos, pela formação, suporte e paciência. Foi meu professor durante a graduação, meu orientador no mestrado e doutorado.Quero agradecer por ser o exemplo de profissional que é, por ter tido o priviçégio de trabalhar contigo. Sempre levarei teus exemplos comigo.
Agradecer as agências de fomento FAPESP, CONACYT, CNPQ (bolsa de doutorado e bolsa de doutorado sanduiche, programa Ciências sem Fronteiras) pelo apoio financeiro do qual foi fundamental para meu crescimento como profissional e realização do projeto.
Agradecer as universidades UNESP e UNICAMP e o centro de pesquisa “CIQA”, por toda estrutura e apoio dos laboratórios.
Aos meus orientadores mexicanos, Prof. Dr. Jorge Romero e Antônio Ledezma pela recepção, apoio, conversas e amizade. Obrigado por me receberem de braços abertos e por estarem com as portas abertas.
Agradeço por todo apoio que tive pelos parceiros de laboratório, pela ajuda, apoio e por todo tempo passado junto, do qual em especial quero agradecer a Renato Grillo, Nathalie Ferreira Mello, Cintia Maruyama, Jhones Luis de Oliveira, Estefânia Campos, Paula Mayara, Carolina Bueno, Cláudia Watanabe, Eric Satori, Daniele Nakasato, Sara Zavala, Gabriela Padrón, Isela Sandoval e Daniel Caballero.
Agradecer ao grupo de funcionários de todos os institutos que trabalhei, desde aos responsáveis por limpeza, vigilância, ao grupo técnico, secretários, e todos os docentes que estiveram presentes na minha formação desde a graduação até o doutorado em especial da graduação, Renata Lima, Magali Glauzer, Raquel de Mendonça e Silvio Toledo.
Agradecer pelo apoio da minha mãe e meu pai, pela paciência, pelo amor, por estarem ao meu lado, me ajudarem a crescer, se formar, serem compreensíveis, por serem os grandes pais e exemplos que são como sinônimos de força, coragem e humildade.
Quero agradecer aos meus afilhados Renan e Lu por serem meus irmãos de espirito dos quais sempre levo comigo onde eu estiver. Em especial aos meus amigos, Sara Zavala, Nathalia Zoacal, Paulina Lugo, Kauana Iwassaki, Cintia Maruyama, Luciana Campos, Renato Grillo, Marcos Paulo Arrivabene, Vitor Aguirre, Cesar Andres, Richie, Paulo Wakida, Edinho Ribeiro, Pedro Carpigiani, Hernrique Sampaio, Eduardo Geringer e Bruno Vasconcelos. Agradeço a todos os amigos e familiares, em especial meus padrinhos Hilda e Benedito, minhas tias Lucia, Maria, Cibele e, Gloria, Cida, Ana, Joana, Terezinha e Geni, e meus tios, Junior, Francisco, Geraldo, Celso, Roberto, José Horácio, Idevar, Juarez, Arlindo, Nelson, meus avos, e a todos meus primos (as), a Pat e o Doug, que me fazem rir e sentir bem, por fazerem parte de minha vida.
RESUMO:
A agricultura atual enfrenta problemas para manter seus níveis de produção e qualidade devido à perda de espaço cultivável, escassez de nutrientes e água como também as mudanças climáticas. Além destes fatores há a exigência do mercado por produtos com menos resíduos de agroquímicos e sistemas agrícolas mais sustentáveis. A ciência sempre esteve presente no desenvolvimento agrícola e nos últimos anos a nanotecnologia vem sendo uma alternativa para o uso mais eficiente de agroquímicos. Sistemas nanocarreadores podem aumentar a estabilidade físico-quimica assim como a efetividade em campo de um agrotóxico e ao mesmo tempo ser menos danoso ao meio ambiente. Neste sentido a literatura tem apresentado vários sistemas com base nanotecnológica para herbicidas, fungicidas e insecticidas, porém poucos são os sistemas para reguladores de crescimento vegetal. Reguladores de crescimento vegetal são moléculas naturais ou sintéticas que desempenham papel fundamental na agricultura para o desenvolvimento e produção no campo. Entre os diferentes hormônios vegetais está o ácido giberélico (GA3) o qual desempenha diferentes ações bioquímicas e
fisiológicas em diferentes etapas de desenvolvimento no vegetal, porém no campo estes produtos possuem baixa estabilidade devido a processos de degradação. O presente trabalho desenvolveu e avaliou diferentes sistemas nanocarreadores de quitosana (CS) para o carreamento do GA3. No capitulo I apresentamos o desenvolvimento de nanopartículas de CS
com alginato (ALG) (tamanho de 450±10 nm, PDI (índice de polidispersão) de 0,3, potential zeta de -29±0,5 mV) e CS/Tripolifosfato (TPP) (tamanho de 195±1 nm, PDI of 0,3, potencial zeta de +27±3 mV). Neste estudo foram avaliados diferentes sistemas nanocarreadores em relação ao tamanho, PDI, potencial zeta e os diferentes mecanismos de liberação que resultaram em diferentes efeitos biológicos na espécie vegetal Phaseolus vulgaris. Ambos os sistemas apresentaram ótima estabilidade química, avaliados por um período de 60 dias. O destaque foi para o sistema de ALG/CS-GA3 que aumentou o desenvolvimento de órgãos
vegetais (raízes e parte aérea) e fatores a atividade fotossintética (níveis de clorofilas e carotenoídes). No capitulo II foi produzido um sistema nanocarreador baseado no polímero γpoligluâmico (PGA) com CS (tamanho de 117±9 nm, PDI de 0,43±0,07, e potential zeta de -29±0,5 mV). Este sistema apresentou ótimas características coloidais e em ensaios biológicos aumentou o desenvolvimento de raízes laterais. Os três sistemas desenvolvidos possuem grandes perspectivas para aplicação no campo, de forma a apresentar uma formulação com base nanotecnologica para o GA3 que pode resultar em uma alta eficiência no campo. No
capitulo III apresenta-se estudos de fitotoxidade em que se avaliou sistemas nanocarreadores de CS/TPP e lipídicas sólida (SLN) sem carrear ativos químicos, em diferentes espécies vegetais. Os resultados mostraram que é importante a avaliação destes sistemas isolados de forma a evitar futuros danos ao meio ambiente. Para as nanopartículas de SLN não houve efeitos fitotoxicos, porem as nanopartículas de CS/TPP foram capazes de afetar a germinação e o desenvolvimento vegetal, sendo a concentração um fator determinante para a fitotoxidade destas partículas. O presente trabalho mostra o potencial de sistemas carreadores de CS para o GA3,os quais devido as diferentes características possuem diferentes efeitos, o que aumenta
suas possibilidades na aplicação agrícola. O presente estudo também mostra o potencial fitotóxico de que nanopartículas poliméricas sem carrear ativo químico podem causar em vegetais sendo importante a avaliação destes sistemas antes de futuras aplicações.
ABSTRACT:
Agriculture faces problems in maintaining its production and quality levels due to loss of arable land, nutrient and water scarcity as well as climate change. In addition, there is a market demand for products with less agrochemical residues and more sustainable agricultural systems. Science is not present in agricultural development and in recent years nanotechnology has been an alternative to the efficient use of pesticides. Nanocarrier systems increase a physical-chemical stability as well as an effectiveness in the field of a pesticide and at the same time sound less damaging to the environment. This study is based on several nanotechnology-based components for herbicides, fungicides and insecticides, but they are the systems for plant growth regulators. Plant growth regulators are natural or synthetic molecules that play a key role in agriculture for development and production in the field. Among the different plant hormones is gibberellic acid (GA3) which performs different biochemical and physiological actions in different stages of development without vegetables, however, no field these products have low stability due to degradation processes. The present work developed and evaluated different chitosan (CS) nanocarrier systems for GA3 loading. In the capital, we present the development of nanoparticles of CS with alginate (ALG) (size 450 ± 10 nm, PDI of 0.3, zeta potential of -29 ± 0.5 mV) and tripolyphosphate (TPP) 1 nm, PDI of 0.3, zeta potential of + 27 ± 3 mV). This study showed that different nanocrystals systems are the same as size, PDI, zeta potential and the different release mechanisms resulted in different biological effects in the plant nature Phaseolus vulgaris. Both systems exhibited optimum chemical stability, evaluated over a period of 60 days. The prominence of the ALG / CS-GA3 system has increased the development of plant organs and biochemical factors. A transport system with no γ-polygluhamic polymer (PGA) with CS (size 117 ± 9 nm, PDI of 0.43 ± 0.07, and zeta potential of -29 ± 0.5 mV) . This system is presented in several columns and in biological assays increased the development of the apical root, and the number of lateral roots. The three systems developed have great prospects for field application in order to present a nanotechnology-based formulation for GA3 that can result in high efficiency in the field. In Chapter III we present the evaluation studies of CS / TPP and solid lipid carrier systems (SLN) without carrying out chemical actives in different plant species. The results show that it is important to evaluate these isolated systems in order to avoid future damages to the environment. For the nanoparticles of SLN there were no phytotoxic effects, however, the nanoparticles of CS / TPP were able to affect germination and plant development, being a determinant factor for the phytotoxicity of the particles. The present work shows the potential of carrier systems of CS for GA3, which are as different characteristics of use of different effects, which increases their possibilities in agricultural application. The present study also shows the phytotoxic potential that polymeric nanoparticles without active chemical active can cause in vegetables being an important evaluation of systems before future applications.
Sumário
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 14
1.1 HORMÔNIOS VEGETAIS ... 14
1.2 REGULADORES DE CRESCIMENTO VEGETAL ... 15
1.2.1 GA3 ... 17
1.3 NANOENCAPSULAÇÃO:SISTEMAS DE LIBERAÇÃO SUSTENTADA E APLICAÇÕES PARA AGROQUÍMICOS ... 19
1.4 EFEITOS DE NANOPARTPICULAS EM VEGETAIS. ... 21
2. OBJETIVOS ... 24 2.1OBJETIVO GERAL. ... 24 2.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ... 24 3METODOLOGIA GERAL ... 26 3.1MATERIAIS ... 26 3.2METODOS ... 26 3.2.1 Preparo de nanopartículas ... 26 3.2.1.1 Nanopartículas de ALG/CS ... 26 3.2.1.2 Nanopartículas de γ-PGA/CS ... 26 3.2.1.3 Nanopartículas de CS/TPP ... 27
3.2.1.4 Preparo de Nanopartículas Lipídicas Solidas ... 27
3.2.2 Caracterização das nanopartículas ... 27
3.2.2.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ... 27
3.2.2.2 Tamanho, índice de polidispersão e Potencial Zeta ... 27
3.2.2.2.1 Dynamic Light Scattering (Malvern Instruments, UK) ... 27
3.2.2.2.2 Dynamic Light Scattering (NanoFlex (Microtec))... 28
3.2.2.2.3 Potencial Zeta ... 28
3.2.2.2.4 Potencial Zeta ... 28
3.2.2.2.5 Estabilidade química dos polímeros (pH) ... 28
3.2.2.2.6 Eficiência de Encapsulação ... 28
3.2.2.2.7 Metodologia de quantificação do hormônio GA3 ... 29
3.2.2.2.7.1 Equipamento Varian ProStar... 29
3.2.2.2.7.2 Equipamento Agilent Technologies 1200 series ... 29
3.2.3 Ensaio de cinética de liberação e modelagem matemática... 29
3.2.3.1 Ensaio de cinética de liberação ... 29
3.2.3.2 Ensaio de cinética de liberação (Alteração de pH e Temperatura)... 30
3.2.3.3 Modelo matemático de Korsmeyer - Peppas ... 30
3.2.4 Microscopias ... 30
3.2.4.1 Preparo das amostras ... 30
3.2.4.2 Microscopia de força atômica (AFM) ... 31
3.2.4.3 Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM) e Varredura (MEV). ... 31
3.2.4.5 Analises térmicas. ... 31
3.2.4.5.1 Calorimetria Exploratória Diferencial ... 31
3.2.4.5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters) ... 31
3.2.4.5.3 Analises de Termogravemetria (TGA) )(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters) ... 31
3.2.4.6 Fourier transform infrared spectroscopy ... 32
3.2.5 Atividade Biológica e fitotoxidade ... 32
3.2.5.1 Atividade biológica das nanopartículas de ALG/CS3 e CS/TPP-GA3 ... 32
3.2.5.1.1 Determinação do conteúdo de clorofila “a” e “b” e carotenoides... 32
3.2.5.2.2 Atividade biológica das nanopartículas de nano-γPGA/CS-GA3... 33
3.2.5.2.3 Incubação das sementes ... 33
3.2.5.2.2 Avaliação do desenvolvimento vegetal ... 34
3.2.5.2.3 Desenvolvimento vegetal ... 34
3.2.5.3 Avaliação da fitotoxicidade das nanopartículas de CS/TPP e SLN ... 34
3.2.5.3.1 Ensaio de germinação ... 34
3.2.2.2 Avaliação da germinação de sementes ... 35
3.2.6 Analise dos dados ... 35
CHAPTER I ... 36
CHITOSAN NANOPARTICLES AS CARRIER SYSTEMS FOR THE PLANT GROWTH HORMONE GIBBERELLIC ACID ... 36
ABSTRACT: ... 37
2.EXPERIMENTAL ... 40
2.1 Materials ... 40
2.2 Preparation of the ALG/CS and CS/TPP nanoparticles ... 40
2.2.1 ALG/CS nanoparticles ... 40
2.2.2 CS/TPP nanoparticles ... 40
2.3 Characterization of the nanoparticles ... 40
2.3.1 Nanoparticle tracking analysis (NTA) ... 40
2.3.2 Dynamic light scattering... 41
2.3.3 Atomic force microscopy (AFM) ... 41
2.3.4 Zeta potential ... 41
2.3.5 Chemical stability of the polymers (pH) ... 41
2.3.6 Encapsulation efficiency ... 41
2.3.6.1 Methodology for quantification of GA3 ... 42
2.3.7 Differential scanning calorimetry (DSC) ... 42
2.4 Release kinetics assays and mathematical modeling ... 42
2.4.1 Release kinetics ... 42
2.4.2 Release assays at different pH and temperature... 42
2.4.3 Korsmeyer-Peppas mathematical model ... 43
2.5 Biological activity ... 43
2.5.1 Determination of chlorophyll ‘a’, chlorophyll ‘b’, and carotenoids ... 44
2.5.2 Data analysis ... 44
3.RESULTS AND DISCUSSION ... 45
3.1 Characterization of the ALG/CS and CS/TPP nanoparticles ... 45
3.1.1 Release kinetics assays ... 49
3.1.2 Release kinetics at different pH and temperature ... 52
3.2 Differential scanning calorimetry (DSC) ... 55
3.3 Biological activity ... 57
4.CONCLUSIONS ... 60
ACKNOWLEDGMENTS ... 61
CHAPTER II: ... 62
Γ-POLYGLUTAMIC ACID/CHITOSAN NANOPARTICLES FOR THE PLANT GROWTH REGULATOR GIBBERELLIC ACID: CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF BIOLOGICAL ACTIVITY. ... 62
ABSTRACT: ... 63
1.INTRODUCTION ... 64
2.MATERIALS AND METHODS ... 66
2.1 Materials ... 66
2.2 Preparation of nano-γPGA/CS ... 66
2.3 Characterization ... 67
2.3.1 Nanoparticle characterization ... 67
2.3.2 Transmission and scanning electron microscopy (TEM and SEM) ... 67
2.4 Encapsulation efficiency ... 67
2.4.1 Quantification of GA3 by high performance liquid chromatography (HPLC) ... 67
2.5 In vitro release assays ... 68
2.6 Differential scanning calorimetry (DSC) ... 68
2.7 Thermogravimetric analysis (TGA) ... 68
2.8 Bioactivity assays ... 68
2.8.1 Germination assays ... 68
2.8.2 Plant development ... 69
2.8.3 Statistical analysis ... 69
3RESULTS AND DISCUSSION ... 70
3.1 Nanoparticle size, polydispersity index, and pH ... 70
3.2 Release kinetics assays ... 72
3.3 Differential scanning calorimetry (DSC) ... 74
3.4 Thermogravimetric analysis (TGA) ... 76
3.5 Bioactivity assays ... 78
3.5.1 Germination index and root development ... 78
3.5.2 Plant development ... 82
4.CONCLUSIONS ... 83
CHAPTER III: ... 85
EVALUATION OF THE EFFECTS OF POLYMERIC CHITOSAN/TRIPOLYPHOSPHATE AND SOLID LIPID NANOPARTICLES ON GERMINATION AND SEEDLING DEVELOPMENT OF ZEA MAYS, BRASSICA RAPA AND PISUM SATIVUM ... 85
ABSTRACT: ... 86
1. INTRODUCTION ... 87
2. MATERIAL AND METHODS ... 88
2.1 Materials ... 88
2.2 Methods ... 88
2.2.1 Preparation of the nanoparticles ... 88
2.2.2 Characterization of the nanoparticles ... 88
2.2.3 Evaluation of phytotoxicity ... 89
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 90
3.1 Characterization of the CS/TPP and SLN nanoparticles (Initial time assay) ... 90
3.3 Evaluation of phytotoxicity of CS/TPP and SLN ... 91
3.3.1 Effects on germination ... 91
3.3.2 Evaluation of effects on seedling development ... 95
4. CONCLUSIONS ... 98
ACKNOWLEDGMENTS ... 99
3. CONCLUSÕES ... 100
4. PERSPECTIVAS ... 102
Lista de abreviaturas e siglas
AFM: Microscopia de força atômicaALG/CS: Nanopartículas de Alginato e Quitosana sem carrear ativo quimico ALG/CS-GA3: Nanopartículas de Alginato e Quitosana com ácido giberélico 3
ALG: Polímero Alginato
CS/TPP: Nanopartículas de Cuitosana com Tripolifosfato sem carrear ativo quimico CS/TPP-GA3: Nanopartículas de Quitosana com tripolifosfato com Ácido giberélico 3
CS: Polímero Quitosana
DLS: Espalhamento dinâmico de Luz GA: Classe das Giberelinas
GA3: Ácido Giberélico 3
HPLC: Cromatografia Líquida de Alta eficiência
Nano- γ-PGA-GA3: Nanopartículas de γ-poliglutâmico e Quitosana com Ácido giberélico 3 Nano-γ-PGA: Nanopartículas de γ-poliglutâmico com Quitosana sem carrear ativo quimico NTA: Nano Tracking Analysis
PCL: Polímero Poli-épsilon Caprolactona PDI: Índice de Polidispersão
PGRs: Regulador de crescimento Vegetal pH: Potencial Hidrogiônico
PVA:Poli-vinil-álcool
SEM: Microscopia Eletrônica de Varreduta SLN: Nanopartículas Lipídicas Sólidas TEM: Microscopia Eletrônica de Trasmissão TGA: Analise de Termogravimétria
TPP: Tripolifosfato de Sódio γ-PGA: Polímero γ-poliglutâmico
1. Introdução geral
1.1 Hormônios Vegetais
Hormônios vegetais ou fitohormônios são moléculas produzidas naturalmente em plantas, que em baixas concentrações influenciam processos bioquímicos e fisiológicos nos vegetais (DAVIES, 2013). Os hormônios vegetais são divididos em classes, entre as quais estão as auxinas, giberelinas (GA), citocininas, ácido abscísico e etileno, sendo descobertas novas classes como jasmonato, brassinosteróides e ácido salicílico (JOHRI & MITRA, 2001).
Os hormônios vegetais são sinalizadores para a comunicação entre as raízes e a parte aérea, para o funcionamento do organismo vegetal (SHABALA et al., 2016). Estes estão relacionados com todos os processos de desenvolvimento vegetal, que vão desde a germinação, até a formação de raízes, caule, folhas, flores e frutos (DURBAK et al., 2012; PERILLI et al., 2012; VANSTRAELEN & BENKOVÁ, 2012) como também em processos fisiológicos em resposta ao estresse abiótico (ATKINSON & URWIN, 2012; RYU & CHO, 2015) e biótico (DENANCÉ et al., 2013; PIETERSE et al., 2012; YANG et al., 2013).
A ação de cada hormônio vegetal é determinada por sua disponibilidade, que pode atuar diretamente ou desencadear uma rede de diferentes hormônios atuando em diferentes estágios ou condições dos vegetais (VANSTRAELEN & BENKOVÁ, 2012). Por exemplo, entre outras funções as auxinas, citocininas e o GA atuam na elongação celular enquanto como também atuam na divisão celular, o ácido abscísico possuí função no fechamento de estômatos e o etileno com maturação de frutos (JOHRI & MITRA, 2001).
Em sementes, o estado de dormência é regulado pelo ácido abscísico sendo que os fatores da redução dos níveis deste hormônio e o aumento do GA resultam no processo de germinação das sementes (MIRANSARI & SMITH, 2014; SHU et al., 2016). As GA atuam na germinação, na síntese e produção de amilases, como α–amilase, e também de proteases e β–glucanases que atuam na clivagem do endosperma das sementes gerando fonte de energia para o embrião (MIRANSARI & SMITH, 2014). Os hormônios vegetais controlam a divisão e/ou expansão celular. Por exemplo, as auxinas induzem a expressão de proteínas e estimulam a proteólise durante o cliclo celular, os GA regulam o ciclo celular e o ácido abscísico atua como um inibidor da divisão celular (UBEDA-TOMÁS et al., 2012).
As auxinas são fundamentais para formação das raízes podendo agir de forma direta ou de forma antagônica com outros hormônios para a formação das raízes primárias ou laterais (SAINI et al., 2013; YAMADA & SAWA, 2013). Plantas em condições de estresse hídrico
possuem fechamento dos estômatos pela ação do ácido abscísico, e ao mesmo tempo redução das citocininas que estimulam a divisão celular reduzindo gastos de energia pelo vegetal (WILKINSON et al., 2012).
A formação do protoxilema nas raízes é devido a uma razão entre os hormônios auxinas e citocininas, em que o aumento de citocininas funciona como um regulador negativo (KONDO et al., 2014; SMET & DE RYBEL, 2016). O etileno pode atuar inibindo a síntese de DNA e a divisão celular, e também é um regulador negativo para a auxina, fator relacionado com a dormência apical entre outros fatores (BURG, 1973; JU et al., 2015). Os hormônios vegetais também possuem ação sobre a regulação de aquaporinas, responsáveis pela absorção de água, gases e metaloides (LI et al., 2014).
Existe também a relação de hormônios vegetais com defesa da planta, através de uma rede de sinalização, para detecção e combate de herbívoros como insetos ou interações de mutualismo, em que o principal hormônio atuante são as citocininas (GIRON et al., 2013; MITHÖFER & BOLAND, 2012). Devido às diversas funções e diferentes tipos de ações que os hormônios vegetais possuem sobre as plantas, estes começaram a ser produzidos para aplicação agrícola visando maior qualidade e produção, sendo conhecidos como uma classe de agroquímicos denominado de “Reguladores de Crescimento Vegetal”.
1.2 Reguladores de crescimento vegetal
Reguladores de Crescimento Vegetal são uma classe de agroquímicos, baseados em hormônios vegetais podendo ser de origem natural ou sintética, aplicados no campo para alterar o metabolismo vegetal (RADEMACHER, 2015). Na agricultura, as aplicações em diferentes etapas de cultivo podem atuar desde a germinação até o desenvolvimento vegetal e produção, em que o uso destes produtos pode resultar em maior rendimento para os agricultores (PET, 2014).
Por exemplo, hormônios como ácido naftaleno acético e brassinosteróides aplicados de forma exógena na espécie Glycine max L. marril (soja), resultaram no aumento da massa seca folhar, o número de ramos e órgãos reprodutivos, aumentando a atividade fotossintética e o nível de proteínas nas sementes (RAMESH & RAMPRASAD, 2015).
O tratamento foliar da espécie Jatropha curcas (pinhão manso) com os hormônios citocininas e inibidores de auxinas resultaram em frutos maiores e maior quantidade de sementes por fruto, sendo estas sementes ricas em óleo vegetal (ABDELGADIR et al., 2010).
A aplicação de citocininas e GA3 na espécie Simmondsia chinensis (Jojoba) resultou no
aumento da parte aérea, como o número de nós no tronco e nos ramos, o número de flores aumentou com a aplicação de citocininas (PRAT at al., 2008).
O uso de GA3 em videiras é comum para o aumento do fruto e peso. O uso também esta
relacionado com a indução da paternocarpia gerando frutos sem sementes (VAROQUAUX & colab., 2000). A aplicação de GA3 na espécie Trigonella foenum – gracecum (feno grego), em
combinação com fósforo foi capaz de aumentar atividade de enzimas como nitrato redutase e anidrase carbônica e aumentar a produção de sementes, assim como o conteúdo total de clorofila e carotenóides (DAR et al., 2015a).
Outros estudos também reportam o uso de reguladores de crescimento vegetal com o aumento do conteúdo nutricional. A aplicação dos hormônios vegetais metil jasmonato e ácido salicílico sobre a espécie vegetal Coriandrum sativum L. (Coentro) foi capaz de aumentar a concentração de carotenoides e ácidos fenólicos, aumentando os níveis de β– caroteno, luteína, clorofila e ácido clorogênico (DIVYA et al., 2014).
Os hormônios vegetais ácido naftaleno acético, GA3, 6-benzil adenina e acido salicílico,
na espécie Phoenix dactylifera (tamareira) aumentaram os níveis de flavonoides, da atividade antioxidante, conteúdo fenólico e aumento de vitamina C (MOHAMED et al., 2014). A aplicação de hormônios cinetina sobre a espécie Lens culinaris medic (lentilha) aumentou o conteúdo de flavonoides, como também da epicatequina, rutina e ácido gálico, e de fatores de interesse em questão nutricional (GIANNAKOULA et al., 2012).
Hormônios vegetais também podem ser usados para melhorar qualidade comercial de frutos. Segundo ZHANG & WHITING (2013) a aplicação de citocinina, GA (GA1, GA3 e
GA4/7) e um inibidor da síntese de ácido abscísico em Prunus avium L. (cereja) foi capaz de
manipular o tamanho das sementes, peso dos frutos ou formação do mesocarpo e endocarpo das frutas. De acordo com MARZOUK & KASSEM (2011) a aplicação de GA3, ácido
salicílico, forclorfenurão e etileno, resultou em produtos de melhor qualidade para comercialização com bagas mais firmes e durante a estocagem diminuiu a perda de bagas.
Aplicações de Reguladores de Crescimento vegetal podem prolongar o tempo de estocagem e manter a qualidade dos produtos. A aplicação de etileno exógeno na espécie
Solanun tuberosum L. (batata) resultou em aumento de ácido abscísico endógeno nos
tubérculos, reduzindo o brotamento dos tubérculos durante a estocagem (FOUKARAKI et al., 2016). Segundo Huang & Jiang (2012) a aplicação de GA3 e forclorfenurão após a colheita
para as espécies Musa spp (banana) e Brassica oleracea (brócolis), retardou a maturação, reduziu a alteração da coloração, diminuiu a respiração vegetal e promoveu perda de água.
As aplicações de diferentes reguladores de crescimento vegetal possuí grande aplicação na micropropagação vegetal, para indução na formação de tecidos vegetais no estado de calo, e posterior formação de raízes e parte aérea. Esta técnica pode ser aplicada ainda em clonagem vegetal, melhoramento genético ou preservação de espécies em extinção (BUTT et al., 2015; ROUT et al., 2006).
Os estudos citados acima reportam aplicações de hormônios vegetais sobre espécies vegetais que podem contribuir para o aumento de produção, qualidade comercial e nutricional, que podem resultar em aplicação alimentar ou geração de energia, por exemplo, biocombustíveis.
1.2.1 GA3
A classe das GA foi descoberta em 1950, em cultivos de arroz que apresentavam uma doença denominada “bakanae”, que gerava plantas maiores e perda de sementes. Estudos mostraram que esta doença estava relacionada com o fungo patogênico gibberella fujikuroi (GUPTA & CHAKRABARTY, 2013; HEDDEN & SPONSEL, 2015a).
Desde a sua descoberta este hormônio vegetal vem sendo produzido industrialmente através de processos fermentativos (GÖKDERE & ATEŞ, 2014; HAMAYUN et al., 2010; RANGASWAMY, 2012). Possui importância econômica para a indústria e agricultura devido sua produção para produtos na aplicação agrícola e os efeitos no vegetal (RODRIGUES et al., 2012).
As GA são constituintes do grupo de diterpenóides tetracíclicos (DAR et al., 2015a). A nomenclatura das GA é dada pela abreviação “GA” em que o número (ex: GA1, GA2...GX)
diferencia os tipos de GA, numerados de acordo com sua descoberta (HEDDEN & SPONSEL, 2015a).
O uso de GA3 (Fig. 1) é comum para a quebra de dormência das sementes em condições
Fig 1: Estrutura química do ácido giberélico (GA3).
No processo de germinação este hormônio funciona como um sinalizador para a produção de α–amilases pelas células da camada de aleurona, que são liberadoas no endosperma das sementes. Os produtos da hidrolise enzimática do amido são usados como fonte de energia pelo embrião (KONDHARE & colab., 2015; MEDEIROS et al., 2015).
Possui efeitos morfológicos e bioquímicos, gerando o aumento do peso dos órgão vegetais e frutos, maior número de inflorescências e de sementes como o aumento do conteúdo clorofila a e b, carboidratos e proteínas (AWAD & AL-QURASHI, 2012a; DONG et al., 2012; ZANG et al., 2016). Pode ser usado para a indução da florescência, aumento do número de flores e desenvolvimento floral (CHRISTIAENS et al., 2012; HAN, et al., 2014; IQBAL & ASHRAF, 2013; SUMANASIRI et al., 2013). Dependendo da concentração sua aplicação diminui o número de flores o que reduz custos com desbastes em lavouras (GONZÁLEZ-ROSSIA et al., 2006).
O uso esta relacionado com o aumento da produção, como também o controle do tempo de frutificação e de colheita (KHAJEHYAR et al., 2015; ULLAH et al., 2014). A aplicação antes da colheita pode resultar em frutos mais firmes, de maior qualidade e com maior durabilidade durante a estocagem (DAGAR et al., 2012).
O uso de GA3 em plantações agrícolas ou para plantas ornamentais possuí um grande
campo de aplicações devido às suas propriedades que podem alterar processos fisiológicos, bioquímicos e a morfologia do vegetal (GUPTA & CHAKRABARTY, 2013; RODRIGUES
OH
O
O
H
O
H
H
CH
2CH
3O
O
H
et al., 2012). Porém um dos problemas encontrados é a sua degradação devido à instabilidade química por fatores como fotólise, hidrólise e mudanças de temperatura quando aplicado em campo, o que reduz sua atividade biológica, sendo uma das atuais soluções para estes problemas o uso de sistemas de liberação controlada (LIU, et al., 2013a) .
1.3 Nanoencapsulação: Sistemas de liberação sustentada e aplicações para agroquímicos
A nanoencapsulação de ingredientes ativos, que possui grandes aplicações em diferentes áreas, baseia-se em que nanopartículas possam envolver e/ou aderir moléculas químicas formando capsulas ou esferas (EZHILARASI et al., 2012).
A encapsulação faz uma proteção para o ativo químico, aumenta sua estabilidade química e reduz processos de degradação da cadeia polimérica (SHAIK et al., 2012). A liberação do ativo químico pode ocorrer através da degradação, por processos de relaxamento da matriz ou difusão da partícula sendo liberado lentamente para o meio externo (KORSMEYER et al., 1983).
Isto gera um sistema de liberação sustentada que prolonga o tempo de ação de um ativo químico e resulta no aumento da sua atividade química e biológica (AQIL et al., 2013; TING et al., 2014).
Na agricultura o uso de agroquímicos para aplicação agrícola precisa ser, estável, de fácil aplicação e eficiente para evitar perdas de ativos químicos, principalmente para produtos que causam danos e contaminação ao meio ambiente (PÉREZ-DE-LUQUE & HERMOSÍN, 2013). A nanoencapsulação pode agregar estas propriedades aos agroquímicos, tornando estes mais adequados para o uso em campo, em que as vantagens são: maior estabilidade físico-química, tempo de ação, distribuição foliar, aumento da atividade biológica, redução da concentração de uso, toxicidade e contaminação ambiental (KHOT et al., 2012; NAIR et al., 2010). Estes sistemas são aplicados a diferentes classes de agroquímicos, como exemplo, herbicidas, fungicidas, inseticidas, reguladores de crescimento vegetal entre outros (KASHYAP et al., 2015; NURUZZAMAN et al., 2016).
Os sistemas de liberação de nanopartículas possuem propriedades diferentes, que dependem do material de que são feitos, das propriedades físico-química das partículas e dos mecanismos de liberação. Por exemplo, segundo Stloukal et al. (2012) as nanopartículas de poli-ácido láctico para o carreamento do herbicida metolacloro, partículas menores possuem
uma liberação maior nas primeiras horas de ensaio, enquanto as partículas maiores, uma liberação mais lenta, mediado por processo de difusão.
De acordo com Prado et al. (2011) nanopartículas de sílica (< 50 nm) como sistema de liberação para os herbicidas 2,4-D e picloram mantiveram a liberação por um período de 30 dias. Estes sistemas além de prolongarem o tempo de liberação podem resultar em menor mobilidade do herbicida no solo (LI et al., 2012), como também uma maior atividade herbicida. Em estudos de atividade herbicida e lixiviação, Cea et al. (2010) mostraram que o encapsulamento do herbicida atrazina por microsferas de etilcelulose com modificação da superfície pela adição de argilas ou nanoargilas, reduziram a mobilidade da atrazina no solo, como também aumentou sua eficiência no controle de plantas alvos.
O uso de sistemas carreadores pode reduzir processos de degradação, Nguyen, et al. (2012) descreve que nanopartículas lipídicas solidas recobertas por quitosana (~200 nm) foram capazes de reduzir processos de fotodegradação do inseticida deltametrina. Segundo Maruyama et al. (2016) o uso de sistemas carreadores de quitosana (~400 nm) para o carreamento combinado dos herbicidas imazapic e imazapir reduziram os efeitos citotóxicos e genotóxicos, tornando soluções mais seguras para aplicação.
Oliveira et al. ( 2015a) mostraram que nanopartículas lipídicas solidas (~255 nm) foram efetivos em tratamentos pré e pós-emergente no controle de plantas alvos usando uma menor concentração de herbicida. Oliveira, et al. (2015a) para nanopartículas de poli-épsilon caprolactona (PCL) para o herbicida atrazina (240 nm), mesmo quando diluída 10 vezes, ainda manteve atividade herbicida.
Em estudos de atividade de nanopartículas de ALG (150 nm) como carreador do inseticida imidacloprida, Kumar et al. (2014), mostraram que estas foram eficazes para o controle da praga, como também reduziram a toxidade do inseticida quando encapsulado.
Segundo Campos et al. (2015) o uso de nanopartículas lipídicas sólidas para o carreamento dos fungicidas tebuconazol e carbendazim reduziram os efeitos citotóxicos destes produtos. De acordo com os estudos citados acima, a encapsulação de agroquímicos pode resultar em formulações ideais para aplicação agrícola, sendo mais eficazes no controle de pragas e menos toxicas para outros organismos que são expostos a estes produtos.
Os fatores da redução de ativo químico aplicado no campo e dos processos reduz a contaminação do meio ambiente, sendo interessante a aplicação destes sistemas para todos os tipos de agroquímicos, tornando a agricultura e produtos agrícolas mais seguros em relação a
contaminação do meio ambiente ou de produtos alimentícios por agroquímicos. Poucos sistemas foram desenvolvidos para reguladores de crescimento vegetal (QUIÑONES et al, 2010; TAO et al., 2012b), sendo as propriedades citadas acima ideais para o regulador de crescimento vegetal GA3. Neste contexto o presente estudo desenvolveu e avaliou diferentes
sistemas carreadores de CS para o regulador de crescimento vegetal GA3. 1.4 Efeitos de nanopartpiculas em vegetais.
Vários sistemas nanoparticulados vem sido propostos para aplicação agrícola, o que resultara na exposição destes materiais a diferentes organismos vivo, sendo necessário avaliar estes, de forma a não causarem impacto ao meio ambiente (FRACETO et al., 2016; KAH & HOFMANN, 2014; NAIR et al., 2010).
Uma vez no ecossistema, as nanopartículas podem estar presentes na base da cadeia alimentar, que são os vegetais, e resultar em efeitos bioacumulativos(CIFUENTES et al., 2010; HUSEN & SIDDIQI, 2014a; YIN et al., 2011a). As características das nanopartículas como a morfologia, tamanho, a carga de superfície e a concentração do material, determina a interação destes com o vegetal, podendo resultar em diferentes respostas biológicas (ABRAHAM et al., 2013b; ZHU et al., 2012b).
As nanopartículas podem ser ou não internalizadas pelos vegetais, na maioria dos casos são absorvidos (HUSEN & SIDDIQI, 2014). A exposição pode ocorre em sementes, ou diferentes órgãos vegetais, e resultar em efeitos metabólicos, que podem aumentar ou inibir o desenvolvimento vegetal (MA et al., 2010).
Vários fatores podem estar envolvidos na captação das nanopartículas por vegetais como também como estas afetam o organismo vegetal, como exemplo sua hidrofobicidade e a carga de superfície (ZHU et al., 2012b). Cada material pode ter uma rota de entrada no vegetal, podendo ser apoplástico (através da parede celular ou espações intracelulares) ou simplástico (célula a célula) (LARUE et. al, 2014; LIN & XING, 2008; WANG, et al., 2012).
Os mecanismos de entrada de nanopartículas ainda não são claros, porem a carga da partícula influência como estas são capitadas por plantas. A parede celular vegetal incluindo a epiderme das raízes possuem carga negativa devido a grande quantidade de polissacarídeos, contendo ácido galacturônico e ácido glucurônico (ZHU et al., 2012b).
Outros 70 – 90 % que promovem uma carga negativa parede celular vegetal são devido a presença de pectina e glucuronoarabinoxilan , proteínas e ligninas que podem atrair as
partículas com carga positiva. As nanopartículas podem entrar em poros, como também aumentar a permeabilidade criando novos poros (ZHU et al., 2012b).
Pela região apical das sementes as nanopartículas podem entrar por endocitose. Para nanopartículas negativas quando estas penetram o sistemas vascular, estas podem ser transportadas rapidamente por efeitos da pressão osmótica, forças capilares ou transpiração, para a parte aérea porém a translocação é maior quando comparado com partículas de carga positiva (ZHU et al., 2012b).
Sendo assim são necessários estudos que avaliem como ocorre esta interação com vegetais, e como as características destes materiais alteram o metabolismo vegetal, se estes podem bioacumular em diferentes organismos e permanecer no meio ambiente (CIFUENTES et al., 2010; LAURUE et al., 2014). Poucos estudos demonstram a interação de nanopartículas poliméricas com vegetais, sendo a maioria dos estudos referentes a nanopartículas metálicas, ou materiais com base em carbono. As características destes materiais como suas propriedades físico-químicas podem causar diferentes respostas em vegetais como estimulantes ou fitotoxicas (CHEN et al., 2010; CIFUENTES et al., 2010; DJIKANOVIĆ et al., 2012; MONDAL et al., 2011).
Por exemplo, segundo Khodakovskaya e colaboradores (2009, 2013), nanotubos de carbono estimulam a germinação, e o desenvolvimento de tabaco e tomate. A concentração usada de nanotubos de carbono determina o estimulo (divisão celular, expressão genica e captação de água) ou inibição do desenvolvimento vegetal.
Estudos com nanopartículas metálicas, como de TiO2, partículas abaixo de 36nm foram
mais viáveis em penetrar células de Triticum aestivum, se acumulando na epiderme e parênquima (LARUE et al., 2012). Sendo que quando estas partículas possuíam tamanho entre 12-25 nanometros foram capazes de chegar nos tecidos vasculares. Uma vez capitada, estas podem causar respostas morfológicas e biológicas nos vegetais, por exemplo, na espécie
Cucumis sativis, as nanopartículas de TiO2, foram capazer de aumentar o nível de nitrogênio,
aumentar o desenvolvimento das raízes (SERVIN et al., 2012).
A concentração de nanopartículas é um fator de importante para determinar seus efeitos, por exemplo, para as espécies Nicotiana tabacum, Brassica juncea e Capsicum annuum, altas concentrações de nanopartículas geraram acumulo na superfície das raízes, causando dano celular e baixas concentrações o aumento do desenvolvimento das raízes (MCDANIEL et al., 2013). Nanopartículas de ZnO2, dependendo do tamanho podem ser internalizadas dentro do
tecido vegetal, quando internalizadas, resultam na inibição do desenvolvimento vegetal (LIN & XING, 2008; WANG, et al., 2013). Alguns estudos relatam que nanopartículas de ouro podem aumentar o desenvolvimento vegetal, em que durante a produção, pode resultar no aumento do número de flores (ARORA et al., 2012; KUMAR, et al., 2013).
Para nanopartículas de prata, estudos em Oriza sativa, mostram que a exposição a estas nanopartículas causam danos celulares, e reduzem a massa vegetal (MIRZAJANI et al., 2013). Segundo Yin e colaboradores (2011), as nanopartículas de prata, mesmo quando sua superfície foi alterada com goma arábica, a exposição na espécie Lollium multiflorum, geraram efeitos fitotóxicos, como a inibição do desenvolvimento das raízes, formação de grandes vacúolos nas células causando o rompimento das mesmas.
Poucos estudos se referem aos efeitos de sistemas nanocarreadores poliméricos em vegetais, estes possuem grande aplicação na agricultura sendo necessário estudos que avaliem seus efeitos, para que estes possam ser seguros para a aplicação em campo, não reduzam a efetividade de um agroquímico e não se tornem uma nova fonte de contaminação ambiental.
2. Objetivos 2.1 Objetivo geral.
O presente estudo teve como objetivo produzir formulações com base nanotecnológica, desenvolvendo diferentes sistemas carreadores de CS para o regulador de crescimento vegetal GA3. Estes sistemas foram propostos para aumentar a estabilidade
química e a eficiência biológica deste hormônio vegetal. O segundo objetivo deste trabalho foi avaliar dois sistemas carreadores em relação ao potencial fitotoxico destas nanopartículas em três espécies vegetais, de forma a precaver possíveis danos que estes produtos com base em nanopartículas possam causar a espécies vegetais
2.2 Objetivos específicos. Capítulo I:
O primeiro capítulo teve como objetivo específico o preparo e caracterização de sistemas nanocarreadores de ALG/CS e CS/TPP. Estes foram caracterizados em relação ás características como tamanho, potencial zeta, pH e eficiência de encapsulação de forma a ser a primeira caracterização destas nanopartículas após o prepraro e avaliar sua estabilidade após o período de 60 dias. Foi realizado Microscopia de Força Atômica (AFM), de forma a validar o tamanho das nanopartículas como também mostrar o formato das mesmas. De forma a mostrar a diferenciação da liberação entre o hormônio encapsulado com o ativo livre, foi realizado um ensaio de liberação, os resultados provenientes do ensaio foram trtados pelo modelo matemático de Korsmeyer-Peppas para elucidação do mecanismo de liberação. Os sistemas passaram por analises de DSC (Calorimetria Exploratória Diferencial) de forma a avaliar possíveis interações entre os componentes do preparo das nanopartículas como também do GA3 com a nanopartículas. Por último os sistemas foram avaliados em relação a
atividade biológica na espécie Phaseolus vulgaris em relação as variáveis, desenvolviemento das raízes, parte aérea, área foliar, níveis de clorofila “a” e “b” e níveis de caratenóides de forma a mostrar a eficácia das nanopartículas em comparação ao ativo livre.
Capitulo II:
O segundo capítulo teve como objetivo específico o preparo e desenvolvimento do sistema nanocarreador de γ-PGA/CS, este foi caracterizado em relação ao características de tamanho, PDI, potencial zeta, pH e eficiência de encapsulação. As caracterizações iniciais foram validadas por análises de microscopia por microscopia eletrônica de transmissão
(TEM) e microscopia eletronia de varredura (MEV), por estas técinicas de microscópia também foram possíveis avaliar a morfologia destas nanopartículas. Foi realizado o ensaio de liberação para avaliar o tempo de liberação do GA3, quando encapsulado e livre. Foram
realizadas analises de térmicas, por DSC e termogravimetria (TGA), para esclarecer possíveis interações entre os polímeros como também o GA3, com as nanopartículas. Por último, a avaliação da atividade biológica em Phaseolus vulgaris em relação as variáveis velocidade de germinação e desenvolvimento das raízes, e avaliação do desenvolvimento vegetal em relação ao comprimeto das raízes e parte aérea e área foliar de forma a demonstrar a atividade biológica do sistemas nanocarreador.
Capitulo III
O capitulo III teve como objetivo espécifico avaliar as características das nanopartículas e a fitotoxicidade de dois sistemas nanocarreadores (CS/TPP e SLN). Foi realizada uma caracterização em relação às características tamanho, PDI, concentração, potencial zeta, pH. Atraves de ensaio de germinação foi avaliadaa fitotoxidade dos sistemas carreadores CS/TPP e SLN sobre as espécies Zea mays, Brassica Rapa e Pisum sativum usando como parâmetros as variáveis germinação, desenvolvimento das raízes e parte aérea.
3 Metodologia Geral
3.1 Materiais
O hormônio vegetal GA3, alginato de sódio, quitosana e tripolifosfato, poli-vinil álcool
(PVA) foram adquiridos pela Sigma Aldrich. O polímero γ-poliflutâmico foi produzido no “Centro de Investigación en Química Aplicada-CIQA, Saltillo, Coahuila-México) Acetonitrila e ácido acético (grau para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) foram adquiridos da JT Baker. Os filtros de ultrafiltração e membranas de celulose foram adquiridos da Millipore®. As sementes de Phaseolus vulgaris, foram coletadas no campo na cidade de São Miguel Arcanjo-SP. As sementes de Brassica rapa, Zea mays e Pisum sativum foram compradas da empresa ISLA sementes. O substrato vegetal usado para os experimentos foram da marca California.
3.2 Metodos
3.2.1 Preparo de nanopartículas 3.2.1.1 Nanopartículas de ALG/CS
As nanopartículas de ALG/CS foram preparadas de acordo com o método de pré-gelificação ionotrópica proposto por Sarmento e colaboradores (2006). Inicialmente com auxílio de uma bomba peristáltica (Miniplus 3, Gilson) foi adicionado pelo período de 60 minutos, 3,75 mL de uma solução de CaCl2 (18 mM) à 59 mL de uma solução de ALG
(0,063%, pH de 4,9) que se manteve sobre forte agitação magnética. Durante esta etapa do processo ocorre a reticulação do CaCl2 sobre o ALG através de interações iônicas formando
uma estrutura denominada “eggbox”. Após este processo foi adicionado o hormônio vegetal GA3 de forma que a concentração final fosse de 50 µg/mL. Manteve-se esta solução sobre
forte agitação e com auxílio de bomba peristáltica foi adicionado 12,5 mL de solução de quitosana (0,07%, pH 4,6) preparada em solução aquosa contendo 5,7% de ácido acético pelo período de 90 minutos formando um complexo polieletrolítico entre os polímeros. O mesmo procedimento foi realizado sem a presença do hormônio.
3.2.1.2 Nanopartículas de γ-PGA/CS
As nanopartículas foram preparadas de acordo com o método de pré geleificação iônica proposto por Sarmento e colaboradores, (2006) com modificações. Inicialmente uma solução de CaCl2 (25mM) foi adicionada com o auxílio de uma bomba peristáltica pelo
agitação. Em seguida, 12,5 mL de uma solução de CS (0.07%, pH 4.5) foi adicionado a solução de γ-PGA/CaCl2 com o auxilio de uma bomba peristáltica por uma hora e trinta
minutos. Foram preparadas nanopartículas com e sem GA3, sendo que a adição de ativo foi
realizada após a aplicação da solução de cloreto de cálcio. A concentração final de GA3 nas
suspensões de nanopartículas foi de 50 µg/mL. 3.2.1.3 Nanopartículas de CS/TPP
As nanopartículas de CS/TPP foram preparadas pelo método de gelificação proposto por Calvo e colaboradores (1997) com modificações. Inicialmente 10 mL de uma solução aquosa de CS (0,2%, pH 4,5 com 0,6% de ácido acético), foi mantida sobre forte agitação, sendo adicionado o GA3 para que a concentração final fosse de 50 µg/mL. Após dissolução do
ativo foram adicionados 6 mL de solução aquosa de TPP (0,1%, pH 4,5 à 4°C). Também foram preparadas nanopartículas sem a presença do hormônio.
3.2.1.4 Preparo de Nanopartículas Lipídicas Solidas
As SLN foram preparadas de acordo com a metodologia proposta por Vitorino e colaboradores (2011). Inicialmente 5 mL de uma solução orgânica de clorofórmio contendo gliceril tripalmitato (75 %) foi vertida em 30 mL de uma solução aquosa de álcool polivinílico (0,6%), em seguida submetida á sonicação por 5 minutos a uma potência de 40 W. A pré– emulsão formada foi submetida à agitação em um ultraturrax por 7 minutos. O solvente foi removido por rotaevaporação e o volume final da solução foi de 20 mL.
3.2.2Caracterização das nanopartículas
3.2.2.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
Para avaliação da distribuição de tamanho e determinação da concentração de nanopartículas nas formulações, foi utilizada a técnica de Nanoparticle Tracking Analisys-NTA (modelo LM-10–Malvern Instruments, UK). Para as análises 10µL da formulação de nanopartículas (ALG/CS ou CS/TPP) foram diluidas em 990 µL de água deionizada. Cada amostra foi medida 10 vezes, sendo que, para cada medida foram contadas aproximadamente 4000 partículas. As medidas foram realizadas a 25°C.
3.2.2.2 Tamanho, índice de polidispersão e Potencial Zeta 3.2.2.2.1 Dynamic Light Scattering (Malvern Instruments, UK)
A distribuição de tamanho das nanopartículas, bem como o índice de polidispersão foram medidos pela técnica Dynamics Light Scattering (DLS). Para avaliação do tamanho (nm) e o índice de polidispersão (PDI) as medidas foram realizadas no equipamento Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, UK). As amostras foram analisadas em triplicata, a 25°C com espalhamento de luz para detecção a um ângulo de 90°.
3.2.2.2.2 Dynamic Light Scattering (NanoFlex (Microtec))
Foram obtidos dados referentes ao tamanho (nm) e o índice de polidispersão das nanopartículas através de equipamento NanoFlex (Microtec, CIQA, Saltillo, México). As amostras foram analisadas em triplicada à 25°C.
3.2.2.2.3 Potencial Zeta
Os valores de potencial zeta foram obtidos através de eletroforese, sendo os valores expressos em mV. As formulações foram analisadas em triplicata, a 25°C usando o equipamento Zetasizer (Malvern ZS90, Malvern Instruments, UK).
3.2.2.2.4 Potencial Zeta
Valores de potencial zeta das nanopartículas foram obtidos pelo equipamento Zeta – Check – Particle Charge Reader. Para o uso do equipamento este foi previamente calibrado em uma solução de alumínio que apresenta valor de potencial zeta de +50 mV. As amostras foram analisadas em triplicata a 25 °C.
3.2.2.2.5 Estabilidade química dos polímeros (pH)
Como forma de avaliar possíveis processos de degradação dos polímeros e componentes da formulação, foram realizadas medidas de pH. Os valores de pH foram determinados através do equipamento pHmetro (Tecnal®) ou Corning pH/ion meter 450 previamente calibrados. As amostras foram avaliadas em triplicata, a 25°C.
3.2.2.2.6 Eficiência de Encapsulação
A determinação da eficiência de encapsulação foi de forma indireta. Logo após o preparo das nanopartículas contendo o GA3, 400 µL foram adicionados a um dispositivo de
ultrafiltração (Microcon–Millipore) que contém uma membrana de celulose regenerada com poro de exclusão no tamanho de 30 kDA. As amostras foram centrifugadas por 30 minutos a
200xg. O filtrado foi coletado e analisado por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantificação do hormônio não associado às nanopartículas. A partir da concentração do filtrado foi obtida a porcentagem de encapsulação, tendo como 100% a concentração de 50 µg/mL.
3.2.2.2.7 Metodologia de quantificação do hormônio GA3
3.2.2.2.7.1 Equipamento Varian ProStar
A quantificação de GA3 foi realizado por CLAE usando um equipamento Varian
ProStar, equipado com uma Bomba OS/210, detector UV-Vis OS 325, forno Metatherm com amostrador automático. A coluna foi uma Supelcosil, 3 µm LC18-DB, 3.3 cm x 4.6 cm, sendo
utilizada como fase móvel acetonitrila e água na proporção de 3:1 (v:v) (contendo 0.1% de ácido fosfórico) com fluxo de 0.4 mL/min, o comprimento de onda para detecção foi de
ʎ=210 nm. A determinação dos cromatogramas foi pelo software Galaxy Workstation. Para
estas condições foi realizada uma curva de calibração, sendo os valores de concentração foram obtidos pela equação y = 9.46 + 2.6*x (r=0.998) com um limite de detecção e quantificação de 4.16 e 13.89 µg/mL respectivamente.
3.2.2.2.7.2 Equipamento Agilent Technologies 1200 series
Para quantificação do GA3 no equipamento da marca Agilent Technologies 1200
series, equipado com uma bomba quaternária, injector manual, detector de índice de refração, compartimento para coluna termostatizado. Como fase móvel foi utilizada uma solução de acetonitrila e água (contendo 0.1% de ácido fosfórico (H3PO4)) na proporção de 3:1 (v:v) e
uma coluna Supelcosil LC18-DB (3.3 x 4.6 cm; 3µm) como fase estácionária. O GA3 foi
detectado em um comprimento de onda de 210 nm com um detector de UV G1365D (1260MWD VL) (Agilent Technologies). As corridas cromatográficas foram realizadas utilizando um fluxo de 0.7 mL/min. O equipamento foi previamente calibrado por soluções padrões de diferentes concentrações de GA3 (grau de pureza > 95%, Sigma Aldrich) obtendo
uma curva de calibração com coeficiente de relação linear de 0.9993, limite de detecção e quantificação de 0.97 e 3.24 µg/mL respectivamente. Os cromatogramas foram obtidos e analisados através do software ChemStation HPLC 2d.
3.2.3 Ensaio de cinética de liberação e modelagem matemática 3.2.3.1 Ensaio de cinética de liberação
O ensaio de cinética de liberação foi realizado através da montagem de um sistema aceptor e doador, estes separados por uma membrana de celulose com poro de exclusão de 1kDa. Ao sistema doador foram adicionadas as amostras de GA3 livre (diluído em água
destilada) e de nanopartículas com GA3. Para o sistema aceptor para as nanopartículas de
ALG/CS-GA3 ou nano-γPGA/CS-GA3, foi adicionado uma solução de CaCl2 (11 mM,pH
4.9), para as nanopartículas de CS/TPP-GA3 foram adicionadas uma solução de TPP (0.1%,
pH 4.75) sendo para o sistema com GA3 livre, apenas água destilada. Estes sistemas se
mantiveram por todo experimento sob agitação magnética. Após a adição das amostras no sistema doador, foram coletadas amostras do sistema aceptor em função do tempo, sendo que o ensaio foi realizado em triplicata e em temperatura ambiente. A quantificação foi realizada por HPLC.
3.2.3.2 Ensaio de cinética de liberação (Alteração de pH e Temperatura)
A fim de avaliar o perfil de liberação sobre diferentes pHs e temperatura, foram realizados ensaios de acordo com o item 2.3.1 a temperatura de 30°C. Para avaliar sobre diferente pHs as nanopartículas de ALG/CS-GA3 tiveram os pHs ajustados para 5.9 e 6.9 e as
nanopartículas de CS/TPP-GA3 para 5.7 e 6.7. O sistema aceptor teve o pH ajustado para o
mesmo pH das nanopartículas.
3.2.3.3 Modelo matemático de Korsmeyer - Peppas
O modelo matemático de Korsmeyer – Peppas foi aplicado para elucidar como ocorre a liberação do ativo pelas nanopartículas, como mostra a equação 1.
𝑀𝑡⁄𝑀∞= 𝑘𝑡𝑛 (Eq. 1)
onde Mt é a quantidade de GA3 liberado em função do tempo (t), M∞ é a quantidade de GA3
adicionado no sistema no t=0, o valor de k determina a constante cinética, e n é o valor do expoente de liberação.
3.2.4 Microscopias
3.2.4.1 Preparo das amostras
As amostras de nanopartículas foram previamente dialisadas antes das análises de microscopia eletrônica. As soluções foram adicionadas em uma membrana de celulose
(Dialysis Tubing, Sigma®, com poro de exclusão molecular de 1200 Da) por uma hora, e na sequência foram preparadas diluições das soluções de nanopartículas em água na proporção 1:4 (v:v) para posterior analises.
3.2.4.2 Microscopia de força atômica (AFM)
As imagens obitidas por AFM, foram atraves do equipamento (Nanosurf Easy Scan 2 Basic AFM-pattem BT02217, Nanosurf® Switzerland), foram usados catilevers TapA1-G (BudgetSensors®,Bulgaria) para o escaneamento das amostras, em modulo de contato. As nanopartículas foram previamente diluídas na proporção 1:7000.
3.2.4.3 Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM) e Varredura (MEV).
As imagens foram obtidas através do equipamento da marca Jeol, modelo JSM – 7401F, sendo as imagens obtidas com magnificação de 22.000 a 35.000 x. A partir das imagens foi realizada a medida do tamanho das nanopartículas através do software ImageJ 1.48v, onde foram contadas 100 nanopartículas para realização dos histogramas e obtenção dos valores médios de tamanho e índice de polidispersão.
3.2.4.5 Analises térmicas.
3.2.4.5.1 Calorimetria Exploratória Diferencial
As amostras foram adicionadas em compartimentos de alumínio e analisadas por DSC com um fluxo de nitrogênio em 50 mL/min, com a variação de temperatura de 10°C/min, em uma faixa de temperatura de 20–350°C.
3.2.4.5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters)
As analises de DSC foram realizadas em um analisador térmico Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters. As amostras de nanopartículas foram centrifugadas a 200 x g, sendo em seguida liofilizadas, foram pesadas em um cadinho de alumina 5 mg de cada amostra. As análises foram realizadas em um intervalo de temperatura de 25 a 350°C, sob a atmosfera de nitrogênio (fluxo de 50 mL/min) com uma taxa de aquecimento de 10°C/min.
3.2.4.5.3 Analises de Termogravemetria (TGA) )(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters)
As analises de TGA foram realizadas em um analisador térmico Discovery TGA, TA Instrumentes/Waters. As amostras de nanopartículas foram centrifugadas a 200 x g, sendo em
seguida liofilizadas, foram pesadas em um cadinho de alumina 5 mg de cada amostra. Estas foram submetidas a aquecimento na faixa de 25 a 600°C, com fluxo de nitrogênio. A partir de 600 a 800°C uma alteração para o fluxo com oxigênio, ambos à 50 mL/min com velocidade de aquecimento de 10°C.
3.2.4.6 Fourier transform infrared spectroscopy
As análises de FTIR foram realizadas por um espectrofotômetro da marca Varian® 660 com acessório de refletância total atenuada (GLADATR, PIKE Technologies) com cristal de diamante (2,2x3.0 mm) e ângulo de incidência de 45°, no modo de transmitância com 32 acumulações em uma faixa de onda de 4000 a 400 cm-1, com resolução de 8 cm-1.
3.2.5 Atividade Biológica e fitotoxidade
3.2.5.1 Atividade biológica das nanopartículas de ALG/CS3 e CS/TPP-GA3
A espécie Phaseolus vulgaris foi selecionada para avaliação da atividade biológica das nanopartículas de CS/TPP–GA3 e ALG/CS–GA3 em comparação ao ativo livre, ao controle
(água destilada) e as nanopartículas sem carrear GA3. Foram realizados tratamentos prévios
nas sementes, emergindo estas nas soluções, em que as concentrações avaliadas foram de 0,05, 0,037, 0,025 e 0,012% (m:m) relação da massa de GA3 (µg) para 1g de sementes. As
diluições foram realizadas em uma solução de CaCl2 (11 mM, pH 4.9) para as nanopartículas
de ALG/CS-GA3 e de TPP (0.1%, pH 4.75) para as nanopartículas de CS-TPP-GA3, para o
ativo livre, apenas água destilada. Após o tratamento as sementes foram transferidas e semeadas em vasos de 9,3 cm de altura com diâmetro alto e baixo de 12,5 e 9,3 cm respectivamente, preenchidos com 600 g de substrato Califórnia, sendo cada tratamento realizado em replicatas (n=4). Após sete dias as plantas foram coletadas e avaliadas em relação ao desenvolvimento das raízes e parte aérea, como o conteúdo de clorofila “a” e “b” e carotenóides.
3.2.5.1.1 Determinação do conteúdo de clorofila “a” e “b” e carotenoides.
Foram coletadas amostras de folhas de cada tratamento com o auxilio de um perfurador de papel, resultando em uma área circular de 5 mm2, sendo estas armazenadas por 12 horas em tubos tipo eppendorf contendo 2 mL de DMSO protegidas da exposição a luz. As amostras foram lidas pelo espectrofotômetro Varian Cary ®50 CONC UV-Vis nos comprimentos de 665, 649 e 480 nm. Para a determinação do conteúdo de clorofila “a” (Equação 2), “b” (Equação 3) e carotenoides (Equação 4):
𝑪𝒉𝒍 𝒂 = 12,19𝑥𝐴665 − 3,45𝑥𝐴649 𝐸𝑞. 2
𝑪𝒉𝒍 𝒃 = 21,99𝑥𝐴649 − 5,32𝑥𝐴665 𝐸𝑞. 3
𝑪𝒂𝒓𝒂𝒕𝒆𝒏ó𝒊𝒅𝒆𝒔 =100 𝑥𝐴480 − 2,14𝑥 𝐶ℎ𝑙𝑎 − 70,16 𝑥 𝐶ℎ𝑙 − 𝑏
220 𝐸𝑞. 4
Onde, Chl a é igual o conteúdo de “colorofila a”, Chl b o conteúdo de “clorofila b” e Ax o valor de absorção obtido para os determinados comprimentos de onda (WELLBURN, 1994).
3.2.5.2.2 Atividade biológica das nanopartículas de nano-γPGA/CS-GA3
As sementes de Phaseolus vulgaris foram previamente esterilizadas em solução de hipoclorito a 10% por dez minutos, em seguida deixadas imersas em água destilada (esterilizada) por 5 minutos, repetindo este procedimento por três vezes. Após esta etapa, as sementes foram tratadas por uma hora, sendo emergidas em soluções de nano-γPGA/CS-GA3 e GA3 nas concentrações equivalentes a 2.1 0.7, 0.23, 0.07 µg de GA3 por grama de semente,
foram realizadas diluições equivalentes para as nano-γPGA/CS para avaliação dos efeitos das nanopartículas sem carrear o GA3. Como controle foi utilizado água deionizada, ácido
glutâmico (0.024%) e CS (0.011%), diluídas em água na mesma concentração encontrada nas nanopartículas.
3.2.5.2.3 Incubação das sementes
Em uma capela de fluxo laminar, foram adicionados 20 mL da solução de Hoagland (contendo agar a 1,5%, esterilizada em autoclave a 121°C por 15 minutos (Autoclave Uamato SE 510)) em placas de petri previamente esterilizadas, formando uma base sólida. As sementes foram transferidas paras as placas e incubadas em estufa, no escuro por um período de 5 dias em temperatura ambiente. O ensaio foi realizado em triplicata, com um n=10.
3.2.5.2.2 Avaliação do desenvolvimento vegetal
Os efeitos das nano-γPGA/CS, nano-γPGA-GA3 e GA3 foram avaliadas atraves das
variáveis: índice de germinação e desenvolvimento da raiz (comprimento da raiz apical (cm) e número de raízes laterais. A porcentagem de germinação foi calculada nos primeiros dois dias do experimento de acordo com a equação 1:
(Equação 1)
% 𝒅𝒆 𝒈𝒆𝒓𝒎𝒊𝒏𝒂çã𝒐 = 𝑁𝑥100 𝑇𝑆
Onde N é o numero de sementes germinadas e TS é igual o numero total de sementes usadas no ensaio.
3.2.5.2.3 Desenvolvimento vegetal
Para avaliação do efeito das formulações após a germinação das sementes, estas foram previamente tratadas como citado no item 2.4.2. Após os tratamentos as sementes foram transferidas para potes de 9.3cm de altura e com diamento alto e baixo de 12.3 e 9.3cm respectivamente. Os potes foram preenchidos com 600g de substrato California e mantigos em casa de vegetação por 15 dias. Após estes período as plantas foram coletadas e obtido dados em relação as variáveis: comprimento das raízes e parte aérea, área foliar e massa seca das raízes e parte área. Para a obtenção da área foliar, as folhas foram scanneadas e as imagens analisadas pelo software ImageJ. Para obtenção da massa seca, as plantas após coletadas e analisadas em relação ao tamanho das raízes e parte aérea, estas foram mantidas em estufa por 3 dias a 60°C.
3.2.5.3 Avaliação da fitotoxicidade das nanopartículas de CS/TPP e SLN 3.2.5.3.1 Ensaio de germinação
Para a avaliação fitotóxica das nanopartículas de CS/TPP e SLN foram utilizadas 3 espécies vegetais, Zea mays, Allium cepa, Brassica rapa e Pissum sativum. As sementes foram previamente tratadas em solução de hipoclorito de sódio (2,5%) por 10 minutos sendo posteriormente lavadas 3 vezes em água ultrapura. As sementes foram germinadas em placas de petri (100 x 15 mm) expostas a soluções aquosas de nanopartículas em 4 diluições (1:0, 1:3, 1:1 e 1:4 v:v), sendo realizado o ensaio em triplicata com n=10 sementes por análise.
