Giancarlo Marchesini
MorphoKinematicFST, um banco de dados unificado de dados categóricos, cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado (FST), validado por
procedimentos metrológicos
FLORIANÓPOLIS 2019
MorphoKinematicFST, um banco de dados unificado de dados categóricos, cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado (FST), validado por
procedimentos metrológicos
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Elétrica
Orientador: Prof. Dr. José Marino Neto
Florianópolis 2019
Marchesini, Giancarlo
MorphoKinematicFST, um banco de dados unificado de dados categóricos, cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado (FST), validado por procedimentos metrológicos / Giancarlo Marchesini ; orientador, José Marino Neto, 2019.
132 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica, Florianópolis, 2019.
Inclui referências.
1. Engenharia Elétrica. 2. Índice Kappa. 3. concordância intra-observador. 4. neuropsicofarmacologia. I. Marino Neto, José. II. Universidade Federal de Santa Catarina.
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica. III. Título.
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
MorphoKinematicFST, um banco de dados unificado de dados categóricos, cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado (FST), validado por
procedimentos metrológicos
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Jefferson Luiz Brum Marques, Ph.D Universidade Federal de Santa Catarina
Profa. Daniela Suzuki, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Leandro José Bertoglio, Ph.D Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Engenharia Elétrica.
____________________________ Prof. Bartolomeu Ferreira Uchôa Filho, Dr.
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Engenharia Elétrica – Universidade Federal de Santa Catarina
____________________________ Prof. José Marino Neto, Dr.
Orientador – Universidade Federal de Santa Catarina
Florianópolis, 30 de julho de 2019. Documento assinado digitalmente Jose Marino Neto
Data: 26/10/2019 14:05:07-0300 CPF: 026.593.838-47 Bartolomeu Ferreira Uchoa
Filho:47636211491
Assinado de forma digital por Bartolomeu Ferreira Uchoa Filho:47636211491
Este trabalho é dedicado à minha querida mãe, dona Sueli, que esteja em paz onde quer que esteja.
AGRADECIMENTOS
Se pudesse definir esta dissertação por uma equação, seria através da composição de uma vasta quantidade de variáveis, que se caso uma estivesse ausente, o resultado seria sem dúvidas, o fracasso. Minhas variáveis foram as seguintes pessoas e meus agradecimentos.
Aos meus amigos e colegas de mestrado, Lennon, Su e Dudu, por agregar momentos felizes e descontraídos, em um dia a dia de incertezas e ansiedades.
Aos “Amigos do Newton”, pela amizade e risadas nos finais de semana, só assim conseguimos tolerar os belos dias de pós-graduação. A Thay pela força e motivação, nos momentos de desespero profissional e mudanças na maneira de pensar.
Ao LabNec e sua querida equipe comandada pela Dra. Cilene, que contribuíram diversas vezes com muita sabedoria e boa vontade nesta pesquisa, aguardo futuras parcerias unindo a farmacologia e a engenharia.
Ao professor Marino, que sem dúvida foi o maior divisor de águas do mestrado. Me oferecendo um tema para a dissertação, em um momento de muita incerteza. Aos conselhos e sabedoria sobre a maneira científica de se pensar e questionar o mundo. Aos “puxões de orelha” e críticas que me fizeram crescer e melhorar (mas ainda muito longe do padrão Brastemp). Pelo investimento em mim, no curso de Metrologia e pelo tema de Inteligência Artificial e Séries Temporais, que me possibilitou ganhar a bolsa de pesquisa no Instituto de Inovação do SENAI.
E finalmente, aos meus velhinhos, Carlos e Sueli. Meu pai e grande amigo, estando sempre presente e sendo meu principal suporte nos momentos difíceis. E a minha mãe, grande catalisadora para eu fazer o mestrado, que pôde me ver entrando neste meio acadêmico, mas não conseguiu me ver terminando. Mesmo sentindo muita a sua ausência, foi ela a primordial fonte de força e motivação.
“Inadvertently, I had stumbled across what has been called the Harvard law of animal behavior, which is related to Murphy's law: "You can have the most beautifully designed experiment with the most carefully controlled variables, and the animal will do what it damn well pleases.”
RESUMO
Estudos comportamentais com modelos animais mostram-se importantes para estudar doenças neurobiológicas e os mecanismos de ação de drogas com potencial para aliviar essas condições. O Teste de Nado Forçado (TNF) é um teste comportamental baseado na observação humana em ratos, utilizado para avaliar drogas com efeitos antidepressivos; e como em qualquer instrumento de medição, a confiabilidade do desempenho do observador deve ser avaliada antes e durante a coleta de dados. Neste trabalho, foi desenvolvido procedimentos para melhorar a validade destes dados, refinando o catálogo comportamental, propostas de treinamento e coleta de dados e a criação de um banco de dados comportamentais, com descritores cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao TNF, validado por procedimentos metrológicos. Foi realizada uma revisão sistemática a fim de constatar o estado atual da literatura, se são empregadas métricas, protocolos e testes de confiabilidade em estudos envolvendo ratos submetidos ao TNF. Um observador inexperiente utilizou o software Ethowatcher® para transcrição, de modo a permitir a identificação do comportamento quadro a quadro, bem como para o cálculo de índices de concordância (concordância total: CT%; Cohen Kappa: CK; concordância ao acaso: CA; concordância em frequência: %F) a partir das transcrições repetidas (15 dias de intervalo), foi refinado o catálogo comportamental utilizado amplamente na literatura, através de proposições lógicas, além de criado uma proposta de treinamento e protocolo de extração de dados para a formação do banco de dados. Os resultados da revisão sistemática evidenciaram uma fraca adesão por parte dos pesquisadores a adotar protocolos que possam reduzir erros sistemáticos em suas pesquisas e a falta de utilização de métricas de confiabilidade nos resultados dos dados observacionais. O refinamento do catálogo mostrou um aumento no índice Kappa, principalmente em relação a Concordância ao acaso (Mínimos: Cat. Antigo: CK = 0,28, CT = 0,42; Cat. Novo: CK = 0,57, CA = 0,33). As concordâncias intra-observador no treinamento se mostraram constantes, tendo pouca variabilidade (CK: 0,78 – 0,82) entre os ciclos de análises (entre um dia e outro seguinte), quando analisados o desempenho por vídeos houve diferenças na variação da concordância ao acaso (0,47-0,50). E finalmente, foi criado o banco de dados, possuindo 138 arquivos em .CSV e .SEGC, referentes a comportamentos de imobilidade, nado e escalada de ratos submetidos ao TNF. As métricas de concordância intra-observador durante a coleta se mostraram estáveis temporalmente (CK: 0,73 – 0,82). Os dados atuais indicam que a magnitude dos erros de concordância no FST garante a importância de relatar e monitorar continuamente os índices de confiabilidade do examinador antes e durante a coleta de dados. O banco de dados foi submetido a um repositório open source, o Open Science Framework, atendendo aos princípios de dados FAIR (findability, acessibility, interoperability, reusability).
Palavras-chave: concordância intra-observador, proposições lógicas, índice Kappa, neuropsicofarmacologia, catálogo comportamental.
ABSTRACT
Behavioral studies using animal models prove to be important for studying neurobiological diseases and the mechanisms of drug action with potential to alleviate these conditions. The Forced Swim Test (TNF) is a behavioral model based on human observation in rats, used to evaluate drugs with antidepressant effects; and as with any measuring instrument, the reliability of observer performance should be evaluated before and during data collection. In this work, procedures were developed to improve the validity of these data, by refining the behavioral catalog, training proposals and data collection and the creation of a behavioral database, with kinematic and morphological descriptors of rats submitted to TNF validated by metrological procedures . A systematic review was performed to verify the current state of the literature, if metrics, protocols and reliability tests were used in studies involving rats submitted to TNF. An inexperienced observer used the Ethowatcher® software for transcription, to allow the identification of the frame-by-frame behavior, as well as for the calculation of concordance indices (total agreement: CT%, Cohen Kappa: CK; frequency agreement:% F) from the repeated transcripts (15 days interval), the behavioral catalog widely used in the literature was refined through logical propositions, besides a proposal of training and data extraction protocol for the formation the database. The results of the systematic review evidenced a low adherence by the researchers to adopt protocols that can reduce systematic errors in their researches and the lack of use of reliability metrics in the results of observational data. The refinement of the catalog showed an increase in the Kappa index, mainly in relation to the random agreement (Minimums: Old Cat: CK = 0.28, CT = 0.42; New Cat: CK = 0.57, CA = 0 , 33). The intraobserver agreement in the training was shown to be constant, with little variability (CK: 0.78 - 0.82) between the analysis cycles (between one day and the next), when video performance was analyzed. agreement to chance (0.47-0.50). Finally, the database was created, with 138 files in .CSV and .SEGC, referring to immobility, swimming and climbing behaviors of rats submitted to TNF. The intraobserver agreement metrics during collection were temporarily stable (CK: 0.73 - 0.82). Current data indicate that the magnitude of FST mismatch guarantees the importance of continually reporting and monitoring the examiner reliability indexes before and during data collection. The database was submitted to an open source repository, the Open Science Framework, based on FAIR (findability, accessibility, interoperability, reusability) data principles.
Keywords: intra-observer agreement, logical propositions, Kappa index, neuropsychopharmacology, behavioral catalog.
Keywords: Keyword 1. Keyword 2. Keyword 3.
PRODUÇÃO ACADÊMICA
[1] MARCHESINI, G.; LINO-DE-OLIVEIRA, C. ; MARINO-NETO, J. . THE USE OF RELIABILITY METRICS FOR OBSERVATIONAL STUDIES IN RATS SUBMITTED TO THE FORCED SWIM TEST (FST): A SYSTEMATIC REVIEW. II SIMPÓSIO BRASILEIRO DE NEUROPSICOFARMACOLOGIA,2019.
[2] MARCHESINI,G.;MARCOLAN, J.A.; DOMINGUES, K.; SUMAN, P.;LINO-DE-OLIVEIRA,
C.;MARINO-NETO,J..The use of reliability measurements in the Forced Swim Test (FST) in rats: Probing the effects of experience on rater´s performance. II SIMPÓSIO BRASILEIRO DE NEUROPSICOFARMACOLOGIA,2019.(RECEBEU MENÇÃO HONROSA NESTE TRABALHO)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Processo de mensuração e calibração. ... 38
Figura 2- Relação entre exatidão, precisão e valor verdadeiro. ... 40
Figura 3 – Comparativo de conceitos de confiabilidade, validade, precisão e exatidão. ... 42
Figura 4 - Relação entre tipos de erros e as suas características qualitativas e quantitativas em um sistema de medição. ... 43
Figura 5 – Ambiente experimental do Teste do Nado Forçado, o rato é submetido a uma situação de estresse, em que não consegue escapar. Na figura é mostrado um cilindro, com quantidade de água e altura suficiente (30 cm) para que o animal não consiga colocar as patas no fundo do recipiente. Para a captação das imagens é posicionada uma câmera perpendicular ao cilindro e alinhada ao centro do mesmo. Na figura o rato demonstra o comportamento Imobilidade. ... 52
Figura 6 - Primeira versão do EthoWtacher®, na figura é representado como era realizada a etapa de tracking. ... 58
Figura 7 - Exemplos das técnicas de Limite de Subtração de fundo e Erosão. a) Um quadro ou frame com o animal. b) O quadro que irá servir como quadro de fundo ou backgroundframe. c) Após a subtração, de nível 10 e erosão 0. d) Subtração em 25 e Erosão 0. e) Subtração em 10 e erosão em 5. f) Subtração em 25 e Erosão em 1. ... 60
Figura 8 - Amostras de rastreamento. a) Largura do animal. b) Comprimento do animal. c) A área do animal. d) O ângulo do animal em relação a horizontal. e) O centro de massa ou centroide... 62
Figura 9 - Fluxograma da linha do tempo do experimento comportamental. ... 67
Figura 10 - Esquemático do experimento comportamental... 68
Figura 11 - Cilindro utilizado para a realização do experimento. ... 69
Figura 12 - Tela de registro do Catálogo de Comportamentos do EthoWatcher® versão 48 Beta. ... 72
Figura 13 - Tela da subseção do Registro do Vídeo, a Calibração. Na figura é possível ver o ambiente experimental sem o rato (Background frame) e com o rato. Necessários para fazer a subtração do plano de fundo e localizar o animal. Para calibração foram utilizados os parâmetros de Subtraction Threshold igual a 100 e Erosion igual a 5. .... 73
conhecida para conversão pixels/cm. b) Colocação dos pontos no comprimento máximo do animal, para habilitar o algoritmo de Câmera Móvel Virtual... 74 Figura 15 - Calibração da ferramenta Área de Interesse. É posicionado um círculo de raio 12,8 cm no centro do cilindro. Essa ferramenta impede qualquer ruído fora do cilindro que comprometa a localização do centroide. ... 75 Figura 16 - Fluxograma resumido do processo de registro do Catálogo Comportamental e dos Vídeos. ... 75 Figura 17 - Segmentação do rato em partes. A) Cabeça. B) Corpo. C) Patas dianteiras. ... 79 Figura 18 – Fluxograma de tomada de decisão para o TNF. ... 82 Figura 19 - Fluxograma de treinamento. ... 84 Figura 20 - Perda do centroide do animal, por ele estar em uma área escura, em que o algoritmo não consegue localizá-lo. ... 85 Figura 21 - Fluxograma da revisão sistemática. ... 90 Figura 23 - Comparativos de índices de concordância intra-observador entre os catálogos antigo e novo. Em vermelho é representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso, em azul a concordância total e em amarelo a concordância em frequência total. Os índices foram normalizados de 0 a 1. Os dados de cada grupo (n=3/grupo) são apresentados com mediana (traço central) e interquartiles (caixa colorida). ... 93 Figura 23 - Concordância em porcentagem na duração dos comportamentos entre os catálogos antigo e novo. Em vermelho é representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso e em azul a concordância total. Os dados de cada grupo (n=3/grupo) são apresentados com mediana (traço central) e interquartiles (caixa colorida). ... 95 Figura 24 - Concordância em porcentagem na duração dos comportamentos entre os catálogos antigo e novo. Em vermelho é representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso e em azul a concordância total. Os dados de cada grupo (n=3/grupo) são apresentados com mediana (traço central) e interquartiles (caixa colorida). ... 97 Figura 25 - Índices de concordância no treinamento, por ciclos. Em vermelho é representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso, em azul a concordância total e em amarelo a concordância em frequência total. Os índices foram normalizados de 0 a 1. Os dados de cada grupo (n=3/grupo) são apresentados com mediana (traço central) e interquartiles (caixa colorida). ... 102
representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso, em azul a concordância total e em amarelo a concordância em frequência total. Os índices foram normalizados de 0 a 1, e os dados são descritos como mediana (traço horizontal), interquartis (caixa), os dados brutos (triângulo). ... 104 Figura 28 - Comparativos de índices de concordância intra-observador durante a coleta para o banco de dados. Em vermelho é representado o Kappa de Cohen, em verde a concordância ao acaso, em azul a concordância total e em amarelo a concordância em frequência total. Os índices foram normalizados de 0 a 1. Os dados de cada grupo (n=3/grupo) são apresentados com mediana (traço central) e interquartiles (caixa colorida). ... 106 Figura 29 - Estrutura do banco de dados de TNF em ratos. Divididos em machos e fêmeas, subdivididos pelo tratamento e comportamento. ... 108
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Exemplo de quadro comparativo entre concordâncias na duração e
frequência. ... 45
Tabela 2 - Interpretação do índice Kappa, segundo Landis e Koch (1977) [40]. ... 47
Tabela 3 - Tabela de interpretação do índice Kappa em relação a confiabilidade dos dados coletados, proposto por McHugh (2012) [41]. ... 48
Tabela 4 - Modelos animais roedores sensíveis a agentes antidepressivos mais utilizados. As colunas mostram a o nome do modelo animal, facilidade de uso do modelo, a confiabilidade, a especificidade e se é aplicável a camundongo, respectivamente. ... 51
Tabela 5 - Relação de alguns fármacos e comportamentos no TNF. ... 54
Tabela 6 - Definições comportamentais para ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado repetido. ... 54
Tabela 7 - Ferramentas de etografias e rastreamento, seus arquivos relatório .XML e dados extraídos. ... 61
Tabela 8 - Estratégia de busca da revisão sistemática. ... 65
Tabela 9 - Experimento comportamental: Grupos (Controle e Tratados) e fármacos utilizados separados por gênero do animal. ... 67
Tabela 10 - Catálogo de comportamentos inicial. ... 70
Tabela 11 - Vídeos selecionados para análises de concordância. ... 71
Tabela 12 - Linha do tempo para análise de concordâncias. ... 76
Tabela 13 - Rascunho do novo catálogo de comportamentos. ... 77
Tabela 14 - Tabela verdade dos comportamentos. ... 81
Tabela 15 - Vídeos cegados para a criação do banco de dados, grifados em amarelo, verde e cinza estão os vídeos que foram repetidos e utilizados para as análises de concordância intra-observador. ... 86
Tabela 16 - Ciclos de concordância intra-observador da coleta de dados. ... 87
Tabela 17 - Código para descegamento dos vídeos. ... 87
Tabela 18 - Amostra do arquivo .CSV com dados etográficos, morfológicos e cinemáticos frame a frame. Na tabela é possível ver o frame, comportamento, identificação do rato, o tratamento, sexo, área em pixels (arP) e coordenada do centroide no eixo X (ceX). ... 88
catálogos. ... 94 Tabela 21 - Estatística descritiva da concordância em porcentagem da duração dos comportamentos dos catálogos antigo e novo. ... 96 Tabela 22 - Estatística descritiva da concordância em porcentagem da frequência dos comportamentos dos catálogos antigo e novo. ... 98 Tabela 23 - Matriz de confusão do catálogo antigo. Com os comportamentos Nadando (Nad.), Escalando (Escal.), Mergulhando (Merg.) e Imobilidade (Imobil). A diagonal representa as concordâncias entre as observações, o restante das células são confusões, que entram no cálculo da concordância ao acaso do índice Kappa. A numeração corresponde aos frames do vídeo observado. A última coluna e linha representam o somatório daquela determinada linha ou coluna. ... 99 Tabela 24 - Matriz de confusão do catálogo antigo. Com os comportamentos Nadando (Nad.), Escalando (Escald.), Mergulhando (Merg.), Imobilidade (Imobil.), Chacoalhando a cabeça (Chac.) e Indefindo (Indef.). A diagonal (em cinza) representa as concordâncias entre as observações, o restante das células são as confusões, que entram no cálculo da concordância ao acaso do índice Kappa. A numeração corresponde aos frames do vídeo observado. A última coluna e linha representam o somatório daquela determinada linha ou coluna. ... 100 Tabela 25 - Estatísticas descritivas das análises de concordância do treinamento, em ciclos. ... 102 Tabela 26 - Estatísticas descritivas das análises de concordância para o treinamento por vídeos. ... 104 Tabela 27 - Estatística descritiva das concordância da coleta de dados para o banco de dados. ... 106 Tabela 28 - Exemplo de planilha .CSV com a identificaçãodo rato, comportamento, área, deslocamento, trecho do comportamento e seu conjunto de frames. ... 108 Tabela 29 - Comparativo de observações entre o observador (Observador 1) deste trabalho e o da Domingues, K. (2015)... 110 Tabela 30 - Testes de Kruskal Wallis entre os observadores. ... 113 Tabela 31 - Tabela de Kappa de Cohen, em dados amostrais. ... 142 Tabela 32 - Tabela criada por Jacob Cohen, para o cálculo de concordâncias e discordâncias em proporções. ... 143 Tabela 33 - Tabela para exemplo 1. ... 144
Tabela 35 – Resultados do Exemplo 2. ... 147
Tabela 36 - Tabela para cálculo do Cohen’s Kappa, exemplo 3. ... 147
Tabela 37 – Resultados do Exemplo 3. ... 148
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina IEB – Instituto de Engenharia Biomédica
LABNEC – Laboratório de Neurobiologia do Comportamento IA – Inteligência Artifical
CK – Cohen Kappa CT – Concordância Total CA – Concordância ao acaso CF – Concordância pela Frequência TNF – Teste do Nado Forçado FST – Forced Swim Test
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 35 1.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E JUSTIFICATIVA ... 35 1.2 OBJETIVO ... 36 1.2.1 Objetivos específicos... 36 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 38 2.1 METROLOGIA... 38 2.1.1 Terminologias metrológicas... 39
2.1.2 A influência da incerteza na medição ... 42
2.1.2.1 Índices de concordância ... 43
2.1.3 Etografia ... 49
2.1.4 Modelos animais para o estudo de efeitos comportamentais de drogas: o Teste do Nado Forçado ... 50
2.1.4.1 O catálogo de comportamentos do TNF... 53
2.1.5 Ferramentas de registro de comportamento: O EthoWatcher® ... 56
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 64
3.1 REVISÃO SISTEMÁTICA ... 64
3.1.1 Estratégia de busca da revisão sistemática ... 65
3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 66
3.2.1 Animais e condições de alojamento ... 66
3.2.2 Procedimentos para administração de substâncias por via oral e treinamentos.66 3.2.3 Ambiente experimental ... 67
3.2.4 Catálogo de Comportamentos inicial ... 69
3.3 REGISTRO E CALIBRAÇÃO DOS VÍDEOS ... 70
3.3.1 Registros dos vídeos e do Catálogo Comportamental ... 70
3.5.1 O refinamento do catálogo comportamental ... 77
3.6 O PROTOCOLO DE TREINAMENTO ... 83
3.7 O PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DADOS ... 84
3.8 A CRIAÇÃO DO BANCO DE DADOS ... 88
4 RESULTADOS ... 88
4.1 REVISÃO SISTEMÁTICA ... 89
4.2 O NOVO CATÁLOGO COMPORTAMENTAL ... 90
4.3 COMPARATIVO ENTRE OS CATÁLOGOS ... 93
4.3.1 Comparativos com concordâncias intra-observador ... 93
4.3.2 Comparativos com concordâncias de duração dos comportamentos ... 94
4.3.3 Comparativo com concordâncias de frequências dos comportamentos... 96
4.3.4 Matrizes de Confusão das observações entre os catálogos ... 98
4.4 ANÁLISES DO TREINAMENTO ... 101
4.5 MÉTRICAS DO BANCO DE DADOS ... 105
4.6 O BANCO DE DADOS DE TNF EM RATOS ... 107
4.7 COMPARATIVO ENTRES AS OBSERVAÇÔES ... 109
5 DISCUSSÃO ... 115
6 CONCLUSÃO ... 122
REFERÊNCIAS ... 123
ANEXO A – Descrição do Cálculo Cohen Kappa ... 141
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONTEXTUALIZAÇÃO E JUSTIFICATIVA
Estudos de observação comportamental de animais em testes de laboratório são importantes para vários campos científicos, principalmente os de natureza neurofarmacológica. Por exemplo, o Teste do Nado Forçado (TNF) é um teste pré-clínico usado para avaliar os efeitos comportamentais de drogas, que podem ter efeitos antidepressivos em humanos. O TNF consiste no registro de categorias comportamentais de um roedor exposto a uma situação aversiva chamada de nado forçado, que é nadar em um tanque cilíndrico com uma quantidade de água que impeça o apoio das patas no fundo do cilindro e que impeça a fuga pela borda superior. Este estudo é feito por observação direta e sistemática por humanos treinados e como qualquer instrumento de medição, é susceptível a erros sistemáticos e aleatórios. A confiabilidade desses dados oriundos de observações comportamentais pode ser medida objetivamente, através de análises intra- e inter-observadores, contribuindo na obtenção de dados reprodutíveis, confiáveis e válidos.
Nosso grupo de pesquisa tem desenvolvido uma série de ferramentas computacionais para o registro e análise de dados comportamentais, morfológicos e cinemáticos em animais de laboratório, como o Ethowatcher [39] [48] [52] [53] [54]. O presente trabalho faz parte desta linha de investigação, que pretende empregar algoritmos de aprendizado de máquina na análise destes dados, usando o TNF em ratos como caso de estudo.
Para tal propósito é necessário a construção de um Banco de dados no qual o registro comportamental feito por observador humano, a ser associado às variáveis morfológicas e cinemáticas, seja também associado a índices de incerteza do procedimento de registro, que possam medir a confiabilidade e qualidade dos dados. Ressalta-se que, antes de aplicar qualquer algoritmo de aprendizado de máquina, é necessário preparar os dados para aplicar técnicas de exploração e mineração de dados (data mining) e assim montar a sua base de conhecimento, auxiliando no suporte para a tomada de decisão do cientista de dados e a sua
eventual aplicação em um algoritmo classificatório ou preditivo para estudar e analisar os efeitos das drogas neurofarmacológicas sobre esses animais.
Assim, neste trabalho foram estudadas maneiras de aumentar o desempenho e confiabilidade dos dados produzidos pelo observador humano, através de refinamento do catálogo de comportamentos, a criação de um protocolo de treinamento e de extração de dados. De forma inovadora, através de procedimentos metrológicos, foi criado um banco de dados de atributos cinemáticos e morfológicos, de ratos submetidos ao TNF, divididos pelo sexo, tratamento (fluoxetina e diferentes doses ou por veículo) e segmentados pelos principais comportamentos estudados pela literatura neste teste, sendo imobilidade, escalada e nado.
1.2 OBJETIVO
O objetivo geral deste trabalho foi o desenvolvimento de um banco de dados comportamentais, cinemáticos e morfológicos de ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado, validado por procedimentos metrológicos.
1.2.1 Objetivos específicos
a) Avaliar o estado da arte da utilização de índices de confiabilidade ou concordância intra-observador em estudos envolvendo o Teste do Nado Forçado (TNF) em ratos por meio de uma revisão sistemática.
b) Estimar estes índices em situação real e típica de uso, que inclui o treinamento do observador no catálogo comportamental tradicional, a execução de transcrições em condições de teste-reteste e a aplicação dos índices de concordância recomendados na literatura.
c) Propor, em consonância com os indicadores de incerteza obtidos na etapa acima, métodos de refinamento do catálogo comportamental e protocolos de utilização (de medição) investigando o seu impacto nos índices de concordância.
d) Aplicar o protocolo de obtenção de dados e de controle dos índices metrológicos descrito na etapa acima para a transcrição de experimentos reais envolvendo
ratos machos e fêmeas tratados com diferentes doses de fluoxetina (uma droga com ação antidepressiva) ou com veículo.
e) Construir e disponibilizar um banco de dados estruturado dos comportamentos: imobilidade, nado e escalada a partir destas observações, que seja passível de utilização em estudos dos efeitos destas drogas sobre o comportamento no TNF, no qual a associação entre categorias comportamentais e os correspondentes descritores morfológicos e cinemáticos sejam vinculados a índices metrológicos válidos de confiabilidade.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Este capítulo apresenta um panorama da área de pesquisa, abordando os principais aspectos da etologia, modelos de animais, análises de concordância e metrologia.
2.1 METROLOGIA
A crescente variedade das atividades humanas científicas, comerciais e industriais, carecem de sistemas de medição cada vez mais confiáveis e precisos para apoiar com eficácia os processos de tomadas de decisão, muitas vezes em problemas de alta complexidade, de difícil modelagem e gerenciamento.
Na modelagem do processo de medição e calibração, deve-se definir o conjunto de atividades necessárias para definir o mensurando (objeto que será mensurado) e modelar sua relação com o resultado da medição [73]. O contexto de medição, no qual é desenhado todo o ambiente experimental, deve incluir o objeto a ser medido, o sistema de medição, o observador que está medindo, as fontes de erros no processo, as etapas de calibração e a forma como será representado os resultados de mensuração. O esquema do processo, visto de uma maneira geral, pode ser visto na Figura 1.
Figura 1 – Processo de mensuração e calibração.
Fonte: Adaptado de Mari, Carbon e Petri (2012) [73].
A etapa experimental, no qual o instrumento de medição interage com o objeto a ser mensurado, nesta mesma etapa todas as possíveis incertezas, erros e vieses influenciam na medição [81]. Na etapa de representação, a incerteza de medição é calculada e informada, através da calibração do instrumento medido. Determinada a incerteza e erro de medição, em
seguida é mostrado o protocolo de calibração, validado e documentado, mostrando todas as etapas, terminologias, processos e normas utilizados [82].
2.1.1 Terminologias metrológicas
No presente estudo serão utilizados alguns conceitos metrológicos, portanto é necessário citá-los e descrevê-citá-los. Essas descrições foram retiradas do Vocabulário Internacional de Metrologia – Conceitos Fundamentais e gerais e termos associados (VIM 2012) [75] e de Kotner et al. (2011) [30].
a) Mensurando: Quantidade a ser medida.
b) Medição: Processo de obtenção experimental de um ou mais valores de quantidade que podem ser razoavelmente atribuídos a uma quantidade.
c) Veracidade: A veracidade de uma medida refere-se à proximidade entre a média de um número infinito de resultados e o valor de referência verdadeiro ou aceito. Não é uma grandeza e, portanto, não pode ser expressa numericamente. A veracidade de medição está inversamente relacionada ao erro sistemático, porém não está relacionada ao erro aleatório.
d) Erro sistemático: Componente do erro de medição que, em medições repetidas, permanece constante ou varia de maneira previsível. O erro sistemático e suas causas podem ser conhecidos ou desconhecidos. Pode-se aplicar uma correção para compensar um erro sistemático conhecido. O viés é tido como a magnitude de qualquer erro sistemático, apesar de que em alguns casos não tenha um valor numérico.
e) Erro aleatório: Componente do erro de medição que, em medições repetidas, varia de maneira imprevisível.
f) Estabilidade temporal: é o termo designado a um instrumento de medição, em que suas propriedades metrológicas permanecem constantes no tempo.
g) Calibração: processo de, sob condições especificadas, estabelecer uma relação entre os valores de quantidade com incertezas de medição fornecidas pelos padrões de medição,
e em uma segunda etapa, utilizar os resultados fornecidos, para estabelecer uma relação para obter um resultado de medição;
h) Incerteza: parâmetro não negativo que caracteriza a dispersão dos valores de quantidade atribuídos a um mensurando, com base nas informações utilizadas.
i) Confiabilidade: é o grau de consistência de uma medida. Pode ser de três tipos: ao longo do tempo (confiabilidade teste-reteste, intra-observador), entre itens (consistência interna) e entre diferentes observadores (confiabilidade entre inter-observadores).
j) Validade: é a medida em que as pontuações de uma medida representam a variável a que se destinam.
k) Precisão: É definida como a proximidade da concordância entre as indicações ou valores de quantidade medidos obtidos por medições replicadas no mesmo objeto ou em objetos similares sob condições especificadas.
l) Exatidão: É definida como a proximidade da concordância entre um valor de quantidade medido e um valor de quantidade real de um mensurando.
Uma relação entre as os conceitos de exatidão, precisão e valor verdadeiro pode ser visto na Figura 2.
Figura 2- Relação entre exatidão, precisão e valor verdadeiro.
Fonte: Adaptado pelo autor de Abernethy, Benedict e Dowdell (1983). p = densidade das medições; DP = desvio padrão.
m) Concordância Intra-observador: é a confiabilidade teste-reteste entre duas observações feitas pelo mesmo observador, da mesma amostra de medidas, separadas umas das outras por um determinado período. É uma análise feita para medir o grau de consistência ao longo do tempo, do mesmo instrumento de medida, em se chegar aos mesmos resultados. Um intervalo que é muito curto tenderá a superestimar a confiabilidade. No entanto, o intervalo também não deve ser tão distante que o observador tenha alterado seus conceitos sobre o objeto em estudo, o que pode subestimar a confiabilidade. Embora dependa do instrumento testado, um intervalo típico é de algumas (2 a 4) semanas [83].
n) Repetibilidade: refere-se à variação em medições repetidas sobre o mesmo assunto sob condições idênticas. Isso significa que as medições são realizadas pelo mesmo instrumento ou método, em um curto período de tempo, sobre o qual o valor subjacente pode ser considerado constante.
o) Concordância Inter-observadores: é o grau em que dois ou mais avaliadores são capazes de diferenciar entre sujeitos ou objetos sob condições de avaliação semelhantes.
p) Reprodutibilidade: refere-se à variação nas medições feitas sobre um assunto sob condições variáveis. As condições de mudança podem ser devidas a diferentes métodos de medição ou instrumentos sendo usados, medições feitas por diferentes observadores ou avaliadores.
Figura 3 – Comparativo de conceitos de confiabilidade, validade, precisão e exatidão.
Fonte: Adaptado de (https://www.matrix.edu.au/the-beginners-guide-to-physics-practical-skills/physics-practical-skills-part-2-validity-reliability-accuracy-experiments/), acessado em 02/03/2019.
2.1.2 A influência da incerteza na medição
Os resultados das medições são fadados a erros no momento da sua aplicação. Isso se deve a fontes de incerteza (e.g. temperatura ambiental, umidade, viés do operador). Estes são efeitos que causam desvios do valor medido, em relação ao valor verdadeiro. Se o procedimento de medição utilizado for bem conhecido, as fontes de incerteza mais importantes são geralmente também conhecidas. Esforços devem ser feitos para minimizar e, se possível, eliminar as fontes de incerteza, otimizando o procedimento de medição [77] [78]. As fontes de incerteza que não podem ser eliminadas, devem ser levadas em conta na estimativa de incerteza. Na Figura 4 é possível ver uma relação entre incertezas, erros, exatidão e precisão.
Figura 4 - Relação entre tipos de erros e as suas características qualitativas e quantitativas em um sistema de medição.
Fonte: adaptado de Menditto, Patriarca e Magnusson (2007).
Se forem feitos um número de medições repetidas do mesmo mensurando, então, idealmente, todas essas medições repetidas deveriam dar exatamente o mesmo valor e este deve ser igual ao valor verdadeiro do mensurando. Na realidade, os resultados das medições repetidas quase sempre diferem até certo ponto e seu valor médio também costuma diferir do valor verdadeiro. As fontes de incerteza causam isso. De um modo um tanto simplificado, as fontes de incerteza (ou efeitos) podem ser divididas em efeitos ou erros aleatórios e efeitos sistemáticos [79], já explicados na seção de Terminologias Metrológicas.
2.1.2.1 Índices de concordância
Análises de concordância se referem à capacidade de aferir resultados idênticos (utilizando uma mesma unidade de medida), aplicados ao mesmo sujeito/fenômeno, seja por diferentes instrumentos, por um mesmo instrumento em tempos diferentes, ou por alguma combinação anterior [29]. Exemplos triviais envolvem calibragem de equipamentos, fidedignidade de escala ou medida, julgamento em provas de habilidades, avaliação de equivalência entre ferramentas de mensuração, avaliação e repetitividade e reprodutibilidade e
finalmente, análise diagnóstica (concordância interpessoal e intrapessoal) e psicométrica (estabilidade temporal) [30].
No caso de registro de comportamentos de um animal (ou etografias), os erros ocorrem, principalmente, no momento da transcrição comportamental e são amostrados através de análises de correlação entre as transcrições de diferentes observadores ou do mesmo observador, em diferentes períodos. Estudos de concordância e confiabilidade de dados são de extrema importância para as ciências médicas, comportamentais e sociais [32]. Contribuem para o aumento da qualidade das pesquisas por prover informações sobre a quantidade de erros inerentes a qualquer diagnóstico, medida ou pontuação por parte dos pesquisadores. Até mesmo quando os observadores usam o mesmo conjunto de regras ou protocolos, é comum chegarem a diferentes conclusões [34]. Um treinamento bem definido pode reduzir, mas não eliminar completamente as diferenças entre observadores, sendo que em pesquisas que envolvem observação comportamental é essencial estabelecer uma concordância inter-observador elevada para que se tenha dados de qualidade [33], [35].
Um índice bem usual é da concordância percentual, que embora tenha benefícios, principalmente a simplicidade computacional e a aparente facilidade de interpretação, tem muitas falhas notáveis [115]. A primeira é que a concordância em porcentagem representa a concordância total entre os observadores sem levar em consideração a concordância ao acaso ou algum outro tipo de viés. Como resultado, não há como determinar como um percentual obtido de concordância se compara a um outro obtido aleatoriamente. Assim, esse índice tende a sobrestimar o nível de concordância, principalmente os comportamentos que ocorrem frequentemente, tornando-os potencialmente enganosos. O coeficiente de Kendall é adequado para variáveis ordinais avaliadas por múltiplos observadores, varia de -1 a 1, indicando discordância e concordância extrema, respectivamente. E outro índice de concordâncias encontrado, é o Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC), que relaciona com a variância entre um conjunto de medidas de observadores, podendo ser usado em análises intra- e inter-observadores [116].
Para o cálculo da concordância inter- e intra-observador, usando a frequência/duração de cada comportamento, é utilizada as seguintes equações: Equação 1 soma a frequência do comportamento observado (X), Equação 2, a porcentagem de
discordâncias calculando o módulo da diferença entre as observações e a Equação 3 resulta a porcentagem de concordância.
(1)
(2)
(3)
Este método possui limitações quando comparados com a duração frame a frame de um comportamento. Por exemplo, na Tabela 1 é mostrado as análises comportamentais de dois observadores, ambos relatando um trecho de episódio de nado e imobilidade de um animal, em uma determinada amostra de vídeo. Do ponto de vista da frequência, concordam 100%, mas no ponto de vista da duração, não (a frequência é reportada pela quantidade de vezes de grupos de comportamentos observados). Apesar desta limitação, a importância desta técnica se encontra na possibilidade de avaliar o observador nas categorias individualmente. Verificar, em quais comportamentos estão ocorrendo maiores discordâncias na frequência e na duração, seriam úteis para refinar o catálogo comportamental e diminuir as ambiguidades nas definições dos comportamentos.
Tabela 1 – Exemplo de quadro comparativo entre concordâncias na duração e frequência.
Frame Observador 1 Observador 2
1 Imobilidade Nado
2 Imobilidade Imobilidade
3 Nado Imobilidade
4 Nado Imobilidade
A ferramenta mais comum, para o cálculo de estatística de concordância intra- e inter-observador, é o Kappa de Cohen (representado por κ). Cohen (1960) [36] afirmou, que em estudos de concordância, existe uma chance de os observadores não saberem a resposta correta pela incerteza, realizarem uma concordância ao acaso ou aleatória, que serve como atenuante ou correção da concordância total. O intervalo do índice Kappa varia de 0 a 1, sendo zero o grau máximo de discordância ou quando a concordância total se iguala a mera concordância ao acaso e quando é 1, representa a concordância máxima perfeita entre os observadores (inter-observadores) ou entre o próprio observador (intra-observador). O Kappa de Cohen é limitado a apenas dois observadores em seu cálculo, posteriormente Fleiss (1971) [42] desenvolveu a sua generalização para dois ou mais observadores. O índice Kappa pode ser utilizado para análises de dados nominais ou ordinais, que atende perfeitamente este estudo, visto que os dados são análises de registro categóricos comportamentais.
O índice Kappa, mostrado na Equação 4, é calculado utilizando a proporção total de concordâncias entre os observadores (PO), e a proporção de concordância ao acaso (PE), mostrado nas Equações 5 e 6, respectivamente. A concordância ao acaso é um atenuante do índice de concordância total. P1k é o comportamento k registrado pelo Observador 1 (ou a primeira etografia de um dado observador, para uma dada amostra de vídeo), enquanto P2k é o comportamento k para o Observador 2 (ou a segunda etografia de um dado observador, para a mesma amostra de vídeo), e n é o número de comportamentos no etograma. Mais detalhes sobre o cálculo e a tabela utilizada veja o Anexo 1.
(4) (5)
(6)
Não há um consenso na literatura sobre qual o nível do Kappa é aceitável. Landis e Koch (1977) [40] sugeriram a Tabela 2, porém ressaltam que as divisões foram arbitrárias e servem apenas como guia para interpretações. Na publicação de McHugh (2012) [41], a autora modifica esta tabela e propõe a Tabela 3, que relaciona o índice Kappa com a
confiabilidade dos dados coletados, mas é necessário ressaltar que a própria autora também relata ser apenas uma proposta, um guia de referência, não informando a natureza dos valores e nem o cálculo. Foi recomendado neste trabalho não analisar apenas o valor do índice Kappa em si, mas em relação a outros índices mencionados anteriormente, como o da concordância ao acaso, a concordância total e a concordância em frequência total. Além disso, através das equações de concordância em frequência, é possível também utilizá-las para a duração de cada comportamento discriminado (e.g a concordância na frequência e duração do comportamento Imobilidade em dois momentos distintos).
É necessário avaliar o observador repetidamente, assim é possível verificar a sua estabilidade temporal, se está apto de fato a concordar consigo mesmo em diferentes momentos ou para com outros observadores, dada uma mesma amostra de vídeo. Como foi visto, não adianta obter uma concordância alta quando observada a frequência de um comportamento, se a concordância no domínio do tempo é baixa. É necessário avaliar se o índice Kappa tem um determinado valor (alto ou baixo) em todas as amostras de vídeo, ou em apenas em um particular. E finalmente, verificar se após um determinado número de análises de concordâncias, é apresentada uma variância elevada entre o menor e o maior índice Kappa observado.
Tabela 2 - Interpretação do índice Kappa, segundo Landis e Koch (1977) [40]. Interpretação do Kappa
Kappa Fraco Leve Razoável Moderado Substancial Quase perfeito
0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.0
Kappa Concordância
<0 Menor que ao acaso
0,01 – 0,20 Leve
0,21 - 0,40 Razoável
0,41 – 0,60 Moderado
0,61 - 0,80 Substancial
0,81 – 0,99 Quase perfeito
Tabela 3 - Tabela de interpretação do índice Kappa em relação a confiabilidade dos dados coletados, proposto por McHugh (2012) [41].
Kappa Concordância Confiabilidade
dos dados 0 – 0,20 Nenhuma 0 – 4% 0,21 – 0,39 Mínima 4 – 15% 0,40 – 0,59 Fraca 15 – 35% 0,60 – 0,79 Moderada 35 – 63% 0,80 – 0,90 Forte 64 – 81% < 0,90 Quase perfeita 82 – 100% Fonte: Adaptado de McHugh (2012)[41].
Como o objetivo principal deste trabalho é criar um banco de dados de dados comportamentais, associados a seus atributos cinemáticos e morfológicos, é imprescindível que os dados de duração dos comportamentos possuam confiabilidade e sejam feitos da forma fidedigna ao comportamento observado. Diante desta problemática, o presente trabalho utilizou o Ethowatcher OS, que possui uma abordagem diferente dos cálculos de concordância do índice Kappa, que utiliza a frequência dos comportamentos transcritos, encontrados comumente na literatura [4], [40]. Através dele é possível associar cada frame do vídeo observado a um comportamento específico, permitindo avaliar a concordância intra- ou
2.1.3 Etografia
O registro comportamental ou etografia, é definido como a transcrição comportamental realizada pelos observadores em relação aos animais. Esse registro deve ser feito da forma mais fiel possível ao comportamento observado, através de um catálogo de comportamentos, de forma que se crie um banco de dados que possa ser utilizado para validar a hipótese em estudo.
Para descrever os comportamentos, pode-se dividir em descrições empíricas, que envolvem os movimentos e posturas do animal (e.g mostrando os dentes), e as descrições funcionais que são comportamentos apresentados diante de uma situação ou evento (e.g mostrando os dentes diante de uma ameaça). O repertório de comportamentos observados forma o catálogo de comportamentos ou etograma, sendo que cada comportamento tem um nome e uma definição associada. As descrições comportamentais devem ser claras, concisas e auto exclusivas, para não confundir os observadores e não haver ambiguidades nas transcrições comportamentais [4].
O observador, ao realizar medições, possui erros e incertezas associados, que contribuem para diminuir a confiabilidade e validade dos dados extraídos. O observador pode ser preciso, tendo uma baixa variabilidade em seus dados, mas devidos a seus vieses, ele não é exato. Alguns podem ser controlados, como o uso de experimentos cegados, para eliminar subjetividades e preconceitos do observador, melhorar a qualidade da gravação do vídeo ou amostra a fim de obter um material mais fácil de se transcrever e realizar treinamentos nos pesquisadores, fazendo uso de análises de concordância. Esse treinamento envolve não só no uso do software ou método de registro, mas como no catálogo comportamental, é necessário a avaliar o seu desempenho e assim iniciar o registro (e.g vídeo) e anotar a ocorrência de cada comportamento à medida em que ocorrem, preservando os dados temporais de sua ocorrência [4], [120].
2.1.4 Modelos animais para o estudo de efeitos comportamentais de drogas: o Teste do Nado Forçado
Os testes animais são utilizados para fins específicos experimentais, que possibilitam estudos para a identificação de novos tratamentos terapêuticos. O desenvolvimento destes modelos tem como objetivo principal esclarecer processos psicológicos, utilizados amplamente para tratar problemas neurobiológicos, especialmente os mecanismos de ação de drogas psicoterapêuticas [5], [6]. Para a doença de Parkinson por exemplo, um modelo bastante utilizado é o da Rotenona, que é uma substância química utilizado como um inseticida e quando aplicada em ratos, induz a degeneração de neurônios e perda da função motora (replicando a condição da doença) [118], ou para estudos envolvendo a dor (avaliação de drogas anestésicas), como a Axotomia, que envolve a remoção de parte do nervo ciático do animal, assim como o nervo safeno adjacente, induzindo a desnervação do membro, o roedor desenvolve anestesia dolorosa e comportamento de automutilação, a extensão desta lesão é então monitorada [119].
Em estudos neurofarmacológicos, a avaliação dos modelos animais se mede pela sua validade etiológica (a origem e a causa de um determinado efeito). Para sua validação, os comportamentos dos animais devem ser causados ou desencadeados pelas mesmas etiologias que desencadeiam a depressão humana. É uma tarefa nada fácil, devido à falta de um causador bem definido para a depressão humana em animais [7][8][9][10]. Aparentemente, o estresse é um desencadeador de depressão e outros transtornos psiquiátricos em seres humanos [11], portanto os modelos animais de depressão avaliam a resposta do animal quando submetido a um estresse inevitável, seja este agudo ou crônico [5] [12] [13] [14].
Muitos dos modelos que avaliam a reação ao estresse mostram validade farmacológica, isto é, são sensíveis para tratamentos antidepressivos conhecidos e compostos administrados de forma aguda, possibilitando a avaliação rápida dos agentes terapêuticos potencialmente novos. A validação é dividida em, ao menos, três categorias: preditiva, de face e de constructo [19]. A preditiva é obtida caso um modelo identifique tratamentos antidepressivos de variados tipos, sem cometer erros, e se o potencial da droga correlaciona com o potencial clínico. A validação de face para um modelo de depressão, exemplificando, representa a analogia entre o modelo e a doença, ou melhor, se o modelo mostra “sintomas” que se assemelham a depressão em variados aspectos. E finalmente, a validade de constructo
é definido como a precisão na medição que o teste tem como propósito medir, ou seja, a capacidade de do modelo de recriar os aspectos etiológicos causais da doença, definição que varia constantemente e é interpretada de outras formas [19][20]. Os modelos mais utilizados para roedores podem ser vistos na Tabela 4.
Tabela 4 - Modelos animais roedores sensíveis a agentes antidepressivos mais utilizados. As colunas mostram a o nome do modelo animal, facilidade de uso do modelo, a confiabilidade, a especificidade e se é aplicável a camundongo, respectivamente.
Modelo animal Facilidade de uso
Confiabilidade Especificidade Aplicável a camundongo Teste do Nado
Forçado
Alta Alta Alta Sim
Teste do Nado Forçado repetido
Alta Alta Alta ?
Teste da Suspensão da cauda
Alta Alta Alta Sim
Fonte: Adaptado de Cryan, Markou e Lucki (2002).
O teste do nado forçado é um teste comportamental para uso de roedores, como ratos ou camundongos, que possibilita predizer a atividade antidepressiva de substâncias em humanos e atualmente, tem viabilizado a descoberta de novos fármacos antidepressivos [21]-[24]. Ao mesmo tempo, é um dos testes mais utilizados para avaliação de inibição comportamental ou o “comportamento depressivo” de animais experimentais [25]-[27]. Proposto por Porsolt [15], [16], o teste consiste em expor o animal em um pequeno cilindro com água suficiente para o animal nadar sem apoiar as patas no fundo, ilustrado na Figura 5.
Figura 5 – Ambiente experimental do Teste do Nado Forçado, o rato é submetido a uma situação de estresse, em que não consegue escapar. Na figura é mostrado um cilindro, com quantidade de água e altura suficiente (30 cm) para que o animal não consiga colocar as patas no fundo do recipiente. Para a captação das imagens é posicionada uma câmera perpendicular ao cilindro e alinhada ao centro do mesmo. Na figura o rato demonstra o comportamento Imobilidade.
Fonte: Adaptado de Cryan, Markou e Lucki (2002).
O animal é submetido a duas sessões de nado forçado, separados por 24 horas (pré-teste e teste). No período de teste, que dura cinco minutos, é medido o tempo que o animal permanece no comportamento de “imobilidade”, que é exatamente o indicador da aquisição do “desespero comportamental” durante o período de pré-teste de quinze minutos [15][16]. Através das etografias, o pesquisador retira dados importantes como frequência, duração e latência de cada comportamento observado. Para ratos, foi elaborado um protocolo de teste de Porsolt repetido (TNF-r) [18]. Que detectou o aumento gradual da eficácia de doses baixas de Fluoxetina ao longo do tempo e mostrou-se adequado para detectar efeitos de curto e longo prazo de inibidores de recaptação de serotonina ou outros antidepressivos, em doses menores que as eficazes no TNF [28].
Os testes e modelos animais, carecem da medição humana, a fim de se obter diversas informações como duração, frequência e latência dos comportamentos observados. Devido à natureza destas ser observacional e interpretativa, é comum acontecer erros no momento do registro [4]. O julgamento humano é, ao mesmo tempo, um forte e uma fraqueza na observação comportamental. Isso está relacionado na capacidade do ser humano em integrar
um conjunto complexo de informações para chegar em um determinado julgamento ou decisão, porém esses julgamentos são imperfeitos, são influenciados pelas características do próprio observador e até por erros genéricos e/ou sistemáticos [33]. Isto é, referem-se ao treinamento deficiente do etólogo ou observador, a má elaboração do catálogo de comportamentos (ou etograma), a falta de informação sobre uma categoria, a natureza ambígua de alguns comportamentos, aos erros na metodologia empregada na aquisição de registros, na análise de dados, na perspectiva do observador ao realizar o experimento, ou mesmo pelo viés e estado de consciência do observador. Estes erros de mensuração podem afetar os resultados em estudos farmacológicos, que carecem de informações baseadas na frequência, duração e latência de comportamentos de animais tratados e controle [48]. Diante deste quadro, são necessários testes de concordância intra- e inter-observadores para averiguar a confiabilidade do observador em extrair dados destes experimentos, são úteis para avaliar a estabilidade temporal do pesquisador ao longo do tempo através de teste-reteste e se existe um consenso entre ele e outros pesquisadores.
2.1.4.1 O catálogo de comportamentos do TNF
Inicialmente, o catálogo comportamental possuía apenas o comportamento Imobilidade (Immobility) que estaria associado a um estado de “desespero comportamental” mencionado anteriormente por Porsolt [15][16][61]. Com o tempo, pesquisadores começaram a definir outros comportamentos apresentados pelo roedor, para testar suas hipóteses da ação de diferentes fármacos sobre estes comportamentos, não somente restrito à Imobilidade. Em um trabalho de Weiss et al. (1981) [64] procurou-se estudar os níveis de noradrenalina (NE), dopamina (NA) e serotonina (5-HT) em diferentes regiões do cérebro do rato e usando como causador de estresse, a aplicação de choques elétricos no animal, acrescentando as categorias: Flutuando (Floating), Lutando (Struggling), Mergulhando (Diving), Meio-mergulho (Half-dive) e chacoalhando a cabeça (headshaking) [64]. Em outro estudo, investigou-se a interação da Desipramina com o comportamento do rato no TNF, utilizou-se a taxa de defecação (defecation rate) ou contagem de bolos fecais produzidos pelo animal, relacionando como um
bom medidor de reação emocional a situações adversas [66]. A relação dos comportamentos e fármacos antidepressivos, de modo geral, reduzem a duração do comportamento Imobilidade, porém podem afetar outros comportamentos, como os que envolvem inibidores da recaptação da serotonina ou de norepinefrina [140], como mostrado na Tabela 5.
Tabela 5 - Relação de alguns fármacos e comportamentos no TNF.
Farmácos Comportamentos.
Desipramina, Maprotilina (relacionados a Noradrenalina)
Reduzem a duração do comportamento Imobilidade, aumentam Escalando, sem afetar o comportamento nadando.
Fluxetina, sertralina e paroxetina (relacionados a serotonina)
Reduzem a duração do comportamento Imobilidade, aumentam o Nadando, sem afetar o escalando.
Fonte: Elaborado pelo autor
Finalmente, Detke, Rickels & Lucki (1995) [17] fizeram um estudo analisando a alteração de comportamentos ativos (Nadando e escalando) a partir de animais tratados com drogas antidepressivas. Este estudo foi notoriamente importante, pois condensou as definições até o momento em quatro: Swimming, Climbing, Immobility e Diving. Slattery e Cryan (2012) publicaram um protocolo para o TNF, fazendo uma descrição similar aos comportamentos de Detke, Rickels e Lucki (1995) e recomendou análises de concordância intra-observador a serem feitas previamente aos testes. Na Tabela 6 é mostrado algumas definições do etograma do TNF e seus autores. No Anexo 2 é apresentado as definições em inglês.
Tabela 6 - Definições comportamentais para ratos submetidos ao Teste do Nado Forçado repetido.
Publicação Descrição comportamental
Porsolt et al. (1977) [61]. a) Imobilidade: deixa de se mover fazendo apenas os movimentos necessários para manter a cabeça acima da água.
Detke, Michael e Lucki (1995) [17] .
a) Imobilidade - um rato foi considerado imóvel quando permaneceu flutuando na água sem se debater e estava fazendo apenas os movimentos necessários para manter a cabeça acima da água;
b) Nadando - foi considerado que um rato estava a nadar se estivesse a fazer movimentos de natação activos, mais do
que o necessário para manter meramente a sua cabeça acima da água, e. movendo-se no cilindro;
c) Escalada - julgou-se que um rato estava subindo quando fazia movimentos ativos com suas patas dianteiras dentro e fora d'água, geralmente dirigidas contra as paredes;
d) Mergulho - um rato foi considerado mergulhar quando todo o seu corpo estava submerso
Weiss et. al (1981) [64]. a) Lutando, definido como a quantidade de tempo que o animal nadou vigorosamente para que todos os quatro membros estivessem se movendo e os dois membros da frente estivessem atravessando a superfície da água. (Isso geralmente era feito por animais contra a parede do tanque de natação e parecia representar as tentativas mais vigorosas de escapar do tanque de natação.)
b) Flutuando, definido como o tempo em que o animal permaneceu na água com todos os quatro membros imóveis.
c) Mergulho foi definido como o animal colocando sua cabeça sob a superfície da água, um mergulho "cheio" sendo pontuado se o animal se movesse em direção ao fundo do tanque de modo que sua cabeça se movesse abaixo de seus pés traseiros;
d) "Meio mergulho" foi marcado se o animal simplesmente colocou sua cabeça abaixo da superfície da água.
e) Balanços de cabeça, definidos como agitação vigorosa da cabeça, que parecia ser feita para limpar a água do rosto e dos olhos, também foram contados.
Page et al. (1999) [56]. a) Natação foi definida como movimento em toda a câmara de
natação, que incluiu o cruzamento para outro quadrante. b) A atividade de escalada (também chamada de surra)
consistia em movimentos direcionados para cima das patas dianteiras ao longo do lado da câmara de natação,
c) A imobilidade foi atribuída quando nenhuma atividade adicional foi observada além daquela necessária para manter a cabeça do rato acima da água.
Bilitzke e Michael (1992) [57].
a) O critério de imobilidade é a ausência de luta com movimento suficiente apenas para manter a cabeça acima da água, ocasionalmente pedaladas suaves em vez de pés vigorosamente em movimento.
Chau et al. (2001) [58]. a) A natação foi definida por comportamentos de fuga (ou seja, mergulho, remada rigorosa com as quatro patas, circulando o tanque e escalando as paredes do tanque). b) A imobilidade foi pontuada como flutuante e trilhando água
Yankelevitch-Yahav (2015) [59].
a) Codifique a duração do tempo gasto como “Imóvel” se o rato estiver flutuando com a ausência de qualquer movimento, exceto aqueles necessários para manter o nariz acima da água.
b) Codifique a duração do tempo gasto como “Esforço / subida” se movimentos rápidos dos membros anteriores forem observados, de tal forma que as patas dianteiras quebrem a superfície da água.
c) Codifique a duração do tempo gasto como “Natação” se o movimento dos membros dianteiros ou posteriores de uma forma de remo for observado.
Kokras et al. (2015) [60]. a) Imobilidade quando flutuavam sem lutar e fazendo apenas os movimentos necessários para manter a cabeça acima da água.
b) A natação foi registrada quando eles nadaram ativamente em círculos (movimento horizontal).
c) Escalada foi considerada quando os ratos estavam subindo nas paredes do cilindro (movimento vertical).
d) O balanço da cabeça (frequência) foi registado quando os ratos exibiram respostas características semelhantes a agitação da cabeça.
Slattery e Cryan (2012) [22].
a) A imobilidade consiste no rato flutuando na água sem lutar e apenas fazendo movimentos necessários para manter a cabeça acima da água.
b) A natação consiste no rato fazendo movimentos horizontais em todo o cilindro de natação, que também inclui a passagem para outro quadrante.
c) Escalada compreende movimento dirigido para cima das patas dianteiras, geralmente contra o lado do cilindro nadador.
d) O mergulho pode ser discernido no TNF modificado, que envolve o mergulho do rato para o fundo do cilindro de mergulho antes de resurgir a superfície.
Fonte: Elaborado pelo autor.
2.1.5 Ferramentas de registro de comportamento: O EthoWatcher®
Recentemente, graças ao advento de computadores com maior processamento e dos algoritmos de visão de máquina, as análises de dados comportamentais categóricos como os acima descritos puderam ser complementadas (e, em alguns casos substituídos) pela análise de dados morfológicos e cinemáticos (e.g., tamanho, forma, velocidade, distância percorrida, dados de rastreamento) retirados automaticamente da imagem do animal em registros comportamentais feitos em vídeo. Nesses softwares o usuário cadastra o catálogo de comportamental, e com base nisso, transcreve os eventos comportamentais (de um vídeo ou
de um experimento em tempo real). Após a etapa de transcrição, esses softwares automaticamente contabilizam a frequência, a duração e a latência (tempo do início do experimento até a primeira ocorrência do mesmo, como o ETHOLOG e o ETÓGRAFO [121], [122]. O JWATCHER [123] é capaz ainda de fazer análises de concordância intra- e inter-observador (pela concordância total e o Kappa de Cohen, assim como sua matriz de confusão).
Outro advento, são os sistemas de video-tracking ou rastreamento, que permitem a distribuição espacial do animal ao longo do ambiente experimental. Permitindo que fosse possível avaliar a cinemática e pequenos comportamentos, que antes não era possível. Esses softwares utilizam arquivos de vídeo (adquiridos por filmadoras, câmeras digitais ou webcams, de uma perspectiva lateral ou superior do ambiente experimental). As técnicas de visão computacional e processamento digital de imagens fazem uso de subtração da imagem ao plano de fundo, podendo rastrear o animal e obter dados relativos a área do seu corpo e atributos cinemáticos (e.g velocidade, velocidade angular, distância percorrida) [124]-[127]. A união destes dados permite os cientistas e pesquisadores a analisar dados categóricos e não-categóricos associados a comportamentos do animal e seus atributos cinemáticos e morfológicos. Existem sistemas, como o LABORASTM (Laboratory Animal Behaviour Observation, Registration e Analysis System) [129], [130], que optaram pelo registro automatizado e que medem o comportamento indiretamente, através de sensores posicionados na arena comportamental (e.g acelerômetros, sensores de pressão, vibração), que associam uma determinada faixa de valores dos sinais a um comportamento. A vantagem dessas plataformas, é que elimina o fator humano das análises, sujeito a vieses, estresse, mau treinamento e outros.
O laboratório de Bioengenharia, do Instituto de Engenharia Biomédica (IEB) da UFSC, desenvolveu o EthoWhatcher® por Crispim (2011) [52], a partir da necessidade em criar uma ferramenta que pudesse registrar os eventos comportamentais observados, através do teclado do computador (a partir de vídeos digitais).
Esse registro é feito através de um catálogo de comportamentos previamente registrado. Os vídeos são registrados e calibrados pelo usuário, que consiste em definir um
plano de fundo para o vídeo, aplicar técnicas de Limiarização e Erosão (Erosion). Ambas necessárias para a ferramenta de rastreamento (tracking), capaz de obter dados cinemáticos e morfológicos do animal. Na Figura 6 é possível ver a tela de rastreamento da primeira versão do EthoWatcher®.
Figura 6 - Primeira versão do EthoWtacher®, na figura é representado como era realizada a etapa de tracking.
Fonte: Crozara (2017).
A análise de rastreamento de vídeo funciona, normalmente, por meio da segmentação de um objeto (e.g., um rato). Que consiste no uso de uma imagem digital do plano de fundo (e.g., uma arena comportamental sem o animal). Para tanto, o usuário costuma ter que selecionar e apresentar à ferramenta computacional a imagem da cena vazia como referência do plano de fundo. Subtraindo-se a imagem de referência das demais imagens que contenham o objeto de interesse em movimento, obtém-se uma representação do objeto subdivido do plano de fundo [53].
