BRUNA DE MELO
“ENVOLVIMENTO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS NA
HIPERALGESIA MUSCULAR INDUZIDA POR CONTRAÇÃO
ISOMÉTRICA SUSTENTADA EM RATOS”
Limeira 2014
RESUMO
Estudos demonstram que a dor muscular induzida por contração isométrica sustentada (CIS) possui importante impacto socioeconômico, no entanto, apesar de sua relevância clínica, os mecanismos inflamatórios envolvidos no desenvolvimento desse tipo de dor ainda são pouco compreendidos. O objetivo deste estudo foi analisar os mecanismos inflamatórios envolvidos no desenvolvimento desse tipo de hiperalgesia muscular. Para isso foi utilizado o modelo de hiperalgesia muscular induzido por contração isométrica sustentada, recentemente desenvolvido por nosso grupo de pesquisa, que consiste na indução de contração muscular isométrica no músculo gastrocnêmio de ratos machos Wistar, pesando entre 200 e 250g, que receberam uma corrente elétrica através do equipamento da marca Grass, modelo SX88R, corrente monofásica, pulso repetido, frequência de 50Hz, duração de pulso de 19ms através de eletrodos tipo agulha, pelo período de 1 hora. Para traçar o perfil inflamatório deste modelo foram administrados via intramuscular, 5 minutos, antes da contração isométrica as seguintes drogas: DALB K (3;30μg) e Bradizida (1,5;15 μg)(antagonistas dos receptores de bradicinina B1 e B2, respectivamente), Atenolol (0,6; 6μg) e ICI 118551(0,15;1,5μg) (antagonistas dos receptores adrenérgicos β1 e β, respectivamente), Indometacina, uma hora antes (10;100μg) (inibidor não seletivo das cicloxigenases) e A317491 (0,6; 6; 60 μg) (antagonista seletivo dos receptores P2X3 e P2X2/3); e administrado intraperitoneal, 20 minutos antes, a Fucoidina (25mg/Kg) (inibidora da ação das selectinas). Os resultados demonstraram que todos esses antagonistas e inibidores reduziram significativamente a hiperalgesia muscular induzida pela contração isométrica sustentada, confirmando o envolvimento da bradicinina, aminas simpatomiméticas, prostaglandinas, neutrófilos e do ATP endógeno via receptores P2X3 e P2X2/3 na hiperalgesia muscular induzida pela contração isométrica sustentada. Esses resultados delineiam pela primeira vez o perfil inflamatório da hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada e sugerem importantes alvos terapêuticos para estudo e tratamento da dor muscular, além de abrir novas perspectivas de estudo de outros mecanismos importantes no desenvolvimento da mesma.
Palavras-chave: Dor muscular, hiperalgesia, inflamação. ABSTRACT
Studies show that muscle pain induced by sustained isometric contraction (CIS) is an important socioeconomic impact, however, despite their clinical relevance, the inflammatory mechanisms involved in the development of this type of pain are still poorly understood. The aim of this study was to analyze the inflammatory mechanisms involved in the development of this type of muscle hyperalgesia. For this model of muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction, recently developed by our research group, which consists of the induction of isometric muscle contraction in the gastrocnemius muscle of male Wistar rats were used, weighing between 200 and 250g, receiving an electric current through the equipment brand Grass , model SX88R , single phase , repeated pulse frequency of 50 Hz , pulse duration of 19ms via needle-like electrodes for a period of 1 hour. To trace the inflammatory profile of this model, the following drugs were administered intramuscularly 5 minutes before the isometric contraction: DALB K (3; 30μg ) and Bradizyde (1.5, 15 mg) (antagonists of bradykinin B1 and B2 receptors, respectively), Atenolol ( 0.6 ; 6μg) and ICI 118551 ( 0.15, 1.5 mg ) ( β1 and β2 adrenergic receptor antagonists, respectively), indomethacin (10;100μg) (inhibitory action of cyclooxygenase) and A317491 ( 0.6 , 6, 60 mg) (selective antagonist of P2X3 and P2X2 / 3 receptors) , and administered intraperitoneally 20 minutes before the fucoidin ( 25mg/Kg) (inhibitory action of selectins) . The results showed that all of these antagonists and inhibitors significantly reduced muscular hyperalgesia induced by sustained isometric contraction, confirming the involvement of bradykinin, sympathomimetic amines, prostaglandins, neutrophils and endogenous ATP via P2X3 and P2X2/3 receptors in muscle hyperalgesia induced by isometric contraction sustained. These results delineate first the inflammatory profile of muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction and suggest important targets for study and treatment of muscle pain, and open new perspectives for the study of other important mechanisms in the development of the same.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1 2. OBJETIVOS 9 3. CAPÍTULOS - ARTIGO 11 4. DISCUSSÃO 41 5. CONCLUSÃO 44 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 ANEXOS 53
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Rita de Cássia e José Benedito por seu amor, incentivo e por me ensinarem o amor e o valor do estudo, a minha irmã Emília Melo por seu amor e seu entusiasmo e ao meu
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me guiado em todos os momentos e por ter tornado possível a realização desse sonho.
Agradeço aos meus pais Rita de Cássia e José Benedito, por todo o incentivo que me deram mesmo com todas as dificuldades que enfrentamos. Agradeço por seu amor, seu carinho e por terem me ensinado a importância e o amor ao estudo. Não há bem maior que vocês poderiam ter me dado.
Agradeço a minha irmã Emília de Melo pelo seu entusiasmo desde o primeiro segundo que lhe contei sobre o mestrado, pelo seu incentivo, seu carinho e pelo seu exemplo como educadora.
Agradeço ao meu namorado Braico Aquino pelo seu amor, apoio, carinho, compreensão e incentivo em todos os momentos.
Agradeço ao professor Cláudio Fusaro por ter sido a primeira pessoa a me incentivar a fazer o curso de mestrado e por me ajudar a encontrar meu caminho. Peço que Deus lhe retribua sempre esse presente que me deu.
Agradeço a professora Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro por ter me aceitado como sua aluna de mestrado, e me dado esta oportunidade da qual nunca me esquecerei. Agradeço por todo incentivo, apoio e por ter acreditado em mim. Agradeço por ter me ensinado tanto, não apenas profissionalmente, mas também pessoalmente. Agradeço também pela relação de amizade e respeito que existe entre nós e por todas as vezes que corrigiu meus trabalhos até tão tarde da noite e que investiu em mim mais até do que eu seria capaz de imaginar. Que Deus lhe dê em dobro tudo que me proporcionou de bom.
Agradeço a FCA/UNICAMP pela oportunidade de ter feito parte da segunda turma de mestrado da unidade e de mudar minha vida
Agradeço ao programa de pós-graduação em Ciências da Nutrição e do Esporte e do Metabolismo pela atenção e ensinamentos
Agradeço ao aluno de mestrado Diogo Francisco pela parceria de sucesso durante a realização deste trabalho e por ter me ajudado nos momentos dos resultados lindos e dos problemas difíceis.
Agradeço a Jalile Garcia por ter me iniciado no laboratório e por ter me ensinado desde os primeiros passos até os processos mais difíceis e a doutoranda Juliana Maia Teixeira por ter me ensinado tanto pela conduta e pelo exemplo como profissional.
Agradeço ao professor Carlos Amilcar Parada por ter aberto as portas de seu laboratório de pesquisa no IB para que eu tivesse minhas primeiras experiências no ambiente laboratorial e pelas reuniões de grupo esclarecedoras no que se refere a dor. Agradeço também seus alunos Dionéia Araldi, Elayne Dias, César Sartori, Paula Marião e Felipe Prado pelo apoio e pelo exemplo.
Agradeço aos professores da FCA Unicamp por terem me ensinado tanto, cada um de sua forma e pelo exemplo. Agradeço em especial aos professores Rodrigo Baldo, Hosana Rodrigues, Augusto Luchessi, Márcio Torsoni e Adriana Torsoni pelo apoio e por toda ajuda na realização deste trabalho, agradeço também a aluna de doutorado Simone por toda sua ajuda e por seu carinho.
Agradeço aos funcionários da segurança e as meninas da manutenção pelo carinho e pela companhia durante férias e feriados com experimentos intensos. Muito obrigado a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Agradeço a Maria Aparecida, técnica de laboratório de histologia da FOP UNICAMP pelo seu auxílio, a Giuliana da FMRP USP por suas orientações quanto aos procedimentos de ELISA e a Josiane nossa querida bioterista por cuidar de nossos animais e pelo carinho.
Agradeço as minhas amigas e colegas do curso de mestrado Khalile Youssef e Sabrina Karen por seu carinho, apoio e muitas risadas, além das muitas caronas para casa.
Agradeço a aluna de mestrado Carolina Jorge por ter se tornado mais que minha companheira de laboratório, mas também por sua amizade e apoio durante os experimentos no laboratório e pela muitas gordices que fizemos juntas. Te desejo muito sucesso!
Agradeço também aos meus queridos amigos de laboratório de Limeira, carinhosamente apelidados de Labedianos, por todo apoio, carinho e força durante esses anos que estamos juntos e que se tornaram parte de minha família nos bons e maus momentos. Nunca me esquecerei do trabalho que fizemos e das gordices Thaísa Joanna, Aline Marques, Graciana Azambuja, Gabriela Cedaro, Carolina Jorge e Diogo Francisco.
Agradeço aos meus familiares pelo entusiasmo e pelo apoio em especial aos meus avós Conceição de Melo, exemplo de pessoa e de vida e ao meu avô Benedito Assis pelo incentivo e entusiasmo, sei que onde o senhor estiver esta vibrando comigo hoje. E a meu tio Luis Carlos por me incentivar e acreditar tanto em mim e por ser uma das causas de eu querer tanto estudar dor.
Agradeço também a todos meus pacientes que me fizeram buscar estudar formas de tratamento da dor por seu incomodo e pelo problema imenso que a dor significa em suas vidas.
Agradeço também a FAPESP, pelo apoio financeiro a realização da pesquisa e pela concessão da bolsa de estudos para que eu pudesse desenvolver meu mestrado.
EPÍGRAFE
Porque eu, o SENHOR, teu Deus, te tomo pela tua mão direita e te digo: Não temas, que eu te ajudo (Isaías 41:13)
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática dos nociceptores aferentes primários no
terminal neuronal e dos possíveis ligantes destes.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
α,β-meATP – Alfa beta metileno ATP
β1 – Receptor beta adrenérgico 1
β2 – Receptor beta adrenérgico 2
µg – Micrograma
AMPc – Monofosfato de adenosina cíclica
ANOVA – Análise de variância
ATP – Adenosina trifosfato
Aδ – Fibra Aδ
B1 – Receptor de Bradicinina 1
B2 – Receptor de Bradicinina 2
CINC-1 – Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant-1 (Quimioatraente-1 de Neutrófilos indutor de Citocina)
g - gramas
IASP – International Association for Study of Pain (Associação Internacional para Estudo da Dor)
IL-1β – Interleucina 1 beta IL-6 – Interleucina 6 IL-8 – Interleucina 8 P2X – Receptores purinérgicos P2X P2X3 – Receptor purinérgico P2X3 P2X2/3 – Receptor purinérgico P2X2/3 PKA – Fosfoquinase A PKC – Fosfoquinase C
RNAm- Ácido Ribonucleico mensageiro
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
LISTA DE SÍMBOLOS ° - Graus α – Alfa β – Beta δ – Delta µ - Micro
1. INTRODUÇÃO
Estudos demonstram que a dor muscular é tipo de dor mais prevalente na população mundial (Andersen et al. 2007; Murray et al. 2012). Ela acomete mais de 40% da população e é responsável por cerca de 29% das faltas no ambiente de trabalho com elevados índices de incapacidade física e laboral (Minson, 2009), sendo que seus prejuízos sócio econômicos ficam atrás apenas das doenças cardiovasculares (Murray et al. 2013; Coogan et al. 2013, Nahit et al. 2013).
A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP) como sendo uma “experiência sensorial e emocional desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial ou descrita nos termos de tal dano”. Trata-se de uma experiência de natureza multidimensional que envolve os componentes motivacional, emocional, sensório-discriminativo, afetivo e cognitivo (Merskey, 1986), sendo influenciada por uma série de fatores como idade (Riley et al. 2013), sexo (Amandusson e Blomqvist, 2013) e etnia (Palit et al. 2013, Matsudaira et al. 2013), estado emocional e pela própria integridade física das vias condutoras.
De forma mais simplificada, a dor pode ser considerada um mecanismo fisiológico protetor do organismo à presença de estímulos de natureza lesiva/ destrutiva, podendo ser definida também, como a percepção de um estímulo nociceptivo. Esta definição engloba dois conceitos: o de percepção e o de nocicepção, sendo que a percepção é uma função integrativa do estímulo realizada a nível central e resultante de componentes cognitivo-motivacionais (Mersky, 1986); e a nocicepção, como sendo resultante da ativação de uma população de neurônios específicos que fazem a transmissão de um estímulo nocivo para as áreas centrais (Millan, 1999; Julius e Bausbaum, 2001).
Inicialmente, na presença de um estímulo nocivo, subjetivamente percebido como doloroso há ativação de receptores específicos denominados nociceptores, que consistem em terminações nervosas livres presentes na maioria dos tecidos corporais, ativados por estímulos de alto limiar, de natureza mecânica, térmica ou química (Mense, 2008). Na membrana do nociceptor estão distribuídos uma série de receptores
específicos classificados como receptores de natureza ionotrópica, que nada mais são do que canais iônicos ativados por ligantes, e por receptores de natureza metabotrópica, caracterizados por serem acoplados a proteína G e estarem envolvidos com uma série de reações intracelulares relacionadas a fosfoquinase C (PKC), fosfoquinase A (PKA) e ao AMPc e culminam na abertura de canais de sódio, e no influxo de íons positivos para o interior da membrana neuronal, sensibilizando-a (Mense e Gerwin, 2010) (Figura 1).
Figura 1: Representação esquemática dos nociceptores aferentes primários no terminal neuronal e dos possíveis ligantes destes. Em: a) Canais iônicos ativados por ligantes, b) receptores metabotrópicos relacionados a ativação da fosfolipase C e da PKC, e em c) receptores acoplados ou não a proteína G e relacionados a ativação do AMPc e PKA.
A sensibilização neuronal é um fenômeno caracterizado pela redução do limiar de excitabilidade das fibras aferentes primárias (Riedel e Neeck, 2001) e ocorre devido ao influxo de íons sódio para o interior da membrana neuronal, despolarizando-a, tornando-a mais facilmente excitável, com consequente aumento no número de potenciais de ação. A este fenômeno damos o nome de hiperalgesia, definida pela
IASP como sendo uma condição caracterizada por um aumento na resposta a um estímulo que normalmente é doloroso, estando muitas vezes associada a condições de natureza inflamatória.
De forma geral, após uma lesão tecidual existe a liberação de uma série de mediadores pró-inflamatórios como bradicinina e de citocinas como TNF-α, IL-1β, IL-6 e CINC-1 (Cunha et al. 1992; Ferreira et al. 1993), que estimulam a síntese de prostaglandinas e a liberação de aminas simpatomiméticas, as quais sensibilizam diretamente os nociceptores aferentes primários (Gold et al. 1996; Rush e Waxman, 2004).
A ativação desses receptores gera a ativação de fibras aferentes nociceptivas que podem ser do tipo A delta (Aδ) ou C. As fibras A delta são caracterizadas por serem fibras nervosas de médio diâmetro, mielinizadas, com velocidade de condução média entre 12 e 30 m/s e envolvidas com a condução da dor de natureza rápida pelo trato paleo-espinotalâmico. As fibras C são caracterizadas por serem pouco mielinizadas, com velocidade de condução menor do que as fibras Aδ (0,5 e 2 m/s) e envolvidas com a condução da dor de natureza lenta ou crônica pelo trato neoespinotalâmico (Millan 1999; Julius e Bausbaum, 2001) conduzindo assim a informação dolorosa a áreas cerebrais para interpretação.
A dor muscular é caracterizada por apresentar uma série de particularidades tanto com as diversas estruturas envolvidas no processamento do estímulo doloroso muscular, como por exemplo, os nociceptores, as vias de condução, áreas cerebrais envolvidas com a interpretação da dor (Mense & Gerwin, 2010) bem como a liberação de citocinas pró-inflamatórias (Loram et al. 2007), a formação de campos receptivos (Hoheisel et al. 1993, Mense, 1993, Yu et al. 1993) e a própria percepção de estímulos de natureza dolorosa (Dubner, 1991).
Quanto aos nociceptores, estes possuem uma estrutura diferenciada no tecido muscular, ainda pouco compreendida, mas que em imagens por microscopia eletrônica aparecem sendo envolvidos por células de Schwann quase que completamente, com apenas uma pequena área não recoberta, local onde há ativação dos nociceptores ali
distribuídos (figura 2). Além disso, sabe-se que a fibra muscular não apresenta nociceptores, estando distribuídos no perimísio, camada adventícia das arteríolas e no tecido peritendíneo.
Figura 2: Ultraestrutura da terminação nervosa livre muscular. A) Representação da terminação nervosa livre envolvida por células de Schwann e as varicosidades formadas por elas. B) Secção da terminação nervosa livre na região da varicosidade mostrando a disposição periférica das células de Schwann em relação ao axônio e a área exposta do neurônio.
Após a ativação dos nociceptores temos a ativação das vias aferentes nociceptivas que conduzem a informação até o SNC, sendo que no músculo a classificação das fibras se dá semelhante a de órgãos viscerais, ou seja, a dor aguda é conduzida via fibras III, que se assemelham as fibras Aδ e a dor crônica pela fibras IV, semelhantes às fibras C até as seguintes áreas: córtex cingulado anterior, córtex somatossensorial primário e secundário, córtex insular, tálamo e córtex pré-frontal para ser interpretada (Apkarian et al. 2005, Lorenz e Casey, 2005, Henderson et al. 2007).
Existem evidências de que a liberação de citocinas pró-inflamatórias estejam relacionadas ao desenvolvimento da dor muscular induzida pelo exercício excêntrico (Kanda et al. 2013) e por processos patológicos envolvidos com a dor crônica (Dina et al. 2008; Noma et al. 2013), no entanto, esta liberação diferentemente do tecido cutâneo se dá mais lentamente, como observado por Loram et al. (2007) em uma análise temporal da liberação de TNF-α, IL1-β, IL-6 e CINC-1 em grupos de animais que receberam a administração de carragenina no tecido subcutâneo, e no tecido
muscular, verificando-se que no tecido cutâneo há elevação cerca de 3 horas após a administração. No entanto, no músculo esta liberação se dá apenas após 24 horas.
Além disso, o tecido muscular apresenta a formação de um maior número de campos receptivos no corno da raiz dorsal quando administrados estímulos de natureza dolorosa como a injeção de bradicinina (Hoheisel et al. 1993) e de óleo de mostarda (Yu et al. 1993) quando comparado a outros tecidos além de apresentar diferenças quanto a percepção da sensação dolorosa uma vez que a dor muscular se manifesta de forma difusa, profunda e referida enquanto que a dor cutânea se manifesta de forma superficial, bem localizada, em pontada ou queimação (Dubner, 1991) devido as diferenças relacionas a condução e as áreas cerebrais ativadas (Mense e Gerwin, 2010).
A dor muscular pode estar associada a uma série de processos lesivos decorrentes de trauma, alongamento excessivo, e contração muscular extenuante e/ou sustentadas. A contração isométrica é o padrão de contração onde há geração de força muscular sem haver deslocamento do seguimento corporal sendo o padrão de contração muscular mais associado às atividades de vida diária e, consequentemente, mais relacionado às condições dolorosas associadas às atividades funcionais na vida diária e laborais (Knardahl, 2002, Boix et al. 2005).
Estudos demonstram que as atividades funcionais, realizadas por longos períodos de tempo e potencialmente dolorosas, como a sustentação do peso corporal na postura em pé e permanecer sentado em atividade de digitação, são mantidas principalmente por contração isométrica sustentada (Roy et al. 1989). Além disso, foi demonstrado que a dor nas costas referida após os períodos de sono na posição deitada é causada por contração isométrica dos músculos lombares (Baum e Essfeld, 1999). Diferentes modelos experimentais realizados em humanos também demonstram que a contração isométrica sustentada induz dor. Há relatos de dores musculares após contrações isométricas sustentadas do músculo masseter ou trapézio, realizadas repetidamente por um determinado período de tempo (Hedenberg-Magnusson et al. 2006) e também do músculo quadríceps, na posição de flexão de joelho a 90°, realizada uma única vez até a exaustão, tanto em mulheres saudáveis como nas portadoras de fibromialgia
(Kosek et al. 1996). Além disso, foi descrito que a dor no músculo trapézio induzida pela manutenção do ombro em abdução a 90° está associada ao aumento da concentração local de bradicinina e calidina (Boix et al. 2005).
Diversos estudos demonstram que a dor muscular está associada a um processo inflamatório, uma vez que antiinflamatórios não-esteroidais diminuem a dor muscular (Kvien e Viktil, 2003) e que em músculos sintomáticos existe um aumento nos níveis de citocinas pró-inflamatórias (Schafers et al. 2003, Loram et al. 2007) e de outros mediadores como bradicinina, prostaglandinas (Mense, 2009) e neutrófilos (Tidball, 2005), indicando a importância dos mecanismos inflamatórios clássicos no desenvolvimento da dor muscular. Sabe-se que durante o processo inflamatório da carragenina, por exemplo, no tecido subcutâneo da pata de ratos a liberação de bradicinina (Ferreira et al. 1993) via receptores B1 e B2 estimula a liberação de TNFα (Poole et al. 1999), e este atua ativando a liberação de IL-1β, IL-6 e IL-8 (CINC1 em ratos)(Cunha et al. 1992), estimulando a liberação de aminas simpatomiméticas (Ferreira et al. 1988) e de prostaglandinas (Cunha et al.1991) que atuam sensibilizando o neurônio. Além desses mediadores, tem sido descrito o envolvimento de neutrófilos, por sua ação na modulação de citocinas inflamatórias (Cunha et al. 2008) e da molécula de ATP (Oliveira et al. 2009). Especificamente a molécula de ATP (adenosina trifosfato) vem sendo apontada como um importante mediador da dor muscular (Mense, 2009). O ATP está presente em todas as células do organismo e existem diversas circunstâncias nas quais o ATP pode ser liberado e atuar como um mediador inflamatório do tecido periférico (Hamilton, 2002). Durante a inflamação, o ATP liberado no meio extracelular contribui com o desenvolvimento da dor inflamatória via ativação dos receptores purinérgicos P2X, em especial o subtipo P2X3 e P2X2/3 (Cockayne et al. 2000, Souslova et al. 2000, Jarvis et al. 2002, McGaraughty et al. 2003, Wu et al. 2004, Oliveira et al. 2005, Oliveira et al. 2009).
Tem sido descrito que os receptores P2X3 são predominantemente expressos nos nociceptores aferentes primários (Chen et al. 1995, Lewis et al. 1995, Collo et al. 1996) e, recentemente, nosso grupo de pesquisa demonstrou que a ativação dos receptores P2X3 e P2X2/3 pelo ATP endógeno é essencial para o desenvolvimento da dor
inflamatória induzida pela carragenina no tecido subcutâneo da pata de ratos, uma vez que o antagonista seletivo de receptores P2X3 e P2X2/3, A-317491 (Oliveira et al. 2009), bloqueou a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina. Neste estudo, foi demonstrado que a participação dos receptores P2X3 e P2X2/3 na hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina é mediada pela sensibilização direta e indireta dos nociceptores aferentes primários. A sensibilização direta envolve a ativação dos receptores P2X3 expressos nas fibras aferentes primárias, enquanto que a sensibilização indireta envolve a liberação prévia da citocina pró-inflamatória TNF-α (Oliveira et al. 2009). Em outro estudo também realizado por nosso grupo de pesquisa foi demonstrado que o agonista não seletivo de receptores P2X3 e P2X2/3, α,β-meATP, induz hiperalgesia mecânica no tecido subcutâneo da pata de ratos através da sensibilização indireta dos nociceptores aferentes primários (dados não publicados).
No tecido muscular, a molécula de ATP está particularmente presente em altas concentrações e, por essa razão, tanto em traumas musculares quanto em eventos patológicos da musculatura, o ATP pode contribuir para o desenvolvimento da dor muscular (McCleskey e Gold, 1999, Burnstock, 2007). Estudos que sustentam essa hipótese demonstram que a contração muscular excêntrica aumenta a expressão do RNAm de receptores P2X3 no músculo masseter de ratos (Dessem et al. 2010), os nociceptores aferentes primários do músculo gastrocnêmio de ratos (Reinohl et al. 2003) ou do músculo tríceps femural de gatos (Hanna e Kaufman, 2004) são ativados pela administração do agonista não seletivo de receptor P2X3 α,β-meATP ou de ATP em concentrações equivalentes às encontradas nas células musculares. Além disso, a administração de ATP ou α,β-meATP no músculo esquelético de humanos (Mork et al., 2003) ou camundongos (Makowska et al. 2006, Reitz et al. 2009) induz dor muscular intensa.
Recentemente, nosso grupo de pesquisa desenvolveu um novo modelo de hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada no músculo gastrocnêmio de ratos. A contração foi realizada através de um eletroestimulador da marca Grass, modelo SX88R, com os seguintes parâmetros: pulso repetido, corrente monofásica, duração de pulso 19ms, frequência de 50 Hz, intensidade de 1,6 V com um
tempo de estimulação de 1 hora e eletrodos inseridos diretamente no ventre do músculo gastrocnêmio de ratos. Após a padronização do modelo, verificou-se o envolvimento de um componente inflamatório, uma vez que a hiperalgesia muscular foi prevenida através do pré-tratamento com o anti-inflamatório esteroidal dexametasona.
Considerando-se esses dados, o objetivo do estudo atual foi analisar o envolvimentos de mediadores inflamatório envolvidos na hiperalgesia muscular induzida pela contração isométrica sustentada. Para isso, investigamos o envolvimento da bradicinina, prostaglandinas, aminas simpatomiméticas, neutrófilos e ATP via ativação de receptores P2X3.
2. OBJETIVOS
Apesar da relevância clínica das dores musculares, os mecanismos inflamatórios envolvidos no desenvolvimento da dor muscular induzida pela contração isométrica sustentada são pouco conhecidos. Portanto, objetivo deste trabalho foi estudar o envolvimento dos mediadores inflamatórios clássicos na hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada em ratos.
Os objetivos específicos foram:
1. Estudar o envolvimento da bradicinina no desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. Para isso, testamos a habilidade dos antagonistas seletivos dos receptores B1 (DALBK) e B2 (Bradizida) em reduzir a hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. 2. Estudar o envolvimento das aminas simpatomiméticas no desenvolvimento da
hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. Para isso, testamos a habilidade dos antagonistas seletivos dos receptores β1 (Atenolol) e β2 (ICI 118,551) em reduzir a hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada.
3. Estudar o envolvimento das prostaglandinas no desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. Para isso, testamos a habilidade do inibidor não seletivo da cicloxigenase (Indometacina) em reduzir a hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada.
4. Estudar o envolvimento dos neutrófilos no desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. Para isso, testamos a habilidade do inibidor não seletivo das selectinas (Fucoidina) em reduzir a hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada.
5. Estudar o envolvimento dos receptores P2X3 e P2X2/3 no desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada. Para isso, testamos a habilidade do antagonista seletivo dos receptores P2X3 e P2X2/3
(A317491) em reduzir a hiperalgesia muscular induzida por contração isométrica sustentada.
3. CAPÍTULO
Versão do artigo “The inflammatory mechanisms involved in mechanical hyperalgesia induced by sustained isometric contraction” que foi submetido ao periódico “Life Sciences” (ANEXO 1)
The inflammatory mechanisms involved in mechanical hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
Bruna de Melo1,
Diogo Francisco da Silva dos Santos1, Carolina Ocanha Jorge1,
Carlos Amílcar Parada2,
Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira-Fusaro*1
1- Laboratory of Studies of Pain and Inflammation, School of Applied Sciences-UNICAMP - Limeira, SP, Brazil
2- Department of Structural and Funcional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas – UNICAMP – Campinas, SP, Brazil
*Corresponding author:
School of Applied Sciences, State University of Campinas- UNICAMP
Pedro Zaccaria,1300, Jd. Santa Luzia, Zip Code:13484-350, Limeira, São Paulo – Brazil Tel: + 55-19-37016716 Fax: + 55-19-37016680
E-mail address: maria.fusaro@fca.unicamp.br (Oliveira-Fusaro MCG)
ABSTRACT
Studies show that muscle pain induced by sustained isometric contraction (CIS) is an important socioeconomic impact, however, despite their clinical relevance, the inflammatory mechanisms involved in the development of this type of pain are still poorly understood. The aim of this study was to analyze the inflammatory mechanisms involved in the development of this type of muscle hyperalgesia. For this model of muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction, recently developed by our research group, which consists of the induction of isometric muscle contraction in the gastrocnemius muscle of male Wistar rats were used, weighing between 200 and 250g, receiving an electric current through the equipment brand Grass, model SX88R , single phase , repeated pulse frequency of 50 Hz , pulse duration of 19ms via needle-like electrodes for a period of 1 hour. To trace the inflammatory profile of this model, the following drugs were administered intramuscularly 5 minutes before the isometric contraction: DALB K (3; 30μg) and Bradizyde (1.5, 15 mg) (antagonists of bradykinin B1 and B2 receptors, respectively), Atenolol ( 0.6 ; 6μg) and ICI 118551 ( 0.15, 1.5 mg) (β1 and β2 adrenergic receptor antagonists, respectively), indomethacin (10 ; 100μg) (inhibitory action of cyclooxygenase) and A317491 (0.6 , 6, 60 mg) (selective antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors) , and administered intraperitoneally 20 minutes before the fucoidan (25mg/Kg) (inhibitory action of selectins) . The results showed that all of these antagonists and inhibitors significantly reduced muscular hyperalgesia induced by sustained isometric contraction, confirming the involvement of bradykinin, sympathomimetic amines, prostaglandins, neutrophils and endogenous ATP via P2X3 and P2X2/3 receptors in muscle hyperalgesia induced by isometric contraction sustained. These results delineate first the inflammatory profile of muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction and suggest important targets for study and treatment of muscle pain, and open new perspectives for the study of other important mechanisms in the development of the same
Keywords: Muscle pain, sustained isometric contraction, inflammatory mediators, P2X3
1. INTRODUCTION
Muscle pain is the most prevalent kind of pain in the world (Andersen et al. 2007; Murray et al. 2012). It affects more than 40% of population and is responsible for 29% of absences of work (Minson 2009). Because muscle pain is one of the main causes of disability after conditions like cardiovascular diseases (Murray et al. 2013; Coogan et al. 2013, Nahit et al. 2013), its socioeconomic impact is very significant.
It is well known that eccentric contractions induce delayed onset muscle soreness (Newham et al. 1983; Kanda et al. 2013), however the socioeconomic impact of this kind of pain is not great. On the other hand, the isometric contraction is associated with activities of daily living (Knardahl 2002; Boix et al. 2005) and when the isometric contraction is sustained for several minutes, it induces muscle pain (Hendemberg-Magnusson et al. 2006; Kosek et al. 1996; Boix et al. 2005; Shinoda et al. 2008).There are reports of muscle pain after sustained isometric contractions of the masseter and trapezius muscle, performed repeatedly for a certain period of time (Hedenberg-Magnusson et al. 2006) and also of the quadriceps muscle, in the position of knee flexion to 90°, held once to exhaustion in both healthy women and women with fibromyalgia (Kosek et al. 1996). In addition, it was reported that the pain in trapezius muscle induced by the maintenance of shoulder abduction to 90° is associated with increased local concentration of bradykinin and kallidin (Boix et al. 2005). Recently, our research group developed a new model of muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction in rats and demonstrated the involvement of an inflammatory component, since the muscle hyperalgesia was prevented by pretreatment with the anti-inflammatory steroid drug Dexamethasone and the histological analysis demonstrated the presence of macrophages and neutrophils after the sustained isometric contraction.
It has been described that muscle pain is involved with inflammatory process (Kvien and Viktil 2003) and there are evidences of the involvement of proinflammatory cytokines (Loram et al. 2007; Schanfers et al. 2003), bradykinin, prostaglandins (Mense 2009) and neutrophils (Tidball 2005), indicating the importance of the classical inflammatory mechanisms in the development of muscle pain. In addition to these classical inflammatory mediators, it has been described the involvement of endogenous
ATP, via activation of P2X3 receptors on muscle pain. It was described that, in different pathological situations, ATP can be released from muscle tissue (Mense 2009; Hamilton 2002; McCleskey & Gold 1999; Burnstock 2007). In the extracellular milieu, ATP may induce pain via activation of purinergic receptors, specially, the subtype P2X3 and P2X2/3 (Cockayne et al. 2000; Soulousva et al. 2000; Jarvis et al. 2002; McGaraughty et al. 2003; Wu et al. 2004; Oliveira et al. 2005; Oliveira et al. 2009), which is expressed preferentially in nociceptive C-fibers (Chen et. 2005; Lewis et al. 1995; Collo et al. 1996) or IV-fibers of the muscle tissue (Mense 2009). The activation of P2X3 receptor by endogenous ATP or by its agonists initiates a depolarization and Ca2+ influx via the co-expressed voltage-dependent Ca2+ channels (Kennedy et al. 2003) contributing to development of inflammatory hyperalgesia (Oliveira et al. 2009; Volonté & Burnstock 2013; Burnstock 2013).
Considering the clinical relevance of muscle pain induced by isometric contraction, the aim of this study was to investigate the inflammatory mechanisms involved with the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction.
2. EXPERIMENTAL PROCEDURES
2.1. Subjects
Male albino Wistar rats weighing 200-250g were used. Experiments were conducted in accordance with the guidelines of the IASP guidelines on using laboratory animals (Zimmermann 1983). All animal experimental procedures and protocols were approved by the Committee on Animal Research of the State of University of Campinas – UNICAMP, protocol number 2770-1. Animal suffering and number of animals per group were kept at a minimum. The animals were housed in plastic cages with soft bedding (five/cage) on a 12-hour light/dark cycle (lights on at 06:00 AM) with food and water avaliable ad libitum. They were maintained on a temperature-controlled room test (± 23◦C) for one hour habituation period prior to the test.
2.2. Model of Induction of Sustained Isometric Contraction
The animals were anesthetized with isoflurane (2%-4%) and submitted to sustained isometric contraction across the electrical stimulator Grass mark, model SX88R, with parameters: Repeated pulse, single phase, 19ms pulse duration, 50 Hz frequency, intensity of 1.6 V with for 1 hour. The electrical stimulation was performed by electrodes inserted directly into the belly of the gastrocnemius muscle of rats as the model previously standardized. For animals sham the electrodes were only inserted but without eletrical stimulation.
2.4. Intramuscular Injections
Drugs or their vehicle were injected into the belly of the gastrocnemius muscle of rats with a 30-gauge needle, as previously described (Gautam and Benson 2013). The needle was connected to a polyethylene catheter and also to a Hamilton syringe (50µl). The animals were briefly restrained and the total volume administered was 50µl.
2.5. Drugs and Doses
It was used the following drugs: the antagonists of bradykinin B1 (DALBK 3, 30μg; Oliveira et al., 2009) and B2 receptors (Bradyzide 1.5, 15μg; Oliveira et al., 2009); the adrenoreceptor β1 (atenolol 0.6, 6μg) and β2 (ICI 118.551 0.15,1,5μg) antagonists; the inhibitor of cyclooxigenase (indomethacin 10, 100μg; Tambeli et al., 2009), the nonspecific selectin inhibitor (fucoidan 25mg/Kg; Zhang et al., 2001); and the
selective P2X3 and P2X2/3 receptor antagonist: 5-([(3-Phenoxybenzyl) [(1S)-1,2,3,4-tetrahydro-1naphthalenyl][amino]carbonyl)-1,2,4-benzene-tricarboxylic acid (A317491 0.6, 6, 60μg; Oliveira et al.,2009). All drugs were obtained from Sigma-Aldrich and dissolved in saline.
2.6. Mechanical Nociceptive Threshold Test
Testing session took place during light phase (between 9:00 A.M. and 5:00 P.M.) in a quiet room maintained at 23°C (Rosland 1991).
a) Randall Sellito
The Randall-Selitto nociceptive paw-withdrawal flexion reflex test (Randall and Selitto 1957) was performed using a Insight analgesymeter digital (Insight, Ribeirão Preto, Brazil), which applies a linear mechanical force to the belly of the gastrocnemius muscle of rats (Fujii et al. 2008). The baseline muscle-withdrawal threshold was defined as the mean of three tests performed at five-minute intervals before the induction of sustained isometric contraction and/or the administration of antagonists. Mechanical hyperalgesia was quantified as the change in mechanical nociceptive threshold calculated by subtracting the mean of three mechanical nociceptive threshold measurements taken after 1-hour of sustained isometric contraction from the mean of the three baseline measurements.
b) PET
This incapacitation test is described in detail elsewhere (Tonussi and Ferreira 1992). In this test, rats are placed on a revolving cylinder (30 cm diameter; 3 rpm) for one minute periods and a computer-assisted device measures the total time that a specific hindpaw was not in contact with the cylinder surface (i.e. paw elevation time; PET). Normally, control animals display a TEP of approximately 10 s, whereas algogenic substances injected into gastrocnemius muscle increase this value only in the affected
limb.
2.7. Statistical Analysis
To determine if there were significant differences (p<0.05) in figure 1 Two Way ANOVA was performed with post-hoc Bonferroni to determine the basis of the significant difference. For date shown in other figures, a One-Way ANOVA or T-test was performed to determine whether there were significant differences (p<0.05) between the groups. If there was a significant difference it was used Tukey Test to determine the basis of the significant difference. Data were expressed in figures by the decrease in muscle-withdrawal threshold and by paw elevation time and presented as means ± S.E.M.
3. RESULTS
3.1. Bradykinin mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
The sustained isometric contraction induced mechanical muscle hyperalgesia 30 minutes and 1 hour after contraction when compared with sham (p<0.05, Bonferroni test, figure 1 A and B). Considering that the greatest response was obtained 1h after contraction, in further experiments, the mechanical hyperalgesia and the paw elevation time was evaluated only 1 hour after the induction of sustained isometric contraction.
To verify whether the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction was mediated by Bradykinin, the antagonist of B1 receptor, DALBK (3; 30µg; Oliveira et al., 2009), or B2 receptor, Bradyzide (1.5; 15µg; Oliveira et al., 2009), was administered into the belly of the gastrocnemius muscle 5 minutes before the isometric contraction. DALBK (30µg/muscle, but not 3µg) or Bradyzide (15µg/muscle, but not 1.5µg) prevented (p<0.05, Tukey test, figure 2 A-D) the mechanical muscle hyperalgesia and the increase of paw-elevation time induced by sustained isometric contraction when administered in the ipsilateral but not in the contralateral gastrocnemius muscle, confirming its local peripheral action. The administration of DALBK (30µg/muscle) and Bradyzide (15µg/muscle) in animals sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and paw-elevation time (p>0.05, Tukey test, figure 2).
3.2. Sympathetic amines mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
To verify whether the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction was mediated sympathetic amines, the antagonist of β1 adrenoceptor Atenolol (0.6; 6µg; Tambeli et al., 2003), or β2 ICI 118,551 (0.15; 1,5 µg; Parada et al., 2003), was administered into the belly of gastrocnemius muscle 5 minutes before the isometric contraction. Atenolol (6µg/muscle, but not 0,6µg) or ICI 118,551
(1.5µg/muscle, but not 0.15 µg) prevented (p<0.05, Tukey test, figure 3 A-D) the mechanical muscle hyperalgesia and the increase of paw-elevation time induced by sustained isometric contraction when administered in ipsilateral but not in the contralateral gastrocnemius muscle, confirming its local peripheral action. The administration of Atenolol (6µg/muscle) and ICI 118,551 (1.5µg/muscle) in animals sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and paw-elevation time (p>0.05, Tukey test, figure 3).
3.3. Prostaglandins mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
To verify whether the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction was mediated by prostaglandins, the non-selective cyclooxygenase inhibitor indomethacin (10; 100µg; Ferreira et al., 1997) was administered into the belly of gastrocnemius muscle 60 minutes before the isometric contraction. The indomethacin (100µg/muscle, but not 10µg) prevented (p<0.05, Tukey test, figure 4, A-B) the mechanical muscle hyperalgesia and the increase of paw-elevation time induced by sustained isometric contraction when administered in ipsilateral but not in the contralateral gastrocnemius muscle, confirming its local peripheral action. The administration of indomethacin (100µg/muscle) in animals sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and the paw-elevation (p>0.05, Tukey test, figure 4).
3.4. Neutrophils mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
To verify whether the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction was mediated by neuthophils, the non-specific selectin inhibitor antagonist Fucoidan (25mg/Kg, i.p ; Zhang et al., 2001) it administered 20 minutes before the isometric contraction. Fucoidan (25mg/Kg) prevented (p<0.05, Tukey test, figure 5 A-B) the mechanical muscle hyperalgesia and the increase of paw-elevation
time induced by sustained isometric contraction. The administration of Fucoidan (25mg/Kg) in animals sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and paw-elevation time (p>0.05, Tukey test, figure 5).
3.5. ATP via activation of P2X3 and P2X2/3 receptor mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
To verify whether the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction was mediated by endogenous ATP via activation of P2X3 and P2X2/3 receptors, the selective P2X3 and P2X2/3 receptor antagonist A-317491 (0.6,6 and 60μg; Oliveira et al., 2009) was administered into the belly of gastrocnemius muscle 5 minutes before the isometric contraction. A-317491 (6 and 60µg/muscle, but not 0.6 µg) prevented (p<0.05, Tukey test, figure 6 A-B) the mechanical muscle hyperalgesia and the increase of paw-elevation time induced by sustained isometric contraction when administered in ipsilateral but not in the contralateral gastrocnemius muscle, confirming its local peripheral action. The administration of A-317491 (60ug/muscle) in animals sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and paw-elevation time (p>0.05, Tukey test, figure 6).
4. DISCUSSION
The findings of the present study demonstrated, for the first time, that the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction is mediated, at least in part, by bradykinin, sympathetic amines, prostaglandins, neutrophils and endogenous ATP via activation of P2X3 and P2X2/3 receptors. This is consistent with previous studies that demonstrated that muscle pain is associated with inflammation, since nonsteroidal anti-inflammatory drugs reduce muscle pain (Kvien and Viktil 2003) and the levels of proinflammatory cytokines are increased in symptomatic muscles (Schafers et al. 2003; Loram et al. 2007). It is interesting to point out that during an inflammatory process a cascade of inflammatory mediators is released. It has been demonstrated that bradykinin is an inflammatory mediator released at the early phase of inflammatory hyperalgesia (Ferreira et al. 1993a; Ferreira et al. 1993b) and it induces hyperalgesia by two distinct pathways that ultimately result in the local production of prostaglandins and in the local release of sympathetic amines (Ferreira et al. 1993a; Ferreira et al. 1993b), which directly sensitize the primary afferent nociceptor (Gold et al. 1996; Rush & Waxman 2004).
Our data that the selective bradykinin B1 and B2 receptors antagonists significantly reduced mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction demonstrated the involvement of bradykinin in this process. Our findings are consistent with studies showing that chronic muscle pain (Gerdle et al. 2008, Basi et al. 2012, Meotti et al. 2012) and muscle pain induced by sustained isometric contraction of the trapezius muscle of humans (Boix et al. 2005) is mediated by bradykinin and kalidina, and that intramuscular administration of bradykinin in healthy human induces muscle pain (Babenko et al. 1999).
Considering our data that the cyclooxygenase as well as the selective β1 adrenoceptor antagonists and β2 significantly reduced the mechanical muscle hyperalgesia demonstrate that the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction is mediated by prostaglandins and sympathetic amines. The involvement of prostaglandin is confirmed by studies that demonstrated that the levels of PGE2 is related to muscle pain in patients with fibromyalgia
(Hedenberg-Magnusson et al. 2001) and the delayed onset muscle soreness (Tegeder et al. 2002). The involvement of sympathetic amines can be confirmed by studies that demonstrated that non-neuronal cells, particularly fibroblasts in muscle tissues of patients with tendinopathy, can contribute to the production of sympathetic amines and, consequently, with the modulation of pain related to these disorders (Danielson et al. 2007a; Danielson et al. 2007; Bjur et al. 2008; Zeisig et al. 2009).
In the present study, we evaluated the involvement of neutrophil migration in muscle hyperalgesia, since our research group has demonstrated that the neutrophil migration contributes to the mechanical hyperalgesia induced by serotonin (Oliveira et al. 2007) and demonstrated that neutrophils are involved in the development of inflammatory hyperalgesia induced by carrageenan (Cunha et al. 2008). Our data that the selectin inhibitor fucoidan prevented the muscle hyperalgesia demonstrate that mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction is mediated, at least in part, by neutrophil migration. These data are supported by studies that demonstrated that acute and sustained muscle contractions increase the presence of neutrophils in human muscle tissue (Fielding et al. 1993; MacIntyre et al. 2000).
Finally, the findings that the selective P2X3 and P2X2/3 receptors antagonist A317491 prevented the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction demonstrate the involvement of endogenous ATP via activation of peripheral P2X3 receptors in this process. These data are supported by studies that demonstrated that eccentric contractions induces increase in expression of RNAm of P2X3 receptors in masseter (Dessen et al. 2010), gastrocnemius (Reinohl et al. 2003) and triceps muscle (Hanna and Kaufman 2004).
5. CONCLUSION
The findings of the present study demonstrate the involvement of bradykinin, sympathetic amines, prostaglandins, neutrophils and endogenous ATP via activation of P2X3 receptors in mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction. These results suggest the potential of our model to the study of muscle pain and point out new therapeutic strategies to control muscle pain.
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7. CONFLICTS OF INTEREST
The authors have no conflicts of the interest to report.
8. ACKNOWLEDGMENT
This work was supported by grants from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Brazil).
9. FIGURES Figure 1 A B 0 5 10 15 20 25 30 35 1,6V - 1h (n=5) Sham (n=5) 1/2 1 2 3 6 Time post contraction (h)
* * P a w e le v a ti o n t im e ( s )
Figure 1. Sustained isometric contraction induced by mechanical muscle hyperalgesia in the gastrocnemius muscle of rats
The sustained isometric contraction induced mechanical muscle hyperalgesia ½ and 1 hour after contraction when compared with sham (n=5, p<0.05, Bonferroni test, A - Randall and B - TEP). The symbol “*” indicates responses significantly greater than that induced by sustained isometric contraction.
0 10 20 30 40 1,6V - 1h (n=5) Sham (n=5) 1/2 1 2 3 6 24 48 * *
Time post contraction (h)
Decr e a se i n p a w -w ith d ra w a l t h re sh o ld ( g )
Figure 2 A B 0 10 20 30 40 * DALBK Isometric Contraction (n=5) 3.0g 30g 30g (ct) 30g (sham) Dec re a s e i n p a w-wi th d ra wal t h re s h o ld ( g ) 0 5 10 15 20 25 30 35 * DALBK (30g) Isometric Contraction (n=5) (sham) P aw el ev at ion t im e (s ) C D 0 10 20 30 40 * Bradyzide Isometric Contraction (n=5) 1.5g 15g 15g (ct) 15g (sham) Dec rea s e in pa w-wi thd rawal t hr es ho ld (g) 0 5 10 15 20 25 30 35 * Bradyzide15g) Isometric Contraction (n=5) (sham) P aw el ev at ion t im e (s )
Figure 2. Bradykinin mediated the mechanical muscle hyperalgesia induced by sustained isometric contraction
DALBK (30µg, but not 3 µg) and Bradyzide (15µg, but not 1,5 µg), administered five minutes, i.m., before the induction of sustained isometric contraction for one hour significantly reduced (n=5, p<0,05, Tukey test) the paw-withdrawal threshold (A-C) and paw elevation time (B-D) induced by sustained isometric contraction when administered
in the ipsilateral but not in the contralateral gastrocnemius muscle. The administration of DALBK and Bradyzide in group sham did not affect the mechanical withdrawal threshold and the paw elevation time. The symbol “*” indicates responses significantly lower than the that induced by sustained isometric contraction.
