Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos
em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não
-Destrutivos
Karla Rodrigues Borba
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área de Concentração: Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Marcos David Ferreira Coorientador: Dra. Poliana Cristina Spricigo
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos
em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não
-Destrutivos
Karla Rodrigues Borba
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área de Concentração: Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Marcos David Ferreira Coorientador: Dra. Poliana Cristina Spricigo
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos
em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não
-Destrutivos
i
ii
Agradecimentos
Ao professor Dr. Marcos David Ferreira pela orientação ao longo de todo o mestrado.
À Dra. Poliana Cristina Spricigo pela confiança, amizade e coorientação. Ao professor Dr. Luiz Alberto Colnago pelos ensinamentos.
Aos analistas, bolsistas e estagiários da Embrapa Instrumentação pelo apoio durante a realização dos experimentos. Em especial: Joana, Silviane,
Milene, Gabrielle e Karla.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP. À Embrapa Instrumentação pela infraestrutura. À empresa Citrosuco pelas laranjas fornecidas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela bolsa concedida.
À Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo auxílio financeiro processo13/23479-0.
iii
Resumo
Objetivo: Alguns atributos em sua composição química e física, como teor de sólidos solúveis (SST), pH (potencial hidrogeniônico), ácidos orgânicos, açúcares e cor são utilizados como parâmetros na aferição da qualidade de frutas. Os métodos utilizados, nos dias atuais, para a análise da qualidade destes produtos são invasivos, que demandam tempo, muitas amostras, reagentes e geram resíduos. Técnicas não destrutivas, como a espectroscopia no infravermelho e de ressonância magnética nuclear, têm sido propostas para avaliar qualidade em frutas e hortaliças. Este projeto teve como objetivo: desenvolver um modelo de calibração, a partir da espectroscopia de infravermelho de médio e próximo, e ressonância magnética com o auxílio das ferramentas quimiométricas PCA (análises de componentes principais) e PLS (Regressão em mínimos quadrados parciais) com a utilização do programa computacional Pirouette versão 4.5, para estimar parâmetros físico-químicos da qualidade de laranjas da variedade ‘Valência’. Métodos: Foram coletadas um total de 450 laranjas de cultivo comercial no interior de São Paulo, transportadas para a Embrapa Instrumentação, São Carlos, SP e em laboratório foram selecionadas, higienizadas e sanitizadas. Em seguida foram realizadas análises espectroscópicas de infravermelho médio (MIR) e próximo (NIR) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Logo após realizadas as análises não destrutivas as laranjas foram analisadas com métodos de referência para os parâmetros de qualidade. Os sinais espectroscópicos foram processados e os modelos de predição foram construídos. Com os sinais de NIR e MIR foram desenvolvidos modelos PLS para determinação de: SST, pH, massa fresca, vitamina C, ácido cítrico e açucares. Para os sinais de decaimento de RMN foram construídos modelos para SST, pH e massa fresca. Resultados: Para a predição de SST o modelo PLS – NIR mostrou melhor resultado, com SEP 0,74 °BRIX e coeficiente de correlação de 0,75. O parâmetro que apresentou melhor aplicação com a técnica de RMN-dt foi para determinação de massa fresca, com SEP 21,41 gramas e r = 0,82. A determinação do pH foi mais precisa com o modelo PLS-MIR, onde observou-se SEP de 0,20 e r = 0,86. Para a predição de vitamina C e ácido cítrico tanto o NIR quanto o MIR resultaram em modelos com aplicabilidade. O modelo mais preciso foi o desenvolvido com sinas de MIR, com coeficiente de correlação de Pearson (r) de 0,81 e erro quadrático médio de predição (RMESP) de 7,51 para vitamina C e 0,82 e 3,36 para ácido cítrico. Em relação a predição de açúcares o NIR não resultou em modelos precisos. Todavia, a utilização de MIR para a predição de sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69, 7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado. Conclusão: A aplicação de espectroscopia na determinação de parâmetros de qualidade mostrou-se uma possível alternativa na análise de qualidade de laranjas sem que seja necessária a destruição das amostras.
Palavras-chave: Espectroscopia. Infravermelho, ressonância magnética
iv
Abstract
Objective: Some attributes in their chemical and physical composition, as soluble solids content (SSC), pH (hydrogen potential), organic acids, sugars and color are used as parameters in measuring the quality of fruit. The methods used nowadays, to analyze the quality of these products are invasive, requiring time, many samples, reagents and generate waste. Non-destructive techniques such as infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance, have been proposed to evaluate quality in fruits and vegetables because they allow rapid implementation of measurements without sample preparation. This project aimed to: develop a calibration model by near ande mid-infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance with the aid of chemometric tools PCA (principal component analysis) and PLS (regression in partial least squares) with use of the computer program Pirouette version 4.5, to estimate physical-chemical parameters of quality oranges from ‘Valencia’ variety. Methodology: A total of 450 commercial cultivation oranges were collected in São Paulo, transported to Embrapa Instrumentation, São Carlos/SP, and in laboratory were selected, cleaned and sanitized. Then spectroscopic analysis near (NIR) and mid-infrared (MIR), and nuclear magnetic resonance (NMR) were made. After performed the non-destructive analysis, the oranges were analyzed with reference methods for quality parameters. Spectroscopic data were processed and prediction models were developed to determinith MIR and NIR signal PLS models were developed to determine SSC, pH, fresh weight, vitamin C, citric acid and sugars. For the NMR signal decay models were constructed to SSC, pH and fresh weight. Results: For SSC prediction PLS model - NIR showed better results, with RMSEP (mean squared prediction error) 0.74 °BRIX and 0.75 correlation coefficient. The parameter that showed better application with DT- NMR technique was to determine fresh weight with RMSEP 21.41 grams and r = 0.82. The determination of pH was more accurate with the PLS-MIR model where there was RMSEP 0.20 and r = 0.86. For the prediction of vitamin C and citric acid as both the MIR NIR models resulted in applicability. The most accurate model was developed with MIR, with Pearson's correlation coefficient (r) of 0.81 and RMESP of 7.51 for vitamin C and 0.82 and 3.36 for Citric acid. Regarding the prediction of sugars NIR did not result in accurate models. However, the use of MIR for the prediction of sucrose, glucose and total sugars were low prediction errors 11.69, 7.79 and 24.28 (g L-1) and strong correlation coefficients to moderate.Conclusion: The application of spectroscopy to determining quality parameters proved to be a viable alternative in quality analysis oranges without destruction of samples.
v
Lista de Abreviaturas e Siglas
ATR (Reflectância Total Atenuada, do inglês Attenuated total reflectance) °BRIX (Unidade do teor de sólidos solúveis)
CEAGESP (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo) CIE (Comission Internationale de l'Éclairage)
CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência) FAO (Food and Agricultural Organization) FT (Transformada de Fourier)
IAC (Instituto agronômico de Campinas)
IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) MIR (Infravermelho médio, do inglês Middle Infrared) NIR (Infravermelho próximo, do inglês Near Infrared)
PC (Componente principal, do inglês Principal components)
PCA (Análise por componentes principais, do inglês Principal component analysis)
PIB (Produto Interno Bruto)
PLS (Regressão por mínimos quadrados parciais, do inglês Partial least squares)
r: Coeficiente de correlação de Pearson
r cal: Coeficiente de correlação de Pearson para calibração r Val: Coeficiente de correlação de Pearson para validação RMN (Ressonância magnética nuclear)
RMN-dt (Ressonância magnética nuclear no domínio do tempo)
RMSEC (Erro padrão da calibração, do inglês Standart error of calibration) RMSEP (Erro padrão da predição, do inglês Standart error of prediction)
RMSEV (Erro padrão da validação, do inglês Standart error of validation) RPD (Desvio do resíduo de predição, do inglês Standart derivation ratio) SST (Teor de sólidos solúveis)
vi
Lista de Tabelas e Quadros
Capítulo 1. Página
Tabela 1. Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação interna e de predição.
28
Tabela 2. Resultados da caracterização das amostras de laranja. 32 Tabela 3. Análise estatística dos conjuntos de calibração com
validação interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
38
Tabela 4. Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
39
Tabela 5. Estatística dos modelos de predição para NIR e MIR para os
parâmetros vitamina C e ácido cítrico. 40
Tabela 6. Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores (g L-1).
42
Tabela 7. Estatística dos modelos de predição PLS- MIR para os
parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores. 43
Capítulo 2.
Tabela 1. Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com
validação interna e de predição. 56
Tabela 2. Resultados da caracterização das amostras de laranja. 61 Tabela 3. Análise estatística dos conjuntos de calibração com
validação interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
62
Tabela 4. Resultados dos modelos PLS construídos com os sinais
analíticos de NIR, MIR e RMN. 69
Tabela 5. Resultados da validação externa (predição) dos modelos
vii
Lista de Figuras
Capítulo 1. Página
Figura 1. Espectro de NIR originais (A) com a divisão dos conjuntos de varáveis; (B) espectros NIR com aplicação de SNV e 1ª derivada (25); espectros de MIR originais (C) com a divisão dos conjuntos de variáveis; (D) espectros MIR normalizados e com a aplicação de 1ª derivada (5).
35
Capítulo 2.
Figura 1. Gráfico do potencial de modelagem das variáveis de MIR
depois da PCA. 63
Figura 2. Análise de componentes principais realizada para SST, pH e
massa com 4 classes de colheitas pré-definidas. 64
Figura 3. PCA com decaimentos de RMN com duas classes de SST. 65 Figura 4. Decaimento CPMG de duas laranjas com teor de sólidos
solúveis (SST) distintos. 66
Figura 5. Análise de componentes principais das amostras de laranja com os espectros de (A) RMN com as duas classes de massa fresca, (B) NIR com as duas classes de SST e (C) MIR com as duas classes de pH.
67
Figura 6. Espectros de MIR de laranjas com diferentes valores de pH. 69 Figura 7: Gráficos dos valores medidos pelas análises de referência e
preditos pelos modelos PLS. (A) PLS - NIR para SST, (B) PLS - MIR para pH e (C) PLS - RMN para massa fresca.
viii
Sumário
Página
Resumo Iii
Abstract Iv
Lista de Abreviaturas, Siglas e Sinônimos V
Lista de Tabelas e Quadros Vi
Lista de Figuras Vii
Introdução 9
Capítulo 1. Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) para determinação de teor de vitamina c, ácido cítrico e açúcares em laranja ‘Valência’ intacta
22
Introdução 25
Material e Métodos 27
Resultados e Discussão 32
Conclusões 43
Referências 44
Capítulo 2. Aplicação das técnicas não-destrutivas de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de ressonância magnética nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para determinação de parâmetros de qualidade em laranjas.
50
Introdução 53
Material e Métodos 56
Resultados e Discussão 60
Conclusões 73
Referências 74
Considerações Finais 80
9
Introdução
As atividades da agroindústria brasileira representam cerca de 30% do Produto Interno Bruto (PIB), que é a soma de todos os bens e serviços produzidos no país. Neste contexto, 35% da mão de obra do Brasil está relacionada com este ramo de atividade, que incluem, dentre outras, etapas de pós-colheita, processamento e distribuição. Dentro da agroindústria, a fruticultura tem forte participação, abrangendo 11,5% do PIB agrícola e 3,45 % do PIB nacional (1).
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas no mundo, ficando atrás apenas da China e Índia (2). A laranja é a fruta de maior produção nacional, onde a maior parte da produção é direcionada a produção de suco (3). A maior parte das laranjas produzidas no Brasil vai para a produção de suco, que no cenário mundial detém 50% da produção e exporta 98% do que produz apresentando 85% de participação no mercado mundial (4).
Fruta, não climatérica, que pertence ao gênero Citrus, dentro da família Rutaceae (5). Dentre as variedades de laranja cultivadas destaca-se a variedade ‘Valência’ que apresenta frutos ovalados, com casca ligeiramente grossa, tem suco de coloração amarelo forte e adocicado (6). Os frutos dessa variedade são destinados tanto para o consumo in natura
quanto para preparo de suco em indústrias.
10
solúveis, textura, cor e valores nutritivos são utilizados como parâmetros de qualidade, além de serem importantes, também, na determinação do ponto de maturação do fruto (7).
Muitos desses parâmetros de qualidade apresentam metodologias de análise complexas e demoradas, como por exemplo, a quantificação de açúcares e ácido orgânicos. Um dos métodos para se obter o teor destes parâmetros é a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a qual requer tempo, reagentes e mão de obra especializada. Além da necessidade de um número amplo de amostras e de destruição delas.
Por sua vez, o teor de sólidos solúveis (SST) é um parâmetro químico de qualidade importante e comumente utilizado na avaliação de laranjas (4). Tanto em frutas climatéricas, quanto em não climatéricas, como a laranja, o ponto de colheita é definido pelo teor de sólidos solúveis. O balanço de açúcares e ácidos contidos na polpa da fruta conferem o sabor que pode ser agradável ou não ao consumidor. Nos frutos cítricos como a laranja, os requisitos de qualidade são baseados, principalmente, em cor e teor de sólidos solúveis (8).
11 de 10° BRIX não podem ser comercializadas, sendo que o ideal é que as laranjas estejam na faixa de 10° a 13° BRIX que caracteriza sucos adocicados (9).
A análise de SST é rotineiramente realizada em refratômetros. Contudo, apenas 85% do resultado de sólidos solúveis obtido por um refratômetro é de fato açúcar, sendo o restante composto por ácidos orgânicos, vitaminas, fenólicos, dentre outros (7). A realização de análises específicas de açúcar resultaria em um valor mais exato da quantidade de açúcar no fruto. Porém essas análises requerem acesso a equipamento, demanda alta de tempo e mão de obra. Portanto, não seriam acessíveis em grande escala de processamento.
Outro parâmetro de qualidade utilizado para avaliação de citros é o potencial hidrogeniônico (pH). O pH, juntamente com o SST, é uma propriedade significativa no suco de laranja podendo afetar a aceitação pelo consumidor. A escala de pH designa as concentrações de H+ presentes na solução (10), representando a intensidade das soluções ácidas com valores abaixo de 6 ou alcalinas com valores de pH acima de 6.
12
antioxidante (12), não é sintetizado pelo organismo humano, tornando essencial sua ingestão. As frutas cítricas, apesar de apresentarem baixas concentrações, são consideradas boas fontes de ácido ascórbico devido a seu alto consumo diário (7). O ácido cítrico, outro ácido orgânico com capacidade antioxidante, também está presente nos constituintes do suco de laranja. Essa molécula proporciona um sabor ácido e refrescante no suco (12).
Juntamente com os ácidos orgânicos, os açúcares são utilizados como critério de avaliação do “flavor” das frutas. “Flavor”, em inglês, é
utilizado para designar o conjunto de características do paladar e do olfato dos alimentos. (7), representando o aroma e sabor da fruta. Os açúcares são os principais componentes do teor de sólidos solúveis em laranjas (13) e são responsáveis pela doçura do fruto. O teor de açúcar geralmente aumenta, por meio de processos biossintéticos, com o amadurecimento das frutas (7).
13 demandando menos mão de obra. Também, pode apresentar as seguintes vantagens: 1) possibilita o monitoramento e análise instantânea de parâmetros de qualidade em campo tornando possível desenvolver melhores estratégias de colheita; 2) durante a etapa de distribuição a utilização de métodos não destrutivos pode ser uma ferramenta útil para os distribuidores e consumidores, possibilitando verificar com rapidez e facilidade se o produto atende as características desejadas (14).
Técnicas não destrutivas, como a espectroscopia no infravermelho, médio (MIR) e próximo (NIR) e de ressonância magnética nuclear (RMN), têm sido propostas para avaliar características representativas de qualidade em frutas, pois permitem rápida execução das medições, com potencial para estimar vários atributos de qualidade simultaneamente além da possibilidade de repetir as medições nas mesmas amostras (15,16). Para as regiões do infravermelho é possível realizar medidas em amostras em todos os estados da matéria como, gases, líquidos e sólidos (17).
14
A radiação de infravermelho corresponde à parte do espectro eletromagnético situada entre a região do visível e das micro-ondas, subdivido em infravermelho próximo (4000 – 12500 cm-1), infravermelho médio (400 – 4000 cm-1) e distante (100 – 400 cm-1) (18). O comprimento de
onda de uma absorção depende das massas relativas dos átomos, das constantes de força das ligações e da geometria das moléculas (19). Desta forma, essa técnica detecta a radiação que é absorvida pelas ligações moleculares. A utilização da espectroscopia no infravermelho para determinação de composição de alimentos está relacionada quase que exclusivamente à região no infravermelho médio e próximo, (20).
Para que as moléculas absorvam a radiação de infravermelho, capaz de variar a amplitude de um de seus movimentos, vibracional ou rotacional, é necessário que ocorram variações no momento dipolo, que pode ser ocasionado pelo movimento vibracional ou rotacional. Somente nessas condições o campo elétrico alternado da radiação é capaz de interagir com a molécula (21). Durante a vibração ou rotação de uma molécula homonuclear (O2, N2 ou Cl2) não ocorre variação no momento de dipolo, portanto essas
moléculas não absorvem radiação no infravermelho (17,22).
15 mais rapidamente do que os dispersivos e são, atualmente, o principal instrumento empregado para medidas no infravermelho (19,23).
A utilização de instrumentos com FT apresenta algumas vantagens, uma delas é o fato dos instrumentos com FT possuírem poucos elementos ópticos e não apresentarem fendas que atenuem a radiação. Com isso, a potência radiante que atinge o detector é muito maior do que com instrumentos dispersivos e a razão sinal/ruído observada é maior (23,24).
Os espectros de NIR são complexos, pois contém informações de sobretons e suas combinações. Isso torna os espectros na faixa NIR muito mais sobrecarregados o que dificulta a atribuição de bandas específicas de absorção (25,26) e pode tornar difícil a interpretação de espectros de misturas complexas como frutas e vegetais. Levando a necessidade de recorrer a métodos estatísticos multivariados para gerar modelos utilizando muitos comprimentos de onda (27).
As principais aplicações da espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIR) se encontram na análise quantitativa e qualitativa de materiais industriais e agrícolas e no controle de processos (20). Sendo que a grande desvantagem dessa técnica é a baixa sensibilidade dos constituintes em menores concentrações (22,28) e pelo fato da difusão de luz ser maior na faixa NIR, alguns fatores como a estrutura física do produto e a presença de água na amostra podem influenciar na aquisição dos espectros (25).
16
infravermelho próximo, foram desenvolvidos para estimar firmeza e sólidos solúveis, de forma não destrutiva, em pêssegos (29) e citros (14,30–32).
A região do infravermelho médio (MIR) é a principal região da espectroscopia vibracional. Espectros de MIR fornecem informações de frequência de vibrações moleculares fundamentais (33), que envolvem o estado fundamental e o primeiro estado vibracional excitado (34). Essa técnica permite a identificação de moléculas orgânicas e a caracterização de grupos funcionais, tais como polissacarídeos (26).
No início a região de MIR era aplicada para análise qualitativa de compostos orgânicos, relacionada principalmente à identificação de ligações moleculares. Com o desenvolvimento de espectrofotômetros com FT houve um aumento no número e tipo de aplicações da espectroscopia na região do MIR (34). Passando, a partir desse momento, a ser usado também para análise quantitativa de amostras complexas por absorção (15).
Com maior resolução, os espectros obtidos na região do MIR apresentam picos bem definidos, facilitando a interpretação de seus sinais. Sua faixa espectral é bastante útil para a identificação de compostos, aonde pequenas diferenças na estrutura e na constituição das moléculas resultam em mudanças significativas do perfil e na distribuição dos picos de absorção, tornando possível a identificação de um composto orgânico comparando seu espectro com banco de dados pré-existentes (35).
17 pela versatilidade para desenvolver novos procedimentos de medida não invasivos, rápidos e preditivos associados a métodos estatísticos multivariados.
Apesar do espectro de infravermelho médio (MIR) ser o mais utilizado na química orgânica, pois fornece informações diversas que auxiliam na análise da composição das moléculas químicas, existem ainda poucos estudos que relatam o uso de MIR para determinar composição de frutas e hortaliças intactas (36,37).
Métodos com espectroscopia de MIR são aplicados com sucesso para estimar a composição de várias amostras de alimentos, principalmente de produtos líquidos como sucos (38). Snyder et al., 2014, determinou a composição percentual no suco de uva, Macedo (2013) identificou e quantificou adulteração em leite bovino, Allendorf, Subramanian, and Rodriguez-Saona (2012) monitoraram variações químicas decorrentes do processo de oxidação em óleos comestíveis e quantificaram o teor de ácidos graxos, Rodriguez-Saona (2011) quantificou carotenóides em suco de tomates e (43) analisou amostras de suco de tomate e conseguiu determinar o teor de sólidos solúveis, pH, glicose, frutose e viscosidade.
18
Ao comparar a utilização da técnica de MIR e NIR na análise de ácidos orgânicos (ácido cítrico e ácido málico) e açúcares (sacarose, frutose e glicose) em amostras liofilizadas de maracujá De Oliveira et al. (2014) encontrou que modelos de MIR tiveram melhores resultados do que aqueles construídos com NIR.
Outra técnica espectroscópica que pode ser uma opção não destrutiva de análise de qualidade é a ressonância magnética nuclear (RMN). Proposta por Wolfgang Pauli, 1924, ao constatar que certos núcleos atômicos apresentavam propriedades magnéticas, ou seja, comportavam-se como pequenos imãs e que a exposição destes a um campo magnético deveria levar a um desdobramento de seus níveis de energia (44).
A espectroscopia de RMN se fundamenta no registro da interação da radiação eletromagnética na região de rádio frequência, 4 a 900 MHz, com núcleos atômicos (22). Os núcleos absorvem radiação eletromagnética quando expostos a um campo magnético intenso. A técnica de RMN permite a observação de núcleos com momento magnético nuclear ou spin ≠ 0 (45).
19 aplicada na análise de alimentos como na determinação de adulteração em leites (46) e azeites (47) e também na análise de parâmetros de qualidade em frutas como SST em ameixas (48) e atributos sensoriais (48) e qualidade físico-química (50) em laranjas.
As técnicas de espectroscopia geram sinais com muitas variáveis e, portanto, são dependentes de técnicas estatísticas apropriadas para o processamento destes sinais (51). É necessário o desenvolvimento de modelos de calibração que tornem possível a determinação do comportamento de um sistema como um todo.
Para isso a quimiometria é utilizada, onde são aplicados métodos matemáticos e estatísticos com a finalidade de delinear procedimentos experimentais para encontrar a máxima informação química relevante com os dados obtidos (52). Com essa técnica se torna possível o desenvolvimento de modelos que possam predizer propriedades a partir da análise de outras.
20
Dentre as diversas áreas da quimiometria podemos citar quatro principais: planejamento e otimização de experimentos, pré-tratamentos matemáticos, métodos de classificação e métodos de regressão ou calibração multivariada. De uma maneira geral, calibração multivariada é composta por três etapas: calibração, predição e validação (53).
A regressão em mínimos quadrados parciais (do inglês, Partial Least Squares) é um método, de calibração multivariada, muito utilizado em quimiometria. Com ele é possível calibrar para o componente desejado enquanto modelagem implícita das outras fontes de variação (53). O PLS é um método matemático baseado em uma relação linear entre as variáveis instrumentais (X) e as variáveis de interesse (Y) (54). Na construção dos modelos PLS, X e Y são decompostas simultaneamente em uma soma de h variáveis latentes. Onde X é uma matriz n x p onde n é o numero de amostras e p o número de variáveis de medida (absorbância em determinados comprimentos de ondas, por exemplo) e Y é um vetor da propriedade de interesse a ser medida pelo modelo (52,55).
21 componente principal (PC2) é traçada no sentido ortogonal à primeira, com o objetivo de descrever a maior porcentagem possível da variação não explicada pela PC1 (55). Cada componente principal é uma combinação linear de todas as variáveis originais, são independentes entre si e são estimados com o propósito de reter o máximo de informação da variação total contida nos dados (56).
22
Capítulo 1.
Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio
(MIR) para determinação de teor de vitamina c, ácido cítrico e açúcares
em laranja ‘Valência’ intacta.
Artigo enviado para publicação em 10 de junho de 2016 para a revista Postharvest Biology and Technology: An International Journal.
23
Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) para determinação de teor de vitamina C, ácido cítrico e açúcares
em laranja ‘Valência’ intacta.
BORBA,K.R.a, SPRICIGO,P.C.b; FERREIRA, M.D.c
a
Department of Food and Nutrition, School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University-UNESP, Rodovia Araraquara – Jaú, Km 1, Araraquara-SP, 14801-902, Brazil.
bDepartment of Plant Science, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, University of São
Paulo, Avenida Pádua Dias, 11, Piracicaba-SP, 13418-900, Brazil.
cEmbrapa Instrumentação, Rua XV de Novembro, 1452, São Carlos-SP, 13561-206, Brazil.
RESUMO
24
resultou em modelos precisos. Todavia, a utilização de MIR para a predição de sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69, 7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado. Desta forma, é possível concluir, que técnicas de infravermelho podem ser aplicadas para determinação de parâmetros de qualidade interna em laranjas de forma não destrutiva.
Palavas-chave: análise não destrutiva; qualidade; quimiometria; PLS.
ABSTRACT
25 sugar prediction, NIR did not lead to accurate models. However, MIR presented low prediction errors (11.69, 7.79, and 24.28 g L-1) as well as strong to moderate correlation coefficients for the predictions of sucrose, glucose, and total sugars. Therefore, it is possible to conclude that infrared techniques can be applied to determine inner quality parameters of oranges in a non-destructive fashion.
Key-words: Non-destructive analyses; quality; chemometrics; PLS.
1. Introdução
A laranja é considerada a principal espécie de citros no mundo em função de sua importância comercial e industrial. O Brasil é, mundialmente, o maior produtor de laranja, com aproximadamente 25,2% da produção mundial (1,2). A maior parte da produção é direcionada a produção de suco, para 2015/16, a safra é estimada em 16,7 milhões de toneladas (3). A qualidade da fruta tem enorme significância no grau de aceitabilidade pelo consumidor e envolve parâmetros sensoriais, físicos, valores nutritivos e constituintes químicos (4).
26
presente no suco de laranja o qual proporciona a característica ácida e refrescante (7).
Os açúcares também apresentam grande importância na qualidade de laranjas, e representam 85% do teor de sólidos solúveis que é comumente utilizado para classificação durante a comercialização de citros (8). Os principais açúcares presentes no suco de laranja são a sacarose e os açúcares redutores frutose e glicose. O balanço entre açúcares e ácidos orgânicos contidos na polpa da fruta confere o sabor que pode ser agradável ou não ao consumidor (9).
Os métodos analíticos convencionais para determinação destes parâmetros são destrutivos e necessitam de tempo, reagentes, pessoal treinado e geram resíduos. Além disso, por se tratar de uma técnica destrutiva as análises são feitas em um número limitado de amostras, que podem não ser representativo da variação real existente no conjunto total (10).
A técnica de espectroscopia de infravermelho tem mostrado boa aplicabilidade para análises de parâmetros de qualidade de frutas. As maiores vantagens da utilização de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) estão no fato de ser uma análise rápida, levando alguns segundos, e de se tratar de um método não destrutivo (10). Além de tornar possível, junto com ferramentas quimiométricas, a determinação de vários parâmetros simultaneamente.
27 de NIR na determinação de SST e acidez de forma não destrutiva em laranja (11,12) pêssego (13) e maçã (14). Ainda com NIR outros estudos determinaram vitamina C em maçãs (14) e laranjas (15). A técnica de MIR não vem sido utilizada para análise de frutas intactas, essa técnica ainda está restrita para análise de polpas e sucos de frutas. Por exemplo, na análise de açúcares totais e redutores em polpa de maracujá e damasco (16).
Ainda não existem estudos comparativos entre a utilização de NIR e MIR em análise de parâmetros internos de laranjas intactas. O objetivo deste estudo foi utilizar técnicas de NIR e MIR em conjunto com o método quimiométrico de regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR) para desenvolver modelos para determinação da qualidade interna, ácido ascórbico, cítrico e açúcares, de laranjas do cultivar ‘Valência’ intactas.
2. Material e métodos
2.1 Material vegetal
28
Tabela 1: Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação
interna e de predição.
Método Parâmetro Cal + Validação interna (n) Validação externa (n) NIR Ácidos orgânicos 228 98
Açúcares 140 60
MIR Ácidos orgânicos 229 98
Açúcares 139 60
Caracterização das amostras
A frutas do conjunto de caracterização foram analisadas quanto sua massa fresca, diâmetro equatorial, coloração da casca, teor de sólidos solúveis (SST) e potencial hidrogeniônico (pH).
Os frutos foram pesados individualmente em balança eletrônica Marte AS 2000C, com precisão de 0,01 g, os valores foram expressos em gramas. Foram realizadas medidas do diâmetro transversal, que corresponde à medida equatorial, com o auxílio de um paquímetro digital modelo Mitutoyo com exatidão de ± 0,02 mm.
Com a utilização do colorímetro, HunterLab MiniScan XE Plus, com amostras avaliadas no sistema L, a* e b* (color space) proposto pela
Comission Internationale de l'Éclairage (CIE), foi feita a análise da coloração
da casca dos frutos para sua caracterização, com duas medições na região equatorial de cada fruto. Os resultados foram expressos em ângulo hue (oh).
29 eletrodo do equipamento QX 1500 QUALSTRON em 20 mL da amostra extraída de cada laranja.
2.3 Infravermelho próximo (NIR)
Para obtenção dos os espectros de NIR as laranjas foram analisadas por reflectância pelo espectrômetro de infravermelho comercial, modelo Spectrum 100N (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT). Os espectros foram coletados na região entre 4000-10000 cm-1 com resolução de 32 cm-1 e 32 varreduras cada para melhorar a relação sinal-ruído. A análise foi realizada em triplicata através do contato da região equatorial da fruta inteira com o cristal do equipamento.
2.4 Infravermelho médio (MIR)
Os espectros de MIR foram coletados pelo espectrômetro Agilent Cary 630 FTIR na região entre 650-4000 cm-1 com resolução de 16 cm-1 e 64 varreduras, para melhorar a relação sinal-ruído. Quatro espectros foram adquiridos através do contato da região equatorial da fruta inteira com casca, com o cristal do acessório de reflectância total atenuada (ATR, do inglês
Attenuated total reflectance). Para a construção dos modelos foi utilizado a média dos 4 espectros.
2.2 Análises de referência
30
Ácido ascórbico e cítrico
Os ácidos L-ascórbico e cítrico foram determinados por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), adaptado de KELEBEK (2009), por meio do cromatógrafo líquido modelo Varian com coluna Agilent C18 (2,5x25mm, 5micro m), detector Ultravioleta-Visível ajustado para leitura a 254nm (ácido L-ascórbico) e 214nm (ácido cítrico) e tampão fosfato (molaridade) pH 2,5 como fase móvel. A vazão da fase móvel foi de 1,0 mL min-1 e o volume de injeção de 20 µL. Foi utilizado o ácido L - ascórbico (pureza >= 99%) obtido de Sigma Life Science como padrão e o ácido cítrico (≥99,5%) da marca Babsynth produtos para laboratório Ltda.
Após a extração do suco, as amostras foram levadas a volume conhecido com ácido metafofosfórico 3% (m/v), filtradas em unidades filtrantes descartáveis teflon hidrofílico (porosidade de 0,45 µm) e protegidas da luz para evitar a degradação dos ácidos orgânicos. As análises foram realizadas em duplicatas.
Açúcares totais e redutores
As análises de açúcares totais e redutores foram realizadas pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), adaptado de KELEBEK (2009), com cromatógrafo líquido modelo Varian equipado com coluna Amino HPX 87H e detector de índice de refração (IR). A coluna foi mantida a temperatura ambiente (25°C), utilizando-se como fase móvel o ácido sulfúrico (H2SO4 0,5 mM) com vazão de 0,6 mL min-1 com volume de
31 As amostras do suco de cada laranja foram extraídas e armazenadas sob temperatura de -28°C. Previamente às análises as amostras foram descongeladas, diluídas na razão 1:10 com água ultrapura (Milli- Q®) e filtradas em unidades filtrantes descartáveis de teflon hidrofílico de porosidade 0,45 µm. Foram utilizadas sacarose (pureza ≥ 99%), D – glicose (pureza ≥ 99,5%) e D – frutose (pureza ≥ 99%) da marca Sigma Life Science
como padrões.
2.5 Processamento dos dados
As análises quimiométricas foram realizadas pelos softwares Origin 8.1 (OriginLab, Northampton, MA, USA) e Pirouette v.4.5) Infometrix, Inc. Bothell – WA).
Os espectros de NIR foram centrados na média e realizados os pré-processamento: Variação Normal Padrão (SNV) e derivada de primeira ordem com janela de 21 pontos. Os sinais espectroscópicos de MIR foram centrados na média, normalizados (0-1) e foi aplicada a primeira derivada com 5 pontos de janela.
32
parâmetro de qualidade o conjunto total de dados foi dividido,por meio de algoritimo randômico, em dois grupos. Um grupo destinado a construção do modelo PLS de calibração e validação interna com teste de validação interna cruzada leave-one-out, com 70% dos dados totais e o outro grupo foi utilizado na construção do modelo PLS de validação externa contendo 30% dos dados totais.
A avaliação dos modelos foi feita a partir da análise dos coeficientes de correlação de Pearson (r) da calibração (r Cal), validação (r Val) e predição
(R), assim como, dos erros quadráticos médios de calibração (RMSEC), validação (RMSEV) e predição (RMSEP); e no desvio do resíduo de predição (RPD).
3. Resultados e discussão
Caracterização das amostras
Os dados estatísticos relativos à caracterização das amostras de laranjas provenientes de floradas distintas estão sumarizados na tabela 2 . A colheita de laranjas em primeira e quarta florada, da mesma safra, permitiu a observação de uma grande amplitude na variação de massa fresca, diâmetro e coloração externa dos frutos. Essas variações em frutos da mesma safra são comuns, e relacionam-se diretamente com os estados nutricionais e hormonais das plantas, e com as condições ambientais durante o desenvolvimento da laranja (19).
Tabela 2: Resultados da caracterização das amostras de laranja.
Média ± dp Intervalo
Massa (g) 188,04 ± 41,28 93,72 - 282,23
Diâmetro (mm) 71,17 ± 4,18 63,80 - 80,38
Coloração flavedo (°hue) 91,99 ± 10,07 76,00 - 108,62
SST (°BRIX) 8,18 ± 1,03 4,80 - 11,48
pH 3,47 ± 0,39 3,47 - 4,23
33 Os valores de massa fresca estão próximos aos descritos por ARRUDA e colaboradores (2009) em estudos conduzidos em pomares brasileiros para descrever a qualidade físico-química de laranjas ‘Valência’. Esses resultados estão de acordo também com aqueles de massa fresca descritos por Magwaza et al. (2013), que avaliaram qualidade de laranjas ‘Valência’ por meio de espectroscopia (NIR). Por sua vez, Bai et al. (2016)
obtiveram valores de até 153 g por fruto em pomares americanos, o que se diferencia dos resultados aferidos neste presente estudo. Em relação à classificação de laranjas pelo seu diâmetro equatorial as laranjas utilizadas pertenciam as classes 3 (80 – 93 mm), 6 ( 70 – 80 mm) 12 ( 56 – 63 mm), de acordo com a classificação feita a partir de padrões determinados pelo CODEX (23).
A avaliação da coloração externa está de acordo com os valores de ºhue apresentados por Arruda et al. (2009) e Miranda et al. (2015). O ângulo ºhue foi utilizado como parâmetro para acompanhar a coloração da casca, podendo variar de 0° a 360°. Resultados de coloração entre 60° e 150° representam frutos de com flavedos amarelados até verdes, respectivamente (25). Neste estudo, frutos com ângulo de 76º foram os mais amarelados nas coletas entre floradas, enquanto que frutos que apresentaram ângulo de 109º foram os mais esverdeados.
34
O pH é um importante parâmetro de qualidade, principalmente para o suco de laranja, ele, juntamente com os valores de acidez titulável, fornece informação da acidez da fruta. Observa-se que a média de pH foi de 3,47, valores de pH acima de 3,5 podem caracterizar frutas menos ácidas, enquanto que aquelas com pH abaixo desse valor caracterizam frutos ácidos (27).
Espectros de NIR e MIR
35 Figura 1: Espectro de NIR originais (A) com a divisão dos conjuntos de varáveis;
(B) espectros NIR com aplicação de SNV e 1ª derivada (25); espectros de MIR originais (C)
com a divisão dos conjuntos de variáveis; (D) espectros MIR normalizados e com a
aplicação de 1ª derivada (5).
Os modelos PLS com espectros de NIR foram construídos com dois conjuntos diferentes de variáveis: NIR 1, onde o intervalo de 6400 a 5600 cm-1 foi excluído, pois essa região apresenta ruídos e sobreposições de absorção de moléculas sem correlação com os parâmetros de qualidade analisados; NIR 2, exclusão das variáveis dos intervalos entre 10000 – 9600 cm-1 (região característica da absorção de RNH
2), 6400-5600 cm-1 e
4400-4000cm-1 (região de absorção de N-H) (28,29).
Nos dois conjuntos de variáveis para NIR observam-se dois picos acentuados nos sinais. O primeiro ocorre em 7000 cm-1 e o segundo ocorre
36
combinações de dobragens (30). Essas regiões estão relacionadas, principalmente, a absorção de água e ácidos orgânicos, e são consideradas regiões de importância para as análises de vitamina C e ácido cítrico.
Para os espectros de MIR dois conjuntos de variáveis também foram testados: MIR 1, utilizando-se todas as 450 variáveis, sem exclusão; MIR 2, variáveis dos intervalos de 3656 a 4000 cm-1 e 2777 a 1773 cm-1 foram
excluídas. Pois nessas regiões existem ruídos aleatórios os quais podem influenciar a correlação entre os sinais espectroscópicos com as medidas de referência (28,31).
O grupo hidroxila (O-H), que está presente em moléculas como álcool, ácidos orgânicos e água, tem forte absorção no intervalo de 3200 a 3600 cm -1(32). O intervalo entre 1790 e 1706 cm-1 é associado ao estiramento dos
grupos C=O e C=C (28) e as bandas entre 1500 e 900 cm-1 são dominadas por grupos de estiramento C-C e C-O (33). Mais especificamente, as regiões no intervalo de 1650 e 1850 cm-1 são associadas ao grupo carbonila (34), encontrados nos aldeídos e cetonas, constituintes de moléculas de monossacarídeos (35). Yang e colaboradores, (2002), analisando soluções de vitamina C observaram uma forte correlação entre os picos entre 3500- 3000 cm-1 e 17500 – 1000 cm-1 com as diferentes concentrações do ácido.
37 correlacionar os atributos do suco com alguns constituintes da casca do fruto, como por exemplo a composição de óleos essenciais, por isso a importância em manter as regiões de absorção do espectro de MIR características de lipídeos.
Análises de referência
Os valores de média, desvio padrão e amplitude dos dados para cada um dos parâmetros analisados nos conjuntos de calibração com validação interna e predição estão apresentados na tabela 3. Os resultados mostram a grande amplitude de variação de cada parâmetro avaliado e utilizado para o conjunto de calibração e de predição na construção dos modelos de regressão. Tal amplitude é essencial para que os modelos apresentem aplicabilidade, uma vez que a regressão precisa ser calibrada com amostras que representem a variação real existente (36,37).
38
Tabela 3: Análise estatística dos conjuntos de calibração com validação interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
Calibração e Validação
interna Predição
Parâmetro Método N Média ± dp Intervalo N Média ± dp Intervalo
Vit C (mg 100 mL-1) NIR 230 41,25 ±14,65 17,56 – 107,46 99 44,07 ±18,02 17,56 – 114,40 MIR 229 40,92 ±14,81 17,56 – 114,40 99 42,10 ±14,98 21,54 – 107,46
Ácido cítrico (g L-1)
NIR 230 11,56 ±6,25 4,10 – 40,25 99 12,27 ±7,13 4,25 – 40,25 MIR 229 11,47 ±6,31 4,10 – 40,25 99 12,00 ±6,47 4,90 – 40,25
Sacarose (g L-1) NIR 140 52,09 ±17,83 23,63 – 113,07 - - -
MIR 139 52,84 ±16,83 21,80 – 92,98 60 53,43 ±18,79 23,63 – 113,06
Glicose (g L-1)
NIR 140 43,83 ±11,29 25,04 – 77,09 - - - MIR 139 44,60 ±11,07 25,35 – 77,09 60 44,61 ±10,63 25,35 – 65,20
Frutose (g L-1) NIR 140 38,71 ±8,38 24,15 – 65,60 - - -
MIR 139 39,22 ±8,32 24,15 – 65,60 - - -
Totais (g L-1) NIR 140 134,65 ±34,92 77,98 – 223,63 - - -
MIR 139 136,38 ±33,51 72,30 – 216,73 - - -
Redutores (g L-1) NIR 140 82,55 ±19,16 49,51 – 137,43 - - -
MIR 139 83,83 ±18,86 49,51 – 137,43 60 84,34 17,87 50,66 – 118,61 N: universo amostral; dp: desvio padrão.
Modelos PLS para vitamina C e ácido cítrico
Os resultados estatísticos dos modelos PLS desenvolvidos com os sinais de NIR e MIR para determinação dos parâmetros vitamina C e ácido cítrico estão apresentados na Tabela 4.
39 Tabela 4: Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
Calibração e validação interna
Parâmetro Método Intervalo de onda (cm-1) N F RMSEV Rval RMSEC Rcal Vit C NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 230 9 8,65 0,74 7,63 0,81
(mg 100 mL-1)
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400
(NIR2) 230 10 10,72 0,72 8,93 0,82 MIR 4000 – 500 (MIR1) 229 10 9,72 0,75 8,26 0,84 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500
(MIR2) 229 10 10,34 0,78 8,97 0,82
Ácido Cítrico NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 230 7 3,72 0,76 3,43 0,81
(g L-1)
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400
(NIR2) 230 8 4,19 0,77 3,73 0,83 MIR 4000 – 500 (MIR1) 229 8 3,68 0,81 3,42 0,85 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500
(MIR2) 229 10 3,79 0,80 3,28 0,86
RMSEV e RMSEC = erros quadráticos médios da validação e calibração; r Val e r Cal = coeficiente de correlação de Pearson da validação e calibração; n = universo amostral; F = fatores.
A escolha dos número de fatores foi feita a partir da observação dos valores de RMSEC e RMSEV, onde o número de fator adequado foi o que apresentou menores valores de erros (38).
40
Os resultados estatísticos da etapa de predição estão apresentados na tabela 5. As duas técnicas apresentaram resultados adequados durante a etapa de predição. Porém, a técnica de NIR tem como característica espectros mais sobrecarregados, contendo muitas combinações de absorções com picos não bem definidos. Essa característica pode ter dificultado a correlação entre os sinais e os parâmetros de qualidade (10,36,39).
Tabela 5: Estatística dos modelos de predição para NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
Predição
Parâmetro Método Intervalo de onda n RMSEP R RPD
Vit C NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 99 13,42 0,69 1,37
(mg 100 mL-1) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400
(NIR2) 99 9,49 0,71 1,32 MIR 4000 – 500 (MIR1) 99 9,21 0,76 1,60 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500
(MIR2) 99 7,51 0,81 1,63
Ácido Cítrico NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 99 4,77 0,74 1,50
(g L-1) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400
(NIR2) 99 3,88 0,75 1,35 MIR 4000 – 500 (MIR1) 99 3,70 0,78 1,68 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500
(MIR2) 99 3,36 0,82 1,83
RMSEP = erros quadráticos médios de predição; r = coeficiente de correlação de Pearson da predição; n = universo amostral; F = fatores; RPD = desvio do resíduo de predição.
41 A técnica de MIR mostrou os melhores modelos, com RMSEP = 7,51 e r = 0,81 para vitamina C e RMSEP = 3,36 e r de 0,82 para ácido cítrico. Além disso, estes modelos resultaram em RPD dentro da faixa de 1,50 - 2,00 que determina o poder de discriminação de valores altos e baixos (10). No caso de MIR, não existem outros estudos sobre sua utilização em análises não destrutivas em laranjas.
Modelos PLS açúcares
42
Tabela 6: Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores (g L-1).
Calibração e validação interna
Parâmetro Método Intervalo de onda (cm-1) N F RMSEV Rval RMSEC Rcal
Sacarose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 140 7 14,25 0,56 12,64 0,70 NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 8 14,49 0,67 12,57 0,71 MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 7 11,12 0,75 9,21 0,84 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 11,94 0,70 10,65 0,78
Glicose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 140 2 10,02 0,35 9,80 0,34 NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 10,76 0,36 10,50 0,43 MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 7,96 0,70 6,92 0,79 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 8,82 0,65 7,85 0,75
Frutose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 140 3 7,75 0,15 7,62 0,26 NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 8,39 0,05 8,20 0,21 MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 6,42 0,64 5,68 0,74 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 10 6,84 0,63 5,30 0,80
Totais NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 140 3 30,28 0,40 26,91 0,46 NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 31,32 0,41 30,58 0,47 MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 23,15 0,72 20,48 0,80 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 25,55 0,67 22,73 0,76
Redutores NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 140 3 17,40 0,26 16,98 0,35 NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 18,72 0,30 18,28 0,33 MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 14,11 0,57 12,38 0,77 MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 15,42 0,62 13,76 0,73
RMSEV e RMSEC = erros quadráticos médios da validação e calibração; r Val e r Cal = coeficiente de correlação de Pearson da validação e calibração; n = universo amostral; F = fatores.
43 Tabela 7: Estatística dos modelos de predição PLS- MIR para os parâmetros
sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores.
Predição
Parâmetro Intervalo de onda (cm-1) N F RMSEP R RPD
Sacarose 4000 – 500 (MIR1) 60 8 14,45 0,62 1,28
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 10 11,69 0,78 1,60
Glicose 4000 – 500 (MIR1) 60 8 9,45 0,61 1,35
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 6 7,79 0,68 1,35
Totais 4000 – 500 (MIR1) 60 8 28,61 0,60 1,14
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 9 24,28 0,70 1,38
RMSEP = raiz média do erro padrão da predição; r = coeficiente de correlação de Pearson da predição; n
= universo amostral; F = fatores; RPD = desvio do resíduo de predição.
4. Conclusões
A aplicabilidade das técnicas espectroscópica NIR e MIR para determinar vitamina C, ácido cítrico e açúcares em laranjas intactas foi avaliada. Assim como, o desempenho de calibração e de predição dos modelos PLS desenvolvidos com diferentes regiões do espectro. Em relação à determinação de açúcares, a técnica de NIR não resultou em modelos precisos. Já a utilização de MIR para a predição de sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69, 7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado.
44
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a agência brasileira FAPESP (processo projeto 13/23479-0) e a CAPES pelo suporte financeiro para esse trabalho.
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Capítulo 2.
Aplicação e comparação das técnicas não destrutivas de
espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de
ressonância magnética nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para
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Aplicação das técnicas não destrutivas de espectroscopia no
infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de ressonância magnética
nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para determinação de
parâmetros de qualidade em laranjas.
Karla Rodrigues Borba1 Poliana Cristina Spricigo2 Luiz Alberto Colnago3
Marcos David Ferreira 4
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, Araraquara – Brasil. 2Universidade de São Paulo – USP, Piracicaba – Brasil
3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, São Carlos –
Brasil.
4Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, São Carlos –
Brasil.
RESUMO
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interna e o de validação externa. Os sinais de NIR e MIR foram obtidos por técnica de reflectância e os sinais de decaimento do RMN-dt por sequência de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). Para a predição de SST o modelo PLS – NIR mostrou melhor resultado, com SEP 0,74° BRIX e r de 0,75. A determinação de massa fresca foi mais adequada com a aplicação da técnica de RMN-dt, com SEP 21,41 gramas e r = 0,82. Para a determinação do pH o modelo PLS-MIR foi mais preciso, onde observou-se SEP de 0,20 e r = 0,86. De acordo com os resultados obtidos a aplicação das técnicas de NIR, MIR e RMN para a determinação de SST, pH e massa fresca mostrou-se uma alternativa pertinente para a análimostrou-se não destrutiva de qualidade em laranjas.
Palavras-chave: Citrus sinensis; quimiometria; sólidos solúveis; pH; massa fresca.
ABSTRACT
53 external validation. The signals NIR and MIR were obtained by reflectance technique and decay of the NMR signal DT by sequence Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). For SST prediction PLS model - NIR showed better results, with EPS 0.74 ° BRIX and r 0.75. The determination of fresh mass was more suitable to the application of NMR-dt technique, SEP 21.41 grams and r = 0.82. To determine the pH-MIR PLS model is more accurate where there was SEP r = 0.20 and 0.86. According to the results of the application of NIR techniques, NMR and MIR for the determination of TSS, pH and fresh weight showed a relevant alternative for the nondestructive examination quality oranges.
Keywords: Citrus sinensis; chemometrics; Soluble solids; pH; fresh pasta
1. Introdução
O Brasil é o maior produtor de laranja do mundo, responsável por aproximadamente 25,2% da produção mundial (1,2). A laranja pode ser destinada tanto ao consumo in natura quanto para o processamento de suco, sendo que grande parte da produção nacional é direcionada a produção de suco. O consumo de laranja, assim como das demais frutas, está diretamente relacionado a sua qualidade. A qualidade dos frutos de laranja depende de atributos como acidez total titulável, pH, teor de sólidos solúveis, textura, cor e valores nutritivos (3).
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laranjas. O conteúdo de sólidos solúveis tem efeito direto nas propriedades físicas e reológicas do suco de laranja, e juntamente com as características de temperatura dos processos e a distribuição e tamanho das partículas de sua matéria-prima, é fundamental no desenvolvimento de seus produtos derivados (4). Outro parâmetro de qualidade utilizado para avaliação de citros é o potencial hidrogeniônico (pH). A escala de pH designa as concentrações de H+ presentes na solução (5), representando a intensidade das condições ácidas ou alcalinas do meio. A concentração de ácidos em produtos cítricos tem envolvimento direto com a qualidade dos frutos e seus derivados, e em balanço adequado com o conteúdo de sólidos solúveis, proporciona o sabor desejado pelos consumidores (6)
O controle da qualidade é etapa chave para que o produto final satisfaça as exigências do consumidor e requisitos do mercado (6). Os métodos analíticos convencionais para determinação de SST e pH em sua maioria são métodos destrutivos. A necessidade da destruição da amostra limita o número de frutos que compõe o universo amostral, onde a representação da variação real existente no conjunto total pode ficar comprometida (7). Além disso, as análises convencionais demandam elevado tempo e mão de obra para a execução da extração e sua determinação, o que pode onerar o sistema de garantia de qualidade (6).
55 amostras (7). Sendo assim, o monitoramento da qualidade de produtos vegetais em linhas de processamento pode ser aperfeiçoado, permitindo amostragens de alta confiabilidade em menor espaço de tempo.
A faixa do infravermelho é dividida em três regiões: infravermelho próximo (4000 – 12500 cm-1), infravermelho médio (400 – 4000 cm-1) e distante (100 – 400 cm-1) (8). Estudos mostraram aplicabilidade da técnica
de NIR para análise de sólidos solúveis, de forma não destrutiva, em pêssegos (9) e citros (10–13). A técnica de MIR foi aplicada com sucesso para estimar a composição de várias amostras de alimentos, principalmente de produtos líquidos como sucos, leites e óleos (14–17).
A espectroscopia de RMN estuda a interação da radiação eletromagnética na região de rádio frequência, 4 a 900 MHz, com núcleos atômicos (18). Os núcleos absorvem radiação eletromagnética quando expostos a um campo magnético intenso, a técnica de RMN permite a observação de núcleos com momento magnético nuclear ou spin ≠ 0 (19).
