aula10 2010

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Santo André - Outubro de 2010

Aula 10

Genomas

procariontes

1 parte

BC-1606

Microbiologia

Prof . Antônio Sérgio Kimus Braz

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Auto-replicador

• Qualquer entidade capaz de guardar e transmitir

informação para criar copias de si mesma

• Elemento egoísta (selfish)

• Primeiro provável autoreplicador RNA

(mundo do RNA)

• Papel hoje desempenhado principalmente pelo DNA

• Alguns vírus ainda usam RNA

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O que um auto-replicador faz ???

• Faz copias de si mesmo

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DNA Molécula que guarda

informação para autoreplicação

• Localização

– Procariontes no citoplasma

– Eucariontes no núcleo e mitocôndrias e cloroplastos

• Estruturas de organização

• Cromossomos

• Plasmídeos

• Replicadores exógenos Vírus e agentes subvirais (DNA

& RNA)

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Procariontes

Eucariontes

Cromossomo:

(molécula extremamente longa de DNA fita dupla)

Geralmente circular Em geral uma molécula

Linear e com telômeros

Normalmente varias moléculas

Plasmídeos:

(molécula relativamente pequena de DNA fita dupla)

Muito freqüente Geralmente circular

Muito raros

circular ou linear

Genoma viral:

(molécula de tamanho variável

DNA ou RNA, fita simples ou duplas linear ou circular..).

Muito freqüente Muito freqüente

Elementos transponíveis:

(molécula relativamente pequena de DNA fita dupla)

Encontrada dentro do interior de outra molécula de DNA

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Genoma de procariotos

Material genético de procariotos:

-Sempre DNA

-Contido no citoplasma

-Condensado e organizado= nucleóide

-Pode conter dois elementos:

DNA cromossômico

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Nucleóide

-DNA associado a proteínas: proteínas básicas,

> SMC

(structural maintenance of chromosome)

-Também contém

> RNA polimerase,

> RNAs

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Composição dos ácidos nucleicos

-Cadeias polinucleotídicas

-Nucleotideo (nt):

•

açúcar •base nitrogenada •grupamento fosfato

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Nucleotídeo (nt)

Açúcares

(pentoses)

Ribose Desoxirribose Ribonucleotídeo=> RNA Ausência de um átomo de oxigênio ligado ao

carbono 2’da pentose

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Bases nitrogenadas

Nucleotídeo (nt)

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Nucleotídeo (nt)

-Bases nitrogenadas se ligam às pentoses formando os

nucleosídeos

Ligação glicosídica

Ligação glicosídica

do tipo ß entre C1 da pentose e o N1 de uma pirimidina

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Nucleotídeo (nt)

Fosfato

A ligação entre o grupo fosfato e a pentose

ligação fosfodiéster=grupamento fosfato ligado ao carbono-5 de um

nucleotídeo e à hidroxila (OH) ligada ao carbono C3 de outro nucleotídeo.

ligação fosfodiéster

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Nucleotídeo (nt)

Monofosfatados ( dNMPs)

Trifosfatados (dNTPs) Formas a partir dos quais os

ácidos nucleicos são sintetizados

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Cadeias polinucleotídicas possuem sempre duas extremidades:

-5’P (fosfato)

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“Maior parte” da moléculas de DNA é composta de duas cadeias

-Cadeias são complementares e antiparalelas

-Complementariedade é decorrente do pareamento entre as bases das duas cadeias por pontes de hidrogênio

(18)

Maior parte” da moléculas de DNA é composta de duas cadeias

A = T

C G

=

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-Cadeias estão

arranjadas em forma de hélice, geralmente

voltada para direita (dextrógira)

-Tamanho de cada volta= 10,4 bases por volta,

quando DNA encontra-se relaxado

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DNA cromossômico

-DNA está associado à proteínas, formando cromossomos

-Cromossomo é geralmente único, composto por DNA circular de dupla fita, disperso no citoplasma

-Tamanho do cromossomo varia de 500 a cerca de 10.000 kb

(aproximadamente 1.000 menor do que o DNA das células eucaróticas) -DNA cromossômico de procariotos pode ser circular ou linear

-Conteúdo G + C varia de 25 a 75%, dependendo da espécie -In vitro DNA possui carga negativa devido aos

grupamentos fosfato no esqueleto

-In vivo, carga negativa é neutralizada pela ligação a íons e moléculas - Mg 2+

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

Seqüências repetitivas

-Seqüências espalhadas no genoma

-Três famílias mais estudadas (não relacionadas)

• seqüências curtas < 200 pb

• não codificadoras

• intergênicas

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-Rep (Repetitive extragenic palindromic)

(Repetitiva Palíndrome Extragênica )

•Primeira a ser descoberta em 1984 •Sequências palindrômicas

• 35 a 40 pb (geralmente 38 pb)

• Podem ser transcritas mas não traduzidas • Encontradas em 25% dos mRNAs

• Podem estar presentes entre genes de um operon, ou no final do operon • Número variável

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REPs são Hotspot de transposição

Contribuem para plasticidade genética do genoma

bacteriano

Também contribuem na regulação do operon

E na estabilidade do mRNA

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RPEs found within the RNA genes. (a) The standard form of the tmRNA genes

observed in most bacterial species. (b) The permutated form of the tmRNA gene observed in α-proteobacteria (Keiler et al. 2000). (c)

Locations of the RPE-1 and RPE-5 inserted in the tmRNA genes of Rickettsia.

Approximate locations of the primers are indicated by

triangles. (d) The secondary structure model of the M1 RNA and the insertion site of the RPE-5 in R. conorii.

(29)

(30)

Reconstructed REP sequences at the insertion sites of ISs with type 1 association with REP sequences. The reconstructed REP sequences displayed in the figure have generally gone unnoticed because it is needed to join the two fragments that are intervened by the IS element to reconstruct the complete REP sequence. The figure shows the multiple alignment of the reconstructed REP sequences with the conserved bases shadowed in blue. The canonical REP sequence is at the bottom of each alignment. One of the REP sequence fragments is in pink, the direct repeat generated in the transposition event is shadowed in blue, and the other REP sequence fragment is in aquamarine. The palindromy of canonical REP sequences is indicated in bracket notation. Tobes and Pareja BMC Genomics 2006 7:62 doi:10.1186/1471-2164-7-62

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Sequências repetitivas

-Eric (Consenso Intergênico Repetitivo Enterobacteriano)

•Sequências palindrômicas • 124 a 127 pb

• Encontradas inicialmente em Enterobactérias • Presentes em:

- regiões transcritas do genoma

- regiões intergênicas de operons policistrônicos - regiões não traduzidas

• Altamente conservadas

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Sequências repetitivas

-Box

•Descobertas em Streptococcus pneumoniae • 150 pb

• Organização modular: Três módulos -BoxA (57pb)

-BoxB (43pb) -BoxC (50pb)

(33)

Na verdade todos esses elementos

São sequencias repetitivas palindrômicas

Essas sequencias são distribuídas amplamente em

bactérias A posição desses sequencias parece ser

espécies especifica. A presença desses elementos

afeta a estabilização, processamento ou termino de

transcrição.

Outas propriedades desses elemntos parece ser ligar

a proteínas especificas, sugerindo que podem ter

relações com a estrutura do nucleoide.

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Aplicação direta do

conhecimento de elementos

Repetitivos:

Uso de oligonucleotídios

desenhados para se ligar a

de regiões

Como Rep, Eric ou Box:

Gera polimorfismo ...

Forma rápida e barata

para identificar linhagens

de bactérias

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Compactação do DNA

DNA deve ser compactado para caber dentro da célula

(36)

DNA é arranjado em vários domínios independentes= cada domíno

consiste de uma alça de DNA, cujos extremos são presos por interações com proteínas e RNA.

E. coli = in vitro cerca de 100 domínios, com 47 kb cada

in vitro cerca de 50 domínios, com 95 kb cada

Estudos de microscopia eletrônica demonstraram que a compactação ocorre em três níveis distintos

•

Proteínas básicas dos tipos HU e H-NS empacotam o DNA em estrutura do tipo “contas de rosário

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DNA é arranjado em vários domínios independentes= cada domíno

consiste de uma alça de DNA, cujos extremos são presos por interações com proteínas e RNA.

E. coli = in vitro cerca de 100 domínios, com 47 kb cada in vitro cerca de 50 domínios, com 95 kb cada

Estudos de microscopia eletrônica demonstraram que a

compactação ocorre em três níveis distintos

•Protéinas básicas dos tipos HU e H-NS empacotam o DNA em estrutura do tipo “contas de rosário”

(38)

DNA bending proteins (HU, IHF, Fis, ... )

Se ligam ao DNA em sítios específicos e não específicos se fazem

isso distorcem essa região. Elas podem dobrar a molecula em

(39)

(40)

DNA bridging proteins (H-NS, StpA, Lrp, SMC , …)

Tem normalmente estruturas multimericas que multiplos dominios

de ligação a DNA, fornecendo meios de interagir com 2 duplex de

DNA simultaneamente

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(42)

supercoiled

core

Domínio

(DNA +

proteínas

básicas)

SMC

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(44)

Mapa genético

-DNA contém inúmeros genes que codificam todas as funções

da célula

•

tRNAs, rRNAs, polipeptídeos com função estrutural e enzimática

-Maior densidade de genes nos cromossomos dos procariotos

do que nos eucariotos

Densidade de genes=número de genes no cromossomo por megabase de DNA (1Mb= 106_pb)

(45)

Organismos tem muitas classes de genes diferentes !!!!

(46)

Organismos tem muitas classes de genes diferentes !!!!

(47)

Organismos tem muitas classes de genes diferentes !!!!

(48)

Mapa genético

Número e tipos de genes presentes no cromossomo

procariótico e a posição de cada gene no DNA

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Correlação entre o tamanho do genôma e

o número de genes em bactérias

Tamanho do genoma (Kpb) N úm er o de g en es ( K pb )

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Bactéria

Levedura

Drosophila

Humano

gene gene gene gene gene gene gene gene gene gene gene gene gene

gene gene gene gene gene gene gene gene gene gene

gene gene gene gene gene gene gene gene

gene gene gene

20 Kb

200 Kb

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Organização dos genes em procariotos

Monocistrônicos

Genes expressos independentemente. Cada gene possui Um promotor

RBS - Sequência de ligação do ribossomo

(ribosome binding sequence)

ORF

(open reading frame) Fase aberta de leitura

Todos genes de eucariontes são monocistronicos...

(salvo algumas execeções de eucariontes basais...)

5'UTR / 3'UTR = Regiões não traduzida 5' e 3'(untranslated region= UTR)

Regiões 5’e 3’. Sequências nestas regiões podem regular a expressão gênica. Por exemplo: estabilidade do RNA

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Policistrônicos

Operon=

Conjunto de genes transcritos a partir de um único promotor

Maioria dos

genes em

bactéria estão

presentes em

operons

-Nos operons estão geralmente agrupados genes relacionados a um mesmo fenótipo como vias metabólicas entre outros.

-Permite que todas as enzimas necessárias para uma via metabólica possam estar disponíveis na célula ao mesmo tempo.

(53)

(54)

Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana. O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma. O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA), e tem, no DNA, uma simetria diádica, seguida de um poli-T.

(55)

TRANSCRIÇÃO: DNA → RNA

Os genes são expressos através da transcrição ...

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(57)

Em

Bactérias

tem um único complexo de RNA polimerase

cuja especifidades se dão por diferentes fatores Sigmas

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(60)

Eucarionte tem diferentes RNAs polimerases para diferentes classes de RNAs

RNA Polymerase IV microRNAs

RNA polimerase virais especificas … RNA virais *

* virus de qualquer organismo (bacteria ou eucarionte)

(61)

Arqueas tem somente uma RNA polimerase

Mas que é mais próxima filogeneticamente a todas de eucarionte

Sendo similar a tipo ancestral desse grupo...

(62)

RNA Pol Archaea

RNA Pol Eucaria

(63)

(64)

(65)

Em eucariontes e em arqueas a regulação de transcrição

é diferente de bactérias...

Não existe fator sigma …

RNA polimerase precisa de varias outras proteínas

Exemplo...

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(67)

 Start codon –

PROCARIOTOS – 90% das vezes AUG é o codon de iniciação mas também AUA, GUG ou UUG podem ser encontrados

EUCARIOTOS – AUG é quase sempre o codon de iniciação

_{Stop codon –}

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_{Stop codon –?????? nemsempre}

UAA, UAG, UGA – sempre sinal para o término da tradução

UGA =>

selenometionina

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Produz enzimas que clivam a lactose (açúcar do leite)

Dois componentes: repressor e genes funcionais

Três genes funcionais

Operon da lactose

-LacZ = galactosidase -LacY= permease

-LacA= B-galactosidade transacetylase

Promotor (P)= ligação da RNA polimerase

Operador (O)= sítio de ligação do repressor

Repressor (lacI) gene

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REGULAÇÃO DATRANSCRIÇÃO:

DNA → RNA

(71)

Exemplo clássico de regulação de genes em bactérias !

Muito usado como base na maioria dos sistemas

artificias de regulação genica em plasmídeos atualmente

Lac operon

(72)

lac operon

Sistema que controla genes envolvidos no

metabolismo de lactose em bactérias

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mRNA

Proteínas (enzimas)

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(77)

Confirmação experimental

Perda de função

devido mutação do repressor

Recupera função No mutante

Pela introdução de um repressor exogeno

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(79)

Ausência de lactose

O gene do repressor codifica a proteína repressora que se liga ao operador. A ligação da RNA ao promotor é bloqueada pelo repressor.

-Normalmente desativo. Presença de lactose induz transcrição dos genes

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Presença da lactose

O gene do repressor codifica a proteína repressora que possui um sítio de ligação para a lactose.

O complexo repressor/lactose é incapaz de se ligar ao promotor e a RNA polimerase é inibida.

(81)

Consensus RBS Sequences

Prokaryotic (Shine-Dalgarno sequence) +1

5’ - AGGAGGACAGCUAUG - 3’

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Informação do DNA vem em ondas

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Genes

Em procariotos

Processo de

transcrição e

tradução

acoplados

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