AGRADECIMENTOS
Ao João pela orientação. Ao LNLS pela infra-estrutura.À Fapesp pela bolsa (Processo nº 2004/14367-4).
Ao Prof. Dr. Nilson I. T. Zanchin por permitir que eu trabalhasse com a Q4DV70. À Profa. Dra. Beatriz G. Guimarães, Prof. Dr. Samuel Goldenberg e Prof. Dr. Marco A. Krieger que também estão envolvidos nesse projeto.
Ao Leandro de C. Vieira e à Dra. Melissa R. Fessel, pelo clone e cristais da Q4DV70.
À Ms. Tatiane Balliano e ao Prof. Dr. Glaucius Oliva, pelo fornecimento de GAPDH e ajuda nos testes de atividade dessa proteína.
Ao Daniel M. T. e Prof. Dr. Jörg Kobarg, pela ajuda com o duplo híbrído e células de inseto. Ao Prof. Dr. José Andrés Yunes, pelo fornecimento de mRNA e pelas discussões.
Ao Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti, pela ajuda com o banco de dados de SAGE. À Profa. Dra. Ana Carolina de Mattos Zeri, pela realização do experimento de RMN. Ao Prof. Dr. Sérgio Shenkman, pelas amostras de T. cruzi.
Ao Prof. Dr. Mário Tyago Murakami, pela ajuda no experimento de SAXS. Ao Amadeu e à Margareth, pelos experimentos de espectrometria de massa.
Às técnicas Celisa, Andréia, Adriana, Elaine, Tereza, Eugênia e Veruska, pelos materiais, protocolos e ajuda.
Ao Prof. Dr. Hiroshi Aoyama, Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos e Prof. Dr. Ricardo Aparício, pela avaliação e pelas discussões no exame de qualificação.
Ao Prof. Dr. Hiroshi Aoyama, Profa. Dra. Maria Cristina Nonato, Prof. Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes, Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, pela participação na banca de tese.
A todos os colegas do CEBIME, por serem sempre tão simpáticos e prestativos.
Aos colegas do grupo: Nádia, Carolina, José Geraldo, Andréa Balan, Germanna, Vanessa, pelo ótimo convívio.
À Tatiana, Priscila e Celisa, pela amizade, incentivo, ajuda e pelas valiosas discussões científicas. A todos os meus parentes e amigos pelo carinho e apoio.
Aos meus pais, pelo amor, carinho, preocupação e dedicação. Aos meus irmãos, Caroline e Victor, pelo amor e carinho.
Ao meu marido Márcio, pelo amor, carinho, paciência, compreensão, incentivo, ajuda. A Deus, por estar sempre do meu lado e me dar força nas horas mais difíceis.
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ... iv
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ... viii
LISTA DE ABREVIAÇÕES ... x
RESUMO ...xii
ABSTRACT ... xiv
CAPÍTULO 1 – ESTUDOS ESTRUTURAIS DA Q4DV70 DE T. cruzi ... 1
1.1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1.1. A doença de Chagas ... 1
1.1.2. O ciclo de vida do T. cruzi ... 4
1.1.3. A escolha de Q4DV70 para estudos estruturais e funcionais ... 6
1.1.4. O enovelamento tiorredoxina ... 8 1.1.5. A possível função de Q4DV70 ... 11 1.2. OBJETIVOS ... 13 1.3. MATERIAL E MÉTODOS ... 14 1.3.1. Clonagem e expressão ... 14 1.3.2. Purificação ... 15 1.3.3. Cristalização ... 16
1.3.4. Determinação do método de crioproteção para cristais ... 17
1.3.5. Coleta e processamento de dados de difração ... 18
1.3.6. Substituição molecular e refinamento do modelo ... 18
1.3.7. Análise da expressão gênica por PCR ... 19
1.3.8. Análise da expressão protéica em T. cruzi por western blot ... 20
1.3.9. Teste de atividade chaperona no enovelamento da GAPDH ... 21
1.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 23
1.4.1. Purificação da proteína Q4DV70 ... 23
1.4.2. Análise da expressão gênica e protéica de Q4DV70 em T. cruzi ... 24
1.4.3. Teste de atividade chaperona da Q4DV70 no re-enovelamento da GAPDH ... 26
CAPÍTULO 2 – ESTUDOS ESTRUTURAIS DA MESOTELINA DE H. sapiens ... 58
2.1. INTRODUÇÃO ... 58
2.1.1. O câncer ... 58
2.1.2. A proteína mesotelina ... 60
2.1.3. A expressão de mesotelina no câncer e sua importância ... 63
2.1.4. A interação entre mesotelina e a proteína MUC16 ... 67
2.1.5. Mesotelina como alvo para desenho de drogas anti-câncer ... 73
2.1.6. Escolha da mesotelina para estudos estruturais ... 76
2.2. OBJETIVOS ... 78 2.3. MATERIAL E MÉTODOS ... 79 2.3.1. Meios de cultura ... 79 2.3.2. Transformação bacteriana ... 79 2.3.2.1. Método PEG ... 79 2.3.2.2. Eletroporação ... 80 2.3.3. Plasmídeos ... 81 2.3.4. Oligonucleotídeos ... 81 2.3.5. Cepas bacterianas ... 81
2.3.6. Reação em cadeia da polimerase ... 82
2.3.7. Eletroforese em gel de agarose ... 82
2.3.8. Extração de DNA do gel de agarose ... 82
2.3.9. Ligação de inserto em plasmídeos ... 83
2.3.10. Extração plasmidial ... 83
2.3.11. Digestão plasmidial ... 83
2.3.12. Expressão da proteína recombinante ... 83
2.3.13. SDS-PAGE ... 84
2.3.14. Purificação de proteína ... 85
2.3.14.1. Cromatografia de afinidade ... 85
2.3.14.2. Cromatografia de filtração em gel ... 85
2.3.14.3. Cromatografia de troca aniônica ... 86
2.3.14.4. Cromatografia de afinidade em condições desnaturantes ... 86
2.3.15. Re-enovelamento da proteína por diálise ... 87
2.3.16. Fluorescência ... 87
2.3.17. Proteólise limitada com tripsina ou quimotripsina ... 88
2.3.18. Dicroísmo circular ... 88
2.3.19. Clivagem da cauda de histidinas ... 89
2.3.20. Medida de concentração de proteína ... 89
2.3.21. Espalhamento dinâmico de luz ... 90
2.3.22. Testes de cristalização ... 90
2.3.23. Refinamento de cristais ... 90
2.3.24. Espectrometria de massas ... 92
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 94
2.4.1. Construção do plasmídeo pET-TEV/mesotelina ... 94
2.4.2. Expressão e purificação da mesotelina ... 95
2.4.3. Comparação das amostras de mesotelina através da fluorescência do triptofano ... 98
2.4.4. Comparação das amostras de mesotelina através da proteólise limitada com tripsina 99 2.4.5. Comparação das amostras de mesotelina através de dicroísmo circular ... 100
2.4.6. Clivagem da cauda de histidinas da mesotelina ... 102
2.4.7. Análise da amostra de mesotelina por espalhamento dinâmico de luz ... 103
2.4.8. Cristalização da mesotelina ... 104
2.4.9. Determinação de domínio estável de mesotelina por proteólise limitada com quimotripsina ... 111
2.4.10. Espalhamento de raios X a baixo ângulo ... 116
2.5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 119
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 121
ANEXO 1 – OUTROS RESULTADOS OBTIDOS... 133
Intelectina-1 ... 135
ROBO4 ... 137
AF1Q ... 142
TCTE1L ... 147
Referências bibliográficas ... 160
ANEXO 2 – ARTIGOS PUBLICADOS ... 163
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1: Esquema do ciclo de vida do T. cruzi. ... 5
Figura 2: Esquema do mecanismo de transcrição e maturação do mRNA em tripanosomatídeos. 7 Figura 3: Exemplos de proteínas com enovelamento tiorredoxina. ... 9
Figura 4: Etapas de purificação da Q4DV70. ... 23
Figura 5: PCR com amostras de T. cruzi. ... 24
Figura 6: Western blot com amostras de T. cruzi usando anticorpos anti-Q4DV70.. ... 25
Figura 7: Atividade recuperada por GAPDH após desnaturação com hidrocloreto de guanidina e re-enovelamento na presença de diferentes concentrações de Q4DV70. ... 26
Figura 8: Cristais da proteína Q4DV70. ... 28
Figura 9: Padrão de difração do cristal de Q4DV70 na presença de gelo ... 29
Figura 10: Padrão de difração do cristal de Q4DV70 sem a presença de gelo. ... 31
Figura 11: Representação esquemática da estrutura de Q4DV70 e resíduos envolvidos na formação de cada tipo de estrutura secundária. ... 34
Figura 12: Superfície eletrostática de proteínas com enovelamento tiorredoxina. ... 36
Figura 13: Alinhamento de seqüência de Q4DV70 e proteínas hipotéticas conservadas de T. brucei, Leishmania brasiliensis, L. infantum e L. major... 38
Figura 14: Cisteína C-terminal de CXXC e cisteína -4 de proteínas hipotéticas de tripanossomatídeos poderiam reconstituir ponte dissulfeto. ... 39
Figura 15: Exposição de resíduos conservados em Q4DV70 e PDIs. ... 41
Figura 16: Alinhamento de seqüência e superposição estrutural nas proximidades do motivo tiorredoxina ... 42
Figura 17: Triptofano que precede o motivo tiorredoxina. ... 43
Figura 18: Serinas (Q4DV70) ou cisteínas (tiorredoxina e PDI) do motivo tiorredoxina. ... 44
Figura 19: Arginina do motivo tiorredoxina de Q4DV70.. ... 45
Figura 20: Histidina ou prolina que antecede a cisteína C-terminal do motivo CXXC. ... 46
Figura 21: Arginina do loop que conecta β5 e α4 em Q4DV70.. ... 47
Figura 22: Resíduo de ácido glutâmico/aspártico importante para atividade oxidorredutase. ... 48
Figura 23: Comparação entre a estrutura da chaperona Wind e Q4DV70. ... 50
Figura 24: Sítio de ligação ao peptídeo de DsbA e região correspondente em Q4DV70. ... 52
Figura 25: Comparação entre Q4DV70 e PDI de levedura. ... 54
Figura 26: Esquema de expressão e processamento da proteína precursora MPF/mesotelina. ... 62
Figura 27: Esquema da proteína MUC16. ... 68
Figura 28: Estrutura do domínio SEA ... 69
Figura 29: O modelo da mesotelina. ... 72
Figura 31: Expressão de mesotelina com cauda de histidinas em BL21(DE3)slyD- a 16ºC. ... 95
Figura 32: Purificação da mesotelina presente na fração solúvel. ... 96
Figura 33: IMAC de mesotelina em condições desnaturantes. ... 97
Figura 34: Espectro de emissão de fluorescência de mesotelina re-enovelada e solúvel. ... 98
Figura 35: Proteólise limitada de mesotelina re-enovelada e solúvel com tripsina.. ... 99
Figura 36: Espectro de dicroísmo circular de mesotelina re-enovelada e solúvel. ... 100
Figura 37: Predição de estrutura secundária da mesotelina realizada pelo programa PSIPRED. 101 Figura 38: Teste de clivagem da cauda de histidinas de mesotelina com protease TEV. ... 102
Figura 39: IMAC após clivagem da cauda de histidinas. ... 103
Figura 40: Cristais de mesotelina. ... 105
Figura 41: Cristais obtidos no experimento 7. ... 108
Figura 42: Cristais obtidos no experimento 8. ... 109
Figura 43: Cristais obtidos no experimento 9. ... 110
Figura 44: Padrão de difração de cristais de mesotelina ... 110
Figura 45: Proteólise limitada de mesotelina com quimotripsina. ... 111
Figura 46: Espectrometria de massa com domínio estável de 20 kDa de mesotelina obtido por proteólise limitada com quimotripsina.. ... 112
Figura 47: Comparação entre o domínio estável, a região de ligação a MUC16 e as repetições do modelo de mesotelina. ... 113
Figura 48: Cromatografia de filtração em gel de amostra da proteólise com quimotripsina.. ... 114
Figura 49: Cromatografia de troca aniônica de amostra da proteólise com quimotripsina. ... 115
Figura 50: Resultados do experimento de SAXS para a proteína mesotelina. ... 116
Figura 51: Envelope da mesotelina calculado a partir dos dados de SAXS. ... 117
Tabela 1: Estatísticas de coleta e processamento de dados para cristal de Q4DV70 ... 29
Tabela 2: Estatísticas de coleta e processamento de dados para cristal de Q4DV70. ... 32
Tabela 3: Superposição de proteínas com enovelamento tiorredoxina na Q4DV70 ... 35
Tabela 4: Expressão de mesotelina em câncer ... 63
Tabela 5: Experimentos de refinamento de cristais de mesotelina. ... 91
LISTA DE ABREVIAÇÕES
3-AT 3-Amino-1,2,4-triazol Å Ångström (1x10-10 metros) AML Leucemia mielóide aguda
Blast Basic local alignment search tool CD Dicroísmo circular
CD44H Receptor de superfície celular para hialuronato
cDNA DNA complementar ao mRNA
COS-7 Linhagem celular de rim de macaco verde africano
CTL Célula T CD8+
DLS Espalhamento dinâmico de luz DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Desoxirribonucleotídeos A, T, C, G DO600nm Densidade óptica medida em 600 nm DTT 1,4-Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodianotetracético
ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay FPLC Fast performance liquid chromatography GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase GPI Glicosilfosfatidilinositol
GST Glutationa S transferase
IgG Imunoglobulina G
IL12 Interleucina 12
IMAC Cromatografia de afinidade a metal imobilizado IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
K Kelvin
kDa Quilo Dalton
LB Luria Bertani
LLA Leucemia linfocítica aguda Mab Anticorpo monoclonal
MPF Megakaryocyte-potentiating factor
mRNA RNA mensageiro
NAD Nicotinamida adenina dinucleotídeo
OVCAR-3 Linhagem de adenocarcinoma de ovário humano
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase PDB Protein Data Bank
PDI Proteína dissulfeto isomerase PEG Polietilenoglicol
PI-PLC Fosfolipase C específica para fosfatidilinositol PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
PVDF Fluoreto de polivinilideno RE Retículo endoplasmático RMN Ressonância magnética nuclear RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto SCT Single chain trimer SDS Docecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida - docecil sulfato de sódio SMR Soluble mesothelin related
TAE Tampão tris-acetato-EDTA TBS Tampão tris-salina
TEV Tobacco etch virus
TFA Tampão da fosfatase alcalina TIG TCTE1L inteira fusionada a GST
Trx80 Tiorredoxina recombinante com 80 resíduos do N-terminal TYM Tryptone-yeast extract medium
RESUMO
Neste trabalho realizamos estudos estruturais com duas proteínas, a Q4DV70 de Trypanosoma cruzi e a mesotelina de Homo sapiens. O objetivo foi contribuir para a compreensão da função dessas proteínas, as quais possivelmente são importantes para a doença de Chagas e o câncer, respectivamente.
A proteína Q4DV70 estava anotada no genoma de T. cruzi como hipotética conservada. Em nosso estudo, a proteína foi pela primeira vez detectada em amostras do parasita. Essa expressão ocorre na fase epimastigota, mas não na fase tripomastigota metacíclica, indicando que a proteína pode ter uma função importante no ciclo de vida do T. cruzi.
A estrutura cristalográfica da Q4DV70 foi resolvida por substituição molecular e refinada com dados até 1,5 Å de resolução. Ela apresenta enovelamento tiorredoxina, formado por uma folha β de 5 fitas cercada por duas hélices α de cada lado.
As proteínas que apresentam maior identidade seqüencial e superposição estrutural com Q4DV70 são as tiorredoxinas e PDIs, oxidorredutases de pontes dissulfeto. Porém, as duas cisteínas do sítio ativo dessas proteínas estão substituídas por serinas em Q4DV70, o que impossibilita a função de formação, redução ou isomerização de pontes dissulfeto.
Diversas tiorredoxina-like apresentam atividade chaperona independente da função oxidorredutase. Essa função está relacionada a regiões hidrofóbicas na superfície e/ou depende da presença de outro domínio. Q4DV70 é monomérica, composta apenas pelo domínio tiorredoxina-like, e não apresenta regiões hidrofóbicas em sua superfície. Além disso, não demonstrou capacidade de aumentar o enovelamento da GAPDH de T. cruzi. Esses resultados indicam que Q4DV70 não apresenta atividade chaperona.
Mesotelina é uma proteína expressa em mesotélio normal e em diversos tipos de câncer, como mesotelioma, câncer de ovário e de pâncreas e leucemia mielóide aguda. Ela é considerada um marcador diagnóstico para esses cânceres e tem sido alvo para o desenvolvimento de drogas anti-tumor. Além disso, ela interage com MUC16, uma proteína presente na superfície de células de câncer de ovário. Apesar da reconhecida importância e uso da mesotelina, pouco se sabe sobre sua estrutura e função.
A proteína foi purificada em condições desnaturantes e submetida ao re-enovelamento por diálise. Experimentos de dicroísmo circular, fluorescência e proteólise limitada comprovaram que a mesotelina foi corretamente re-enovelada. Essa amostra foi submetida a ensaios de cristalização, os quais resultaram em cristais que difrataram a baixa resolução.
A estrutura de baixa resolução da mesotelina foi calculada a partir de dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo e mostra que sua forma é alongada e curvada. O espectro de dicroísmo circular da mesotelina é típico de proteínas ricas em hélices α. Recentemente foi proposto que a estrutura da mesotelina é formada por uma estrutura em super-hélice, composta por repetições do tipo ARM, as quais apresentam 3 hélices α cada uma. Nossos resultados experimentais indicam que esse modelo teórico está correto.
Proteólise limitada com quimotripsina resultou em um domínio estável de 20 kDa na região N-terminal da proteína. Esse domínio contém os 64 resíduos descritos como possível sítio de ligação a MUC16 e deve ser formado pelas 4 primeiras repetições do tipo ARM, de acordo com o modelo publicado.
ABSTRACT
In this work we carried out studies with two proteins, Q4DV70 from Trypanosoma cruzi and mesothelin from Homo sapiens. The aim was to help the understanding of the function of these proteins which possibly are important to Chagas disease and cancer, respectively.
Q4DV70 protein was annotated in T. cruzi genome as a conserved hypothetical protein. In our studies, the protein was detected for the first time in parasite samples. Its expression occurs in the epimastigote form but not in the metacyclic trypomastigote form indicating that Q4DV70 is important for the pathogen life cycle.
Q4DV70 crystal structure was solved by molecular replacement and refined with data to 1.5 Å maximum resolution. It shows a thioredoxin fold, formed by a five stranded β-sheet flanked by two α-helixes in each side.
The proteins more sequentially identical and better structurally superposed to Q4DV70 are thioredoxins and protein disulfide isomerases, which are disulfide oxidoreductases. However, the cysteine residues from CXXC motif of the active site are replaced by serines in Q4DV70, what prevents the function of formation, reduction and isomerization of disulfide bonds.
Different thioredoxin-like proteins show chaperone activity independent of oxidoreductase function. This function is related to hydrophobic regions on the surface and/or is dependent of another domain. Q4DV70 is monomeric, composed only by thioredoxin-like domain and does not show hydrophobic regions on its surface. Moreover the protein does not increase the refolding of GAPDH from T. cruzi. These results indicate that Q4DV70 does not present chaperone activity.
Mesothelin is a protein expressed in normal mesothelium and in different types of cancer, such as mesothelioma, ovarian cancer, acute myeloid leukemia and cancer of pancreas. It is considered a diagnostic marker for these cancers and it has been used in the development of anti-tumor drugs. Besides that, it binds to MUC16, a protein present on the surface of ovarian cancer cells. In spite of its recognized significance and use in cancer, little is known about its structure and function.
The protein was purified under denaturing conditions and submitted to refolding by dialysis. Circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis experiments confirmed that mesothelin was correctly refolded. This sample was submitted to crystallization trials that resulted in crystals which diffracted at low resolution.
The low resolution structure of mesothelin was calculated from small angle X-ray scattering data and it shows an elongated and curved shape. The circular dichroism spectrum for mesothelin is typical of proteins that are rich in α-helixes. Recently it was proposed that mesothelin has a superhelix structure made by ARM repeats which are composed by 3 α-helixes each one. Our experimental results indicate that this theoretical model is correct.
Limited proteolysis with chymotrypsin resulted in a stable domain of 20 kDa in the N-terminal region of the protein. This domain has the 64 residues described as the possible binding site for MUC16 and should be composed by the first four ARM repeats according to the model.
Caro leitor,
Essa tese está dividida em dois capítulos, de forma a facilitar a sua
compreensão. Estes capítulos são:
Capítulo 1 – Estudos estruturais da Q4DV70 de T. cruzi...página 1
Capítulo 2 – Estudos estruturais da mesotelina de H. sapiens...página 58
Boa leitura!
CAPÍTULO 1 – ESTUDOS ESTRUTURAIS DA Q4DV70 DE T. cruzi
1.1. INTRODUÇÃO
1.1.1. A doença de Chagas
A doença de Chagas, seu agente causal e o inseto vetor foram identificados há mais de 100 anos por Carlos Chagas (Chagas, 1909). Ela é endêmica da América Latina e estima-se que entre 8 e 10 milhões de pessoas estejam cronicamente infectadas (OPS, 2006) e que 50 mil novos casos ocorram a cada ano (Dias et al., 2008).
A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e transmitida ao homem principalmente através das fezes de insetos hematófagos contaminados. Nesse caso, é importante considerar a existência de dois ciclos, o silvestre e o domiciliar. O ciclo silvestre consiste do inseto que vive na mata em pequenas colônias, possui predadores naturais e tem nos anfíbios, répteis, aves e pequenos mamíferos, sua fonte de alimento. O homem raramente entra nesse ciclo. A infecção dos humanos geralmente ocorre através do ciclo domiciliar. Nesse caso, os insetos formam grandes colônias nas habitações humanas e têm no sangue das pessoas e animais domésticos sua principal fonte de alimento. Graças a programas multinacionais coordenados de eliminação do inseto vetor, o Brasil foi considerado livre da transmissão vetorial em 2006 (Schofield et al., 2006). Outras formas de transmissão da doença ao homem são:
por transfusão sangüínea. Somente o teste obrigatório para T. cruzi nos bancos de sangue pode evitar que ocorra esse tipo de transmissão. Devido à mobilidade de pessoas da América Latina para os Estados Unidos, países da Europa e Ásia, a doença de Chagas atingiu áreas consideradas não-endêmicas. Nesses países, a transmissão se dá principalmente através de transfusão sangüínea (Grant et al., 1989, Nickerson et al., 1989). Alguns casos foram observados em regiões do Brasil consideradas livres da doença, como na Amazônia e em Santa Catarina, e ocorreram por transmissão oral (Rodriguez-Morales, 2008).
A doença de Chagas apresenta-se através de uma fase aguda e uma fase crônica. A fase aguda é caracterizada pela presença do parasita no sangue circulante do paciente, o que facilita o diagnóstico por exame parasitológico direto. Os sintomas apresentados podem ser: febre, mal estar, falta de apetite, edemas localizados na pálpebra e inchaço dos gânglios linfáticos. Essa fase dura de 4 a 8 semanas e freqüentemente passa sem ser percebida, já que os sintomas não são específicos da doença. Os casos não tratados na fase aguda evoluem para a fase crônica. Essa é caracterizada pela ausência da parasitemia, o que leva à necessidade de exame sorológico para diagnóstico da doença, como teste de ELISA. Cerca de 70% dos indivíduos infectados não desenvolvem a doença clínica. Porém, 30% apresentam a forma cardíaca da doença, caracterizada por miocardiopatia crônica, insuficiência cardíaca, distúrbios de condução atrioventricular e intraventricular, arritmias, cardiomegalia, entre outros (Maguire et al., 1987; Kuschnir et al., 1985). Estudos mostram que 8-10% apresentam a forma digestiva, isto é, um aumento dos órgãos como esôfago e cólon, com lesões inflamatórias no sistema nervoso entérico (de Oliveira et al., 1998; de Rezende & Moreira, 1988; Mota et al., 1984).
A patogenia na fase crônica tem sido explicada por duas hipóteses diferentes. Uma dela sugere que o parasita seja importante para elicitar a resposta imune que leva à inflamação, mas que a auto-imunidade, e não a presença do parasita, seja essencial para manter esse quadro
(Cunha-Neto et al., 1995; Kalil & Cunha-Neto, 1996). Já a outra hipótese sugere que a presença do parasita seja essencial e suficiente para manter a resposta inflamatória, o que pode incluir a auto-imunidade (Tarleton et al., 1997; Tarleton & Zhang, 1999; Tarleton, 2001; Tarleton, 2003; Marin-Netto et al., 2007). Existe um consenso crescente de que a presença do parasita e de uma resposta imune desbalanceada do hospedeiro sustentem a resposta inflamatória característica da fase crônica.
O tratamento para a doença de Chagas é feito com as drogas nifurtimox e benzonidazol, que foram introduzidas empiricamente para uso clínico nas décadas de 1960 e 1970 (Rodrigues Coura & de Castro, 2002). Esses medicamentos são efetivos na fase aguda da doença, com eliminação dos parasitas em até 80% dos pacientes tratados (Cançado, 1999; Cançado, 2002). Porém, elas são pouco eficazes na fase crônica da doença, com até 80% de pacientes tratados não curados (Cançado, 2002). A baixa eficiência na fase crônica ocorre devido ao curto tempo de vida das drogas e penetração limitada nos tecidos (Raaflaub & Ziegler, 1979; Raaflaub, 1980, Workman et al., 1984), o que impede que alcancem os parasitas, que nessa fase se encontram confinados em tecidos profundos (Urbina & Docampo, 2003). Além disso, esses medicamentos causam efeitos colaterais sérios que muitas vezes levam à descontinuação do tratamento (Rodrigues Coura & de Castro, 2002; Rassi et al., 2009). A ação do nifurtimox ocorre pela produção de grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (Docampo & Moreno, 1986). Já a ação do benzonidazol parece resultar de estresse oxidativo e envolver modificações de macromoléculas (Docampo & Moreno, 1986; Docampo, 1990).
médico-hospitalares e programas de controle e vigilância. Dessa forma, o desenvolvimento de novas drogas, mais efetivas na fase crônica e que causem menos efeitos colaterais, é essencial para o controle da doença.
1.1.2. O ciclo de vida do T. cruzi
O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e envolve dois hospedeiros: o homem ou outro mamífero e o inseto da ordem Hemíptera, família Reduviidae, subfamília Triatominae, conhecido popularmente como barbeiro (figura 1).
Figura 1: Esquema do ciclo de vida do T. cruzi. 1) o inseto suga o sangue de um animal infectado e ingere
tripanossomos na forma tripomastigota; 2) no estômago do invertebrado os tripomastigotas se diferenciam em epimastigotas; 3) epimastigotas sofrem replicações por divisão binária e se aderem às células intestinais; 4) no intestino posterior epimastigotas se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos (metaciclogênese); 5) o inseto pica a presa para alimentar-se do seu sangue e defeca próximo ao local, eliminando epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos; 6) o indivíduo a coça a região, arrastando o parasita ao ponto da picada, o qual atravessa a epiderme lesionada; 7) tripomastigotas metacíclicos infectam células do hospedeiro vertebrado. Então, eles se diferenciam em amastigotas, que se replicam por fissão binária. Após a multiplicação os amastigotas se diferenciam em tripomastigotas; 8) quando a célula estoura os tripomastigotas se disseminam pela corrente sangüínea e infectam diferentes tipos celulares; 9) o ciclo se completa quando o barbeiro pica o animal, ingerindo formas tripomastigotas. Esquema reproduzido a partir de: http://www.fcfrp.usp.br/dactb/Parasitologia/Arquivos/Genero_Trypanosoma.htm
1 2 3 4 5 6 8 7 9
1.1.3. A escolha de Q4DV70 para estudos estruturais e funcionais
Como o melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos no processo de transformação do T. cruzi pode auxiliar no desenho de drogas efetivas no controle da doença de Chagas, proteínas diferencialmente expressas durante a metaciclogênese foram escolhidas para determinação da estrutura e caracterização da função.
O genoma de tripanossomatídeos mostra que os genes codificando proteínas estão organizados como unidades policistrônicas bidirecionais (El-Sayed et al., 2005). A transcrição se inicia em regiões padrão em cada cromossomo na ausência de promotores para RNA polimerase II e de fatores de transcrição típicos. O processo de maturação de mRNAs a partir do RNA policistrônico ocorre através de duas reações: o trans-splicing e a clivagem e poliadenilação da extremidade 3’ (figura 2). No trans-splicing uma seqüência de RNA de 39 nucleotídeos denominada splice leader (SL-RNA), que contém um cap na sua extremidade 5’, é adicionada na extremidade 5’ do transcrito. Mecanismos pós-transcricionais regulam a expressão gênica em tripanossomatídeos (Haile & Papadopoulou, 2007).
Figura 2: Esquema do mecanismo de transcrição e maturação do mRNA em tripanosomatídeos. a) A
transcrição é policistrônica e bidirecional. b) O trans-splicing ocorre pela união de fragmentos de SL-RNA 5’-capped com SL-RNA que codifica proteína. c) A maturação do mSL-RNA ocorre pela adição da cauda poli-A 3’.
Análise global usando microarranjos de DNA indicaram que o mRNA que codifica a proteína Q4DV70 apresenta associação diferencial aos polissomos nos diferentes estágios do T. cruzi, segundo o Dr. Marco Aurélio Krieger (Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba-PR) e o Dr. Samuel Goldenberg (Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Curitiba-PR). Isso parece indicar que a proteína é diferencialmente expressa durante o ciclo de vida do parasita e pode ter uma função importante no processo de transformação de um estágio para outro. Este foi um dos fatores que levou à escolha da proteína como objeto para realização de estudos estruturais e funcionais. O fato da seqüência da proteína Q4DV70 estar anotada como hipotética conservada, sem nenhuma possível função associada, foi outro motivo para sua escolha. Havia a possibilidade
// // ~AAAn SL-RNA
a)
b)
~AAAn ~AAAnc)
1.1.4. O enovelamento tiorredoxina
Observou-se que a proteína Q4DV70 apresenta domínio tiorredoxina-like, através de busca por proteínas que apresentassem similaridade de seqüência com ela, usando o programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). O enovelamento tiorredoxina clássico é composto por uma folha β de 4 fitas rodeada por 3 hélices α e recebeu esse nome porque foi observado pela primeira vez na proteína tiorredoxina de Escherichia coli (Holmgren et al., 1975). Posteriormente, foi observado em outras proteínas, como glutationa S-transferase (Reinemer et al., 1991), glutarredoxina (Sodano et al., 1991), DsbA (Martin et al., 1993), glutationa peroxidase (Epp et al., 1983), proteína dissulfeto isomerase – PDI (Kemmink et al., 1996) e peroxirredoxina (Choi et al., 1998). Apesar de apresentarem similaridade estrutural (figura 3), essas proteínas realizam diferentes funções na célula e não apresentam identidade seqüencial significativa.
Figura 3: Exemplos de proteínas com enovelamento tiorredoxina. Tiorredoxina (2AJQ); GST (1AQW);
glutarredoxina (1KTE); DsbA (1FVK); glutationa peroxidase (2I3Y); PDI (2B5E) e peroxirredoxina (2VL2).
As tiorredoxinas são proteínas pequenas encontradas em todos os organismos, de arqueobactérias a humanos (Stefanková et al., 2005). Todas possuem CGPC no sítio ativo. Suas funções incluem servir de substrato para enzimas redutoras, oxidorredutase de dissulfeto, fator regulatório para enzimas ou receptores, subunidade para DNA polimerase viral e componente
Tiorredoxina
GST
DsbA
Glutationa
peroxidase
Glutarredoxina
Peroxirredoxina
PDI
tiol da glutationa para halóides de alquil e aril, epóxidos, quinonas e alcenos ativados para produzir compostos que são mais polares e mais facilmente eliminados. Sua estrutura é composta por 2 domínios, sendo um com enovelamento tiorredoxina e outro composto por 5 hélices α (Reinemer et al., 1991).
Glutarredoxinas quase sempre apresentam CPYC no sítio ativo. O mecanismo de ação pode ser classificado como redução monotiol ou ditiol (Pan & Bardwell, 2006). O mecanismo ditiol é muito similar ao encontrado nas tiorredoxinas. A redução monotiol consiste de interação da glutarredoxina com glutationa ligada à proteína alvo e retirada dessa molécula. Isso é feito através do seu bolsão de ligação, composto em parte pela K8 e pelo D67. Esses resíduos não estão presentes em outros membros da superfamília tiorredoxina, o que explica porque as glutarredoxinas são tão eficientes nessa função (Pan & Bardwell, 2006).
DsbA é uma proteína de bactéria presente no periplasma que catalisa a formação de pontes dissulfeto durante o enovelamento de proteínas secretadas (Guddat et al., 1998). É a proteína mais oxidante da família tiorredoxina e no sítio ativo apresenta CPHC. É composta por dois domínios, sendo que um domínio formado por hélices está inserido no domínio tiorredoxina (Martin et al., 1993).
Glutationa peroxidases formam uma família de proteína cujos membros catalisam a redução de peróxido de hidrogênio em água ou hidroperóxidos orgânicos em álcoois correspondentes usando glutationa reduzida como doador de elétrons (Margis et al., 2008).
PDI é uma proteína que catalisa a formação, isomerização e redução de pontes dissulfeto em proteínas no retículo endoplasmático (RE) (Freedman et al., 1994). Sua estrutura está organizada em 5 domínios: a, b, b’, a’, c (Darby et al., 1996). Os quatro primeiros domínios apresentam enovelamento tiorredoxina e formam um “U” torcido, enquanto o domínio c é formado por uma hélice que fica para fora do “U” (Tian et al., 2006). Os domínios a e a’
apresentam CGHC no sítio ativo e os domínios b e b’ são cataliticamente inativos e sem similaridade de seqüência com proteínas da família tiorredoxina.
Peroxirredoxinas, também chamadas de tiorredoxinas peroxidases, formam uma família de proteínas antioxidantes. Através da atividade peroxidase reduzem e detoxificam peróxido de hidrogênio, peroxinitrito e outros compostos orgânicos hidroperóxidos (Wood et al., 2003).
1.1.5. A possível função de Q4DV70
A proteína Q4DV70 não possui resíduos de cisteínas em sua seqüência e por isso não pode atuar como oxidorredutase de pontes dissulfeto. Sabe-se que diversas proteínas com enovelamento tiorredoxina apresentam outras funções independentes da atividade de formação, redução ou isomerização de pontes dissulfeto. Alguns exemplos estão descritos a seguir.
Em células de E. coli infectadas com bacteriófago T7, a tiorredoxina interage com a proteína do gene 5 do fago e forma um complexo que é essencial à atividade da DNA polimerase de T7. Foi mostrado que essa atividade não é afetada pela substituição das cisteínas por outros resíduos, ou seja, não depende da atividade oxidorredutase da tiorredoxina (Huber et al., 1986).
A proteína Trx80, uma forma truncada da tiorredoxina humana presente no sangue, apresenta efeitos mitogênicos sobre monócitos, através da indução da secreção de IL12. Essa função não depende da atividade oxidorredutase, já que mutação das cisteínas do motivo CXXC por serinas não afeta o efeito estimulatório da proteína (Pekkari et al., 2003).
estado nativo, através da criação de um microambiente que compete com as reações de agregação, impedindo que elas ocorram e levem a proteína a atingir um enovelamento incorreto.
Uma das formas de se observar atividade chaperona é através de ensaios de re-enovelamento in vitro. A proteína alvo é desnaturada em tampão contendo uréia ou guanidina e colocada para re-enovelar por diluição em tampão sem o agente desnaturante e na presença de diferentes concentrações da possível chaperona. A fração de proteína que re-enovelou é determinada através de ensaios de atividade específicos para a proteína alvo. Dessa forma, foi observado que as proteínas PDI, DsbA e DsbC são capazes de aumentar o re-enovelamento da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) uma proteína sem pontes dissulfeto (Cai et al., 1994; Zheng et al., 1997; Chen et al., 1999). A tiorredoxina de E. coli aumentou o re-enovelamento do receptor de galactose, uma proteína sem cisteínas (Kern et al., 2003).
As proteínas Wind de Drosophila melanogaster e sua homóloga de mamíferos ERp29 são membros da família PDI em que o motivo CXXC está ausente. Essas proteínas se localizam no RE e têm função de chaperona. ERp29 participa do enovelamento de proteínas secretadas (Ferrari et al., 1998). Wind participa do processamento de Pipe, uma enzima modificadora de proteoglicano transmembrana do complexo de Golgi (Sen et al., 2000). Foi observado que Wind apresenta um motivo CXXC em outra região da seqüência, porém este não reconstitui a atividade oxidorredutase ou isomerase de pontes dissulfeto (Ma et al., 2003).
A proteína Q4DV70 possui um peptídeo sinal de 30 resíduos na região N-terminal, como predito pelo programa SignalP 3.0 server (Emanuelsson et al., 2007). Dessa forma, a proteína poderia ser transportada para o RE, onde atuaria como chaperona para cadeias polipeptídicas nascentes, prevenindo-as da agregação e mantendo-as em conformações favoráveis ao seu correto enovelamento.
1.2. OBJETIVOS
O objetivo geral desse trabalho é caracterização estrutural da Q4DV70 de T. cruzi de forma a contribuir para a compreensão de sua função e importância para o patógeno.
Os objetivos específicos incluem:
• Coleta e processamento de dados de difração de cristais de Q4DV70;
• Resolução da estrutura por substituição molecular e refinamento do modelo;
• Análise da estrutura através de comparações com outras proteínas tiorredoxina-like; • Análise da expressão em T. cruzi através de western blot;
1.3. MATERIAL E MÉTODOS
1.3.1. Clonagem e expressão
A clonagem e expressão da Q4DV70 foram realizadas pelo técnico Leandro de Carvalho Viera, que trabalhava com a Profa. Dra. Beatriz Gomes Guimarães e o Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin Zanchin no LNLS. Os métodos utilizados estão descritos a seguir para melhor entendimento dos resultados posteriores.
A seqüência que codifica Q4DV70 foi amplificada por PCR sem o peptídeo sinal (resíduos A30-T153) a partir de DNA genômico de T. cruzi linhagem Dm28c usando os oligonucleotídeos Q4DV70F 5’ – CTGACATATGGCGTCAAATGTGGCAAATGAC – 3’ e Q4DV70R 5’ – TCAGATCTTCATGTGTTCTGAAAAACAAAACTG – 3’. O gene foi clonado nos sítios de restrição Nde I e Bam HI do vetor pET-TEV. Este plasmídeo é um pET28a (Novagen) no qual a seqüência codificadora do sítio de clivagem por trombina foi substituída pela seqüência do sítio de clivagem pelo domínio catalítico de 27 kDa da proteína de inclusão nuclear do tobacco etch virus, conhecido popularmente como protease TEV (Carneiro et al., 2006). O seqüenciamento mostrou que Y94 foi mutada para uma histidina, o que pode ser explicado por variabilidade genética das linhagens usadas no seqüenciamento genômico (T. cruzi CL Brener) e na amplificação de Q4DV70 (T. cruzi Dm28c).
Células competentes E. coli linhagem BL21(DE3)slyD- foram transformadas com pET-TEV/Q4DV70. Uma colônia foi incubada em 10 mL de meio de cultura Lúria Bertani (LB) líquido contendo canamicina (50 µg/mL) por 16 horas a 37ºC sob agitação de 200 rpm. Após esse período, a cultura foi diluída em 1 L de LB líquido contendo canamicina e continuou-se o cultivo
nas mesmas condições anteriores. Quando a densidade óptica em 600 nm (DO600nm) atingiu 0,8
adicionou-se à cultura o indutor isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para uma concentração final de 0,4 mM. Após 4 horas de indução as células foram coletadas por centrifugação a 6000 g por 15 minutos a 4ºC e mantidas a -20ºC até o momento da utilização.
1.3.2. Purificação
O estabelecimento do protocolo de purificação da proteína Q4DV70 foi realizado pela pós-doutoranda Dra. Melissa Regina Fessel, sob supervisão do Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin Zanchin. Os métodos utilizados estão descritos a seguir para melhor entendimento dos resultados posteriores.
As células foram ressuspendidas em 10 mL de tampão A (50 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 100 mM de NaCl, 5% (v/v) de glicerol) contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). Após incubação por 1 hora no gelo com 80 µg/mL de lisozima, as células foram lisadas por sonicação com 12 pulsos de 10 s, a intervalos de 1 min, usando amplitude de 40%, em equipamento Vibracell VCX 500 (Sonics & Materials, Inc.).
O sobrenadante, obtido por centrifugação a 20000 g por 30 minutos a 4ºC, foi submetido à cromatografia de afinidade a metal imobilizado (IMAC), em sistema ÄKTATM FPLCTM (GE Healthcare), usando coluna HiTrapTM Chelating de 5 mL (GE Healthcare), a um fluxo de 1 mL/min. A coluna foi carregada com solução 100 mM de NiSO4 e equilibrada com tampão A. A
A reação de clivagem da cauda de histidinas conteve: 0,26 mg/mL de proteína, 0,013 mg/mL de protease TEV, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) por 15 horas em temperatura ambiente. A reação foi parada com 0,01% (m/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) e aplicada em coluna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) equilibrada com 50 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 100 mM de NaCl e 5% (v/v) de glicerol. Essa cromatografia foi realizada em sistema ÄKTATM FPLCTM (GE Healthcare) com fluxo de 1 mL/min.
Outra IMAC foi realizada em coluna HiTrapTM Chelating HP de 5 mL (GE Healthcare) acoplada ao sistema ÄKTATM FPLCTM (GE Healthcare) com fluxo de 1 mL/min. A coluna foi lavada com 10 CV de tampão A e proteínas ligadas foram eluídas com gradiente linear de imidazol de 0 a 500 mM em 20 CV.
As frações das cromatografias foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Aquelas que continham a proteína de interesse foram juntadas, dialisadas contra 20 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl e 5% (v/v) de glicerol. A amostra foi concentrada pelo método de filtração usando Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter (Millipore) com poro de 10 kDa, o qual foi sumetido a centrifugação a 3220 g a 4ºC.
1.3.3. Cristalização
A cristalização da Q4DV70 foi realizada pela Dra. Melissa Regina Fessel.
Testes de cristalização foram realizados pelo método de difusão de vapor usando robô HoneyBee 963 (Genomic Solutions). Foram feitas gotas sentadas contendo 200 nL de Q4DV70 a 3 ou 6 mg/mL Q4DV70 e 200 nL de solução do reservatório. As gotas foram equilibradas contra 80 µL de solução do reservatório a 18ºC. Os kits utilizados foram: Crystal Screen e Crystal
Screen 2 da Hampton Research (Jancarik & Kim, 1991), Wizard Screens I e II da Emerald (Hol et al., 2005), PACT (Newman et al., 2005), JCSG (Page et al., 2003), SaltRx da Hampton Research (Gilliland et al., 1994; Kanaujia et al., 2007) e Precipitant Synergy (Majeed et al., 2003).
Cristais formando grupos de placas foram obtidos na condição 20% (m/v) de PEG 3350, 200 mM de tiocianato de sódio pH 6,9. A primeira otimização foi feita variando-se a concentração de tiocianato e PEG e a massa molecular do PEG. Foram feitas gotas sentadas contendo 1 µL de Q4DV70 a 4 ou 6 mg/mL e 1 µL de solução do reservatório, equilibradas contra 80 µL de solução do reservatório. A melhor condição obtida (25% (m/v) de PEG 1500, 200 mM de tiocianato de sódio pH 6,9) foi otimizada através da adição de aditivos dos kits Additive Screen I, II, III, (Hampton Research) usando gotas penduradas de 2,5 µL de Q4DV70 a 4 mg/mL, 2,0 µL de solução do reservatório e 0,5 µL de solução de aditivo, equilibradas contra 200 µL de solução do reservatório. Os melhores cristais foram obtidos na gota em que foi adicionado 100 mM de fenol como aditivo (concentração final de 10 mM).
1.3.4. Determinação do método de crioproteção para cristais
Foi testada a obtenção de cristais de Q4DV70 na presença de diferentes crioprotetores. Para isso, foram feitas gotas penduradas de 2,5 µL de Q4DV70 a 3, 4 ou 5 mg/mL, 2,0 µL de solução do reservatório (25% (m/v) de PEG 1500, 200 mM de tiocianato de sódio pH 6,9 e
10% (v/v) de glicerol resultaram em cristais que difrataram a alta resolução e não congelaram a 100 K.
1.3.5. Coleta e processamento de dados de difração
Os dados de difração foram coletados na linha de luz W01B-MX2 do LNLS usando detector MAR 225 CCD (Mar Research), através do software MarCCD (Mar Research). Foi utilizado o método de rotação, com varredura de 1º. Os cristais foram resfriados a 100 K com fluxo de nitrogênio gasoso (Oxford Nitrogen Cryojet XL). O processamento dos dados foi realizado no programa HKL-2000 (Otwinowski & Minor, 1997).
1.3.6. Substituição molecular e refinamento do modelo
O coeficiente de Matthews (Matthews, 1968) foi calculado utilizando-se 14894 Da como peso molecular da Q4DV70. A região V365-G484 da PDI de levedura (código PDB: 2B5E) foi utilizada como modelo de busca para o faseamento por substituição molecular. O modelo foi previamente modificado usando a opção last common atom do programa CHAINSAW (Stein, 2008) disponível no pacote CCP4 e átomos não-protéicos foram excluídos do arquivo de coordenadas atômicas.
A substituição molecular foi feita usando o programa MOLREP (Vagin & Teplyakov, 1997) do CCP4. O refinamento do modelo foi iniciado através de 2 ciclos de simulated annealing com dinâmica molecular cartesiana usando o programa CNS (Brünger et al., 1998 ). Seguiram-se vários ciclos de refinamento com o programa REFMAC5 usando parâmetros padrão (Murshudov et al., 1997) seguido de inspeção dos mapas de densidade eletrônica e construção manual do
modelo usando o programa COOT (Emsley & Cowtan, 2004). Durante esses ciclos moléculas de água foram adicionadas automaticamente pelo ARP/wARP implementado no REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) ou manualmente através do programa COOT (Emsley & Cowtan, 2004). As figuras de estrutura foram geradas com o programa PYMOL (DeLano, 2002).
1.3.7. Análise da expressão gênica por PCR
Os experimentos foram realizados pela Dra. Melissa Regina Fessel. Amostras de T. cruzi linhagem Y formas epimastigota e tripomastigota cedidas pelo Prof. Dr. Sérgio Shenkman foram utilizadas para extração do RNA total pelo método de Trizol. Os cDNAs foram preparados a partir dos RNAs com Kit CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante.
A reação para amplificação conteve 25 ng de DNA genômico ou 10 ng de cDNA, 1X PCR Buffer (Invitrogen), 0,2 mM de dNTP (Invitrogen), 12,5 pmol de cada oligonucleotídeo Q4DV70F e Q4DV70R, 2 de mM de MgCl2 (Invitrogen), 0,5 µL de Taq DNA Polimerase
(Invitrogen), para volume final de 25 µL. O equipamento utilizado foi GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems). O programa foi iniciado a 95ºC por 1 minuto, seguido por 30 ciclos de: 94ºC/1 min, 55ºC/1 min, 72ºC/2 min e finalizado a 72ºC por 7 minutos.
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel contendo 1,5% (m/v) de agarose em tampão TAE (40 mM de Tris-HCl, 5,7% (v/v) de ácido acético, 50 mM de EDTA) e 0,2 µg/mL
1.3.8. Análise da expressão protéica em T. cruzi por western blot
Amostras de T. cruzi linhagem Y formas epimastigota e tripomastigota foram cedidas pelo Prof. Dr. Sérgio Shenkman. As amostras totais haviam sido preparadas através da adição de tampão de amostra de SDS-PAGE 1X às células previamente centrifugadas e aquecimento por 5 min a 95ºC. As amostras solúveis haviam sido preparadas através de lise das células com tampão (1% (v/v) de Triton X-100, 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, coquetel de inibidores de protease), centrifugação, separação de pellet e sobrenadante, adição de tampão de amostra de SDS-PAGE 2X ao sobrenadante, aquecimento por 5 min a 95ºC.
Após a realização de SDS-PAGE, as amostras do gel foram transferidas para membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por 2 horas a 1 mA/cm2 de membrana em solução de transferência (16 mM de tricina, 48 mM de Tris, 0,37% (m/v) de SDS, 20% (v/v) de metanol). A membrana foi bloqueada com 2% (m/v) de leite em pó desnatado em tampão TBS (20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5) por 16 horas a 4ºC sob agitação. Após esse período foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente com anticorpo primário anti-Q4DV70 produzido em coelhos (Célula B) diluído 1:1000 em TBS contendo 1% (m/v) de leite. A membrana foi lavada por 3 vezes de 10 minutos em 50 mL de TBS. Foi feita incubação com anticorpo secundário conjugado a fosfatase alcalina (Anti-rabitt IgG Alkaline Phosphatase-Conjugated, Sigma Aldrich) diluído 1:5000 em TBS contendo 1% (m/v) de leite. A membrana foi lavada por 3 vezes de 10 minutos em 50 mL de TBS. A revelação foi feita incubando-se a membrana com 10 mL de TFA (100 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 9,5) contendo 66 µL
de NBT (Promega) e 33 µL de BCIP (Promega) por 3 a 10 minutos. Após esse período a membrana foi incubada com 50 mL de TBS contendo 10 mM de EDTA, que inibe a reação da fosfatase alcalina.
1.3.9. Teste de atividade chaperona no enovelamento da GAPDH
A GAPDH (E.C. 1.2.1.12) é uma enzima da glicólise, via metabólica que converte glicose em piruvato com produção de energia. Ela catalisa a conversão de gliceraldeído 3-fosfato em 1,3-bisfosfoglicerato, em uma reação de dois passos, com gasto de uma molécula de fosfato inorgânico e redução de NAD+ em NADH. A GAPDH foi utilizada como substrato em pelo menos três ensaios de atividade chaperona com proteínas que apresentam enovelamento tiorredoxina (Cai et al., 1994; Zheng et al., 1997; Chen et al., 1999), e por isso foi escolhida para o teste com a Q4DV70. A GAPDH foi usada nesses estudos por ser uma proteína que apresenta organização tetramérica (39 kDa cada monômero), baixa reativação após desnaturação, propensão a agregar em 1-2 M de guanidina e sem pontes dissulfeto (Cai et al., 1994).
Os experimentos com a Q4DV70 e a GAPDH de T. cruzi foram realizados no Instituto de Física de São Carlos – USP, em colaboração com a Ms. Tatiana Balliano e o Prof. Dr. Glaucius Oliva.
GAPDH a 5,46 mg/mL (140 µM) foi desnaturada com 3 M de hidrocloreto de guanidina por 8 horas a 4ºC na presença de 5 mM de DTT. Após esse período a proteína foi diluída 50 vezes em tampão contendo 5 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 20 mM de fosfato de potássio pH 7,0, na presença de diferentes concentrações da proteína Q4DV70, por 30 minutos a 4ºC seguido de 3 horas a 20ºC.
Foi subtraída a absorbância final da absorbância inicial em cada amostra. A fim de estimar a proporção de proteínas que foi re-enovelada em cada amostra, os resultados obtidos foram comparados com o valor obtido para a proteína nativa, que foi considerado 100%. Os experimentos foram realizados em triplicata e foi feita a média dos resultados para amostras correspondentes.
1.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1.4.1. Purificação da proteína Q4DV70
A proteína Q4DV70 foi expressa por 4 horas a 37ºC na fração solúvel em células E. coli BL21(DE3)slyD-. Como a proteína apresentava cauda de histidinas fusionada ao seu N-terminal, a amostra foi submetida à IMAC (coluna 1, figura 4). A proteína foi eluída da coluna com alto grau de pureza (coluna 2, figura 4) e teve sua cauda clivada com protease TEV (coluna 3, figura 4). A proteína apresenta peso molecular de 16,7 kDa com cauda de histidinas e de 14,9 após a clivagem da cauda. Para separação da Q4DV70 sem cauda da protease TEV e proteínas que não tiveram a cauda clivada, foram realizadas cromatografia de filtração em gel e IMAC (colunas 4 e 5, figura 4). O rendimento da purificação foi de 14 mg de proteína por litro de cultura. Essa proteína foi utilizada nos experimentos de western blot, re-enovelamento de GAPDH e cristalização na presença de crioprotetores.
M 1 2 3 4 5 14,4 kDa 35 kDa 25 kDa 45 kDa 66,2 kDa 116 kDa 18,4 kDa
clivagem da cauda de histidinas com protease TEV, 4 = Q4DV70 após filtração em gel, Q4DV70 no flowthrough da IMAC.
1.4.2. Análise da expressão gênica e protéica de Q4DV70 em T. cruzi
A expressão do gene que codifica Q4DV70 foi analisada através de PCR, usando oligonucleotídeos específicos e cDNA de fases epimastigota e tripomastigota de T. cruzi (figura 5).
Figura 5: Gel de agarose 1,5%. PCR com amostras de T. cruzi. Em (a) foram utilizados oligonucleotídeos
para Q4DV70. Em (b), foram utilizados oligonucleotídeos para o controle TcNek15. Amplificações a partir de DNA genômico (1, 4, 7, 11), cDNA (2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13), ou RNA (10, 14) obtidos a partir de forma epimastigota (EPI) ou tripomastigota (TRIPO) de T. cruzi. M = marcador de peso molecular.
Pode-se observar pela figura 5 que a seqüência de Q4DV70 foi amplificada a partir de cDNA de fase epimastigota, mas não de fase tripomastigota, o que está de acordo com a expressão diferencial do gene observada pelo Dr. Krieger e Dr. Goldenberg, que haviam realizado ensaios de microarranjo a partir de mRNA associado aos polissomos (resultados não publicados). A amplificação do controle TcNek15 a partir de cDNA das duas fases de T. cruzi
M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14
500 pb 400 pb 1000 pb
a)
b)
mostra que ambas as amostras de cDNA estavam intactas. A não amplificação de TcNek15 a partir das amostras de RNA mostra que estas amostras não estavam contaminadas com DNA genômico. Neks (NIMA-related kinase) são quinases envolvidas na regulação do ciclo celular. A Nek15 de T. cruzi (TcNek15) foi aqui mostrada como controle porque em seus estudos a Dra. Fessel observou que seu gene não é diferencialmente expresso.
Western blot foi realizado com amostras de T. cruzi na fase epimastigota ou tripomastigota, utilizando-se anticorpos policlonais específicos para Q4DV70, a fim de se demonstrar que os níveis de RNA correlacionam com os níveis da proteína (figura 6).
Figura 6: Western blot com amostras de T. cruzi usando anticorpos anti-Q4DV70. Em (a), SDS-PAGE
13%. Em (b), membrana de PVDF. C = amostra de Q4DV70 recombinante purificada, EPI = proteínas de epimastigota, TRIPO = proteínas de tripomastigota, TOTAL = proteínas solubilizadas em tampão de amostras de SDS-PAGE, SOLÚVEL = proteínas solubilizadas em tampão com detergente neutro.
C EPI TRIPO EPI TRIPO
SOLÚVEL TOTAL
Não houve tempo de realizar experimentos para demonstrar a localização celular da proteína durante essa tese. Isso deverá ser feito futuramente, possivelmente por imunohistoquímica.
1.4.3. Teste de atividade chaperona da Q4DV70 no re-enovelamento da GAPDH
O gráfico da figura 7 mostra a atividade recuperada por GAPDH submetida à desnaturação química e ao re-enovelamento por diálise na presença de Q4DV70 comparando-se com amostra da proteína nativa.
Figura 7: Atividade recuperada por GAPDH após desnaturação com hidrocloreto de guanidina e
re-enovelamento na presença de diferentes concentrações de Q4DV70.
Observa-se que aproximadamente 30% da atividade é recuperada por GAPDH desnaturada após a diluição na ausência de Q4DV70. Esse valor não aumenta na presença de concentrações crescentes de Q4DV70 e parece até diminuir em concentrações maiores que 42
µM. Esses resultados parecem indicar que Q4DV70 não aumenta o re-enovelamento de GAPDH
e, portanto, não poderia ser considerada uma chaperona dessa proteína.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 A ti v id a d e r e la ti v a Controle 0 µM 2,8 µM 5,6 µM 14 µM 28 µM 42 µM 56 µM 84 µM
Nos experimentos que demonstraram a atividade chaperona, obteve-se 23% de reativação com 30 µM de PDI (Cai et al., 1994), 12,5% com 30 µM de DsbA (Zheng et al., 1997) e 32% com 56 µM de DsbC (Chen et al., 1999). A proteína GAPDH utilizada nesses experimentos foi purificada de músculo de coelhos (Cai et al., 1994; Zheng et al., 1997; Chen et al., 1999), enquanto a GAPDH utilizada nos nossos experimentos é de T. cruzi expressa em bactéria. Testes realizados por Cai (Cai et al., 1994) mostram que a GAPDH apresenta maior reativação espontânea quanto menor a sua concentração durante o re-enovelamento, com cerca de 30% a 0,83 µM e 2% a 2,2 µM. Nos experimentos aqui realizados, a proteína foi re-enovelada em concentração de 2,8 µM e mesmo assim foi capaz de recuperar 30% da atividade espontaneamente. Já nos experimentos com PDI, DsbA ou DsbC, foi utilizada GAPDH a 2,8 µM, obtendo-se reativação espontânea de 2, 3,5 e 6%, respectivamente (Cai et al., 1994; Zheng et al., 1997; Chen et al., 1999). Isso poderia ser explicado por diferenças entre as duas GAPDH utilizadas.
1.4.4. Determinação da estrutura cristalográfica da Q4DV70
Os cristais da proteína Q4DV70, obtidos pela Dra. Melissa Regina Fessel, cresceram como grupos de placas partindo de um vértice comum, mesmo após serem realizados diversos ciclos de refinamento (figura 8).
Figura 8: Cristais da proteína Q4DV70.
Uma placa foi quebrada de um grupamento, obtido na condição 25% (m/v) de PEG 1500, 200 mM de tiocianato de sódio pH 6,9, 10 mM de fenol, e colocada diretamente no fluxo de nitrogênio gasoso a 100 K. Embora tenha se formado gelo na solução em que se encontrava o cristal (figura 9), ele difratou a mais de 1,8 Å e por isso foi coletado um conjunto de dados (Tabela 1).
Figura 9: Padrão de difração do cristal de Q4DV70 na presença de gelo, indicada pelos anéis escuros.
Tabela 1: Estatísticas de coleta e processamento de dados para cristal de Q4DV70 não crioprotegido. Valores em parênteses referem-se à camada de mais alta resolução.
Comprimento de onda (Å) 1,459
Distância do detector (mm) 100
Temperatura (K) 100
Imagens coletadas 360
Grupo espacial P212121
Parâmetros de célula unitária (Å) a=35,04 b=50,76 c=60,98 α=β=γ=90º
Mosaicidade (º) 0,4
Resolução (Å) 20,00-1,76 (1,82-1,76)
I/σ(I) 44,1 (8,2)
O processamento dos dados de difração mostrou que o sistema cristalino é ortorrômbico primitivo. Devido à ausência de reflexões pelos conjuntos de planos (h00), (0k0) e (00l) quando h, k e l, respectivamente, assumem valores ímpares, definiu-se que o cristal pertence ao grupo espacial P212121. Os parâmetros de célula unitária são a = 35,04 Å, b = 50,76 Å, c = 60,98 Å, α = β = γ = 90º. Os pontos na borda do detector estavam a 1,76 Å de resolução e apresentaram I/σ(I)
de 8,2 em média, o que indica que o cristal difratava a mais alta resolução. Os dados eram de boa qualidade, com Rmerge de 0,09, embora o conjunto apresentasse uma baixa completeza (81,4 %), o
que em parte pode ter ocorrido devido à formação de gelo.
O coeficiente de Matthews calculado foi de 1,82 Å3Da-1, compatível com 1 molécula por unidade assimétrica e 32,5% de conteúdo de solvente.
Através do programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) foi realizada busca por proteínas que apresentassem identidade de seqüência com a Q4DV70 e tivessem sua estrutura resolvida e depositada no Protein Data Bank (PDB). O domínio a’ da PDI de levedura (código PDB: 2B5E) apresentou a maior identidade com Q4DV70, de 28% (35 dos 127 resíduos que compõem a Q4DV70 sem a cauda de histidinas), e por isso foi escolhido como modelo para a substituição molecular.
A modificação prévia do modelo com o programa CHAINSAW (Stein, 2008) foi realizada para aumentar a chance de se obter uma solução correta, já que a substituição molecular seria difícil, visto que a identidade de seqüência é menor que 30%. A substituição molecular realizada com o programa MOLREP (Vagin & Teplyakov, 1997) gerou resultado bastante satisfatório, já que o contraste entre a solução correta e as soluções incorretas foi de 4,2. O Rfactor inicial foi de
0,623.
O refinamento através de simulated annealing foi realizado para retirada da tendência que vem do modelo utilizado para busca. Os ciclos de refinamento por modificação/construção do
modelo no COOT (Emsley & Cowtan, 2004), refinamento pelo REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) e adição de moléculas de água foram realizados até que o modelo convergisse para Rfree de
0,28 e Rfactor de 0,22.
Novos cristais foram obtidos na presença de crioprotetores, sendo que os melhores se formaram na presença de 10% (v/v) de etilenoglicol ou 10% (v/v) de glicerol. Uma placa foi quebrada de um grupamento obtido na condição 25% (m/v) de PEG 1500, 200 mM de tiocianato de sódio pH 6,9, 10 mM de fenol, 10% (v/v) de etilenoglicol e colocada diretamente no fluxo de nitrogênio gasoso a 100 K. O cristal não apresentou a formação de gelo (figura 10) e um conjunto de dados foi coletado e processado (Tabela 2).
Tabela 2: Estatísticas de coleta e processamento de dados para cristal de Q4DV70. Valores em parênteses referem-se à camada de mais alta resolução.
Comprimento de onda (Å) 1,459
Distância do detector (mm) 60
Temperatura (K) 100
Imagens coletadas 129
Grupo espacial P212121
Parâmetros de célula unitária (Å) a=35,04 b=50,32 c=61,18 α=β=γ=90º
Mosaicidade (º) 0,4 Resolução (Å) 20,00-1,50 (1,55-1,50) I/σ(I) 23,9 (4,7) Completeza (%) 99,1 (95,9) Multiplicidade 4,7 (3,5) Rmerge 0,07 (0,24) Reflexões 84522 Reflexões únicas 17813 (1619)
O segundo cristal pertence ao mesmo grupo espacial que o anterior, P212121, com
parâmetros de célula unitária iguais ou muito semelhantes: a = 35,04 Å, b = 50,32 Å, c = 61,18 Å, α = β = γ = 90º. A coleta foi feita até a resolução máxima de 1,50 Å, com I/σ(I) de 4,7 na última camada de resolução. Os dados eram de boa qualidade, com Rmerge de 0,07 e este conjunto
apresentou completeza próxima de 100%.
Os dados do novo conjunto foram utilizados para o refinamento do modelo, com o cuidado de manter as mesmas reflexões para o cálculo do Rfree. No final do refinamento, o
modelo apresentou Rfactor de 0,18 e Rfree de 0,22, com 90% da cadeia polipeptídica construída
(resíduos 13-127), 116 moléculas de água e 1 molécula de tiocianato. Além disso, 92,3% dos resíduos apresentam-se nas regiões mais favorecidas do plot de Ramachandran e 7,7% nas regiões permitidas adicionais (dados obtidos com o programa Procheck, Laskowski et al., 2003). O rmsd para comprimentos de ligação é de 0,026 Å e o rmsd para ângulos de ligação é de 2,158º.
O fator B médio observado é de 12,59 Å2 e o calculado pelo Wilson Plot foi de 16,90 Å2. A estrutura da proteína Q4DV70 foi depositada no PDB sob o código 3H79.
1.4.5. Análise da estrutura cristalográfica da Q4DV70
1.4.5.1. O enovelamento tiorredoxina
A estrutura da Q4DV70 é formada por uma folha β de 5 fitas com 2 hélices α de cada lado da folha. Os elementos de estrutura secundária estão arranjados na ordem: β-α-β-α-β-α-β-β-α (figura 11).
Figura 11: Representação esquemática da estrutura de Q4DV70 e resíduos envolvidos na formação de
cada tipo de estrutura secundária.
A fim de comparar a estrutura de Q4DV70 com outras proteínas tiorredoxina-like, foi realizada a superposição no programa COOT (Tabela 3).
α
3
β
1
β
3
β
2
β
4
β
5
α
1
α
2
α
4
90º β1 α1 β2 α2 β3 α3 β4 β5 α4Tabela 3: Superposição de proteínas com enovelamento tiorredoxina na Q4DV70
Proteína Organismo Código PDB N
o
de resíduos
alinhados* Identidade* Rmsd*
PDI (a’) S. cerevisiae 2B5E_A 104 32% 1,4 Å
Wind D. melanogaster 1OVN_A 103 18% 1,6 Å
ERp29 H. sapiens 2QC7_A 101 13% 1,6 Å
Tiorredoxina E. coli 2TRX 100 15 % 1,6 Å
Tiorredoxina H. sapiens 1ERT 101 18 % 1,9 Å
DsbA E. coli 1FVK_A 74 10% 2,0 Å
DsbC E. coli 1EEJ_A 76 9% 2,4 Å
Peroxirredoxina H. sapiens 2VL2 85 6% 2,4 Å
Glutationa
peroxidase H. sapiens 2I3Y_A 91 9% 2,6Å
Glutarredoxina S. scrofa 1KTE_A 83 8% 3,3 Å
GST H. sapiens 1AQW_A 61 11% 3,5 Å
* Número de resíduos alinhados, identidade e rmsd calculados pelo programa COOT.
A superposição de proteínas da família PDI (PDI, Wind e ERp29) e tiorredoxinas na Q4DV70 é semelhante (rmsd de 1,4 a 1,9 Å). Já a identidade de seqüência de Q4DV70 é muito maior com o domínio a’ da PDI (32%) do que com as outras proteínas (até 18%).
A superfície eletrostática de Q4DV70 foi comparada com a de algumas proteínas da Tabela 3 (figura 12).
Figura 12: Superfície eletrostática de proteínas com enovelamento tiorredoxina, colorida de acordo com a
carga, do vermelho (-) para o azul (+). As estruturas foram previamente superpostas na Q4DV70 e está mostrada a face que contém o motivo tiorredoxina. As cisteínas desse motivo, ou resíduos correspondentes, estão apontadas pelas setas verdes.
