Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
BÁRBARA ALVES PORTO
Caracterização de fungos presentes em solos sulfetados da Antártica
e sua avaliação para estudos emprocessos de biolixiviação de metais
BELO HORIZONTE
2020
BÁRBARA ALVES PORTO
Caracterização de fungos presentes em solos sulfetados da Antártica
e sua avaliação para estudos em processos de biolixiviação de metais
Dissertação de mestrado apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas para obtenção do título de Mestre em Microbiologia.
Orientador: Dr. Luiz Henrique Rosa
Laboratório de Microbiologia Polar e Conexões Tropicais Departamento de Microbiologia/ICB
Universidade Federal de Minas Gerais
BELO HORIZONTE
2020
Ms. Thamar Holanda
Laboratório de Microbiologia Polar e Conexões Tropicais
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais
Dr. Carlos Augusto Rosa
Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Leveduras Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais
Dr. Fábio Soares de Oliveira Ms. Mariana de Resende Machado Laboratório de Geomorfologia
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe
pessoas.
Agradeço primeiramente ao meu orientador Professor Luiz Henrique Rosa, pela oportunidade, empenho, paciência para ensinar, competência e amor pelo que faz e sempre me orientou muito bem desde quando entrei no laboratório como aluna de iniciação científica.
Agradeço a minha colaboradora Thamar Holanda pela paciência, dedicação, e compromisso durante os dois anos de mestrado, admiro muito sua vocação científica, sempre tentando desvendar os mistérios e desafios que surgem ao longo do caminho e agradeço por me corrigir quando necessário.
Agradeço aos colaboradores Fábio e Mariana, pelo apoio com as análises de solos, demonstrando o quão interligadas são áreas relacionadas ao meio ambiente.
Agradeço o apoio dos meus amigos de laboratório de fungos da UFMG que sempre estavam ali para dividir os desafios e também comemorar as alegrias ao longo do trajeto.
Agradeço aos funcionários Débora e Thiago por serem prestativos, comunicativos e sempre dispostos a resolver toda parte burocrática, e a todo o Departamento de Microbiologia da UFMG por me proporcionarem um ambiente de aprendizado e troca de conhecimento.
Aos meus amigos mais próximos pelo apoio quando eu mais precisei e pelos momentos de distração e lazer que fizeram parte do processo.
A equipe de judô Arrasta Judô CTE - UFMG que me acolheu quando eu mais precisei de apoio e treinamento da mente e do corpo.
Agradeço as agências financiadoras CNPq, CAPES e FAPEMIG pelo suporte financeiro. Agradeço a Deus, pois tornou possível a realização de mais um sonho.
Agradeço também a mim mesma por reconhecimento de toda a dedicação, determinação, superação, resiliência e por acreditar que é possível.
Quero agradecer com muito carinho especialmentea minha família, em especial meu pai Elviro, minha mãe Nanci, meu irmão Arthur e minha vó Vitória, que são minha base para tudo na vida, por me apoiarem sempre e serem meu alicerce forte e inatingível, com eles me fortaleci e consegui fazer do trabalho a seguir inédito.
E por fim, agradeço às Professoras Viviane, Mariana e Iara por aceitarem participar da banca examinadora, contribuindo positivamente para o estudo.
radiação solar e fortes ventos em seus diferentes ecossistemas. Na Antártica ocorrem solos com diferentes características físico-químicas, os quais representam interessantes micro-habitats que abrigam micro-organismos. Dentre os solos antárticos, destacam-se os sulfetados (conhecidos 5
como yellow points) que se formam por afloramentos de sulfetos com caráter ácido e oligotrófico. Entre os micro-organismos presentes na Antártica, os fungos se sobressaem pela sua alta capacidade adaptativa, tolerando condições extremas e colonizando os habitats e substratos variados, incluindo os solos sulfetados presentes na região. Entretanto, a composição da diversidade da comunidade de fungos presente nestes solos ainda é pouco conhecida. Dentro do 10
reino Fungi, algumas espécies se destacam pela habilidade de serem acidófilos, além de produzirem diferentes ácidos orgânicos de interesse para aplicação na biometalurgia como os processos de biolixiviação de metais de interesse industrial. A partir do exposto, este estudo teve como objetivo caracterizar a diversidade de fungos cultiváveis presentes em solos sulfetados localizados na Península Keller, coletados em 5 pontos da Ilha Rei George, Antártica e avaliá-los 15
para futuros estudos de biolixiviação de metais. Os solos sulfetados foram diluídos a 10-2 e 100 μL da diluição foram inoculados em três meios: ágar Extrato de Malte-Extrato de Levedura (YM) com Cloranfenicol, meio rico em nutrientes, Dichloran Glicerol Agar (DG18) Cloranfenicol, meio xerofílico e Ágar Dichloran Rosa de Bengala Cloranfenicol Base (DRBC), meio seletivo para fungos, e incubados a 15 °C por até 60 dias. Após purificação, as colônias fúngicas foram 20
agrupadas morfologicamente, e molercularmente por amplificação das regiões microsatélite, para posterior identificação utilizando técnicas de biologia molecular. Oitenta e cinco isolados no total, sendo 74 fungos filamentosos e 11 leveduras foram obtidos. Os fungos filamentosos foram identificados como pertencentes a 18 espécies. As mais abundantes foram Mortierella amoeboidea, Mortierella globalpina, Mortierella turficola, Penicillium chrysogenum, Penicillium 25
rubens. As leveduras foram identificadas como Leucosporidium creatinivorum, Leucosporidium sp. e Rhodotorula mucilaginosa, dentre estas a mais abundante foi L. creatinivorum. Foram realizados ensaios de crescimento em diferentes pH’s (3,7, 9) e a diferentes temperaturas (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 °C). Noensaio de tolerância a diferentes faixas de pH, 76 fungos apresentaram crescimento satisfatório nos pHs 3, 7 e 9. Faixas de pH ácidos são importantes em 30
processos de biolixiviação e pH alcalinos são utilizados em etapas de reações químicas industriais, portanto, é necessário a busca de fungos que cresçam bem nos três diferentes pH. Todos os fungos também foram avaliados quanto a sua capacidade de crescer em diferentes temperaturas (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ºC), os quais as espécies Hyaloscypha hepaticicola, M. amoeboidea, M. globalpina,
sp.3, M. turficola, Pseudogymnoascus destructans, R.mucilaginosa e duas espécies de leveduras não identificadas cresceram bem até 25 ºC; e as espécies Leptobacillium leptobactrum, M.turficola, Pseudogymnoascus destructans e Antarctomyces psychrotrophicus que cresceram apenas em temperaturas mais frias até os 20 ºC. Os fungos H. hepaticicola, Leptobacillium 40
leptobactrum, M. turficola, P.chrysogenum, P. rubens, Periconia prolifica, P. destructans, L. creatinivorum, Leucosporidium sp. e R. mucilaginosa foram capazes de crescer em pH 3 e também apresentaram perfis de crescimento acentuado para temperaturas altas até 35 ºC e, por isso, considerados promissores para futuros estudos de biolixiviação de metais de interesse, tendo em vista que pH ácidos e temperaturas mesofílicas são comumente utilizadas em processos 45
industriais. No ensaio de biolixiviação utilizando um complexo rejeito de mineração, P. chrysogenum UFMGCB17938 biosorveu Estrôncio e Zinco que são metais de que podem ser retirados em beneficiamento de rejeitos, sendo o zinco importante anticorrosivo industrial e utilizado na fabricação de ligas e o Estrôncio quando associado a compostos carbonatados, pode ser usado para fixar CO2 sob forma de carbonatos em concentrados de mineração. (Sr e Zn). 50
Quanto a biolixiviação do Ferro e Manganês (metais mais abundantes no rejeito) apesar de não ter atingido valores altos, os resultados dos índices foram significativos para futura otimização do processo. Sendo Ferro e Manganês importantes para indústria extrativa, possuindo grande valor comercial para indústrias siderúrgicas. A partir dos conjuntos de dados obtidos, fungos acidófilos e mesofílicos presentes nos solos sulfetados da Antártica tem potencial para serem explorados 55
como organismos capazes de atuar em processos de biolixiviação de metais de interesse na indústria mineral.
radiation and strong winds in its different ecosystems. In Antarctica there are soils with different 60
physical and chemical characteristics, which represent interesting microhabitats that house micro-organisms. Among the Antarctic soils, sulfurates (known as yellow points) stand out, which are formed by outcrops of sulfides with an acid and oligotrophic character. Among the microorganisms present in Antarctica, fungi stand out for their high adaptive capacity, tolerating extreme conditions and colonizing varied habitats and substrates, including the sulphide soils 65
present in the region. However, the composition of the diversity of the fungi community present in these soils is still poorly understood. Within the Fungi kingdom, some species stand out for their ability to be acidophils, in addition to producing different organic acids of interest for application in biometallurgy such as the metal bioleaching processes of industrial interest. Based on the above, this study aimed to characterize the diversity of cultivable fungi present in sulfide soils 70
located on the Keller Peninsula, collected at 5 points on King George Island, Antarctica and to evaluate them for future studies of metal bioleaching. The sulfide soils were diluted at 10-1 and 100 μL of the dilution were inoculated in three media: Malt Extract-Yeast Extract (YM) with Chloramphenicol, medium rich in nutrients, Dichloran Glycerol Agar (DG18) Chloramphenicol, xerophilic medium and Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Base Agar (DRBC), selective 75
medium for fungi, and incubated at 15 °C for up to 60 days. After purification, the fungal colonies were grouped morphologically, and molecularly by amplification of the microsatellite regions, for further identification using molecular biology techniques. Eighty-five isolates in total, 74 filamentous fungi and 11 yeasts were obtained. Filamentous fungi were identified as belonging to 18 species. The most abundant were Mortierella amoeboidea, Mortierella globalpina, Mortierella 80
turficola, Penicillium chrysogenum, Penicillium rubens. Yeasts were identified as Leucosporidium creatinivorum, Leucosporidium sp. and Rhodotorula mucilaginosa, the most abundant of which was L. creatinivorum. Growth tests were performed at different pH's (3,7,9) and at different temperatures (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 °C). In the tolerance test to different pH ranges, 76 fungi showed satisfactory growth at pHs 3, 7 and 9. Acid pH ranges are important in alkaline pH 85
and bioleaching processes are used in industrial chemical reaction steps, therefore, it is necessary to search for fungi that grow well at three different pH levels. All fungi were also evaluated for their ability to grow at different temperatures (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 °C), which species Hyaloscypha hepaticicola, M.amoeboidea, M. globalpina, M. turficola , P. chrysogenum and P. rubens grew in a wide range of temperatures from 5 to 35 ºC; L. creatinivorum, Leucosporidium 90
psychrotrophicus that grew only in colder temperatures up to 20 ºC. The fungi H. hepaticicola, Leptobacillium leptobactrum, M. turficola, P. chrysogenum, P. rubens, Periconia prolifica, P. 95
destructans, L. creatinivorum, Leucosporidium sp. and R. mucilaginosa were able to grow at pH 3 and also showed marked growth profiles for high temperatures up to 35 ºC and, therefore, considered promising for future studies of metal bioleaching of interest, considering that acidic pH and mesophilic temperatures are commonly used in industrial processes. In the bioleaching assay using a mining tailing complex, P. chrysogenum UFMGCB17938 absorbed Strontium and Zinc, 100
which are metals that can be removed for the processing of tailings, zinc being an important industrial anticorrosive and used in the manufacture of alloys and Strontium when associated with carbonated compounds, can be used to fix CO2 in the form of carbonates in mining concentrates. (Mr and Zn). Regarding the bioleaching of Iron and Manganese (metals most abundant in the tailings), despite not having reached high values, the results of the indices were significant for 105
future optimization of the process. Iron and Manganese are important for the extractive industry, and have great commercial value in steel industries.
Blast - Basic Local Alignment Search Tool CTAB - Brometo de Cetil Trimetilamônio
110
cmolc dm-³ - Centimol de carga por decímetro cúbico dag Kg-1 - Decagrama por quilograma
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA -Ácido Desoxirribonucleico
EDTA - Ácido etilenodianimo tetra-acético
115
ITS - Região transcrita interna L - Litro
MEGA - Molecular Evolutionary Genetics Analysis min - Minutos
mL - Mililitro
120
mm - Milímetro mM - Micromolar g L-1 - Gramas por litro mg L-1 - Miligramas por litro mg mL-1 - Miligramas por mililitro 125
mol L-1 - Mol por litro ng - Nanograma
ng L-1 - Nanograma por litro nm - Nanômetros
⁰C - Graus Celsius
130
OPERANTAR 34 - Operação Antártica 34 PCR - Reação em Cadeia de Polimerase pH - Potencial hidrogeniônico
PROANTAR - Programa Antártico Brasileiro p/v - Concentração peso por volume
135
RNA - Ácido ribonucleico rpm - Rotações por minuto S - Segundos
Taq polimerase – Thermus aquaticus polimerase UFC g-1 - Unidades Formadoras de Colônia. 140
μg - Micrograma μL - Microlitro(s)
μmol μL-1- Micromol por microlitro(s) 145
Península Antártica. B. Ilhas Shetland do Sul. C. Península Keller com suas áreas sulfetadas. Fonte: MACHADO, M.R. Assinaturas pedo-geomorfológicas da transição para-periglacial na Antártica Marítima e suas consequências para a evolução da paisagem. Tese de Doutorado em 150
geografia, UFMG, 2019. No
prelo...25
Figura 2. Amostras de solos sulfetados, conhecidos como yellow points, localizados na Península
Keller, Rei George, Antártica A = ponto 1 (AS1), B = ponto 2 (AS2), C = ponto 3 (AS3), D =
ponto 4 (AS4) e E = ponto 5 (AS5). Fotos: Fábio
155
Oliveira...26
Figura 3. Porcentagem de isolados fúngicos obtidos a partir do processamento dos solos
sulfetados da Península Keller, Ilha Rei George,
Antártica...40
Figura 4. Número de isolados por ponto e por meio de cultura. YM: ágar Extrato de
Malte-160
Extrato de Levedura; DRBC: ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol Base; DG18: ágar
DG18 Dicloran
Glicerol...41
Figura 5. Diagrama de Venn representando táxons fúngicos obtidos dos 5 pontos amostrais dos
solos sulfetados da Península Keller, Ilha Rei George,
165
Antártica...44
Figura 6. Dendrograma do perfil de similaridade de Sorensen (A) e Bray-Curtis (B) entre as
assembleias fúngicas dos cinco solos sulfetados amostrados na Península Keller, Ilha Rei George, Antártica...49
Figura 7. Curva de rarefação utilizando o índicede Mao Tau das assembleiasfúngicas isoladas de
170
cinco solos sulfetados amostrados na Península Keller, Ilha Rei George, Antártica...49
obtidas...27
Tabela 2. Fungos obtidos nos solos sulfetados da Península Keller, Ilha Rei George, Antártica e
identificados por comparação de sequências com a correspondência no BLASTn e banco de dados
NCBI Gen Bank
database*...42 180
Tabela 3. Índices de diversidade (Fisher’s α), riqueza (Margalef’s) e dominância (Simpson’s) de
acordo com a comunidade de fungos obtida dos cinco solos sulfetados da Península Keller, Ilha Rei George, Antártica e Análise química de rotina (Mariana Machado, IGC, Maio 2019) ...47
Tabela 4. Carbono Orgânico nas Frações da Matéria Orgânica dossolos sulfetados de Keller e
185
Fração Granulométrica dos perfis analisados (Mariana Machado, IGC, Maio 2019) ...48
Tabela 5. Crescimento dos fungos em diferentes faixas de pH durante 21 dias de crescimento a
15°C... 50
190
Tabela 6. Crescimento dos fungos em diferentes faixas de temperatura durante 21
dias...52
Tabela 7. Análise do bioensaio de biolixiviação por Espectrometria de EmissãoÓpticacom Plasma
Acoplado indutivamente
(ICP-OES)...55 195
ABSTRACT ... 10
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA ... 12
LISTA DE FIGURAS ... 14 LISTA DE TABELAS ... 15 1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ... 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 17 2.1 Ecossistemas antárticos ... 17 2.2. Solos antárticos ... 17
2.3 Solos sulfetados na Antártica ... 19
2.4 Diversidade de fungos na Antártica ... 20
2.5 Fungos presentes em solos da Antártica ... 22
2.6 Fungos acidófilos em processos de biolixiviação de metais ... 23
3 OBJETIVO ... 25
3.1 Objetivo geral ... 25
3.2 Objetivos específicos ... 25
4MATERIAL E MÉTODOS ... 26
4.1 Área de estudo e obtenção de amostras... 26
4.2 Análises físico-químicas do solo ... 27
4.3 Processamentos das amostras e isolamentos dos fungos ... 28
4.4 Identificação de fungos ... 29
4.4.1 Fungos filamentosos ... 29
4.4.2 Leveduras ... 32
4.4.3 Purificação dos amplicons ... 34
4.4.4 Reações de Sequenciamento ... 34
4.4.5 Análise Computacional das sequências ... 35
4.5 Análise de diversidade ... 35
4.5 Ensaio de crescimento em diferentes pH ... 37
4.6 Ensaio de termotolerância ... 38
4.7 Padronização do ensaio debiolixiviação ... 39
4.7.1 Pré-tratamento do rejeito ... 39
4.7.2 Ensaio de esterilidade do rejeito de minério de ferro ... 39
4.7.3 Ensaios de biolixiviação ... 39
4.8 Análise por espectometria de emissão óptica acoplado com plasma indutivamente (ICP-OES) ... 40
5.3 Análise físico-química dos solos sulfetados ... 46
5.4 Diversidade da comunidade fúngica dos solos sulfetados ... 47
5.4 Ensaio de crescimento em diferentes faixas de pH ... 50
5.5 Ensaio de crescimento em diferentes temperaturas ... 52
5.6 Ensaios de biolixiviação ... 54
6 DISCUSSÃO ... 56
6.1 Identificação, distribuição e diversidade dos táxons ... 56
6.2 Ensaio de crescimento em diferentes faixas de pH ... 59
6.3 Ensaio de termotolerância ... 61 6.4 Ensaio de biolixiviação ... 62 7 CONCLUSÃO ... 64 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 65 9 PRODUÇÃO ACADÊMICA ... 73 10 FINANCIAMENTO ... 73
1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A Antártica representa um ambiente singular por ser caracterizada pelo isolamento geográfico e climático, baixas temperaturas, baixa disponibilidade de água, fortes ventos e alta incidência de radiação ultravioleta, condições estas consideradas extremas e limitantes à vida 200
(ROSA et al., 2019). Entretanto alguns micro-organismos, em especial os fungos habitam os diferentes ecossistemas antárticos e são capazes de resistir, sobreviver e colonizar diferentes habitats sob condições extremas (RUISI et al., 2007). Além disso, muitos destes fungos possuem potencial na produção de diferentes substâncias de interesse biotecnológico (ROSA et al., 2019).
Substratos como os solos podem abrigar uma infinidade de micro-organismos. Um tipo 205
especial de solos, denominados solos sulfetados, ocorre na Antártica em regiões denominadas de yellow points, devido a coloração amarelo-laranja produzida por reações de oxidação de sulfetos contidos em rochas que formam esses solos (DO VALE LOPES et al., 2019). De acordo com Simas et al. (2006), esse tipo de solo é considerado extremo por ser oligotrófico, ácido, com pouca disponibilidade de nutrientes e altas concentrações de sulfetos. Cao et al. (2015) apontam que 210
partículas contendo sulfetos podem afetar tanto a biota do solo quanto atividades enzimáticas, resultando em mudanças na estrutura do solo, ciclagem de nutrientes e decomposição da matéria orgânica. Devido a estas condições poliextremófilas, este tipo de substrato pode revelar uma rara comunidade de fungos acidófilos capazes de sobreviverem a elevadas concentrações de sulfetos. Além disso, de acordo com Lima et al. (2008), fungos acidófilos podem consumir sulfetos do 215
solo e os converter em ácido sulfúrico, o que acaba tornando solúveis os minerais de interesse econômico e estespodem ser recuperados posteriormente por meio de processos de biolixiviação.
A composição da comunidade de fungos em solos sulfetados da Antártica ainda é incipiente, o que demonstra uma relevância deste estudo em termos de diversidade e 220
bioprospecção. Até o momento, apenas dois trabalhos encontraram fungos cultiváveis em solos sulfetados na Antártica. Gomes et al. (2018),em um único sítio de coleta de solo sulfetado na Ilha Rei George, Península Keller, identificaram sete táxons.Wentzel et al. (2018) identificaram em dois pontos, também da Ilha Rei George, 13 táxons. Destes dois trabalhos, nenhum deles teve o objetivo específico de indentificar a diversidade fúngica de solos sulfetados, da Antártica. Desta 225
forma, o presente trabalho abrange uma amostragem mais significativa com cinco sítios de coleta de solos sulfetados em regiões distintas da Península Keller na ilha Rei George. Este tipo de estudo utilizando fungos de solos sulfetados da Antártica como potenciais biolixiviadores de metais é considerado pioneiro.
A busca de fungos biolixiviadores na Antártica é de grande relevância, pois podem existir 230
linhagens não descritas que possuem vias metabólicas e bioquímicas desconhecidas (DE MENEZES, et al., 2016), com capacidade de produzir subtâncias biolixiviantes de metais como ácidos orgânicos, que serviriam de protótipo para processos em escala industrial de biolixiviação de metais. Nesse contexto, no mercado mundial, o valor dos metais tem aumentado e as empresas têm investido em formas alternativas de recuperação de metais de rejeito de mineração (RUSSO, 235
M.L.C, 2007), visto que os rejeitos causam grandes danos ambientais e também grandes perdas de metais. Com isso, processos de biolixiviação utilizando micro-organismos como os fungos, como catalisadores desses processos, pode ser uma alternativa amigável e eficiente em indústrias minerais. Diante do exposto, o trabalho descrito tem relevância e se justifica por ser o primeiro modelo de metodologia para aplicações futuras utilizando fungos de solos sulfetados da Antártica 240
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Ecossistemas antárticos
O continente Antártico constitui cerca de 10% da área continental do planeta, aproximadamentede 14 milhões de km2, o equivalente a 1,6 vezes a área total do Brasil (DE 245
MATTOS, 2016). Aproximadamente 98% do continente estão cobertos de gelo e neve durante todo o ano, com uma espessura média de 2 km que, em algumas regiões, pode ultrapassar 4,8 km (FRANCELINO & SCHAEFER, 2004). No inverno, pelo congelamento dos mares em sua volta, esta área congelada aumenta para cerca de 32 mil km2 (TURNER et al., 2014).
As temperaturas médias anuais variam de -32 ºC (verão) a -65 ºC (inverno), sendo que uma 250
das menores já registradas foi de -93,2 ºC no Platô Antártico Oriental (NASA, 2013). Na Antártica verifica-se uma alta incidência de radiação ultravioleta, fortes ventos, baixas temperaturas e uma constante dinâmica de congelamento e degelo (FELL et al., 2006; GONÇALVES et al.,2012), que influenciam fortemente a presença da biota residente na região (GOCHEVA et al., 2006; FOUTAIN et al., 2016). Tais condições podem abrigar uma microbiota extremamente adaptada a 255
severas limitações de água e nutrientes que estruturam todo o ecossistema Antártico (BARRETT et al., 2008). Além disso, os micro-organismos ali presentes possuem alta resiliência para sobreviver em diferentes condições extremas (FOUNTAIN et al., 2016).
2.2. Solos antárticos
260
O solo pode ser definido como um sistema complexo, dinâmico e vivo (BUSCOT, 2005). A complexidade do solo é determinada por numerosas e diversas interações entre os seus componentes biológicos, químicos e físicos, apresentando uma variedade de micro-habitats (TORSVIK & OVREAS, 2002; BUSCOT, 2005; ZHANG & XU, 2008). Toda sua gênese, funcionalidade e dinâmica frenteao ambiente em que se insere estão expressas nas características e 265
atributos herdados dos cinco fatores responsáveis por sua formação, sendo eles (i) o material de origem (rochas ou sedimentos), (ii) o clima, (iii) seu posicionamento no relevo, (iv) os organismos e (v) o tempo; todos interagindo com intensidades e frequências diferentes ao longo do tempo (VAN, 2019).
Os solos antárticos estão entre os mais frios e secos do planeta e possuem características 270
intrínsecas da região (BURTSON et al., 2016), os quais estão sob influência de condições ambientais descontínuas (TORSVIK & OVREAS, 2002; BUSCOT, 2005; ZHANG &XU, 2008). Apresentam distintos atributos físicos e químicos, e a maioria dos solos é oligotrófico (GODINHO et al., 2015), além de sofrerem mudanças drásticas na temperatura e alta incidência de radiação solar (TOSI et al., 2005). A formação do solo na Antártica ocorre principalmente nas áreas livres 275
de gelo, o que corresponde a apenas 0,18% da área continental e marinha adjacente (BURTSON et al., 2016). As áreas no interior do continente e península são mais secas e frias e menos favoráveis à formação dos solos, enquanto a Antártica Marítima, que corresponde à Península e ilhas adjacentes, é um pouco mais úmida e, por isso, mais oportuna ao desenvolvimento dos solos e da colonização biológica (SIMAS et al.,2008). Assim, interações entre os solos e organismos nesta 280
região tem sido objeto de interesse científico (SIMAS et al., 2008).
Os diversos tipos de solos da Antártica constituem tanto a porção continental quantoaporção marítima (BEYER & BOLTER, 2002). As áreas continentais são extremamente frias e secas e o clima é responsável pelo desenvolvimento incipiente do solo (CAMPBELL & CLARIDGE, 1987, 2004a, 2004b; SIMAS et al., 2006). Em contrapartida, solos da Antártica 285
marítima apresentam temperatura mais amenas, maior disponibilidade de água líquida, presença generalizada de ninhais de aves marinhas, maior desenvolvimento da vegetação, maior atividade microbiana, resultando em intemperismo químico mais acentuado (DO VALE LOPES et al., 2017) e maior desenvolvimento dos solos (SIMAS et al., 2006). A compreensão da formação de solos em áreas marítimas ainda é limitada e demanda investigações científicas mais aprofundadas. 290
A maioria dos solos na Antártica marítima se desenvolve a partir de sedimentos depositados nos ambientes costeiros, de rochas ígneas vulcânicas ou intrusivas (SIMAS et al., 2008). Isso porque as ilhas que formam os arquipélagos são produtos de atividades magmáticas ao longo das ilhas (NAYAS et al., 2008). Algumas delas também apresentam rochas sedimentares antigas, cretáceas, que podem dar origem a solos. Essas são, porém, espacialmente menos 295
expressivas que as rochas ígneas (SIMAS et al., 2008). Buscando agrupar os tipos de solos que ocorrem na Antártica marítima, Simas et al. (2008) propuseram três categorias: (i) solos afetados por ciclos de congelamento e descongelamento (com ou sem permafrost); (ii) solos ornitogênicos e (iii) solos sulfetados. O primeiro grupo incorpora os solos submetidos à ação do gelo por meio de diversos processos tipicamente periglaciais (SLAYMAKER, 2011), como crioclastia 300
(fragmentação física das rochas por efeito do congelamento e descongelamento) e crioturbação (revolvimento de partículas pela ação do gelo, podendo promover a orientação (frostjacking) dessas e a separação entre partículas grossas e finas (frostsorting) (SIMAS et al., 2008). Esses processos podem estar ligados à presença do solo permanentemente congelado (oupermafrost), que é uma condição térmica na qual a temperatura do solo permanece abaixo de 0 oC por no 305
mínimo dois anos consecutivos; sendo que isso deve ocorrer até dois metros de profundidade. Os chamados solos ornitogênicos, segundo grupo, sofrem forte influência da presença de aves marinhas e contém elevada biodiversidade e biodisponibilidade de nutrientes (SIMAS et al.,2008). São solos que receberam o aporte de guano (excremento acumulado de aves marinhas),
principalmente de pinguins, petréis e skuas e, por isso, foram enriquecidos com fósforo, tornando-310
os importante estoque de nutrientes para o estabelecimento e expansão da colonização biológica. Por fim, o terceiro grupo, objeto de investigação neste estudo, corresponde a um grupo de solos que representam o maior grau de intemperismo químico da Antártica (SIMAS et al., 2006).
2.3 Solos sulfetados na Antártica
315
Em algumas áreas da Antártica marítima ocorrem afloramentos contendo intrusões de rochas enriquecidas em sulfetos, principalmente pirita e arsenopirita, as quais são formadas por processos hidrotermais e o seu intemperismo dá origem a solos ácidos-sulfetados (SIMAS et al., 2006). Como o intemperismo das rochas sulfetadas formam solos com cores amareladas e avermelhadas que podem ser visualizadas facilmente nas paisagens (FRANCELINO et al., 2011), 320
constituindo coberturas que caracterizam as áreas conhecidas como yellow points (solos sulfetados), representando os solos com maior grau de intemperismo da Antártica.
Oprocesso de sulfurização está ligado à gênese de solos associados às rochas sulfetadas, quando os minerais ricos em enxofre são expostos ao ar e a variação da umidade é capaz de oxidá-los (TATUR et al., 1993). Como resultado dessa oxidação, ocorre a liberação de soluções muito 325
ácidas, com pH baixo, que atuam como soluções de alteração dos demais minerais presentes na rocha; assim, a oxidação dos sulfetos (sulfurização) (TATUR et al., 1993) diminui demasiadamente o pH e promove o intemperismo químico da rocha, mesmo em condições em que as temperaturas permaneçam próximo a zero (SOUZA, 2012). Os valores extremamente baixos de pH refletem uma alta capacidade de adsorção atribuída a minerais pouco cristalinos (SCHAEFER 330
et al., 2004). Dentre os minerais secundários formados a partir do intemperismo dessas rochas, está a jarosita, uma argila sulfetada amarela que é responsável pela cor dos solos e formam-se também fases de ferro não cristalino (ferrihidrito) (SIMAS et al., 2006).
A Península Keller, área em que está localizada a Estação Antártica Brasileira Comandante Ferraz (EACF), destaca-se por apresentar uma ocorrência generalizada de rochas afetadas por 335
sulfeto, das quais os solos sulfetados são formados. Os solos formados das rochas sulfetadas em Keller são muito ácidos e diferem dos demais solos formados a partir de basaltos e andesitos, pois apresentam menor concentração de P, Ca2+, Mg2+, mas elevadas concentrações de Al3+ (SIMAS et al., 2006). Ao longo das áreas afetadas por sulfeto, a drenagem ácida favorece a solubilização e mobilização de ferro e redução da mineralização de matéria orgânica por micro-organismos 340
(SIMAS et al., 2006). Por esse motivo, vários setores em Keller possuem um padrão amarelado-avermelhado, o qual cobre aproximadamente 19,6% (1,2 km²) da área livre de gelo nas faces leste, sul e oeste.
No estudo comparativo realizado por Lopes et al (2017), foram encontrados solos sulfetados em pontos amostrais na Ilha Seymor (SOUZA et al., 2014), na Península Barton 345
(LOPES et al., 2017) e na Península Keller (SIMAS et al., 2008). Os autores concluíram que as principais propriedades nos solos influenciadas pela oxidação de sulfetos são a cor, textura e pH que indicam apresença generalizada de sulfatos e óxidos e destaca também que alguns destes solos estão entre os mais ácidos encontrados na Antártica Marítima.A geração de acidez ocorre devido à oxidação de sulfeto que aumenta o desgaste químico e formação de minerais pouco cristalinos 350
(SCHAEFER et al., 2004). Em geral, o sulfeto dos solos em Keller tem uma proporção maior de partículas finas e argila, com menor teor de cascalho e areia em relação ao basalto e solos andesitos (SOUZA et al., 2012). Essa diferença na textura do solo também tem implicações diretas sobre desenvolvimento de relevo e na dinâmica hídrica superficial e subsuperficial da paisagem bem como na presença de diversos tipos de micro-organismos (HUJSLOVÁ et al., 2014).
355
2.4 Diversidade de fungos na Antártica
Os fungos vêm sendo ao longo dos anos descritos em diferentes substratos na Antártica e representamum componente importante das comunidades microbianas encontrados em habitats terrestres e marinhos (RUISI et al., 2007). É importante destacar que mais de 1000 espécies de 360
fungos já foram descritas na Antártica, sendo distribuídos nos diversos substratos da região (GONÇALVES et al., 2012; GODINHO et al., 2013; FURBINO et al., 2013; WENTZEL et al., 2018; ROSA et al., 2019). Além disso, Bridge & Spooner, 2012 sugerem também que, os fungos podem ser a biota mais diversificada do continente Antártico, e a verdadeira diversidade pode ser maior que a estimada. As comunidades de fungos da Antártica incluem táxons que pertencem aos 365
principais grupos de fungos: Ascomycota, Basidiomycota, Mortierellomycota, Mucoromycota, Chytridiomycota e Glomeromycota, algumas assembléias também incluem os stramenopiles (Oomycota) e os Mycetozoa (KIRK et al., 2008; BRIDGE & SPOONER, 2012; ROSA et al., 2019).
Entre os micro-organismos habitantes da Antártica, os fungos colonizam diferentes 370
substratos (ROSA et al., 2019) como rochas (ONOFRI et al., 2000; SELBMAN et al., 2005), solos (NEWSHAM et al., 2015; ONOFRI et al., 2000; GIRI et al., 2005; KRISHNAN et al., 2011; WENTZEL, 2018), plantas (TOSI et al., 2002; ROSA et al., 2009), águas continentais (GONÇALVES et al., 2012), solos da Antártica Marítima (GONÇALVES et al., 2015), lagos (GONÇALVES et al., 2012 ), sedimentos de lagos (BRUNATI et al., 2009; TSUJI et al., 2013), 375
macroalgas (LOQUE et al., 2010, GODINHO et al., 2013, FURBINO et al., 2013), sedimentos marinhos (GONÇALVES et al., 2013) e neve e gelo ( PRICE, 2000; ELSTER et al., 2007).
Metschnikowia australis, Antarctomyces psychrotrophicus, Antarctomyces pellizariae, Cryomyces antarcticus, Friedmanniomyces simplex, Friedmanniomyces endolithicus, Mortierella antártica, Penicillium antarcticum, Penicillium tardochrysogenum, Thelebolus globosus, 380
Telebolus ellipsoideus, Thelebolus balaustiformis e Thelebolus spongiae são consideradas espécies psicrofílicas endêmicas encontradas nesses diversos substratos da Antártica (ROSA et al., 2019). Dentre essas, as espécies endêmicas A. psychrotrophicus (isolado do solo antártico) e A. pellizariae (isolado da neve) nas Ilhas Shetland do Sul, (STCHIGEL et al. 2001; DE MENEZES et al. 2017) são importantes para usos em processos biotecnógicos, A. psychrotrophicus produz 385
uma proteína anti-congelante, e A. pellizariae um pigmento azul raro, com futuros usos na indústria de alimentos (DE MENEZES et al. 2017).
Outras espécies como as espécies do gênero Pseudogymnoascus são abundantes na Antártica, ocorrendo em diversos substratos (ROSA et al., 2019), sendo P. destructans caracterizada como um fungo patogênico psicrofílico que levou a uma redução das populações de 390
morcegos como agente causador da síndrome do nariz branco (SNM) em regiões temperadas (LORCH et al. 2011).
Diferentes espécies de fungos vêm sendo caracterizados, as quais parecem possuir papéis importantes nos processos ecológicos da região (ciclagem de nutrientes, interações ecológicas, controle biológico, produção de metabólitos, decomposição e equilíbrio ecológico) (RUISI et al., 395
2007; BRIDGE & SPOONSER, 2012; ROSA et al., 2019), aparatos que resultaram na sobrevivência e seleção desses organismos extremófilos. Algumas espécies fúngicas são endêmicas da Antártica e possuem adaptações a estes ambientes, como já relatados os táxons Antarctomyces psychrotrophicus (STCHIGEL et al., 2001), Cryomyces antarcticus, Lecanicillium muscarium (SELBMANN et al., 2008), Taphrina antarctica (SELBMANN et al., 2014) e 400
2.5 Fungos presentes em solos da Antártica
Os diferentes tipos de solos antárticos vêm sendo extensivamente estudados como fontes 405
de diversidade fúngica (ROBINSON, 2001; TOSI et al., 2005; HUGHES et al., 2006; AISLABIE et al., 2009; KOCHKINA et al., 2012; GODINHO et al., 2015; GONÇALVES et al., 2015; DE SOUSA et al., 2017; GOMES et al., 2018). Maior parte dos fungos encontrados nos solos antárticos são cosmopolitas e adaptados ao frio, mas alguns deles são endêmicos (ARENZ et al., 2014) e considerados dominantes dos solos continentais (ROSA et al., 2019). Dentre os gêneros 410
mais encontrados nos solos antárticos estão Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Mortierella, Antarctomyces, Pseudogymnoascus, Rodothorula e Cryptococcus (WICKLOW, 1968; MERCANTINI et al., 1989; STCHIGEL et al., 2001; ARENZ et al., 2006; MARGESIN et al., 2007; BENSCH et al., 2010; MELO et al., 2014; DE MENEZES et al., 2017; GOMES et al., 2018). A ocorrência de fungos cosmopolitas na Antártica pode ser explicada pelo transporte de 415
propágulos microbianos de outras regiões, como a mais próxima do Continente, a porção austral da América do Sul (RUISI et al., 2007).
Entre os solos antárticos, os desertos áridos e solo mineral dos Vales Secos (Dry Valleys) da Antártica representam uma comunidade adaptada de fungos como já relatados os táxons Cryptococcus vishniacii, Phaeosphaeria sp., Coniochaeta lignaria e Cochiobolus heliconiae 420
aparentemente adaptadas a condições ultraoligotróficas (FELL et al., 2006), além de uma diversidade restrita dos gêneros Helicodendro e Zalerion (ROSA et al., 2019). Solos ornitogênicos contém elevado aporte de guano e elevada disponibilidade de nutrientes, devido à presença de excretas de aves, e revela uma biomassa microbiana composta por fungos (AISLABIE et al.,2009; DE SOUSA et al., 2017). Sousa et al. (2017) relataram ainda a abundante presença das espécies 425
Penicillium chrysogenum, Aspergillus fumigatus, Rhodotorula mucilaginosa e Byssochlamys spectabilis, espécies estas que apresentam importância médica como potenciais causadores de infecções oportunistas em humanos.
Trabalhos com fungos presentes no permafrost antártico revelam a presença uma diversidade de táxons psicrofílicos (ZUCCONI et al., 2011). Táxons psicrofílicos são aqueles que 430
são adpatados ao frio com crescimento ótimo abaixo de 15 °C, psicrotolerantes são tolerantes ao frio com faixa de crescimento até 25 °C, e mesófilos tem faixa de crescimento ótimo de 20 °C a 45 °C (ROTHSCHILD & MANCINELLI, 2001; MARGESIN et al., 2007; HARDING et al., 2011; SEEL et al., 2016). Usualmente fungos encontrados no permafrost da Antártica são fungos que formam conídios (Aspergillus spp., Chrysosporium spp., Cladosporium spp. Penicillium spp.) 435
(DA SILVA et al., 2019), o que indica que possivelmente o estado dormente desses táxons lhes permite o maior período de sobrevivência neste micro-habitat (OZERSKA et al., 2009). O número
de espécies pertencentes ao gênero Penicillium foi o mais alto em contrapartida apenas quatro espécies de Cladosporium foram relatados na revisão de Da Silva e colaboradores (2019), sendo ambos amplamente distribuídos entre as amostras de permafrost.
440
Os solos ácidos, como os solos sulfetados da Antártica com pH entre 3-7 também vem sendo investigados quanto a presença de micro-organismos, os quais parecem abrigar uma restrita diversidade de comunidades microbianas (BAKER et al., 2004, 2009; LÓPEZ & AMILIS, 2001; LÓPEZ et al., 2004; ZETTLER et al., 2002). Hujslová et al. (2014) encontraram isolados fúngicos hialinos pertencentes aos gêneros Acidothrix, Acidea e Soosiella em solos ácidos desítios costeiros 445
da República Tcheca e Península Antártica. Solos ácidos da Península de Mitchell (com pH variando de 4 a 6) abrigam uma comunidade de fungos pertencentes a classe Ascomycota (77%) (JI et al., 2016). Apesar de distintos tipos de solos na Antártica, eles têm em comum o fato de persistirem a longo prazo sob condições ambientais adversas, além de sua longa história de isolamento que resulta num alto grau de colonização de espécies de fungos diversas, muitas das 450
quais endêmicas para a região (ROSA et al., 2019; CONVEY, 2010).
2.6 Fungos acidófilos em processos de biolixiviação de metais
Aplicações biotecnológicas visando à recuperação de metais valiosos têm desempenhado um papel significativo na mineração desde o início da era média até o final do século (LIANG & 455
GADD, 2017). O desenvolvimento sustentável requer medidas para reduzir a dependência de recursos não renováveis e a demanda por recursos primários (MISHRA & RHEE, 2014). A obtenção de metais por meio da mineração convencional é laboriosa, e neste panorama, processos baseados na utilização de micro-organismos podem oferecer uma possibilidade de obtenção de metais dificilmente acessíveis por meio físico-químicos (ILYAS et al., 2013). O termo 460
biolixiviação pode ser definido como um processo de dissolução de metais de sua fonte mineral por micro-organismos, que transformam elementos metálicos sólidos em suas formas solúveis, os quais podem ser extraídos mais facilmente do substrato mineral (BRANDL, 2001). A biolixiviação é geralmente menos poluente quando comparada com os processos de mineração convencionais físico-químicas que geram dióxido de enxofre tóxico e contribuem para poluição 465
ambiental (CHAUDHARY et al., 2014).
O uso de micro-organismos na lixiviaçãode metais pela ação de um fluido percolante de minérios tem se mostrado eficiente, econômico e ecologicamente amigável, a qual representa uma alternativa em operações de mineração (GENTINA & ACEVEDO, 1985). Micro-organismos como bactérias e fungos convertem compostos metalizados em suas formas solúveis em água e 470
microbiológica é possível realizar a recuperação de metais de resíduos perdidos em processos físico-químicos na mineração tradicional (BRANDL, 2001).
Micro-organismos acidófilos se desenvolvem em pH ácido entre 2 e 4, e, por isso, são amplamente utilizados na recuperação de metais ajudando a dissolver metais pela secreção de 475
ácidos orgânicos e inorgânicos em meio aquoso (SCHIPPERS, 2006). A mobilização de metais é feita pela (i) formação de ácidos orgânicos ou inorgânicos (formados pelo metabolismo microbiano resultando em acidólise orgânica e formação de quelatos (BRANDL, 2001), (ii) reações de oxidação e reduçãoe (iii) a excreção da complexação de agentes, sendo o ácido sulfúrico o principal ácido inorgânico encontrado em ambientes de lixiviação formado com a ação 480
principalmente de micro-organismos oxidantes de enxofre, como a bactéria Thiobacillus ferrooxidans (SCHIPPERS, 2006).
Algumas espécies de Aspergillus e Penicillium são capazes de produzir ácidos orgânicos como ácido oxálico, ácido cítrico e ácido maléico, os quais, seletivamente, biocatalisam metais (AMIRI et al., 2011; LIANG & GADD 2017). A capacidade dos fungos para solubilizar 485
compostos metálicos insolúveis e minerais depende da excreção de ácidos orgânicos, como os oxálicos e ácidos cítricos, que não só diminuem o pH, mas também complexam os metais presentes aumentando suas solubilidades (RAO et al., 2002). Chaudhary et al. (2014) caracterizaram fungos solubilizadores de minério de ferro, dentre os quais se destacou Penicillium verruculosum. Esses fungos solubilizadores de metais parecem interagir com metais presentes nos 490
minérios e são capazes de influenciar a mobilização dos metais ali presentes (FOMINA et al., 2005). Aspegillus niger (BRANDL, 2001; MISCHRA et al., 2014) e Penicillium simplicissimum (BRANDL, 2001) também foram caracterizados como biolixiviadores de metais de interesse. Dada todas as informações expostas, acredita-se que os fungos acidófilos presentes em solos sulfetados da Antártica podem apresentar potencial como fungos lixiviadores para recuperação de 495
3 OBJETIVO 3.1 Objetivo geral
Identificar e caracterizar a comunidade de fungos cultiváveis presentes em amostras de 500
solos sulfetados da Antártica com intuito de selecionar candidatos promissores para estudos de biolixiviação de metais de interesse para indústria mineral.
3.2 Objetivos específicos
• Isolar os fungos de amostras de diferentes solos sulfetados da Antártica; 505
• Depositar os isolados na Coleção de Culturas e Células da UFMG e contribuir para preservação e montagem de uma coleção temática de fungos de ambientes extremos; • Identificar todos os fungos obtidos por meio de taxonomia polifásica;
• Determinar a diversidade, riqueza, dominância e similaridade das comunidades dos fungos encontrados;
510
• Submeter os fungos obtidos a testes fisiológicos de crescimento em diferentes faixas de pH e temperatura;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Área de estudo e obtenção de amostras
515
O material estudado foi coletado durante a Operação Antártica XXXVI dentro das atividades de pesquisa do Programa Antártico Brasileiro (PROANTAR), no verão austral de janeiro a fevereiro de 2018. As amostras foram coletadas em diferentes pontos da Península Keller na Ilha Rei George, Shetland do Sul, Península Antártica (Figura 1). Foram coletadas pela equipe do Laboratório de Geomorfologia da Universidade Federal de Minas Gerais, amostras de solo de 520
cinco pontos de área sulfetada, denominados yellow points, escolhidos com base em áreas onde haviam presença de rochas sulfetadas (Figura 2). A localização dos pontos de coleta foi determinada pelo sistema de coordenadas geográficas UTM obtidas por meio do Global Positioning System (GPS) (Tabela 1).
Figura1. Mapa ilustrando os locais onde as amostras de solos sulfetados foram obtidas. A. Península Antártica. B. Ilhas Shetland do Sul. C.
Península Keller com suas áreas sulfetadas. Fonte: MACHADO, M.R. Assinaturas pedo-geomorfológicas da transição para-periglacial na Antártica Marítima e suas consequências para a evolução da paisagem. Tese de Doutorado em geografia, UFMG, 2019. No prelo.
Figura 2. Amostras de solos sulfetados, conhecidos como yellow points, localizados na Península Keller, Rei George, Antártica A = ponto 1
Tabela 1. Pontos de coleta e coordenadas geográficas onde as amostras de solos
sulfetados foram obtidas.
Local Pontos de coleta Coordenadas geográficas (UTM)
Península Keller, Ilha Rei George
AS1 62°4'29.6"S 58°23'45.3"W AS2 62°04'24.9"S 58°25'01.7"W AS3 62°05'05.9"S 58°24'30.5"W AS4 62°05'00.1"S 58°24'53.2"W AS5 62°04'14.9"S 58°25'10.5"W
UTM = Universal Transversa de Mercator. AS1 = Antártica Sulfetado Ponto 1, AS2 = Antártica Sulfetado Ponto 2, AS3 =Antártica Sulfetado Ponto 3, AS4 = Antártica Sulfetado Ponto 4 e AS5 =Antártica Sulfetado Ponto 5.
Para a realização das coletas foram utilizadas espátulas esterilizadas e sacos plásticos tipo Whirl-Pak (Sigma-Aldric, EUA). Para cada um dos cinco pontos foram coletadas aproximadamente 500g-1 do solo em triplicata. Após a coleta, as 15 amostras foram mantidas a -20 °C para preservação das suas características e posteriormente transportadas até o Laboratório de Microbiologia Polar e Conexões Tropicais do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais até o processamento.
4.2 Análises físico-químicas do solo
Foram coletadas cinco amostras superficiais de solos sulfetados na profundidade de 0-10 cm na Ilha Rei George (Península Keller). As áreas de coleta são conhecidas como yellow points devido à coloração dos solos, amarelo-alaranjado, sendo esses solos derivados de andesitos piritizados, isto é, rochas vulcânicas enriquecidas em sulfeto de ferro, principalmente pirita (DE SOUZA, 2014). Todas as amostras foram coletadas em triplicata, sendo posteriormente homogeneizadas e peneiras em malha de 2mm. Foram realizadas análises químicas de rotina e granulométricas, ambas realizadas conforme procedimentos da Embrapa (1997) e Almeida et al. (2012) no Laboratório de Física do Solo e no Laboratório de Rotina do Departamento de Solos da Universidade Federal de Viçosa.
Para a granulometria foram quantificadas as frações granulométricas areia, silte e argila (análise textural). As amostras foram dispersas quimicamente com 10mL de NaOH 1 mol L-1 e agitadas lentamente por 16 horas. A fração areia foi separada por
peneiramento (areia fina < 0,053 mm e areia grossa >0,2 mm). As frações silte e argila foram separadas através da sedimentação diferencial, segundo a Lei de Stokes, utilizando o método da pipeta. Os resultados em % foram plotados no diagrama ternário areia-silte-argila para obtenção da classe textural (ALMEIDA et al., 2012).
Com relação às análises químicas, determinou-se o pH em água em solução de KCl 1 mol L-1com medição pelo método potenciométrico em suspensão solo: solução igual a 1:2,5. O cálcio e magnésio trocáveis foram extraídos com KCl 1 mol L-1 em pH 7e dosados por meiodo espectrofotômetro de absorção atômica. Potássio e sódio trocáveis foram extraídos com solução de HCl 0,05 mol L-1 e H2SO4 0,025 mol L-1 (Mehlich 1), sendo dosados pelo espectrofotômetro de emissão de chama. O alumínio trocável foi extraído com KCl 1 mol L-1, determinado por titulação com NaOH 0,025 mol L-1. Acidez extraível (H+ + AL3+) foi extraída com acetato de cálcio 0,5 mol L-1 ajustada a pH 7 e determinada por titulação com NaOH 0,06 mol L-1. O fósforo, zinco, cobre, manganês e ferro foram extraídos com Mehlich -1 e o enxofre foi extraído por fosfato monocálcico em ácido acético e determinado pelo espectrofotômetro de absorção molecular (Colorimetria).
Em colaboração com a equipe do Laboratório de Geomorfologia da Universidade Federal de Minas Gerais, a matéria orgânica foi determinada pelo método de oxidação úmida de Walkley-Black seguindo as recomendações de Matos et al. (2017), em que o C do solo é oxidado por dicromato em meio ácido como agente oxidante e uma fonte externa de calor (bloco digestor a 170 °C). Com a quantificação do Carbono orgânico do solo é possível estabelecer a quantidade de matéria orgânica pelo fator Van Bemmelen. Considera-se que a matéria orgânica do solo apresenta 58% de C orgânico total, desta forma multiplica-se o teor de C obtido por 1,72 (100/58).
4.3 Processamentos das amostras e isolamentos dos fungos
Para o isolamento dos fungos dos solos sulfetados, 1g de amostra de cada uma das 15 amostras de solo foi re-suspendida em 9 mL de solução salina (NaCl 0,85%) e homogeneizado durante 5 minutos em vórtex. Em seguida da diluição 10-2, 100 μL foram inoculados nos meios de cultura ágar Extrato de Malte-Extrato de Levedura (YM) (0,3% extrato de malte, 0,3% de extrato de levedura, 1% glicose, 0,5% peptona, 2% ágar), Dichloran Rosa de Bengala ágar (DRBC) (Oxoid, EUA) e Dichloran Glicerol ágar (DG18) (Oxoid, EUA), ambos acrescidos de100 μgmL-1 de cloranfenicol (Sigma, EUA) para evitar o crescimento de bactérias contaminantes. O meio YM foi usado por
ser um meio rico em nutrientes, o DBRC como meio seletivo para fungos de crescimento lento, usualmente usado para isolamento de fungos do solo, o qual além de restringir o tamanho da colônia ele inibe o crescimento de bactérias e o DG18 que é seletivo para fungos xerofílicos (aqueles capazes de crescer em condições de baixa disponibilidade de água). As placas contendo os meios de cultura foram incubadas a 15 ºC durante um período de até 60 dias. Foi determinada para cada fungo a quantificação de unidades formadoras de colônias fúngicas (UFC g-1).
As colônias puras de todos os fungos filamentosos obtidos foram preservadas em duplicata, em água destilada esterilizada (CASTELLANI, 1967) e em glicerol 15% a -80 °C. As culturas de leveduras foram inoculadas em meio GYMP (glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1% e de fosfato de sódio 0,2%) e após o período de 24-48 horas a 15 °C foi acrescido 20% glicerol e depositadas no ultrafreezer a -80 °C. Todos os isolados obtidos foram armazenados na Coleção de Micro-organismos e Células do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.
4.4 Identificação de fungos 4.4.1 Fungos filamentosos
Os isolados de fungos filamentosos obtidos foram crescidos em meio YM a 15 °C por quinze dias. Após o período de incubação, as colônias dos fungos filamentosos foram fotografadas e submetidas à análise de acordo com as seguintes características macro morfológicas: coloração da colônia (frente e verso), textura da superfície (frente e verso), aspecto da borda e presença/ausência de pigmentos e exsudatos. Após o agrupamento macromorfológico, os grupos formados foram submetidos ao agrupamento molecular pela técnica de finger print através da amplificação com o iniciador GTG5 que permite detectar polimorfismos de DNA, discriminando a identidade dos isolados. Os isolados que apresentarem padrões de bandas idênticos foram confirmados, como pertencentes a um mesmo grupo. Um isolado de cada grupo molecular foi selecionado para sequenciamento da região transcrita interna ITS-5.8S da região gênica do rRNA. Quando necessário, as identificações dos grupos foram posteriormente confirmadas por meio do sequenciamento parcial do gene da β-tubulina. A escolha da região a ser sequenciada foi determinada de acordo com os gêneros encontrados, após o sequenciamento da região ITS.
4.4.1.2 Extração do DNA total
A extração de DNA total foi realizada de acordo com metodologia descrita por (ROSA et al., 2009) com modificações. O cultivo dos fungos filamentosos foi realizado no meio de isolamento meio ágar YM de cada morfotipo encontrado e incubado por 7 a 14 dias. Após o período de incubação, fragmentos de micélio foram colocados em tubos de 2,0 mL acrescidos de 400 μL de tampão de lise (Tris-HCl - trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS - sódio dodecil sulfato 1%) e mantidos a -20 ºC por no mínimo 30 minutos. O tampão de lise tem como função promover a degradação da parede celular e proteína das hifas. Em cada tubo foram adicionadas três beads de aço inoxidável (3 mm de diâmetro) estéreis e posteriormente submetidos à trituração no equipamento microdesmembranador Bullet Blender TM 24 (Uniscience). Em seguida, foram adicionados 162 μL de CTAB (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização e incubação por 40 minutos a 65 ºC. Posteriormente foram acrescidos 570 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), os tubos foram homogeneizados e incubados por 30 minutos a 0 ºC no freezer. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 14.000 rpm por 10 minutos e o líquido sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e acrescentado 10% do volume de seu volume de uma solução de acetato de sódio 3M. A suspensão foi homogeneizada e incubada a 0 ºC no freezer por 30 minutos e depois centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e, em seguida, adicionado 50% de seu volume de isopropanol (Merck) e homogeneizada. As amostras foram deixadas em repouso sob a bancada por 1 hora para precipitar o DNA. Uma nova centrifugação foi realizada a 14.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento homogeneizado com etanol 70% (Merck) v/v. Este passo foi repetido 2 vezes. As amostras secaram em overnight por 24 horas sob a bancada, e acrescidas de 50 μL de tampão TE/Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M) e incubadas a 65ºC por 60 minutos para hidratar o DNA, em seguida foram armazenadas em freezer a -20ºC (SANTIAGO et al., 2012). Posteriormente utilizando o espectofotômetro (NanoDrop ND 1000 Technologies, EUA) as amostras foram quantificadas e diluídas para concentração de DNA entre 200 a 500 ng μL-1 por amostra e depois armazenadas em freezer a -20 ºC até a preparação das reações em cadeia de polimerase (PCR).
4.4.1.3 Amplificação utilizando o Iniciador (GTG)5
Foi realizado um agrupamento molecular para detectar polimorfismos de DNA, de maneira a discriminar a identidade dos isolados por meio da amplificação das regiões de microssatélite, conforme descrito por Lieckfeldt et al. (1993). A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi realizada para um volume final de 25 μL contendo de 1,0 a 5,0 μL de DNA (variando de acordo com a concentração do DNA, a qual deve estar entre 50-500 ng μL-1), 2,0 μL do iniciador (GTG)5 10 mol L-1 (MWG Biotech); 2,5 μL de tampão de PCR 5X (Sinopse inc), 1,5μL de MgCl2 25mM, 1,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Sinopse inc) e o volume final completado com água ultrapura esterilizada. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Valpoprotect - Eppendorf). O programa consiste de uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 94 ºC, pareamento a 55 ºC por 1 minuto e extensão a 72 ºC por 90 segundos, e uma extensão final a 72 ºC por 6 minutos. Os produtos da PCR (amplicons) foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8), durante aproximadamente uma hora e meia a 80 V. As bandas foram coradas com um agente intercalante (GelRed), e os géis visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, France).
4.4.1.4 Amplificação da região ITS
Após a confirmação dos agrupamentos dos fungos pela técnica de amplificação por (GTG)5, um isolado dentre os que apresentaram um mesmo padrão de bandas foi selecionado para o sequenciamento da região ITS. Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) foram utilizados para amplificação da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do gene do rDNA, conforme descrito por White et al., (1990). A PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo de 1,0 a 5,0 μL de DNA (variando de acordo com a concentração do DNA, a qual deve estar entre 50-500 ngμL-1), 1,0 μL de cada iniciador ITS1 e ITS4 10 μmol-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Thermo), 2,0 μL de MgCl2 25mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Thermo) e o volume final completado com água esterilizada. As reações da PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Valpo Protect - Eppendorf). O programa consiste de uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguido por 35
ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 minuto, pareamento a 55 ºC por 1 minuto, e extensão a 72 ºC por 1 minuto, e uma extensão final a 72 ºC por 5 minutos. Os amplicons foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8), durante aproximadamente 20 minutos a 120 V. As bandas foram coradas com um agente intercalante (GelRed), e os géis visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, França).
4.4.1.5 Amplificação parcial do gene β-TUBULINA
Os iniciadores BT2a (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) e BT2b (ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC) foram utilizados para amplificação parcial do gene da β-tubulina, conforme descrito por Glass & Donaldson (1995). A PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo de 1,0 a 5,0 μL de DNA (variando de acordo com a concentração do DNA, a qual deve estar entre 50-500 ng/μL), 1,0 μL de cada iniciador BT2a e BT2b 10 μmolμL-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Thermo), 2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Thermo) e o volume final completado com água esterilizada. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Valpo Protect - Eppendorf). O programa consiste de uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94 ºC, um minuto de pareamento a 59 ºC e 90 segundos de extensão a 72 ºC e uma extensão final por 7 minutos a 72 ºC. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5 M, pH 8), durante aproximadamente 20 minutos a 120 V. As bandas foram coradas com um agente intercalante (GelRed) e os géis visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, França).
4.4.2 Leveduras
Os isolados de leveduras obtidos foram crescidos em meio YM a 15 °C por sete dias e também submetidos ao agrupamento macromorfológico e molecular como citado nos tópicos 4.4.1 e 4.4.1.3.
4.4.2.1 Extração de DNA total de leveduras
A extração de DNA total foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Sambrook et al. (1986) com modificações. Após o cultivo da levedura (item 4.2), uma alçada de cada colônia foi adicionada em tubos de 0,6 mL, e adicionados em 100 μL de tampão de lise (Tris-HCl – trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%), agitadas em vórtex e incubadass a 65 °C por 30 minutos. Após esta etapa, foram adicionados 200 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e homogeneizados. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos e o líquido sobrenadante transferido para novos tubos de 0,6 mL e acrescidos de 100 μL de isopropanol (Merck) v/v, sendo a suspensão gentilmente homogeneizada e as amostras deixadas em repouso sob a bancada por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos. O DNA foi lavado com 200 μL de etanol 70% (Merck) e centrifugado a 14.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante contendo etanol foi desprezado e as amostras secaram overnight por 24 horas e após, foram hidratadas com 100 μL de tampão TE (Tris 10 mM; EDTA 1mM). Todos os produtos obtidos foram quantificados em espectrofotômetro (NanoDrop ND 1000 Technologies, EUA). As concentrações de DNA foram acertadas de 50 a 500 ngµL-1 e estocados a –20 °C até sua utilização.
4.4.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1/NL4
Após a confirmação do agrupamento pela técnica de amplificação por (GTG)5os isolados selecionados foram submetidos ao sequenciamento da região D1/D2 da
subunidade maior do rDNA utilizando os iniciadores NL1
(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) e NL4 (GGTCCGTGTTTCAAGACGG), segundo a metodologia descrita por Lachance et al. (1999). As reações de PCR foram realizadas em microtubos com volume final de 50 µL contendo: 1,0 a 5,0 μL de DNA (variando de acordo com a concentração do DNA, a qual deve estar entre 50-500 ngμL -1), 1,0 μL de cada iniciador NL1 e NL4 10 μmol-1, 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Thermo), 2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Thermo) e o volume final completado com água esterilizada. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycler (Eppendorf), nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 ºC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de: desnaturação a 95 ºC por 15 segundos, pareamento a 54 ºC por 25 segundos e
extensão a 72 ºC por 20 segundos, seguida por uma extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8), a uma corrente de 120 V durante 20 minutos. As bandas foram coradas com solução de GelRed e os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, França).
4.4.3 Purificação dos amplicons
Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando EDTA. Ao produto de PCR com volume de 45 μL, foram adicionados 11,25 μL de EDTA 125 mM e 141μL de etanol absoluto (Sigma). Esta mistura foi submetida à centrifugação com rotação de 14.000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e para lavagem do precipitado foi adicionado 120 μL de etanol 70% e realizado homogeneização. Após centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado novamente e o restante do etanol evaporou por 2 horas a 37 ºC. O DNA foi ressuspendido em 10 μL de água esterilizada. O produto obtido foi quantificado em espectrofotômetro (NanoDrop ND 1000 Technologies, EUA) para ser utilizado nas reações de sequenciamento.
4.4.4 Reações de Sequenciamento
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o kit de sequenciamento Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystem, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado ABI 3730xl (Applied Biosystem, USA) do Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular (LPCM) da FIOCRUZ/Instituto René Rachou. A reação de PCR foi realizada em microplacas de 96 poços (Applied 5 Biosystems, EUA) em um volume final de 10 μL, contendo: 1 μL do iniciador (5 ρmol), 1 μL de tampão (presente no kit de sequenciamento), 1 μL de Big Dye, 1 μL de DNA 30 (concentração do DNA purificado entre 10 e 20 ng µL-1) e completando-se o volume final com água ultrapura esterilizada. O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 36 °C por 1 minuto, 36 ciclos de anelamento a 96 °C por 15 segundos, seguido por 15 segundos de extensão a 50 ºC e 4 minutos de extensão final a 60 ºC. Em seguida, os produtos das reações foram transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços para serem precipitados. Para precipitação das reações de sequenciamento, 1,0 μL de acetato de amônio 7,5 M foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato
