UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS CARINE DANIELLE FERREIRA COSTA LEITE

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

CARINE DANIELLE FERREIRA COSTA LEITE

EFEITO DA ALIMENTAÇÃO SUPLEMENTADA COM SEMENTE

DE LINHAÇA NO CRESCIMENTO CORPORAL E NA

ORGANIZAÇÃO HISTOLÓGICA DA RETINA DE RATOS

DURANTE O DESENVOLVIMENTO

CARINE DANIELLE FERREIRA COSTA LEITE

EFEITO DA ALIMENTAÇÃO SUPLEMENTADA COM SEMENTE

DE LINHAÇA NO CRESCIMENTO CORPORAL E NA

ORGANIZAÇÃO HISTOLÓGICA DA RETINA DE RATOS

DURANTE O DESENVOLVIMENTO

Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Ciências Médicas

Orientador: Prof. Luis Guillermo Coca Velarde Co-orientador: Prof. Ronald Marques dos Santos

Niterói 2011

L533 Leite, Carine Danielle Ferreira Costa

Efeito da alimentação suplementada com semente de linhaça no crescimento corporal e na organização histológica da retina de ratos durante o desenvolvimento / Carine Danielle Ferreira Costa Leite. – Niterói: [s.n.], 2011.

98f. : il., 30 cm.

Dissertação(Mestrado em Ciências Médicas)– Universidade Federal Fluminense, 2011.

1. Suplementação Alimentar. 2. Linho. 3. Caseínas. 4. Ratos. 5. Ácidos Graxos Ômega-3. 6. Retina. I. Título.

CARINE DANIELLE FERREIRA COSTA LEITE

EFEITO DA ALIMENTAÇÃO SUPLEMENTADA COM SEMENTE

DE LINHAÇA NO CRESCIMENTO CORPORAL E NA

ORGANIZAÇÃO HISTOLÓGICA DA RETINA DE RATOS

DURANTE O DESENVOLVIMENTO

Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Ciências Médicas

Aprovada em / /2011. BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr(a). Lenise Arneiro Teixeira – UFF

Prof. Dr(a). Kátia Calvi Lenzi de Almeida – UFRJ

Prof. Dr(a). Maria Thereza Baptista Wady – UFF

Niterói 2011

Dedico este trabalho a todas as pessoas que se fizeram presentes nos momentos bons e difíceis, e, principalmente a Deus por ter me dado tanta esperança e força, algo que nunca imaginei possuir.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Elisa e José pelo grande incentivo.

Ao meu noivo Victor pelo carinho, incentivo e compreensão.

Ao meu orientador, Luis Guillermo Coca Velarde, por ter me aceitado como orientanda e pelas análises estatísticas.

Ao meu co-orientador, Ronald Marques dos Santos, pela paciência, atenção e grandes ajudas.

Ao meu professor, Gilson Teles Boaventura, pela confiança e oportunidade. Aos amigos do Labne, Juliana Azevedo, Lívia Hipólito, Ludmila Cardozo, Kátia Lenzi e Juliana Tomaz pela amizade, ajuda, carinho e atenção.

Às bolsista, Akemi Suzuki e Gabriela Vicente, pela grande ajuda, dedicação e responsabilidade.

À coordenação do curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, em especial à secretária Dina, pela paciência e ajuda.

“Todo o conhecimento humano começou com intuições, passou daí aos conceitos,

e terminou com idéias.”

RESUMO

Linhaça é rica em proteína e ácido alfa-linolênico, da série ômega-3 que têm influência na espessura da retina e função visual. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito desta oleaginosa no crescimento corporal e organização histológica da retina de ratos filhotes. Vinte e duas ratas Lister Hooded foram acasaladas, mantidas em temperatura constante (24 ± 2°C), iluminação controlada e ciclo claro-escuro (12/12 h) e divididas em 2 grupos: Grupo Controle (GC) que recebeu ração à base de caseína com 17% de proteínas, ad libitum e Grupo Linhaça (GL) que recebeu ração acrescida de 14% de caseína e 25% de farinha de linhaça, totalizando 17% de proteínas, ad libitum. Aos 14 dias de vida (P14), aos 21 dias de vida (P21) e aos 42 dias de vida (P42) dos animais, 12 filhotes de cada grupo e em cada idade foram sacrificados para análise das retinas, como também, durante todo esse período controlou-se o consumo de ração das ratas, o número de crias, assim como o peso corporal dos filhotes desde o nascimento até o P42. Analisou-se além do consumo de ração e peso corporal dos filhotes, o perfil lipídico das rações, o crematócrito do leite materno e a espessura do tecido retiniano e de suas camadas (Camada de Segmento Externo e Interno de Fotorreceptores: SEF ; Camada Nuclear Externa: CNE ; Camada Plexiforme Externa: CPE ; Camada Nuclear Interna: CNI ; Camada Plexiforme Interna: CPI ; Camada de Células Ganglionares: CCG). Para as análises do consumo de ração e crematócrito do leite materno utilizou-se o Teste T-student, nas análises do número de crias por grupo e peso corporal dos filhotes utilizou-se o Teste da soma dos postos de Wilcoxon e para as análises do perfil lipídico das rações e comparação da espessura das camadas da retina foi utilizado ANOVA. Os dados foram avaliados pelo Software S-Plus 8.0 com p≤0,05. GL apresentou maior teor de ácido alfa-linolênico na sua ração (46,15±0,64) do que o GC (5,38±0,19), porém menor quantidade de ácido linoléico (GL=14,41±0,09 ; GC=53,69±0,15). Já no consumo de ração das ratas, o GL foi semelhante ao GC, assim como no número de crias por grupo. GL se equiparou ao GC no teor de gordura e valor energético total do leite materno e no peso corporal dos filhotes ao desmame e no 42° dia de vida. Em P14, GL apresentou maior espessura da retina (p=0.001) e das camadas CNE (p=0) e CNI (p=0) e menor espessura da CPE (p=0). Em P21, GL apresentou menor espessura da retina (p=0) e das camadas CNE (p=0) e CNI (p=0), mas maior espessura da SEF (p=0). Em P42, GL apresentou menor espessura da retina (p=0.0016) e das camadas CNE (p=0.0058) e CNI (p=0.0012). A suplementação com farinha de linhaça promoveu um crescimento satisfatório, como possivelmente, acelerou o desenvolvimento da retina e gerou incorporação de ácidos ômega-3 nesse tecido.

ABSTRACT

Flaxseed is rich in protein and alpha-linolenic acid, omega-3 series that have influence on retinal thickness and visual function. The present study was to evaluate the effect of this oilseed in body growth and histological organization of the retina of young rats. Twenty-two Hooded Lister rats were mated, kept at constant temperature (24 ± 2 ° C), controlled lighting and light-dark cycle (12/12 h) and divided into 2 groups: Control Group (GC) received diet based on casein with 17% protein, ad libitum and Flaxseed Group (GL) received diet plus 14% casein and 25% flaxseed meal, totaling 17% protein, ad libitum. At 14 days old (P14) on day 21 (P21) and at 42 days (P42) of animals, 12 pups of each group and each age were sacrificed for analysis of the retinas, but also throughout this period is controlled feed intake of rats, the number of offspring, as well as the body weight of pups from birth until P42. Looked beyond the feed intake and body weight of pups, the lipid profile of the diets, the creamatocrit breast milk and the thickness and the retinal layers (Layer Internal and External Segment of Photoreceptors: SEF; Nuclear Layer External: CNE, outer plexiform layer: CPE, inner nuclear layer: CNI, inner plexiform layer: CPI, ganglion cell layer: GCC). For the analysis of feed intake and breast milk creamatocrit used the Student's t test, analysis of the number of litters per group and body weight of pups was used to test the sum of the ranks and Wilcoxon tests for the lipid profile of each diet and compared the thickness of the retina we used ANOVA. The data were evaluated by S-Plus Software 8.0 with p ≤ 0.05. GL showed a higher content of alpha-linolenic acid in their diet (46.15 ± 0.64) than GC (5.38 ± 0.19), but lower linoleic acid (GL = 14.41 ± 0, 09, GC = 53.69 ± 0.15). In the feed intake of rats, the GL was similar to the GC, as well as the number of litters per group. GL matched the GC in fat and total energy intake of breast milk and body weight of pups at weaning and 42 days of life. In P14, GL had higher retinal thickness (p = 0.001) and CNE layers (p = 0) and CNI (p = 0) and lesser thickness of CPE (p = 0). In P21, GL showed lower retinal thickness (p = 0) and layers of NEC (p = 0) and CNI (p = 0), but increased thickness of the SEF (p = 0). In P42, GL showed lower retinal thickness (p = 0.0016) and layers of NEC (p = 0.0058) and CNI (p = 0.0012). Supplementation with flaxseed meal promoted a satisfactory growth, and possibly accelerated the development of the retina and caused the incorporation of omega-3 in this tissue.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURAS Pág.

Figura 1. Essencialidade dos ácidos graxos essenciais 16 Figura 2. Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3 17

Figura 3. Morfologia da retina 25

Figura 4. Fovea centralis e ponto cego 26

Figura 5. Representação da via retinotectal de ratos 27 Figura 6. Representação do sistema visual de mamíferos 28 Figura 7. Medição da espessura das camadas da retina 48 Figura 12. Retina dos animais com 14 dias de vida 57 Figura 13. Retina dos animais com 21 dias de vida 59 Figura 14. Retina dos animais com 42 dias de vida 60

LISTA DE FIGURAS

FIGURAS Pág.

Figura 8. Peso corporal dos filhotes ao desmame 53 Figura 9. Evolução ponderal dos filhotes durante a lactação 54 Figura 10. Peso corporal dos filhotes ao 42° dia de vida 55 Figura 11. Evolução ponderal do 21° ao 42° dia de vida 56

LISTA DE ABREVIATURAS AA – Ácido araquidônico

ADP – Ácido docosapentaenóico ALA – Ácido alfa-linolênico

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico CCG – Camada de células ganglionares C 18:3 n-3 – Ácido alfa-linolênico

C 18:2 n-6 – Ácido linoléico CNE – Camada nuclear externa CNI – Camada nuclear interna CoA – Coenzima A

CPE – Camada plexiforme externa CPI – Camada plexiforme interna

CREB – Elemento de resposta de ligação à adenosina monofosfato cíclico DHA – Ácido docosahexaenóico

DMRI – Degeneração macular relacionada com a idade DNA – Ácido desoxirribonucléico

PUFAs – Ácidos graxos poliinsaturados E14 – 14° dia embrinário

E22 – 22° dia embrionário E15 – 15° dia embrionário E16 – 16° dia embrionário E17 – 17° dia embrionário EPA – Ácido eicosapentaenóico

Fase G1 – Fase do ciclo celular de síntese protéica

Fase G2 – Fase do ciclo celular de duplicação dos centríolos Fase M – Mitose

Fase S – Fase do ciclo celular de duplicação do DNA GABA – Ácido gama-aminobutírico

GC – Grupo controle GL – Grupo linhaça Kcal – Kilocalorias

LABNE – Laboratório de Nutrição Experimental

LCPUFA – Ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa n-3 – Ácido graxo da família ômega-3

n-6 – Ácido graxo da família ômega-6 P14 – 14 dias de vida pós-natal P21 – 21 dias de vida pós-natal P42 – 42 dias de vida pós-natal

RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro SDG - Diglicosídeo secoisolariciresinol

SEF – Camada de segmento externo e interno dos fotorreceptores SNC – Sistema Nervoso Central

UFF – Universidade Federal Fluminense VLDL – lipoproteína de baixa densidade ω-3 – Ômega-3

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 12

2. REVISÃO DE LITERATURA 14

2.1. Lipídios 14

2.1.1. Estrutura Química e Classificação 14

2.2. Ácidos Graxos Poliinsaturados 15

2.2.1. Importância dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 17

2.3. Ômega-3 durante a gestação e lactação 21 2.4. Fisiologia da retina e suas funções 23

2.5. Retina e Sistema Nervoso Central 27 2.6. Ômega-3 e retina 30

2.7. Desenvolvimento neurológico e visual 32 2.8. Semente de linhaça 35 3. JUSTIFICATIVA 37 4. HIPÓTESE 38 5. OBJETIVOS 39 5.1. Objetivo geral 39 5.2. Objetivos específicos 39 6. MATERIAL E MÉTODOS 41 6.1. Ética 41 6.2. Material 41 6.3. Delineamento experimental 44 6.4. Métodos 45 6.4.1. Análise bioquímica 45 6.4.2. Coleta de material 46 6.4.2.1. Leite materno 46

6.4.2.2. Olhos dos filhotes e obtenção dos cortes 46

6.4.3. Análises bioquímicas 46

6.4.3.1. Determinação do crematócrito 47

6.4.3.2. Coloração das lâminas histológicas 47

6.4.3.3. Análise das retinas 48

6.4.4. Análise estatística 49 7. RESULTADOS 50 7.1. Perfil lipídico das rações experimentais 50

7.2. Consumo de ração das ratas e número de crias 52

7.3. Crematócrito do leite materno 52

7.4. Peso corporal dos filhotes ao desmame e evolução ponderal durante a lactação 53 7.5. Consumo de ração dos filhotes após desmame até 42 dias de vida 54

7.6. Peso corporal dos filhotes ao 42° dia de vida e evolução ponderal do 21° ao 42° dia de vida 55 7.7. Espessura das camadas das retinas dos filhotes aos 14 dias de vida 56 7.8. Espessura das camadas das retinas dos filhotes aos 21 dias de vida 58 7.9. Espessura das camadas das retinas dos filhotes aos 42 dias de vida 59 8. DISCUSSÃO 61 9. CONCLUSÕES 69 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

A nutrição materna é essencial durante a gestação e lactação, pois há aumento funcional e bioquímico das demandas maternas de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs), contribuindo para um adequado desenvolvimento do feto e, posteriormente para o lactente (FIDLER & KOLETZKO, 2010).

Boa parte da energia provida do leite vem por meio da gordura, que é necessária para o crescimento rápido do recém-nascido e para fornecimento suficiente dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6, essenciais para completar o desenvolvimento de tecidos como o cérebro, a retina e a pele (DANGAT et al., 2011).

Os PUFAs da série ômega-3 (n-3) são considerados de grande relevância no metabolismo por exercerem funções biológicas específicas, dentre elas, efeitos protetores contra doenças crônicas não transmissíveis, decorrentes de suas atividades antioxidante, antiinflamatória e anticancerígena (TROINA et al., 2010).

O uso de alimentos funcionais tem recebido considerável atenção da comunidade científica, com destaque para a semente de linhaça. Essa semente é de grande interesse devido ao seu alto teor de ácidos ω-3, que apresentam influência na função visual (FIGUEIREDO et al., 2009).

Justamente pela grande presença destes na retina, com destaque para o DHA, uma de suas contribuições é no desenvolvimento da função visual (LAURITZEN et al., 2004).

O DHA é responsável pela proteção, funcionamento, desenvolvimento e diferenciação das membranas da retina, principalmente dos fotorreceptores, que apresentam a maior concentração deste ácido graxo (SANGIOVANNI, 2005; BAZAN, 2006).

A retina é um tecido extremamente organizado pertencente ao sistema nervoso central. A sua organização em camadas sinápticas e nucleares, muito semelhante ao observado em outras estruturas do sistema nervoso, faz com que esta seja um excelente modelo experimental (KOLB, 2003).

A principal função desse tecido é desempenhar um papel sensorial importante de transdução da informação luminosa em impulsos elétricos, os quais são retransmitidos para o sistema nervoso central, contribuindo dessa forma para o estabelecimento da percepção visual (LIMA et al., 2007).

Mediante tais fatos, é de grande relevância um melhor esclarecimento sobre os efeitos da semente de linhaça no crescimento corporal de ratos filhotes e sua contribuição na formação da retina desses animais.

2.1. Lipídios

Os lipídios são definidos como uma classe de compostos solúveis em solventes orgânicos como acetona, éter e clorofórmio. A imiscibilidade em água dos lipídios faz com que estes recebam processamentos especializados durante a digestão, absorção, transporte, armazenamento e utilização (SHILS et al., 2003).

Além de seu alto valor energético, os lipídios apresentam ácidos graxos essenciais e atuam como veículo das vitaminas lipossolúveis (TURKKI & RYNBERGEN, 1988). E como principais lipídios encontramos triglicerídeos, ácidos graxos, colesterol, ésteres de colesterol e fosfolipídeos (SALEM, 1999).

2.1.1.

Em relação a sua estrutura, os lipídios são misturas de glicerídios, e estes são formados pela associação química entre o glicerol e uma, duas ou três moléculas de ácidos graxos (SALEM, 1999).

Os ácidos graxos são cadeias de hidrocarbonetos com um número par de carbonos, variando de 4 a 26 átomos. Além das diferenças de comprimento de cadeia, estes variam quanto ao número e arranjo das duplas ligações e apresentam um grupo carboxílico (OH-C=O) e um grupo metílico (CH3) (SHILS et al., 2003).

Quanto a classificação, esta é feita de acordo com o tamanho da cadeia, em ácidos graxos de cadeia curta (contendo de 4 a 6 carbonos), ácidos graxos de cadeia média (contendo de 8 a 12 carbonos), ácidos graxos de cadeia longa (contendo mais de 12 carbonos), e ácidos graxos de cadeia muito longa (apresentam mais de 18 carbonos) que são conhecidos pela sigla LCPUFA, sendo eles o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido docosahexanóico (DHA) (TURKKI & RYNBERGEN, 1988).

Os ácidos graxos também são classificados de acordo com o número de ligações duplas em saturados, monoinsaturados e poliinsaturados. Os saturados não apresentam ligações duplas e são encontrados em grande quantidade em fontes animais como carnes, ovos, leite e derivados, e também em alguns vegetais hidrogenados. O ácido oléico é um tipo de ácido graxo monoinsaturado, apresentando uma única ligação dupla. Já os ácidos graxos poliinsaturados – PUFA que apresentam duas, três ou quatro ligações duplas, são classificados principalmente, nas séries ômega 3 (ω-3) e ômega 6 (ω-6), que se diferenciam na posição da primeira dupla ligação (DZIEZAK, 1989; CALDER, 1998).

2.2.

Os ácidos graxos poliinsaturados podem ser obtidos diretamente da alimentação ou formados a partir dos ácidos graxos essenciais. Após os ácidos graxos essenciais serem obtidos, estes são desaturados (pela inserção de dupla ligação) e alongados (pela adição de 2 unidades de carbono) a PUFAs (DIRIENZO et al., 2008).

O ácido linoléico (C18:2, familia ômega-6) e o ácido alfa-linolênico (C18:3, familia ômega-3) dão origem a outros ácidos de cadeias mais longas (figura 1), chamados de LCPUFAs. Enquanto que o ácido linoléico pode ser metabolizado em ácidos gama-linolênico, dihomo-alfa-linolênico e araquidônico (AA), o alfa-linolênico pode ser metabolizado em outros da série ω-3, sendo eles EPA e DHA (VALENZUELA, 2005; SALEM, 1999).

Tais processos metabólicos (Figura 2) ocorrem no retículo endoplasmático, predominantemente nas células hepáticas, tendo como produto final os ácidos docosapentaenóico (ADP) e DHA; e essas etapas envolvem ação das enzimas alongase e dessaturase, que formam os ácidos tetracosahexaenóico (24:6 n-3) e tetracosapentaenóico (24:5 n-6), finalizando com uma β-oxidação para remoção de dois átomos de carbono, originando então o AA e o DHA (INNIS, 2003; QIU, 2003).

Figura 2 - Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3 (INNIS, 2003).

2.2.1.

Os componentes lipídicos, especialmente os ácidos graxos, estão presentes nas mais diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura das membranas celulares e nos processos metabólicos (YOUDIM et al., 2000).

Os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 têm sido alvos de inúmeros estudos nas últimas décadas, os quais esclarecem muitas de suas funções no organismo humano. Esses estudos também têm destacado a importância da ingestão destes lipídios na fase gestacional, nos primeiros meses após o nascimento, na terceira idade e em diversas doenças, principalmente degenerativas (YEHUDA et al., 2002; HORNSTRA, 2000; UAUY et al., 2001; ALBERTAZZI & COUPLAND, 2002).

Em humanos, os ácidos linoléico e alfa-linolênico são necessários para manter sob condições normais as funções cerebrais e a transmissão de impulsos nervosos, como também participam da transferência de oxigênio atmosférico para o plasma sanguíneo, da síntese de hemoglobina e da divisão celular (YEHUDA et al., 2002).

Entretanto, as duas classes de PUFA devem ser bem diferenciadas por serem metabolicamente diferentes e possuírem funções fisiológicas opostas. Um excesso de ácido linoléico irá impedir a transformação do alfa-linolênico em seus derivados EPA e DHA, e um menor consumo de ácido linoléico levará a diminuição do AA. Sendo assim, o equilíbrio nutricional torna-se importante para se conseguir a homeostase e desenvolvimento normal do organismo (SIMOPOULOS, 2000; MADSEM et al., 1999).

A enzima delta-6-dessaturase é responsável pela concorrência entre esses ácidos graxos essenciais, devido ao fato desta enzima apresentar maior especificidade pelos ácidos ômega-3, precisando assim de menores quantidades destes que de ômega-6 para produzir a mesma quantidade de produto. Isto significa que deve existir uma proporção maior de ácido linoléico que de alfa-linolênico (MADSEM et al., 1999; SALEM, 1999).

Enquanto que o ácido linoléico pode ser encontrado em abundância nos óleos de milho, girassol e soja, o ácido alfa-linolênico é encontrado em concentrações elevadas na semente de linho (Linum usitatissimum) (YOUDIM et al., 2000; COLETTA et al., 2010).

Nas últimas décadas, os estudos têm comprovado que as dietas com quantidades adequadas de ácidos graxos poliinsaturados ω-3 desempenham papel importante na prevenção e tratamento de várias doenças. Tanto o EPA quanto o DHA e PUFAs n-3, são potentes agentes antiinflamatórios e possuem efeito antitrombótico, reduzindo doenças cardiovasculares, neoplasias e colite ulcerativa (ANTI et al., 1992). Além disso, os resultados das pesquisas vêm confirmando que um aumento na ingestão de ácidos graxos ω-3 reduz a taxa total de colesterol no sangue, um outro fator para redução de doenças cardiovasculares (HARRIS et al., 1999; UAUY & VALENZUELA, 2000). Estudos clínicos com suplementação de ω-3,

junto com consumo reduzido de gordura também têm sido sugeridos para a prevenção de câncer de mama (STOLL, 1998). Portanto, a semente do linho, bem como outras fontes importantes de alfa-linolênico, deve ser incorporada à dieta à fim de se obter estes efeitos benéficos (CONNOR et al., 1999).

Já os ácidos graxos ômega-6, são necessários para a estimulação do crescimento, manutenção da pele, crescimento capilar, regulação do metabolismo do carboidrato, atividade e manutenção do desempenho reprodutivo, dentre outros efeitos fisiológicos. No caso da deficiência deste ácido ocorrem taxas de crescimento reduzidas, dermatite escamosa com aumento da perda de água, infertilidade e diminuição das respostas inflamatórias, pois a aderência e a agregação de plaquetas ficam prejudicadas devido à síntese limitada de tromboxanos, neste caso. E as funções dos monócitos e macrófagos apresentam-se defeituosas devido à produção prejudicada de eicosanóides (SHILS, 2003).

Uma das principais funções já mencionadas destes ácidos graxos é o seu papel como componente dos fosfolipídios, contribuindo para a integridade das membranas plasmática e intracelulares. Devido a esse acúmulo nas membranas, o tipo e a quantidade destes podem influenciar inúmeras funções fisiológicas. A flexibilidade natural desses ácidos graxos resulta em um aumento significativo na fluidez da membrana, além de aumentar a eficiência de eventos de fusão de membrana. No cérebro, estes ácidos essenciais são encontrados nas membranas de células sinápticas e a presença destes, nesses locais, permite uma melhora na eficiência de fusão de vesículas às membranas (KOLETZKO et al., 2001; MARSZALEK & LODISH, 2005).

O DHA, oriundo da família n-3, tem importante função na formação, desenvolvimento e funcionamento do cérebro e da retina, e a diminuição dos níveis desse ácido nos tecidos da retina tem sido associada, em recém-nascidos, com anormalidades no desenvolvimento visual, e em adultos, com a diminuição da acuidade visual (SANGIOVANNI & CHEW, 2005; CHEN et al., 1996). Em crianças com síndrome de Zellweger, caracterizada por déficit na síntese de DHA, a ingestão prolongada desse ácido graxo tem-se mostrado eficiente para amenizar os sintomas relacionados com as funções visuais, hepáticas, cerebrais e musculares (MARTINEZ et al., 2000).

Durante o crescimento dos neuritos, altas concentrações de DHA são encontradas nos cones de crescimento, revelando que este ácido graxo pode ser extremamente importante para um crescimento máximo dos neuritos durante o desenvolvimento neural, como também este pode ser importante para uma eficiente regeneração dos axônios e dendritos após uma lesão neural (MARSZALEK & LODISH, 2005).

Em estudos efetuados com animais, observou-se que as dietas deficientes em ácidos graxos ômega-3, provocam o declínio da concentração de DHA nos tecidos do cérebro e da retina, e elevam a quantidade de ADP. Portanto, na ausência de DHA, ocorre a síntese do ácido graxo mais semelhante, o ADP (ANDERSON & CONNOR, 1994; NEURINGER et al., 1986).

O ácido araquidônico, oriundo da família n-6, também está fortemente relacionado com o desenvolvimento do cérebro e da retina durante o período gestacional e os primeiros anos de vida. Embora seja encontrado no cérebro em quantidades menores que o DHA, os fosfolipídios associados aos neurônios são altamente enriquecidos com AA, o que tem sugerido o seu envolvimento na transmissão sináptica (YOUDIM et al., 2000; PIOMELLI, 1994).

Entretanto, a existência de uma maior afinidade do AA pela enzima ciclo-oxigenase, responsável pela obtenção de prostanóides e conversão deste ácido graxo em endoperóxidos cíclicos, que origina as prostaglandinas, resulta em uma maior probabilidade de obtenção das prostaglandinas e tromboxanos da série 2, que participam de inúmeros processos inflamatórios no organismo. Portanto, a produção excessiva de prostanóides da série 2 está relacionada com a ocorrência de desordens imunológicas, doenças cardiovasculares e inflamatórias, sendo recomendado o aumento na ingestão de ácidos graxos da família n-3 para elevar a produção de prostanóides da série 3 (ALBERTAZZI & COUPLAND, 2002; SIMOPOULOS, 2004). Assim, os valores de AA encontram-se aumentados em condições neuropatológicas inflamatórias (HAAG, 2003).

2.3. Ômega-3 durante a gestação e lactação

Durante o desenvolvimento fetal, PUFAs n-3 são transferidos da mãe para o feto via placenta e, após o nascimento, pelo leite materno (AIKAWA, 2007).

A habilidade da placenta em extrair esses ácidos graxos da circulação materna e transferi-los para o feto é de crucial importância, já que gera um enriquecimento desses lipídios na circulação fetal (INNIS, 2005; HERRERA, 2002).

Como a transferência placentária é seletivamente maior para AA e DHA do que para outros ácidos graxos, este fato determina concentrações sanguíneas fetais mais elevadas destes ácidos e também por várias semanas após o nascimento da criança. Isso é importante devido ao efeito positivo que estes lipídios representam no crescimento fetal, principalmente para crianças nascidas prematuras, e no desenvolvimento do sistema nervoso central (FLEITH & CLANDININ, 2005; ELIAS & INNIS, 2001; GUESNET et al., 1999).

O crescimento cerebral fetal acelera durante a segunda metade da gestação até 1 ano de vida da criança e se prolonga por mais alguns anos da infância, e justamente nessas fases, gestação e lactação, o aporte de ácidos graxos poliinsaturados, com destaque para o ômega-3, torna-se importante devido sua elongação em DHA que é rapidamente acumulado não só pelo cérebro como também pela retina do feto e recém-nascido (COLETTA et al., 2010).

A importância fisiológica dos ácidos graxos n-3 no desenvolvimento visual e neural da criança tem sido estudada intensamente nos últimos anos. Altas concentrações de DHA na retina e cérebro sugerem que este ácido graxo tem importante função no processo visual e neural (OKEN & BELLINGER, 2008; MAKRIDES et al., 2010).

Assim, a ingestão dietética adequada desses ácidos durante o período perinatal é essencial para o crescimento e desenvolvimento fetal e neonatal, como também, a nutrição intra-uterina pode influenciar no risco do desenvolvimento de doenças crônicas na fase adulta. Isso enfatiza a necessidade de uma adequada ingestão de

PUFAs durante a gravidez, lactação e infância (GROVE & SMITH, 2003). Vários consensos têm recomendado que gestantes consumam 200 mg/dia de DHA para otimizar os resultados da gravidez e saúde do feto (KOLETZKO et al., 2008).

Alguns estudos também têm mostrado outros efeitos positivos do aumento na ingestão desses ácidos graxos durante a gestação e pós-parto, como por exemplo, uma maior duração gestacional sem efeitos adversos, sendo considerado como um bom resultado pela perspectiva pediátrica, diminuição da pré-eclâmpsia associada à ação antiinflamatória dos ácidos n-3, como também possível prevenção ou tratamento da depressão durante a gravidez ou no período pós-parto (JENSEN, 2006; ADAIR, 1996; HIBBELN et al., 2006).

Essa ingestão de ácidos graxos poliinsaturados se estende também durante a fase de lactação, e em casos de lactantes com baixa ingestão desses lipídios, recomenda-se sua suplementação para aumentar seus conteúdos, principalmente de DHA no leite materno, desencadeando um adequado desenvolvimento neurológico e visual do bebê (BORIS et al., 2004).

Nas últimas décadas, especial atenção também tem sido dada à composição e aos aspectos fisiológicos da fração lipídica do leite materno (UAUY & CASTILLO, 2003).

A média do conteúdo de gordura no leite é de 3,8g/100 mL e essa fração lipídica fornece nutrientes essenciais tais como vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos linoléico e alfa-linolênico (McMANAMAN & NEVILLE, 2003; INNIS, 2003).

Entretanto, a qualidade dos lipídios da dieta materna tem influência direta no perfil de ácidos graxos do leite secretado, sendo que uma dieta rica em ácidos graxos poliinsaturados vai determinar maiores níveis destes no leite secretado (TINOCO et al., 2007).

Por outro lado, dietas maternas deficientes nesses ácidos graxos, contribuem para um déficit destes no leite materno, principalmente de DHA, resultando em problemas, a longo prazo, sobre as funções cognitivas, comportamentais e baixa acuidade visual infantil, fatos que têm estimulado a suplementação de DHA até

mesmo nas fórmulas infantis (HEIRD & LAPILLONNE, 2005; FEWTRELL, 2006; UAUY & DANGOUR, 2006).

Sendo assim, a composição lipídica da dieta materna tem um efeito marcante sobre a composição de ácidos graxos transferidos para o feto e para o lactente, e mediante isso, vários estudos enfatizam a necessidade de se assegurar recomendações de gordura dietética, dando ênfase principalmente aos alimentos ricos em ácidos graxos n-3, durante a gestação e lactação, que são períodos de intenso anabolismo e transferência de nutrientes para o desenvolvimento do bebê (INNIS, 2007).

2.4. Fisiologia da retina e suas funções

A retina é um tecido fino, transparente e delicado que reveste o olho por dentro e de acordo com sua classificação anatômica pode ser dividido em duas porções, a retina central e a periférica (ARATA et al., 2006).

Este tecido é separado da circulação sistêmica pelas barreiras hemato-retiniana e hemato-aquosa e recebe seus suprimentos nutricionais das circulações retiniana e coroidal. Dentre suas funções, destacam-se a captação de fótons, conversão de energia fotoquímica em energia elétrica, integração dos potenciais de ação resultantes e transmissão destes para os centros visuais superiores até o lobo occipital do cérebro (BITO et al., 1978).

De acordo com sua organização laminar, as células da retina estão dispostas em camadas (figura 3). Tomando como referência o globo ocular, a retina apresenta como camada mais externa o epitélio pigmentar, que serve como um condutor seletivo de substrato e permite a difusão de oxigênio da coróide para a retina, além de constituir a barreira hemato-retiniana externa, participar da absorção de luz e em conjunto com os fotorreceptores participa do ciclo da vitamina A (AMARAL, 2008; STRAUSS, 2005).

O epitélio pigmentar é seguido pela camada de segmento externo dos fotorreceptores (cones e bastonetes) e pela camada nuclear externa que contém os corpos celulares destas células (AMARAL, 2008). A imagem fornecida pelos cones é mais nítida e mais rica em detalhes, e existem três tipos de cones, um que se excita com luz vermelha, outro com luz verde, e o terceiro com luz azul. Já os bastonetes, não têm poder de resolução visual tão bom, mas são mais sensíveis à luz do que os cones, sendo assim, em situações de pouca luminosidade, os bastonetes são os responsáveis pela visão, a chamada visão noturna (BIO, 2000).

Na próxima camada, a plexiforme externa, os fotorreceptores estabelecem contatos sinápticos com as células bipolares e horizontais, e mais internamente, encontra-se a camada nuclear interna, na qual se apresentam os corpos celulares das células horizontais, bipolares e amácrinas, seguida pela camada plexiforme interna, onde estas três últimas células citadas estabelecem contato sináptico com as células ganglionares que estão localizadas na camada mais interna, chamada de camada de células ganglionares, cujos axônios irão formar o nervo óptico, que conduz a informação visual para os centros cerebrais superiores (AMARAL, 2008).

Os fotorreceptores, células bipolares, horizontais, amácrinas e ganglionares constituem os neurônios da retina e desempenham funções sensoriais (MASLAND, 2001). As células de Müller são um tipo de células gliais que dão suporte nutricional e regulatório para esses neurônios (GARDNER et al., 1997).

Além dessas células, a retina apresenta outros tipos, como a microglia que desempenha funções imunomoduladoras, constituindo uma população de macrófagos residentes que monitoram o ambiente local, reagem ao estresse causado por infecção, trauma ou deslocamento de retina e removem células apoptóticas através da fagocitose (ELWARD & GASQUE, 2003). As outras são as células vasculares endoteliais e pericitos que dão suporte nutricional e removem produtos indesejáveis da retina (GARDNER et al., 2002).

Figura 3 - Morfologia da retina (YANG, 2004).

A retina apresenta duas regiões especiais, fovea centralis ou fóvea e o disco óptico (figura 4). A fóvea está no eixo óptico do olho em que se projeta a imagem do objeto focalizado, e a imagem que nela se forma tem grande nitidez. Portanto, é a região da retina mais altamente especializada para a visão de alta resolução, apresentando apenas cones, além de permitir que a luz atinja os fotorreceptores sem passar pelas demais camadas da retina, maximizando assim, a acuidade visual. Em contrapartida, o disco óptico é o ponto insensível a luz e do qual emergem o nervo óptico e os vasos sanguíneos da retina, sendo conhecido como o ponto cego (BIO, 2000).

Figura 4 – Fovea centralis e ponto cego (BIO, 2000).

A funcionalidade desse tecido começa com a transdução do sinal luminoso para sinais eletroquímicos mediante a chegada de fótons de luz nos pigmentos visuais dos fotorreceptores, que mudam de conformação, ativando a proteína transducina, e esta por sua vez ativa a fosfodiesterase visual, levando ao fechamento de canais de sódio e a conseqüente hiperpolarização da célula fotorreceptora. É no segmento externo de fotorreceptores que ocorre a transdução do sinal luminoso em sinalização neural e esta passa a ser transmitida para as células bipolares, sofrendo múltiplas modulações ao longo do percurso pelas células horizontais, amácrinas e células de Müller, até chegar às células ganglionares que projetam seus axônios aos alvos subcorticais através do nervo óptico, e este se projeta para a base do diencéfalo onde converge para formar o quiasma óptico (GRAZIANO & LEONE, 2005; AMARAL, 2008).

Após atravessarem o quiasma óptico (figura 5), as projeções das células ganglionares rumam em direção aos alvos visuais subcorticais, onde vão estabelecer seus contatos sinápticos de forma ordenada em camadas visuais específicas, sendo o colículo superior um dos principais centros visuais subcorticais em mamíferos, e em roedores, o principal alvo retiniano, visto que todas as células ganglionares estendem seus axônios para este núcleo visual (NAKAHARA et al., 2006; LINDEN & PERRY, 1983).

Figura 5 - Representação da via retinotectal de ratos. Os axônios do nervo óptico (ON) terminam, principalmente, no colículo superior (SC) e alguns deles no pré-tectum (PT). Outras abreviaturas: BS: tronco cerebral; Cer: cerebelo; IC: colículo superior inferior; OC: quiasma óptico; OT: trato óptico. (HEIDUSCHKA & THANOS, 2000).

2.5. Retina e Sistema Nervoso Central

A maneira precisa com a qual o sistema nervoso funciona requer uma apropriada interação entre aferências pré-sinápticas e seus alvos pós-sinápticos. Uma das características dos padrões de conectividade axonal dos sistemas sensoriais é sua

organização em mapas topográficos, sendo assim, os axônios retinotectais apresentam uma topografia organizada em que a inervação de seus alvos reflete a organização das células da retina, ou seja, axônios de células ganglionares vizinhas ocupam regiões vizinhas na superfície do colículo superior, onde os axônios dessas células da região temporal da retina se projetam para a região mais rostral do colículo, enquanto que a região nasal da retina inerva a área mais caudal do colículo (figura 6) (GAREL & RUBENSTEIN, 2004; SCHULTE & BUMSTED-O’BRIEN, 2008).

FIGURA 6 - Representação do sistema visual de mamíferos. As projeções das células ganglionares da retina (CGR) sofrem decussação parcial no quiasma óptico, de tal forma que as células da retina temporal que não cruzam se estabilizam na região rostral do colículo superior (CS) ipsolateral (verde), enquanto que as células da retina temporal cruzam quiasma óptico e se projetam para a região caudal do CS contralateral (vermelho) (GUAN & RAO, 2003).

Sendo assim, a retina tem sido muito utilizada como modelo experimental para o estudo do desenvolvimento e das comunicações químicas entre as células nervosas,

já que apresenta uma complexidade neuroquímica semelhante à de outras regiões do sistema nervoso (FREITAS, 2008).

Além disso, esse tecido se destaca por ser um tecido nervoso de fácil acesso podendo ser obtido durante quase todo o período de desenvolvimento embrionário, como também, seus tipos celulares expressam quase todos os sistemas de neurotransmissores e neuromoduladores que estão presentes em diversas áreas cerebrais, com destaque para o glutamato e GABA (ácido gama-aminobutírico) (SOUZA, 2010).

Os neurônios retinianos se comunicam por meio de um intricado padrão de conexões, o que torna esse tecido mais uma vez um excelente modelo de estudo do processamento de informações por circuitos neurais complexos. A via caracterizada pela passagem de informação de fotorreceptores para células bipolares e ganglionares é denominada via radial, enquanto que a modulação desses sinais pelas células horizontais e amácrinas é denominada via lateral (NEWMAN, 2004).

A retina serve principalmente de exemplo para o que ocorre no desenvolvimento do córtex cerebral. As suas células apresentam o fenômeno de migração nuclear intercinética durante o ciclo celular. Durante a fase G1 (fase de síntese protéica), os núcleos dessas células se deslocam da zona ventricular, localizada em uma região adjacente ao epitélio pigmentar, para a camada ganglionar, onde ocorre a fase S (fase de duplicação do DNA). Após a duplicação do DNA (ácido desoxirribonucléico), os núcleos retornam à zona ventricular, onde ocorre a fase M (mitose). Durante este período, a célula mantém contato com ambas as extremidades da retina através de processos citoplasmáticos, os quais são retraídos na transição de G2 (fase de duplicação dos centríolos) para M (PEARSON et al., 2002).

A neurogênese desse tecido inicia-se na área dorsotemporal da retina central, próximo ao nervo óptico, a partir de estruturas do diencéfalo, conhecidas como vesículas ópticas, e o desenvolvimento da topografia retinotectal de roedores envolve uma seqüência de eventos (DONOVAN & DYER, 2005; PRADA et al., 1991; VELASCO, 2009).

As células ganglionares da retina de ratos são geradas entre os dias embrionários 14 e 22 (E14 – E22) (REESE & COLELLO, 1992). Estudos mostram que em E15 são observados os primeiros cones de crescimento no quiasma óptico (HORSBURGH & SEFTON, 1986). Em E16, as projeções já alcançam a borda do colículo superior, e em torno de E17 já são detectadas as primeiras sinapses (LUND & LUND, 1976).

Entretanto, apesar dos axônios das células ganglionares atingirem as áreas visuais cerebrais em estágios iniciais do desenvolvimento, essas projeções encontram-se desordenadas. Somente por volta da segunda semana de vida pós-natal, as projeções retinotectais de roedores apresentam um desenvolvimento similar ao de animais adultos (SERFATY & LINDEN, 1994).

2.6. Ômega-3 e retina

Os principais ácidos graxos poliinsaturados encontrados na retina são o DHA e AA, ambos presentes nas membranas neural e vascular, além do EPA, que é encontrado nas células vasculares endoteliais da retina (SANGIOVANNI & CHEW, 2005).

O destaque vai para o DHA, considerado o ácido graxo mais abundante tanto no cérebro quanto na retina, estando presente nos fosfolipídios de membrana, principalmente fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina, espécies de fosfolipídios da retina, além de ser encontrado nos plasmalogênios, compostos relacionados à proteção celular contra o estresse oxidativo (MARSZALEK & LODISH, 2005; UAUY et al., 2000; ANDRÉ, 2005).

A concentração deste ácido graxo no tecido retiniano é de cerca de 22 – 33% do total de ácidos graxos, principalmente no segmento externo dos fotorreceptores, onde está presente aproximadamente em 30 – 40% do total de ácidos graxos nessa camada da retina, e dessa forma, atua nas membranas dos cones e bastonetes,

conferindo a fluidez necessária para que ocorra o processo de transdução do sinal luminoso e sua conversão em sinal elétrico, que é posteriormente processado pelo cérebro (UAUY & HOFFMAN, 2000).

Sendo assim, os fotorreceptores, iniciantes do processo visual, são os principais detentores dos LCPUFAs nesse tecido, devido a níveis excepcionais de DHA, e as maiores concentrações deste são encontradas, justamente, nos cones. O DHA corresponde a 50% do total de ácidos graxos nas estruturas fosfolipídicas dos fotorreceptores e altos níveis deste parecem maximizar a eficiência e a sensibilidade do processo de fototransdução (INNIS, 2007).

Porém, a capacidade dos fotorreceptores em sintetizar DHA é limitada (WANG & ANDERSON, 1993; WETZEL et al., 1991), sendo o epitélio pigmentado e o endotélio da retina, as células capazes de sintetizar esse ácido graxo (WANG & ANDERSON, 1993; DELTON et al., 1997). Assim, o suporte de DHA para os fotorreceptores vem por meio da transferência de LCPUFAs das células do epitélio pigmentado da retina, astrócitos e células de Müller para estes, já que não há um contato direto entre os fotorreceptores e circulação (SANGIOVANNI & CHEW, 2005).

Há relatos na literatura de que os ácidos graxos n-3 conferem proteção às membranas neural e vascular da retina, apresentando atividade para a prevenção de algumas doenças de grande importância para Saúde Pública, como a retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade e degeneração macular relacionada à idade neovascular, sendo o DHA um importante componente estrutural desse tecido, apresentando ação na permeabilidade e fluidez de suas membranas, além de conferir proteção contra os fatores envolvidos na patologia da vascularização retiniana, os danos causados pela exposição à luz, espécies reativas de oxigênio e radicais livres, inflamações e alterações na retina relacionadas com a idade (DMRI) (SANGIOVANNI & CHEW, 2005).

O DHA é sintetizado principalmente a partir do ácido alfa-linolênico dentro do fígado. Uma ingestão de 1,6g/dia de n-3, sendo que a maioria está na forma de ácido alfa-linolênico, obtém-se aproximadamente de 0,1 a 0,2g/dia de DHA (SCOTT & BAZAN, 1989).

O ácido alfa-linolênico entra nos hepatócitos através de um receptor, e esse processo é ativado pela Coenzima A (CoA). Logo em seguida, sofre elongação e dessaturação em DHA e este é transportado através das lipoproteínas (VLDL) nos capilares até os tecidos-alvos, como os fosfolipídios que compõem as membranas da retina, promovendo então a formação e desenvolvimento desse tecido (SANGIOVANNI & CHEW, 2005).

Estudos mostram que um fornecimento insuficiente de ácidos graxos ômega-3 durante o desenvolvimento pré e pós-natal diminui o conteúdo de DHA nos tecidos neurais, com um aumento recíproco de ADP, levando a uma variedade de déficits visuais, olfatórios, cognitivos e comportamentais em modelos animais. Em humanos, essa privação dietética resulta em alterações no padrão de ácidos graxos presentes nos fosfolipídios da retina, causando redução também do aporte de DHA (aproximadamente 40% do nível normal), sendo o suficiente para alterar a função visual (LIM et al., 2005).

2.7. Desenvolvimento neurológico e visual

O sistema nervoso central (SNC) infantil apresenta um dinamismo evolutivo muito intenso e seu amadurecimento decorre de eventos aditivos/progressivos (proliferação e migração neuronal, organização e mielinização) e subtrativos/regressivos (morte neuronal/apoptose, retração axonal e degeneração sináptica) (REED, 2005).

No homem, a proliferação neuronal ocorre a partir da zona ventricular e subventricular, produzida por divisões das células-tronco entre dois e quatro meses de gestação, com rápido crescimento do número de células nervosas. A migração tem pico de atividade dos três aos cinco meses de gestação, quando as células nervosas já formadas migram de seus locais de origem dentro do SNC para locais onde exercerão suas funções ao longo da vida; nessa fase inicia-se a organização do córtex cerebral, e esta começa no quinto mês de gestação e continua até alguns

anos após o nascimento. Por volta do segundo trimestre de gestação e estendendo-se até a vida adulta, ocorre a mielinização, caracterizada pela formação de uma membrana de mielina ao redor dos axônios, funcionando como isolante elétrico, com conteúdo predominantemente lipídico, e que permite uma condução mais rápida do impulso nervoso (VOLPE, 2001).

Ao nascer, muitos dos nervos dos bebês não possuem bainhas de mielina maduras, o que explica os movimentos destes serem inábeis e sem coordenação, e, o desenvolvimento anormal destas bainhas pode dar lugar a defeitos neurológicos permanentes (MERCK, 2007).

Ao mesmo tempo, a visão é considerada um dos mais importantes sentidos no desenvolvimento físico e cognitivo da criança. Esta é o agente motivador das primeiras ações voluntárias dos membros superiores. O desenvolvimento motor e a capacidade de comunicação são prejudicados na criança com deficiência visual, pois os gestos e as condutas sociais são aprendidos pelo feedback visual (GRAZIANO & LEONE, 2005).

Entretanto, ao nascimento, os aspectos fisiológicos, anatômicos e neurológicos da visão ainda se encontram imaturos. Parte do desenvolvimento visual ocorre muito rapidamente, visto que é nos primeiros meses de vida que ocorrem importantes modificações no comportamento visual de toda criança, e estas modificações sofrem influências de fatores de maturação neurológica e de experiências ambientais (KANDEL et al., 1997; LINDSTEDT, 2000).

Estudos experimentais de Hubel e Wiesel, na década de 60, demonstraram a inter-relação entre maturação neurológica e experiências ambientais em relação ao desenvolvimento visual, onde foi comprovado que a privação dos estímulos visuais nas primeiras semanas de vida provocava a perda da capacidade visual e alterações anatômicas nas vias neurológicas da visão (RUAS et al., 2006).

Portanto, durante o desenvolvimento visual, os neurônios apresentam um perfil mais instável de contatos sinápticos estando mais susceptíveis a influências do ambiente durante estabelecimento das conexões. A janela temporal na qual o

sistema encontra-se mais imaturo e suscetível a mudanças é conhecida como período crítico (KATZ & CROWLEY, 2002).

Sendo assim, o sistema visual possui um período de maior plasticidade para o desenvolvimento de determinadas funções visuais, e cada função visual tem seu perfil específico de desenvolvimento, que depende do nível da função ao nascimento, da velocidade de desenvolvimento e do intervalo do período crítico (LINDSTEDT, 2000).

O período crítico varia nas espécies e nas estruturas a serem estudadas, e além de ter papel fundamental no desenvolvimento de sistemas sensoriais, este também é importante em outras funções como o aprendizado (BERARDI & MAFFEI, 2000).

Enquanto que em humanos o período crítico de desenvolvimento visual se estende dos três meses de vida pós-natal até os seis anos de idade, em ratos este vai da 3ª semana de vida pós-natal até a 6ª semana, sendo que nas duas primeiras semanas de vida pós-natal do animal, o seu sistema visual possui maior plasticidade neural, ou seja, uma habilidade dos neurônios em alterar seus padrões de conexão funcional em resposta às variações de estímulos (FOX & CATERSON, 2002; CAMPELLO-COSTA et al., 2000; SHAW et al., 1994).

Desta forma, no período crítico de desenvolvimento visual do lactente, é possível observar como este expressa seu comportamento visual na relação com os objetos e ambiente, podendo-se obter informações valiosas sobre a conduta visual, já que o comportamento visual deve ser valorizado como uma manifestação do desenvolvimento neurológico (GAGLIARDO, 2004).

Entretanto, em relação aos roedores, há um consenso na literatura de que os ratos são criaturas noturnas, apresentando visão pobre. Porém, quando possível, os ratos usam a visão como principal sistema perceptivo para obter informações sobre o ambiente (ZHENG et al., 2008).

Ao mesmo tempo, vários estudos sobre o impacto da nutrição no desenvolvimento do sistema nervoso central e visual, demonstraram que reduções no fornecimento de nutrientes essenciais durante a gestação e infância possuem

efeitos profundos no crescimento somático e no desenvolvimento estrutural e funcional do cérebro e da visão. Dentre esses nutrientes essenciais, destaca-se o ômega-3, encontrado em alta concentração, dentre uma de suas fontes, na semente de linhaça (UAUY & DANGOUR, 2006; ALMEIDA et al., 2009).

2.8. Semente de linhaça

A linhaça (Linum usitatissimum), originária do linho, é uma semente oleaginosa muito utilizada em produtos forneados e como componente de misturas de cereais matinais (TURATTI, 2000).

O grande destaque desta oleaginosa está no seu alto teor de ácido alfa-linolênico e, aproximadamente 20% deste ácido graxo contido na linhaça é convertido no corpo humano em DHA (HU, C., 2007).

Em relação às fibras dietéticas, estas correspondem a cerca de 28% do peso seco desta semente com proporções de fibras solúveis e insolúveis variando de 20:80 e 40:60 (HARPER et al., 2006).

Além disso, esta oleaginosa é considerada um alimento nutracêutico, pelo fato de ser uma fonte natural de fitoquímicos, aumentando ainda mais o interesse no seu consumo, associado ao seu conteúdo de bioativos que têm ação antioxidante, destacando-se dentre eles, os flavonóides e lignanos. Vários mecanismos têm sido sugeridos para explicar as ações dos lignanos, incluindo as atividades antiestrogênica, antiaterogênica, anticarcinogênica e antioxidante. A presença de tocoferóis nesta semente também aumenta sua atividade antioxidante, com destaque para o gama-tocoferol (CARAGAY, 1998; YUAN et al., 1999; OOMAH et al.,1995).

Ao mesmo tempo, o estudo realizado por LEITE et al. (2011) constatou que esta oleaginosa promoveu aumento no peso cerebral de ratos durante a infância e adolescência, o que os levou a concluir que supostamente esta semente promoveu

um melhor desenvolvimento cerebral nesses animais, ou seja, a semente de linhaça de alguma forma interfere no desenvolvimento do sistema nervoso central.

Por apresentar tais características, pode-se perceber os benefícios desta oleaginosa no contexto de saúde em geral, fato que vem aumentando cada vez mais as pesquisas em torno desta semente.

Considerando que os ácidos graxos ômega-3 são essenciais durante o período crítico de desenvolvimento do sistema nervoso e que a semente de linhaça é uma oleaginosa rica nestes lipídios, este trabalho pretende contribuir para o conhecimento das influências desses ácidos graxos no sistema nervoso através do estudo da retina de mamíferos.

A oferta de ácidos graxos essenciais na alimentação suplementada com linhaça interfere no desenvolvimento da retina de ratos durante o seu desenvolvimento embrionário e pós-natal.

5.1. Objetivo geral

Avaliar os efeitos da semente de linhaça no crescimento corporal e na organização histológica da retina de ratos da linhagem Lister Hooded.

5.2. Objetivos específicos

 Avaliar o perfil lipídico das rações experimentais;

 Avaliar o consumo de ração das ratas matrizes e dos seus filhotes após desmame;

 Avaliar a variação ponderal dos filhotes durante a lactação e do 21° ao 42° dia de vida pós-natal;

 Avaliar a organização histológica da retina e de suas camadas em idades pós-natal: aos 14 dias de vida (P14), aos 21 dias de vida (P21) e aos quarenta e dois dias de vida (P42) pós-natal.

6.1. Ética

O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal, sob protocolo de número 00110-09.

6.2. Material

Semente de linhaça

As amostras de linhaça utilizadas eram da linhaça marrom e oriundas da empresa Arma Zen Produtos Naturais LTDA, Rio de Janeiro-RJ.

Rações experimentais

A semente de linhaça foi triturada em liquidificador para obtenção da farinha, que posteriormente foi pesada, ensacada, lacrada e armazenada em geladeira até ser usada para a confecção da ração. As rações experimentais preparadas no Laboratório de Nutrição Experimental (Labne) da UFF foram adicionadas de misturas de vitaminas e minerais segundo as normas do Comitee on Laboratory Animal Diets, 1979, modificadas segundo as recomendações do American Institute of Nutrition-93 garantindo que cada nutriente exerça suas funções específicas (REEVES et al., 1993).

Os ingredientes das rações experimentais (tabela 1) foram pesados e homogeneizados em batedeira industrial Hobart® (São Paulo, SP, Brasil), com água fervente para gelatinização do amido. A massa obtida foi transformada em pellets e seca em estufa ventilada (Fabbe-Primar® n°171, São Paulo, SP, Brasil) a 60°C por 24 horas, e após identificação, armazenada sob refrigeração até o uso.

Tabela 1 – Formulação das Rações (g/100g de alimento) com 17 % de proteína.

Componentes Controle Linhaça

Caseína1 20 14,12 Linhaça2 - 25,0 Amido3 52,95 45,83 Açúcar4 10,0 10,0 Mix Minerais1 3,5 3,5 Mix Vitaminas1 1,0 1,0 Óleo de soja5 7,0 - Celulose6 5,0 - B-colina1 0,25 0,25 Cistina1 0,3 0,3 Total 100 100 VET (Kcal/100g) 355,64 388,91

1-Rhosther Industria e Comércio LTDA, 2-ArmaZem LTDA, 3-Maisena, 4-União, 5-Liza®, 6-Macrocel®, VET-Valor energético total.

Animais

Foram utilizados, neste estudo, ratos da espécie Rattus norvegicus, da linhagem Lister Hooded, por apresentarem pigmentação no tecido retiniano. O pigmento do epitélio da retina ao absorver a luz que já incidiu sobre os pigmentos fotorreceptores evita que esta reflita nas estruturas subjacentes e retorne para os fotorreceptores, prejudicando a informação visual. Embora o objetivo deste trabalho não tenha sido avaliar a função retiniana, decidimos utilizar ratos não albinos por considerá-los um modelo mais adequado ao estudo deste tecido do sistema visual.

6.3. Delineamento experimental

O ensaio biológico inicial foi desenvolvido utilizando 22 ratas Lister hooded, divididas em dois grupos com onze animais cada:

1. Grupo Controle (GC), recebeu ração à base de caseína com 17% de proteínas, ad libitum.

2. Grupo Linhaça (GL), recebeu ração suplementada com 25% de semente de linhaça e com total de 17% de proteínas, ad libitum.

As ratas receberam as rações experimentais desde o acasalamento, e após os 15 dias de acasalamento, estas foram mantidas em gaiolas individuais com seus filhotes, com temperatura constante (24 ± 2°C), iluminação controlada e ciclo claro-escuro de 12 em 12 horas.

Aos 14 dias de vida dos filhotes (P14), 12 animais de cada grupo foram sacrificados para a retirada e análise das retinas. Após o período de desmame (P21), ou seja, ao 21° dia de vida dos filhotes, realizou-se a separação das ratas de seus filhotes para ordenha e coleta do leite materno, e sacrificou-se 12 filhotes de cada grupo para coleta das retinas. Os 12 animais restantes de cada grupo passaram a receber rações experimentais com linhaça e caseína, amabas com 10% de proteínas, até o 42° de dia de vida (P42), quando foram sacrificados para coleta das amostras. Durante todo esse período controlou-se 2 vezes na semana, o consumo de ração das ratas e dos filhotes após desmame, além do peso corporal destes desde o nascimento até o 42° dia de vida.

6.4. Métodos

6.4.1. Análise bioquímica

Todas as rações foram analisadas quanto à composição dos ácidos graxos no Instituto Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

A extração lipídica, saponificação e metilação dos ácidos graxos foram realizadas, em duplicata, partindo de uma alíquota de 0,2 g de amostra (ração) de acordo com o método LEPAGE & ROY (1987). Os ésteres metílicos foram quantificados por cromatografia gasosa, utilizando-se o cromatógrafo Perkin Elmer autosystem XL equipado com detector de chama ionizável e o software Turbochrom Navigator. Os ácidos graxos foram separados com coluna capilar SP 2560 (Supelco, USA) com 100mm x 0,25mm x 0,20µm. O hidrogênio foi utilizado como gás de arraste. As temperaturas de injeção e detecção foram respectivamente, 260°C e 280°C. A temperatura de corrida foi programada para iniciar à 135°C durante 5 minutos com subida de 2°C/minuto até 195°C. A partir daí, com subida de 4°C até alcançar 240°C, permanecendo por 2,5 minutos. O tempo total da corrida somou 45 minutos. A pressão do gás arraste foi de 32 Psi. A razão de split foi de 1:70. Os ésteres foram identificados por comparação com seu tempo de retenção com padrões conhecidos (Sigma, Supelco). Os resultados foram expressos como percentual de ácidos graxos totais.

6.4.2. Coleta de material

6.4.2.1. Leite materno

A retirada do leite foi realizada seguindo a técnica descrita por KEEN et al. (1981), na qual as mães foram separadas de seus filhotes no 21° dia de lactação por 4 horas, e receberam injeção intraperitoneal do anestésico xilazina (Calmiun) 20mg/Kg e ocitocina (Naox) 5UI para estimular a ejeção do leite, sendo este posteriormente estocado à -20°C até ser analisado.

6.4.2.2. Olhos dos filhotes e obtenção dos cortes

Após anestesia com Tiopental (0,15mL x peso corporal/100), os filhotes foram sacrificados por decapitação em guilhotina e seus olhos foram recolhidos com auxílio de pinça e tesoura, e posteriormente armazenados em solução de paraformaldeído 4% por 3 horas. Estes então foram lavados em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, e em seguida imersos em tampão sacarose 20% para crioproteção. Após essa etapa, os olhos foram congelados utilizando um meio de congelamento próprio (EasyPath®, Killik, Brasil) para a obtenção dos cortes das retinas em criostato (LEICA® CM 1850), com espessuras de 16 µm.

6.4.3. Análises bioquímicas

As análises bioquímicas foram realizadas no Laboratório de Nutrição Experimental da Universidade Federal Fluminense e Laboratório de Plasticidade Neural da Universidade Federal Fluminense.

6.4.3.1. Determinação do crematócrito

Para esta determinação seguiu-se a técnica desenvolvida por LUCAS et al. (1978), na qual após homogeneização do leite ordenhado (1mL), este foi transferido para tubo de ensaio e aquecido em banho-maria à 40°C durante 10 minutos. Uma vez transcorrido o tempo, 3 alíquotas de 75 µl foram centrifugados por 15 minutos, à 1715Xg, para separação da coluna de creme e soro, e posterior cálculo do teor de gordura e valor energético total do leite.

Para calcular o teor de creme foi usada a seguinte fórmula: % de creme = Coluna de Creme (µm) x 100 ÷ Coluna Total (µm)

Para calcular o teor de gordura foi usada a seguinte fórmula: % de gordura = (% de creme – 0,59) ÷ 1,46

Para calcular o conteúdo energético total foi usada a seguinte fórmula: Kcal/100 mL de leite = (% de creme x 66,8 + 290) ÷ 10

6.4.3.2. Coloração das lâminas histológicas

As lâminas histológicas foram previamente gelatinizadas e coradas com corante cresil-violeta, utilizando o método de Nissl, seguindo o protocolo descrito abaixo:

 H2O destilada - 1 minuto

 Corante cresil-violeta - 1 minuto  H2O destilada - 1 minuto

 Álcool etílico 80% - 1 minuto  Álcool etílico 90% - 1 minuto  Álcool etílico 95% - 1 minuto  Álcool etílico 100% - 1minuto  Xilol 1 - 1 minuto  Xilol 2 - 1 minuto  Montagem das lamínulas com Entelan (Merk®)

6.4.3.3. Análise das retinas

As imagens do tecido retiniano foram obtidas em microscopia ótica de campo claro, utilizando-se o microscópio (ZEISS®, modelo AXIOSKOP, Alemanha), com aumento de 140x, e as lâminas foram digitalizadas em câmera digital (Soundvision® SV Micro), comparando-se, nas diferentes idades estudadas, a espessura das camadas da retina do grupo linhaça com o grupo controle por meio do programa Image J para quantificação dos dados obtidos. Para tal procedimento, mediu-se em cada animal 5 campos de cada camada do tecido, e tais camadas receberam as determinadas siglas: Camada de Segmento Externo e Interno dos Fotorreceptores (SEF); Camada Nuclear Externa (CNE); Camada Plexiforme Externa (CPE); Camada Nuclear Interna (CNI); Camada Plexiforme Interna (CPI); Camada de Células Ganglionares (CCG).

Figura 7 – Medição da espessura das camadas da retina.

6.4.4. Análise estatística

Os resultados das diferentes análises foram expressos em média e desvio padrão. Para análise do consumo de ração e crematócrito dos animais utilizou-se o Teste T-student. Na análise do número de crias por grupo e peso corporal dos filhotes, utilizou-se o Teste da soma dos postos de Wilcoxon. Para as análises do perfil lipídico das rações experimentais e comparação da espessura das camadas da retina dos filhotes foi utilizado ANOVA. Todos os dados foram avaliados com o software S-Plus 8.0 com p≤0,05.

7.1. Perfil lipídico das rações experimentais

A tabela 2 mostra que foram encontrados 31 ácidos graxos diferentes nas rações. Porém, neste estudo levamos em consideração para análise e discussão somente os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6, pois já foram descritos na literatura como influentes no desenvolvimento do cérebro e retina.

Assim, ao se analisar a presente tabela, percebe-se que o GL foi superior ao GC na quantidade do ácido C 18:3 n-3 (alfa-linolênico) e inferior na quantidade do ácido C 18:2 n-6 cis (linoléico).