19 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÉRIKA RAMOS SILVA
EFEITOS DO CARVACROL COMPLEXADO EM BETACICLODEXTRINA SOBRE A REAÇÃO INFLAMATÓRIA DE RATAS SUBMETIDAS À LESÃO
POR INALAÇÃO DE FUMAÇA
São Cristóvão 2018
20 É RIKA RA M OS S IL VA E FEIT OS DO CA RV AC ROL COM PLE XA D O E M B E T AC ICLO D E XTRINA S OB RE A REAÇ ÃO INFLAM AT ÓRIA D E RA T AS S UBM E T IDA S À LE S ÃO P OR INA L AÇ ÃO DE FU M AÇ A. 201 8
21 ÉRIKA RAMOS SILVA
EFEITOS DO CARVACROL COMPLEXADO EM BETACICLODEXTRINA SOBRE A REAÇÃO INFLAMATÓRIA DE RATAS SUBMETIDAS À LESÃO
POR INALAÇÃO DE FUMAÇA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador(a): Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo
São Cristóvão 2018
22 96 f. : il.
23 ÉRIKA RAMOS SILVA
EFEITOS DO CARVACROL COMPLEXADO EM BETACICLODEXTRINA SOBRE A REAÇÃO INFLAMATÓRIA DE RATAS SUBMETIDAS À LESÃO
POR INALAÇÃO DE FUMAÇA.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau Doutor em Ciências da Saúde.
Aprovada em: ____/_____/_____
Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo (UFS)
Prof. Dr. Marcio Roberto Viana dos Santos (UFS)
Prof. Dr. Lucindo José Quintans Junior (UFS)
Prof. Dr. Renan Guedes de Brito (UFS/ UNIT)
Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque (UNIT)
24 RESUMO
Efeitos do carvacrol complexado em betaciclodextrina sobre a reação inflamatória de ratas submetidas à lesão por inalação de fumaça. Silva, E.R., 2018. Tese de Doutorado, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Sergipe. 96 pg.
Introdução: A elevada morbidade, mortalidade das vítimas de lesão inalatória, bem como os custos com sua assistência, ressaltam a necessidade de investimento em tratamentos eficazes e de baixo custo que contenham o processo patológico local e sistêmico. O carvacrol é produto natural, com grande potencial terapêutico para esta afecção uma vez que possui propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. Objetivos: Avaliar o efeito do carvacrol complexado em betaciclodextrina (β-CD), administrado sob forma de aerossóis, sobre ratas submetidas à lesão por inalação de fumaça, considerando a toxicidade, os efeitos antioxidantes e os aspectos histomorfológicos da traquéia, pulmão e fígado. Materiais e Método: Estudo experimental longitudinal, randomizado com grupo controle, no qual 24 ratas adultas com ciclo estral regular foram distribuídas em 4 grupos: Controle (sem lesão e sem tratamento), oxigênio com soro fisiológico (GOS), oxigênio com carvacrol a jato (GOCJ) e oxigênio com carvacrol ultrassônico (GOCU), sendo seis ratas por grupo. Cerca de 48h após a lesão pulmonar as ratas foram eutanasiadas. Os testes aplicados foram de Shapiro-Wilk, Teste Anova One Way (distribuições normais), Teste Kruskal-Wallis (distribuições anormais) e post test de Dunnet. O nível de significância foi 95% (p<0.05). A análise histomorfológica foi realizada de maneira descritiva. Resultados: As variações nas taxas de hemoglobina, hematócrito, TGP/ALT, bilirrubina total, creatinina e ureia, mantiveram-se na faixa de normalidade. Não houve diferença nos níveis de MPO e TBARS entre os grupos (p>0,05), entretanto os níveis de GSH e FRAP, nos grupos GOCJ (p<0,01 e p<0,05) e COCU (p<0,01 e p<0,01), foram maiores que o GOS, semelhantes ao Controle. O GOCU teve maior preservação do epitélio traqueal, menor resposta inflamatória, redução das áreas de enfisema pulmonar e espessura dos septos alveolares. Carvacrol não gerou efeitos tóxicos celulares ou hepáticos. Conclusão: O carvacrol complexado em β-CD administrado pela via inalatória, na dose e concentração administradas, apresentou ação antioxidante, amenizou lesões traqueais e enfisema pulmonar, sem ocasionar hepatotoxidade.
25 ABSTRACT
Effects of complexed carvacrol on betacyclodextrin on the inflammatory reaction of rats subjected to smoke inhalation injury. Silva, E.R., 2018. PhD thesis, Post-graduation Program in Health Sciences, Federal University of Sergipe. 96 pg.
Introduction: The high morbidity, mortality of inhaled injury victims, as well as the costs of their care, underscore the need to invest in effective and low cost treatments that contain the local and systemic pathological process. Carvacrol is a natural product with great therapeutic potential for this condition since it has antioxidant and anti-inflammatory properties. Objective: To evaluate the effect of complexed beta-cyclodextrin (β-CD) carvacrol on aerosolized rats exposed to smoke inhalation injury, considering the toxicity, antioxidant effects and histomorphological aspects of the trachea, lung and liver. Materials and methods: A randomized, longitudinal experimental study with a control group in which 24 adult rats with regular estrous cycle were divided into 4 groups: Control (without injury and without treatment), oxygen with physiological saline (GOS), oxygen with carvacrol (GOCJ) and oxygen with ultrasonic carvacrol (GOCU), with six rats per group. About 48 hours after the lung injury the rats were euthanized. The tests applied were from Shapiro-Wilk, Anova Test One Way (normal distributions), Kruskal-Wallis Test (abnormal distributions) and Dunnet's post test. The level of significance was 95% (p <0.05). Histomorphological analysis was performed in a descriptive way. Results: Variations in the hemoglobin, hematocrit, TGP / ALT, total bilirubin, creatinine and urea rates remained within the normal range. There were no differences in the MPO and TBARS levels between the groups (p> 0.05), however the levels of GSH and FRAP in the GOCJ (p <0.01 and <0.05) and COCU (p <0, 01 and p <0.01), were greater than the GOS, similar to Control. GOCU had greater preservation of tracheal epithelium, lower inflammatory response, reduction of areas of pulmonary emphysema and thickness of alveolar septa. Carvacrol has not produced any toxic cellular or hepatic effects. Conclusion: Carvacrol complexed in β-CD administered by the inhalation route, at the dose and concentration administered, presented antioxidant action, ameliorated tracheal lesions and pulmonary emphysema, without causing hepatotoxicity.
26 AGRADECIMENTOS
Acho que não tenho como chegar a este momento sem atribuir a Deus toda honra e toda glória pelo privilégio de concluir este doutorado. Privilégio sim! Porque foi um grande prazer, sem pesar, poder conduzir esta pesquisa ao lado de pessoas tão queridas e competentes que me ensinaram muito mais que um método científico. Neste caminho fortaleci amizades, ampliei minha visão, acrescentei conhecimento, troquei experiências, amadureci minha alma, fortaleci meu espírito. Desconstruí conceitos, revisei teorias, abaixei a cabeça. Recomecei várias vezes. Reconheci meus limites e descobri como vencê-los. Por tudo que passei, Paizinho lindo, maravilhoso, sempre cheio de Amor e cuidado, eu declaro: meu coração está cheio de gratidão.
Tenho uma família linda representada pelos meus pais Ary e Risete, meu marido Claudemir, meus filhos Maria Júlia e Henrique e minhas irmãs. Todos, de diferentes formas, me incentivaram a prosseguir. Me mostraram que eu precisava ir além das adversidades e dos meus próprios limites. Que era preciso terminar o que eu havia começado, para que pudéssemos experimentar uma nova etapa nas nossas vidas. Eu amo muito, muito, muito todos vocês. Obrigada por compreenderem minha ausência e me ajudarem tanto.
Agradeço pelo meu excelente orientador, Adriano Antunes, que sempre confiou em meu trabalho e com respeito e humanização me ajudou a alcançar este objetivo. Permita-me chama-lo de Sir. Foi e sempre será uma honra compor seu grupo de pesquisa. Te desejo ainda mais sucesso e sabedoria na condução de seus projetos. Você merece ser ainda mais feliz.
À primeira dama, Paulinha Nunes, amiga tão especial, sempre tão cuidadosa e zelosa com todos a sua volta. Você deu ritmo a esta pesquisa, freando ou acelerando nos momentos exatos. Sentando para restabelecermos as metas. Não tenha dúvida de que suas intervenções foram essenciais para que chegássemos até aqui.
Saran, homem de princípios, habilidoso nas palavras e prática da ciência. Que Deus continue essencialmente presente em sua vida. Quantas vezes te agradecer, parecerá pouco para expressar minha gratidão.
Ao grupo de pesquisa em queimados, não queria citar nomes para não parecer injusta com alguém... mas com amizades tão preciosas, alguns mais chegados que irmãos, tudo fica mais leve e prazeroso! Uma delícia compartilhar com vocês cada momento!
27 Especialmente Fernanda Zoio e Fernanda Franja, grandes amigas, juntas desde o princípio, ajudando em momentos cruciais. Amo vocês!
Outras e outros foram chegando... Karen Karen, Hericalizandra, Luciana Zago, Luciana Garcez, Nayara, Juliana, Isabelle...vocês TODAS contribuíram de várias formas. Tenho certeza do sucesso deste grupo!
Nossos pimpolhos Luiz, Viviane, Adelvan. A excelência em seus trabalhos, aliviou a carga sobre meus ombros e nos permitiu cumprir prazos e metas.
Aos meninos do Left, especialmente Gaby, Lee, Paula Menezes, Yasmin, Bruno, Igor, Tati e todos os demais que ajudaram direta ou indiretamente.
A Alan, Tassinha, Professoras Ana Mara, Juliana e Edna Aragão, Professores Lucindo, Márcio, Ricardo Albuquerque, biomédicas da Maternidade Nossa Senhora de Lourdes (Daniela, Ane e Leila)... muito obrigada!
Impossível não reconhecer que estas múltiplas mãos e estes diversos olhares contribuíram sempre positivamente para esta conquista. Esta vitória é NOSSA! Obrigada mais uma vez.
28 DEDICATÓRIA
29 EPÍGRAFE
“Contudo, buscai com zelo os melhores dons. O amor que vem de Deus.” I Coríntios 12:31
30 LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Detalhamento da quantidade de grupos avaliados, ações desenvolvidas, quantidades de animais por grupo, tempos de sacrifício e quantidade de dosagens dos produtos ofertados.
31 LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuição da média e erro padrão das variáveis hematológicas dos grupos avaliados (hemograma).
41
Tabela 2. Distribuição da média e erro padrão das variáveis bioquímicas dos grupos avaliados.
32 LISTA DE FIGURAS
Figura 1- (A) Imagem da câmara para indução da lesão inalatória com o algodão distribuído para combustão.
36
Figura 1- (B) Demonstração da fumaça gerada durante o processo de queima do algodão.
36
Figura 1- (C) Rata submetida à lesão inalatória. 36
Figura 2- (A) Imagem da câmara desenvolvida para favorecer inalação de oxigênio e carvacrol inalatório.
37
Figura 2- (B) Sistema de inalação de oxigênio, soro fisiológico ou carvacrol inalatório contendo: micronebulizador + espaçador aderido à câmara de inalação.
37
Figura 2- (C) Rata adaptada à câmara de inalação. 37
Figura 3. Níveis de Mieloperoxidade (MPO) obtidos no tecido pulmonar das ratas dos grupos GC, GOS, GOCJ e GOCU.
44
Figura 4. Níveis das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) obtidos no tecido pulmonar das ratas dos grupos GC, GOS, GOCJ e GOCU.
45
Figura 5. Níveis de Glutationa reduzida (GSH) obtidos no tecido pulmonar das ratas dos grupos GC, GOS, GOCJ e GOCU.
46
Figura 6. Níveis de Potencial Antioxidante Total do Pulmão (FRAP) obtidos no tecido pulmonar das ratas dos grupos GC, GOS, GOCJ e GOCU.
46
Figura 7- Tecido traqueal das ratas alocadas nos grupos: (A) Controle- GC; (B) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e soro fisiológico 0,9%- GOS; (C) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio a Jato- GOCJ e (D) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio ultrassônico- GOCU. (↔) Espessura da reação de granulação; ED: edema (Hematoxilina e Eosina, H&E, 100x).
48
Figura 8- Tecido traqueal das ratas alocadas nos grupos: (A) Controle- GC; (B) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e soro fisiológico 0,9%- GOS; (C) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio a Jato- GOCJ e (D) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio ultrassônico- GOCU. (↔) cartilagem hialina; ER: epitélio Respiratório; EPE: epitélio Pavimentoso Estratificado; Min: mucosa inflamada; Gl: Glândulas, (Hematoxilina e Eosina, H&E, 400x).
33 Figura 9- Tecido pulmonar das ratas alocadas nos grupos: (A) Controle-GC; (B)
Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e soro fisiológico 0,9%- GOS; (C) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio a Jato- GOCJ e (D) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio ultrassônico- GOCU (Hematoxilina e Eosina, H&E, 100x).
51
Figura 10- Área enfisematosa das ratas alocadas nos grupos: (A) Controle- GC; (B) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e soro fisiológico 0,9%- GOS; (C) septo alveolar remanescente; (D) bronquiolos dilatados, (E) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio a Jato- GOCJ e (F) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio ultrassônico- GOCU (Hematoxilina e Eosina, H&E, 400x).
52
Figura 11- Tecido hepático das ratas alocadas nos grupos: (A) Controle- GC; (B) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e soro fisiológico 0,9%- GOS; Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio a Jato- GOCJ e (F) Grupo que foi lesado, recebeu oxigênio e carvacrol complexado em β-CD, meio ultrassônico- GOCU (Hematoxilina e Eosina, H&E, 100x).
34 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CD: Ciclodextrina β-CD: Betaciclodextrina IL-1β: Interleucina 1 beta IL2: Interleucina 2 IL4: Interleucina 4 IL6: Interleucina 6 IL-8: Interleucina 8 IL10: Interleucina 10
TNF: Fator de Necrose Tumoral TNF-α: Fator de Necrose Tumoral Alfa ALI: Lesão Alveolar Aguda
FiO2 : Frações Inspiradas de Oxigênio CO: Monóxido de Carbono
Fe3+: Enzimas Citocromo Oxidase IC: Intervalo de Confiança ATP: Trifosfato de adenosina ATPase: Adenosinatrifosfatase
CoA: Acetilação da Coenzima Acetil FDA: Food and Drugs Associacion
μm: Micrômetros
µg: Micrograma
CRL7272: Células Pulmonares Humanas
g: gramas
mg: miligrama
cm: Centímetro
l/min Litros por minuto
UR Umidade Relativa
g/Kg Gramas por kilograma de peso Lapec: Laboratório de Pesquisas
LeFT: Laboratório de Ensaios Farmacêuticos e Toxicidade SF: Soro Fisiológico
DPOC: Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica UFS: Universidade Federal de Sergipe UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético HE: Hematoxilina e Eosina
TBARS: Ácido Tiobarbitúrico
FRAP: Potencial Antioxidante Total do Plasma GSH: Glutationa reduzida
MDA: Malondialdeído MPO: Mieloperoxidase
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária SARA: Síndrome da Angústia Respiratória Aguda ERO: Espécie Reativa de Oxigênio
WBC: Células brancas sanguíneas (White Blood Cells) H&E: Hematoxilina e Eosina
COX-2: ciclooxigenase 2
35 SOD: Superóxido Dismutase
36 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 19 2 REVISÃO DE LITERATURA 22 2.1 A Lesão inalatória 22 2.2 Carvacrol 26 2.3 Complexação em Betaciclodextrina 29 3 OBJETIVOS 32 3.1 Geral 33 3.2 Específicos 33 4 MATERIAIS E MÉTODO 34
4.1 Desenho do estudo e modelo animal 34
4.2 Carvacrol como produto inalatório 35
4.3 Distribuição por grupos 35
4.4 Indução da lesão inalatória 36
4.5 Intervenção Terapêutica 37
4.6 Sedação, anestesia e eutanásia dos animais 38
4.7 Retirada das amostras 38
4.5 Análise estatística 40 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 6 CONCLUSÃO 55 7 PERSPECTIVAS 55 8 REFERÊNCIAS 56 ANEXO I 76 ANEXO II 112 ANEXO III 113
37 1. INTRODUÇÃO
Uma análise do contexto e gravidade dos maiores incêndios ocorridos nos Estados Unidos (EUA) no século XX, demonstrou que ao longo dos anos, estas catástrofes, reduziram em prevalência e número de óbitos. Entretanto, grande parte das vítimas ainda morrem no local do incêndio, no percurso para os hospitais ou na sua chegada ao mesmo. Aqueles que, após a admissão hospitalar, sobrevivem, necessitarão de cuidados avançados, com alto custo, por tempo prolongado. São as vítimas de extensas lesões dérmicas por queimadura ou por inalação de fumaça, estando estas associadas ou não (BARILLO; WOF, 2006).
No Brasil há carência de grandes estudos epidemiológicos ou multicêntricos que ajudem a esclarecer o panorama dos grandes incêndios, a proporção entre sobrevivência, gravidade e óbito das vítimas, bem como dos custos e eficácias das intervenções (CAVALCANTI et al., 2008; GIMENES et al., 2009). Foram vivenciadas catástrofes como as do Gran Circus Norte-americano (1961- Rio de Janeiro), Edifício Joelma (1974- São Paulo), Edifício Andorinhas (1986- Rio de Janeiro), queda do avião da TAM no aeroporto de Congonhas (2007- São Paulo), sendo o mais recente o da boite Kiss, na cidade de Santa Maria (2013- Rio Grande do Sul) com óbito de mais de 240 pessoas.
Sem dúvida, a lesão inalatória é uma das principais causas de morte nos pacientes queimados, sendo normalmente iniciada pela absorção desinibida de fumaça, com caráter extremamente tóxico para o sistema respiratório (SOUZA et al., 2004). A fisiopatologia das lesões inalatórias abrange múltiplos fatores e o sistema respiratório lesado pode apresentar deterioração em poucas horas, causando a produção de uma grande quantidade de radicais livres (PETERS, 1981).
Os consensos existentes em relação à abordagem das vítimas de lesão inalatória referem-se à: manutenção da perviabilidade das vias aéreas, suporte ventilatório, oxigenoterapia, hidratação visando a estabilização do balanço hídrico, suporte nutricional, sedação para melhora do conforto e redução da dor, prevenção das lesões secundárias, como infecção pulmonar e síndrome do desconforto respiratório agudo (SOUZA et al., 2004).
Nos últimos anos, grandes avanços foram feitos no tratamento de queimaduras dérmicas, entretanto os avanços relacionados aos danos provocados pela
38 inalação de fumaça foram limitados, voltados ao tratamento das suas consequências, como pneumonites ou pneumonias (LI et al., 2013). O ponto central na terapêutica das vítimas dessa lesão é a compreensão da relevante resposta inflamatória existente, com suas repercussões pulmonares e extra pulmonares (sistêmicas) sendo abordadas como fenômeno global e não como complicações isoladas.
Em vários países, substâncias ativas encontradas em produtos naturais estão sendo cada vez mais utilizadas na busca de fármacos mais seletivos, potentes, de baixo custo e fácil disponibilidade (GONÇALVES et al., 2008; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). Muitos produtos naturais exercem ação oxiredutora significativa, cujas atividades estão relacionadas com as suas propriedades terapêuticas. O carvacrol é um produto natural, monoterpênico, que possue propriedades biológicas que servem como barreira de processos mediados por radicais livres, tais como irritação e inflamação, devido a sua ação antioxidante (GUIMARÃES et al., 2010).
Estudos o têm descrito, como potencialmente eficaz no processo inflamatório (WAGNER et al., 1986; BOTELHO, 2009; LANDA et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2010; HOTTA et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2012; SILVA et al., 2012; ZHONG et al., 2013; DENG et al., 2013; NAFEES et al., 2013; LIMA et al., 2013; RANGEL et al, 2014; BOSKABADY & MAHTAJ, 2015). Também são constatadas ações antioxidantes (MONZOTE et al, 2009; ARIGESAVAN & SUDHANDIRAN, 2015), antimicrobianas (BOTELHO et al, 2008; GUEVARA et al, 2015), antifúngicas (CHAMI et al., 2004); antiparasitárias (NOVATO et al, 2015), antitumorais e antimutagênicas (ARUNASREE, 2010; SUBRAMANIYAN, et al., 2014; CHEN et al, 2015), antigenotóxicas (ARISTATILE et al., 2014), analgésicas (GUIMARÃES et al, 2014; RANGEL et al, 2014), anti-espasmódicas e angiogênicas (CANBEK et al, 2008; Yu et al.,2013), anti-plaquetárias (LEE et al., 2015), antielastases (BASER, 2008), antidepressivas (MELO et al. 2010).
A ação do carvacrol sobre as doenças do sistema respiratório também tem sido comprovada. Há evidências de que o carvacrol iniba a peroxidação lipídica, diminuindo níveis de malondialdeído (MDA) e superóxido dismutase (SOD) e reduzam a contagem de eosinófilos no pulmão de modelos animais com DPOC (BOSKABADY, GHOLAMI
39 Em cobaias, o carvacrol apresentou poderoso efeito relaxante nos músculos controles traqueais, previniu o aumento dos níveis séricos de proteína total, fosfolipase A2, histamina e efeito estimulador nos adrenoceptores β2 (BOSKABADY et al., 2016; SHAKERI; BOSKABADY, 2015), suprimiu a ciclooxigenase-2 (COX-2) através do seu efeito agonístico sobre receptores ativados por proliferadores de peroxisoma (PPAR) (HOTTA et al., 2010).
Apesar de todos os benefícios já descritos sobre o carvacrol, a quantidade de estudos que visam avaliar seus efeitos na lesão por inalação de fumaça, administrado por aerossolterapia, são raros. Além disso, o fato de não haver padrão ouro para o tratamento desta afecção, de elevada incidência, morbidade e mortalidade, ressalta a necessidade de desenvolver estudos pré-clínicos, controlados e randomizados que proponham novos tratamentos para a lesão.
Segundo BOATENG et al. (2008), produtos que inibam a evolução do processo inflamatório e que possibilitem um tratamento eficaz, trazendo maior conforto e breve retorno do paciente à normalidade da vida, são de grande valia.
Este estudo teve por interesse avaliar os efeitos do carvacrol inalatório, complexado em β-ciclodextrina, sobre a reação inflamatória no sistema respiratório de ratas com lesão por inalação de fumaça. A partir de duas formas de administração do produto (meio a jato e ultrassônico), foram analisadas a toxicidade do carvacrol e sua ação antioxidante, considerando as variáveis hematológicas, de marcadores de estresse oxidativo e histomorfologia dos tecidos traqueal, pulmonar e hepático. Desta forma, buscou-se contribuir efetivamente para a descoberta de um produto acessível e de baixo custo, que gere impacto direto sobre a melhora da sobrevida das vítimas de grandes incêndios, bem como redução das taxas de morbimortalidade dos mesmos.
40 2. Revisão de Literatura
2.1 A Lesão inalatória
A lesão inalatória consiste na reação inflamatória gerada pela combustão incompleta de materiais (SOUZA et al., 2004), que pode ocorrer em associação ou não a queimaduras dérmicas. Estima-se que queimaduras que acometem 33% da superfície corporal, ou mais, estão invariavelmente associadas a queimaduras inalatórias, e esta associação aumenta os índices de mortalidade entre 45 e 78% (MOYLAN; CHAN, 1978; LEVINE et al., 1978; RYAN et al., 1998). Pode ser classificada com base na localização anatômica ou considerando o mecanismo de lesão. Quando considerada a localização anatômica denomina-se: supraglótica quando acomete a via aérea superior; infraglótica quando lesa a via aérea inferior e a de parênquima pulmonar (ENKHBAATAR et al., 2016).
Segundo Souza et al., (2004), os mecanismos de lesão inalatória podem ser classificados em três: lesão térmica direta, inalação do gás hipóxico e intoxicação por inalação de gases tóxicos com ação local e/ou sistêmica. A prevalência de um ou mais desses fatores ocasiona sinais e sintomas peculiares que exigem tratamentos específicos e resultam em diferentes prognósticos (HEIMBACH; WAECKERLE, 1988).
A lesão térmica direta decorre da elevada temperatura da fumaça inalada e acomete comumente as regiões supralaríngeas, uma vez que as vias aéreas superiores apresentam características fisiológicas que auxiliam na transferência de calor e minimizam as lesões térmicas (RONG et al., 2011). Há presença de eritema, edema e ulcerações de mucosa, podendo haver sangramento local ou mesmo obstrução da área acometida (WARD; TILL, 1990).
Kurzius-Spencer et al., (2008) mediram os marcadores inflamatórios traqueobrônquicos de vítimas de inalação de fumaça e constataram aumento nas concentrações de IL-1β e IL-8, particularmente durante as primeiras 6 a 7 horas após a exposição.
Assim, para este tipo específico de exposição, a coleta de amostras traqueobrônquicas pode produzir os melhores marcadores iniciais de lesão pulmonar. Sabe-se que a IL-1β aumenta o recrutamento de neutrófilos e estimula a secreção de citocinas pró-inflamatórias. Apesar de alguns estudos associarem o aumento das
41 concentrações plasmáticas médias de IL-1β com sobrevida de pacientes e desenvolvimento de lesão alveolar aguda (ALI), não houve relação entre o aumento da IL-1β traqueobrônquica e a sobrevida do paciente (KURZIUS-SPENCER et al., 2008). Talvez porque este tipo de lesão seja raro.
No decorrer da combustão, a concentração de oxigênio reduz progressivamente até o momento em que o fogo se extingue. Durante este processo, quando as frações inspiradas de oxigênio (FiO2) se aproximam de 5%, valor percentual considerado incompatível com a vida, as vítimas apresentam dispnéia, tontura, confusão mental, torpor e podem evoluir para coma e óbito (WEISS; LAKSHMINARAYAN, 1994).
Numerosos gases tóxicos são gerados a partir da combustão e degradação térmica de materiais sintéticos. A queima do poliuretano, por exemplo, pode resultar na formação de isocianeto e cianeto hidrogenado (FEIN et al., 1980), enquanto a combustão de materiais naturais como madeira, algodão e papel, podem resultar na formação de numerosos ácidos orgânicos, aldeídos e outros gases nocivos, incluindo óxido sulfúrico e nitrogênio. Aldeídos, especialmente acroleína podem causar irritação das membranas mucosas expostas e edema pulmonar (HAPONIK, 1993). Gases irritantes como a amônia e o dióxido sulfúrico, podem ser absorvidos por material particulado, sendo transportados para o espaço alveolar onde causarão mais danos como: edema de mucosa, broncorréia e obstrução brônquica que aumenta a resistência de vias aéreas (COLEMAN, 1981).
A fisiopatologia da lesão após a inalação de fumaça tem sido objetivo de diversas pesquisas, contudo, os mecanismos molecular e celular ainda não são bem compreendidos (ERNST, 1998, PIANTADOSI, 1999; FINNERTY et al., 2008). A ação lesiva decorre de um processo inflamatório agudo, mediado por polimorfonucleares, principalmente neutrófilos. Em segundos a atividade do surfactante reduz, resultando em congestão seguida de atelectasia (TRUNKEY, 1978; COX et al., 2005; COX et al., 2009).
Tanto em humanos quanto em cobaias, a lesão por inalação de fumaça geralmente apresenta lesão grave das vias aéreas superiores em 24 horas, enquanto que o edema alveolar geralmente leva 48 ou 72 horas para se manifestar (WRIGHT, MURPHY, 2005). Quando ocorre lesão pulmonar, evidências clínicas e fisiológicas aparecem precocemente (apenas 24 horas após a exposição), provocando alterações de permeabilidade capilar, do fluxo linfático e do clearance muco-ciliar, podendo ainda
42 determinar infecção secundária de origem bacteriana (pneumonia), atelectasia e o aparecimento da Síndrome de Desconforto Respiratório Agudo (SARA) (HERNDON et al., 1984; DEMLING, 1993; ZUÑIGA; VILLEGAS, 2009). A reposição hídrica modifica a fisiopatologia oriunda das queimaduras de pele em maiores proporções e injúrias inalatórias (SOUZA et al., 2004).
Os efeitos sistêmicos dos gases tóxicos estão associados à elevada morbimortalidade. Dois gases obtém destaque quanto a seus efeitos deletérios: monóxido de carbono e cianeto. O monóxido de carbono (CO) é um gás inodoro, incolor e inflamável que resulta da combustão incompleta de combustíveis fósseis como carvão mineral, gasolina e querosene.
A intoxicação causada por monóxido de carbono é uma das causas mais freqüentes de óbito nos pacientes submetidos a lesões inalatórias. Ele possui grande afinidade pela hemoglobina, gera um complexo extremamente estável denominado carboxihemoglobina, causando assim um decréscimo na saturação de oxihemoglobina, o que diminui a liberação de oxigênio aos tecidos, impedindo o processo de geração de energia. O monóxido de carbono liga-se também à mioglobina, prejudicando o armazenamento de oxigênio nos músculos (SEGER, WELCH, 1994; ERNST, 1998, PIANTADOSI, 1999).
A toxicidade do cianeto é causada pela inibição da oxigenação celular, o que causa anóxia tecidual pela inibição reversível das enzimas citocromo oxidase (Fe3+). A inibição da via glicolítica aeróbia desvia o metabolismo para a via anaeróbia alternativa, produzindo então o acúmulo de sub-produtos ácidos (SHUSTERMAN, 1993; MAYES, 1993). O tipo de exposição, o tempo, ou ainda a predominância de um ou mais desses mecanismos determinam diferentes evoluções da lesão inalatória (SOUZA et al., 2004). A hipótese é que a resposta inflamatória influencia a condição clínica após injúria inalatória. A resposta inflamatória sistêmica engloba a liberação de uma grande quantidade de citocinas como as interleucinas IL-1β, IL6, IL8 ou fator de necrose tumoral (TNF) (FINNERTY et al., 2006; FINNERTY et al., 2008).
Citocinas anti-inflamatórias como IL-10, são liberadas concomitantemente na tentativa de regular os efeitos das citocinas pro-inflamatórias. A elevação de citocinas pró e anti-inflamatórias altera a função imune e o metabolismo proteico, e estas alterações podem conduzir a comprometimento da estrutura e função de múltiplos sistemas orgânicos. O hipermetabolismo pode levar a um indevido uso das proteínas,
43 resultando em indução de um dinâmico estado hipercatabólico (WALTON; MANARA, 2005; FINNERTY et al., 2006). Por outro lado, a própria resposta imunológica pode ser influenciada por vários fatores. Ao analisar retrospectivamente 7640 pacientes admitidos em um centro regional de queimadas entre os anos 2002 a 2012, Knowlin et al. (2016) constataram que no subgrupo de pacientes queimados com lesão por inalação, as probabilidades de mortalidade diminuíram nos fumantes pré-existentes. Esta constatação permite inferir que o mecanismo de tolerância imunológica modula e diminui a resposta pró-inflamatória, conferindo maior sobrevivência aos fumantes após exposição a ferimentos agudos por inalação de fumaça.
Em estudo complementar, utilizando este mesmo banco de dados, Knowlin et al., 2017, analisaram o risco de mortalidade em pacientes que apresentavam doenças cardiovasculares prévias à inalação da fumaça. Constataram que o risco de mortalidade foi 42% maior (IRR = 1,42, IC 95% = 1,10-1,84) para pacientes com doença cardiovascular pré-existente em comparação àqueles que não tinham doença cardiovascular, isto após controle de outras co-variáveis.
Além das co-morbidades, outras variáveis parecem interferir no prognóstico das vítimas de lesão inalatória. Bedri et al 2017, revisaram 135.680 prontuários de vítimas de queimadura entre os anos de 2002–2011, objetivando estabelecer relação entre os fatores socioeconômicos, étnicos e gênero com o desfecho clínico. Após análise, concluíram que os americanos afrodescendentes, do gênero feminino e que não tinham cobertura do seguro de saúde, apresentaram mais complicações, sofreram mais intervenções cirúrgicas, maior tempo de permanência hospitalar e maiores índices de mortalidade. Mesmo tendo menor área de superfície corporal queimada e menor proporção de lesão inalatória. Essas disparidades enfatizam ainda mais a necessidade de pesquisas adicionais sobre os fatores raciais e socioeconômicos subjacentes que essa revisão da base de dados não pôde discernir.
Na assistência às vítimas de lesão por inalação de fumaça alguns cuidados imediatos garantem a integridade de órgãos e sistemas. É preciso iniciar a oxigenioterapia com hiperóxia (FiO2=100%) por tempo determinado, discernir a indicação de via aérea artificial e suporte ventilatório invasivo ou não invasivo. É importante manter a perveabilidade das vias aéreas bem como a estabilidade alveolar. Reconhecendo os efeitos sistêmicos da afecção, a hidrataçao e monitorização da micro e macro hemodinâmica são de extrema relevância para prevenir complicações adicionais.
44 O tratamento farmacológico é baseado nas consequencias e complicações adicionais. Podem ser administrados corticoesteróides, antibióticos, anticoagulantes, sedativos e analgésicos e nos casos de intoxicação por cianeto, hidroxocobalamina, nitrito de sódio tiossulfato de sódio ou nitrito de sódio, por via endovenosa (BASSI et al., 2014).
2.2 Carvacrol
O óleo essencial de uma determinada planta é o conjunto de substâncias voláteis caracterizado por componentes de diferentes grupos químicos. Estes extratos vegetais têm como um de seus constituintes os terpenos, substâncias formadas pela ciclização enzimática através da conversão de moléculas simples, lineares de hidrocarbonetos fosfatados em esqueletos carbocíclicos quirais, cuja oxidação e rearranjo posterior fornecem um número interminável de estruturas químicas (VIGAN, 2010).
Além do seu vasto uso na indústria de cosméticos, os constituintes dos óleos essenciais, com modificações dos grupamentos moleculares, podem ser utilizados como modelos estruturais para pesquisa de novos fármacos com maior eficácia e seletividade (MAIMONE; BARAN, 2007). Por isso, ocupam lugar especial na história da medicina popular de culturas orientais e ocidentais.
Dentre as pesquisas com fenóis monoterpênicos, o carvacrol (2‐methyl‐5‐(1‐methylethyl)‐phenol) é um dos óleos essenciais que tem merecido destaque pelos seus potenciais terapêuticos. Existem várias evidências sobre os benefícios biológicos deste produto. Ele aumenta a permeabilidade da membrana citoplasmática ao romper as membranas externas de bactérias Gram negativas levando ao extravazamento de ATP da célula. O carvacrol também inibe ATPase (HELANDER et al., 1998; GILL; HOLLEY, 2006a; GILL; HOLLEY, 2006b), previne a formação de produtos tóxicos pela ação de espécies reativas de oxigênio, uma vez que diminui a formação de 3-nitrotirosina e malondialdeído (PRIETO et al., 2007). Além disso, inibe a agregação plaquetária induzida por ácido araquidônico com maior eficácia que a aspirina (SON et al., 2005), reduz a síntese de prostaglandina (WAGNER et al., 1986), produz mediadores inflamatórios, tais como IL-1β e prostanoides, possivelmente pela libertação de IL-10 (LIMA et al., 2013) e aumenta a taxa de regeneração hepática (UYANOGLU et al., 2008).
45 A comprovação destes efeitos e tantos outros, consagram o carvacrol como produto com potencial anti-inflamatório e antinociceptivo (DAMASCENO et al., 2014), antioxidante e antimicrobiano (MASTELIC et al., 2008; BEENA et al., 2013), antibactericida (MATHELA et al., 2010), antifúngico e insecticida (PETE et al., 2010), antiapoptótico, antimutagênico, antiplaquetário, reparador e protetor tecidual (LANDA et al., 2009; GUIMARAES et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2012; NAFEES et al., 2013; LIMA et al., 2013; RANGEL et al., 2014).
Corroborando com esta constatação científica, nos últimos treze anos, as pesquisas experimentais testando este produto, comprovaram efeitos benéficos no combate a diversas doenças como: diabetes (DENG et al., 2013; EZHUMALAI et al, 2013; EZHUMALAI et al., 2014); candidíase oral (CHAMI et al., 2004); periodontite (BOTELHO et al, 2008; BOTELHO et al., 2009; ZEIDA´N-CHULIA, 2013); câncer (ARUNASREE, 2010; CHEN et al, 2015); úlceras gástricas (SILVA et al., 2012), edema cerebral (ZHONG et al., 2013); depressão (MELO et al., 2010) e doenças cardiovasculares (WEI et al., 2013).
Também já são conhecidos os efeitos desse monoterpeno em doenças pulmonares como injúrias (Barnwal et al., 2017; Boskabady; Gholami Mahtaj, 2015; Selimoğlu et al., 2014), Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) (Boskabady; Mahtaj, 2015; Games et al., 2016; Gholami Mahtaj et., 2015) e asma (Boskabady; Jalali, 2013; Boskabady et al., 2016). Inclusive recentemente, Alavinezhad et al. (2017) publicaram ensaio clínico (fase II), randomizado, duplo cego, placebo-controlado com o objetivo de avaliar o efeito preventivo de carvacrol em pacientes asmáticos durante um período de tratamento de 2 meses. Os resultados demonstraram que os efeitos antiinflamatórios do carvacrol melhoraram a função pulmonar e reduziram os sintomas respiratórios dos pacientes asmáticos.
Este composto volátil, de odor diferenciado é encontrado em plantas aromáticas e óleos essenciais, inclusive sendo componente principal das frações de Origanum Vulgare (orégano) e Thymus vulgaris (tomilho) (IPEK et al., 2005; LIOLIOS et al., 2009), o que lhe confere grande potencial dietético. O Carvacrol é geralmente reconhecido como seguro e a sua utilização em alimentos foi aprovada pela Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos e pela Food and Drugs Administration (FDA) (HYLDGAARD et al., 2012; Code of Federal Regulations, 2013). É um aditivo seguro
46 que aumenta a vida útil dos alimentos, como aromatizante, e agente que atua frente a microorganismos (ULTEE; SMID, 2000; KNOWLES et al., 2005).
A ação antimicrobiana natural está fundamentada na perturbação da membrana citoplasmática, ruptura do fluxo de elétrons, interferência no transporte ativo, inibição da coagulação do conteúdo citoplasmático e da atividade enzimática (OLIVEIRA, 2010). Sua ação inibitória sobre a produção de toxinas foi comprovada em caldos e sopas de cogumelo (ULTEE; SMID, 2000), arroz (ULTEE et al., 2000),suco de maçã (KISKÓ; ROLLER, 2005) e outros alimentos minimamente processados (PERIAGO et al., 2001; PERIAGO; MOEZELAAR, 2001).
Pesquisa realizada por Türkez e Aydin (2013) objetivou investigar os efeitos genéticos, oxidativos e citotóxicos do carvacrol em células sanguíneas humanas cultivadas. Foi demonstrado que o carvacrol aumentou os níveis de LDH das células sanguíneas humanas cultivadas via ensaios de lactato desidrogenase (LDH) e (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT), com efeito dose e tempo dependente. Este é um achado importante pois o LDH no soro é um indicador biológico para aumento do dano celular (Yokogawa et al., 2004; Park et al., 2010).
Em geral, o carvacrol a 150 e 200 mg/L diminui significativamente (p <0,05) a viabilidade das células sanguíneas humanas (Türkez; Aydin, 2013). Estes resultados corroboram com os achados de Aristatile et al. (2010), cuja concentração de carvacrol acima de 100 mg / mL aumentou a taxa de mortalidade celular em linfócitos humanos.
Os mecanismos possíveis para esta ação citotóxica do carvacrol ainda não são bem conhecidos, mas são considerados alguns fatores, sendo eles: estresse oxidativo; a inibição do proteassoma, da topoisomerase, da síntese de ácidos graxos; acúmulo de P53; inibição do ciclo celular e fosfatidil-inositol 3-quinase ou aumento na expressão de c-fos e c-myc (BRUSSELMANS et al., 2005; CHEN et al., 1998, 2005; KAZI et al., 2004).
Por outro lado, não houve evidências de que o carvacrol fosse genotóxico ou mutagênico nos linfócitos avaliados (TÜRKEZ; AYDIN, 2013). Em pesquisas desenvolvidas por Slamenova et al. (2011) Aristatile et al. (2011), a aberração cromossômica (CA) em hepatócitos primários de ratos não atestava qualquer atividade genotóxica de carvacrol. Este monoterpeno também não alterou os níveis de 8-OH-dG em comparação ao grupo controle (Türkez; Aydin, 2013). Esta variável (8-OH-dG) é um dos principais produtos do dano oxidativo do DNA, considerado como um marcador
47 útil e relevante para o estresse oxidativo celular, particularmente em relação à carcinogênese (HALLIWELL, 1999).
Seus potenciais terapêuticos são reconhecidos pela medicina alternativa ou complementar de vários países do continente asiático (a exemplo da China), do Mediterrâneo (a exemplo, Líbano) ou da América do Sul (KHOURY et al., 2016). Por outro lado, suas características químicas, como baixa solubilidade em água e fácil sublimação, podem ser consideradas desvantagens pela indústria farmacêutica. É sabido que o melhor controle da biossíntese de um produto, aumenta seu rendimento (MENDES et al., 2014).
A partir deste princípio, o processo de biossíntese do carvacrol envolve várias etapas. Inicialmente há a clivagem da glucose em fosfoenolpiruvato, seguida pela descarboxilação e acetilação da coenzima acetil (CoA) com transformação para o intermediário mevalónico. Em seguida há dois processos concomitantes: a transformação em y-terpineno com aromatização em p-cimeno e a hidroxilação em carvacrol e timol.
Pesquisa realizada por Ramak et al. 2013, descobriu que a inibição da via mevalonato melhora a biossíntese de carvacrol em culturas da planta iraniana Satureja khuzistanica. Fatores externos como estação do ano e qualidade do solo podem interferir na qualidade do óleo essencial. A influência de fatores externos sobre as propriedades do carvacrol, são corroboradas por Milos et al (2000).
Uma opção de controle sobre esta variável, mais viável e menos onerosa, é o uso do carvacrol, óleo essencial sintético (FRIEDMAN, 2014).
2.3 Complexação em β-ciclodextrina
As evidências científicas confirmam o potencial terapêutico do carvacrol, entretanto, sua instabilidade, volatilidade e baixa solubilidade em água, são desafios que a indústria farmacêutica necessita enfrentar e transpor. Os meios de encapsulação, proteção e liberação controlada são excelentes opções para aumentar a estabilidade, especialmente nos processos de preparação e armazenamento dos produtos (MORALES, 2015). A exemplo disso, considera-se a ciclodextrina, um oligossacarídeo cíclico obtido através de hidrólise e conversão enzimática do amido por alguns microorganismos (LOFTSSON, MASSON, 2001; DE ARAÚJO et al., 2003).
48 As ciclodextrinas naturais mais comuns são compostas de seis (α-ciclodextrina), sete (β-ciclodextrina) e oito (γ-ciclodextrina) unidades de D-(+)-glucopiranose, todas unidas por ligações α-1,4 (LOFTSSON et al., 2005). Estes compostos possuem em sua estrutura grupos hidroxila primários e secundários orientados para o exterior. Desta forma, possuem exterior hidrofílico e uma cavidade interna hidrofóbica/lipofílica. Estas características análogas permitem às ciclodextrinas complexação de moléculas com dimensões compatíveis, alterando suas propriedades físico-químicas, como citado anteriormente (MCCORMACK, GREGORIADIS, 1998; MATIOLI, 2000). As β-ciclodextrinas (β-CDs) são as mais amplamente utilizadas na complexação com várias classes de fármacos (IRIE, UEKAMA, 1997) e são consideradas aditivos alimentares uma vez que dispõem de baixa toxicidade (LOFTSSON et al., 2005).
A estrutura química caracterizada pela formação de complexos de inclusão com vários fármacos, modifica a liberação dos mesmos, o que contribui para o maior tempo de ação e redução da toxicidade local e/ou sistêmica (FRACETO et al., 2007). Além disso, possibilita a veiculação de fármacos líquidos sob a forma de pó e previne as interacções fármaco/fármaco e fármaco/excipiente (STELLA, RAJEWSKI, 1997). A inclusão molecular em CD mascara sabores ou odores desagradáveis, diminui a evaporação de substâncias voláteis, protege moléculas sensíveis da luz ou oxigênio (MURA, 2014). Destaca-se também por melhorar a solubilidade de fármacos pouco solúveis e aumentar a estabilidade e biodisponibilidade de produtos (MCCORMACK, GREGORIADIS, 1998; MATIOLI, 2000).
A mucosa traqueobrônquica e a superfície epitelial alveolar são extensamente vascularizadas e isto resulta em uma rápida absorção medicamentosa (WASHINGTON et al., 2001; MARTIN & FINLAY, 2014). Além destes benefícios, há prevenção da degradação do fármaco no trato gastrointestinal, via com alta atividade enzimática. Assim, a administração de drogas em forma de aerossóis no sistema respiratório reduz as doses e os efeitos colaterais, mantendo o fornecimento sistêmico de fármacos.
Os nebulizadores utilizam gases comprimidos (ar comprimido, oxigênio, nitrogênio) ou a potência ultra-sônica ou mecânica para utilização de produtos farmacêuticos, dos quais se inclui suspensões a serem utilizadas na forma de gotas em aerossol e que podem ser inaladas diretamente na boca ou no nariz. As partículas menores e a velocidade lenta do aerossol nebulizado são defendidas para aumentar a
49 penetração nos locais alvo nos meatos médio e superior e nos seios paranasais (LAUBE, 2007).
A associação destes fatores melhora as condições de absorção dos fármacos. Entretanto, pontos limitantes referem-se a compostos em formulação de rápida ação, necessidade de dissolução, ou seja, solubilidade aquosa para que o fármacos seja adequadamente disponibilizado, ao clearance mucociliar e à atividade macrofágica alveolar (LOFTSSON et al., 2005; LIANG et al. 2014). Desta forma, a liberação controlada de fármacos pulmonares é um sistema promissor, havendo destaque para as partículas grandes porosas, as micropartículas swellable e as partículas porosas de agregados de nanopartículas (LIANG et al. 2014).
Desde 1999, Cabral Marques et al. constataram que a absorção das ciclodextrinas no sistema pulmonar é superior à obtida no trato gastrointestinal, sendo também consideradas semelhantemente seguras. Estudos recentes usando esta tecnologia confirmaram estes resultados (GUPTA et al., 2011; UNGARO et al., 2012).
A FDA estabelece poucas orientações a respeito de produtos nasais com absorção sistêmica e para métodos de distribuição como aerossóis nebulizados, vapores, jatos líquidos, gotas e formulações em pó. As questões relacionadas à anátomo-fisiologia nasal, posição corporal, necessidade de coordenação respiratória (entre as fases inspiração e expiração), a influência do fluxo aéreo (laminar, turbilhonar e transicional), bem como as propriedades mecânicas dos diferentes modos de geração de aerossol, precisam ser considerados (SAHIN-YILMAZ; NACLERIO, 2011; FRANK et al., 2012).
Ainda segundo orientação da FDA, as pulverizações nasais e dos aerossóis pressurizados dos produtos ou medicamentos com ação nasal (nos testes in vivo), devem gerar fração de partículas respiráveis abaixo de 9 μm. Este tamanho de partícula, evita a inalação pulmonar de medicamentos destinados à administração nasal (DJUPESLAND, 2012).
De acordo com Shao et al., 1994 e Wall et al., 1994 a absorção de fámacos administrados por via intratraqueal, foi maior quando utilizadas várias ciclodextrinas. Kinnarinen et al., 2003, demonstraram bons efeitos utilizando complexos de ciclodextrina como pó seco inalatório. Inclusive há evidências de que a complexação com γ-ciclodextrina e dimetil-β-ciclodextrina aumentaram a fração respirável de medicamentos habitualmente utilizados nas doenças respiratórias, a exemplo de
50 dipropionato de beclometasona e salbutamol (LEITE PINTO, CABRAL MARQUES, 1999).
Quando avaliada a toxicidade das ciclodextrinas naturais, a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina e β-2-hidroxipropil-β-ciclodextrina metilada em células epiteliais pulmonares, tipo Calu-3, in vitro, constatou-se que a tolerância destas células é dose dependente, sendo que a viabilidade celular diminuiu apenas nas altas concentrações de ciclodextrina (KINNARINEN et al., 2004). Resultados também benéficos foram obtidos após tratamento de 72 h com soluções aquosas 0,1-1% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, onde não foram observados aumentos de células pulmonares humanas CRL7272 in vitro (NIMBALKAR et al., 2001).
Em 2005, LOFTSSON et al. afirmaram que apesar dos resultados serem favoráveis, o número de estudos que tratam da administração, toxicidade ou dos efeitos locais de produtos ou fármacos, complexados com ciclodextrina por via inalatória, ainda eram limitados. Mas estudos recentes, esclarecem estes aspectos e reforçam a segurança, baixa toxicidade e maior eficácia dos produtos encapsulados com esta tecnologia (KIM et al., 2012; KIM et al., 2013).
Radicais livres e espécies reativas estão disponíveis no domínio de vários processos patológicos e fisiológicos, incluindo lesão por inalação de fumaça (SALVEMINI et al., 2006). Muitos produtos naturais exercem atividades redutoras significativas, as quais estão relacionadas com as suas propriedades terapêuticas (GUIMARÃES et al., 2010). Acreditamos que a complexação do carvacrol em betaciclodextrina, atenda a estas necessidades ou ultrapasse-as.
A associação do potencial terapêutico do carvacrol, complexado em betaciclodextrina e administrado por meio de aerossóis pode contribuir para a modulação da resposta inflamatória do sistema respiratório em vítimas de lesão inalatória. Medicamentos que bloqueiam a aderência de neutrófilos na microvasculatura pulmonar, inibidores de leucotrienos e antioxidantes têm sido pesquisados e seus benefícios, pontuados (TASAKI et al., 2002).
51 3.1 Geral
- Avaliar o efeito do carvacrol complexado em β-ciclodextrina (β-CD), administrado sob forma de aerossóis, sobre a reação inflamatória de ratas lesadas por inalação de fumaça.
3.2 Específicos
- Verificar a eficácia dos modelos de inalação do carvacrol complexado em β-ciclodextrina, utilizando os meios a jato e ultrassônico.
- Avaliar a toxidade do carvacrol complexado em β-CD, administrado sob forma de aerossóis em ratas submetidas à lesão inalatória, considerando as variáveis hematológicas e histomorfológicas.
- Avaliar a ação antioxidante do carvacrol complexado em β-CD, administrado sob forma de aerossóis em ratas submetidas à lesão inalatória.
- Analisar as características histomorfológicas dos tecidos traqueal, pulmonar e hepático das ratas submetidas à lesão inalatória e tratadas com carvacrol complexado em β-CD.
52 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Desenho do estudo e modelo animal
Trata-se de um estudo experimental, longitudinal, randomizado com grupo controle, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Tiradentes, registro de aprovação 011.217A. Foram utilizadas 24 ratas adultas, fêmeas, com cerca de 200-350 g. O uso de animais de pequeno porte (ratas Wistar) é justificado pela fácil manipulação, baixo custo, semelhança com modelo humano, especialmente no que se refere às análises hematológicas, histológicas e imunológicas.
Durante a pesquisa, as ratas passaram pela análise e acompanhamento do ciclo estral, sendo utilizadas apenas as ratas que apresentaram ciclo regular e que estavam em estro no dia da lesão (MARCONDES et al., 2002). Esta medida visou controlar possíveis interferências hormonais sobre fatores de estresse e reações imunológicas e inflamatórias. Este é um modelo animal aceito em pesquisas semelhantes à nossa (Demling et al., 1994; Demling et al., 1996; Wang et al., 1996; Tasaki et al., 1997; Wang et al., 1997; Tasaki et al., 1998; Cox et al., 2005; Morita et al., 2006; Murakami et al., 2007; Esechie et al., 2008; Hamahata et al., 2008; Esechie et al., 2009; Cox et al., 2009; Belli et al., 2011; Hamahata et al., 2011; Abali et al., 2013 CARVALHO et al., 2016).
Os animais tiveram ingesta de alimentos e água sem restrições, fornecidos pelos pesquisadores, no Biotério do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe (Lapec/UFS). Foram alojados em gaiolas, caixas de polipropileno autoclavável, com as dimensões: 49 cm x 34 cm x 16 cm (comprimento x largura x altura), com tampa (grade) em aço galvanizado com separadores em aço inox, contendo 03 animais por gaiola, respeitando o ciclo circadiano de 12 horas claro/12 horas escuro, controlados por um temporizador digital. O período de claro se iniciava às 6 h, e o de escuro, às 18 h, baseado nos estudos realizados por Belli et al. (2011), Li et al. (2013) e Qiu et al. (2012).
As salas possuiam exaustores e são mantidas em temperatura de 22±2 °C, umidade relativa (UR) do ar em 50±10%. Os registros da temperatura e da UR foram feitos diariamente a fim de garantir a estabilidade do sistema.
53 4.2 Carvacrol como produto inalatório
Pelas características hidrofóbicas descritas anteriormente, o carvacrol foi complexado em β-ciclodextrina.
O produto inalatório foi preparado no Laboratório de Ensaios Farmacêuticos e Toxicidade (LeFT) da Universidade Federal de Sergipe. O método de complexação com betaciclodextrina foi o preconizado por Marreto et al., 2008. O carvacrol (150,22 mg) e a β-CD (1135 mg) foram misturados na razão molar de 1:1 em 20 mL de água destilada sob constante agitação por 36 horas a 150 rpm. Em seguida, as soluções foram mantidas sob refrigeração a -4 °C. A solução congelada, posteriormente, foi liofilizada a –50 °C e 1,09 Pa até remoção de toda umidade. As amostras secas foram armazenadas em recipiente fechado no dessecador à temperatura ambiente.
O carvacrol complexado em β-ciclodextrina foi diluído em 5 mL de soro fisiológico a 0,9% (isotônico), sendo utilizado 240 µg de complexo de carvacrol para cada 1 mL de SF (1,2 g de complexo de carvacrol em 5 mL de SF a 0,9%). Esta concentração foi estabelecida a partir do trabalho de Mahtaj et al. (2015).
4.3 Distribuição por grupos
As ratas com ciclo estral regular, foram divididas aleatoriamente em quatro grupos (Quadro 1).
Quadro 1: Detalhamento da quantidade de grupos avaliados, ações desenvolvidas, quantidades de animais por grupo, tempos de sacrifício e quantidade de dosagens dos produtos ofertados.
Grupo Descrição Quantidade de animais e
tempo de sacrifício 1 Ratas sem lesão inalatória, sem tratamento.
Grupo Controle (GC)
06 ratas
Sacrifício: 48h após lesão 2 Ratas com lesão inalatória, sendo tratadas com
nebulização de oxigênio a 100% (15 L/min) trinta minutos após a indução da lesão inalatória, após inalação de oxigênio (durante 30’), inalou solução salina, soro fisiológico a 0,9% (SF 0,9%).
Grupo OxiSoro (GOS)
06 ratas
54 3 Ratas com lesão inalatória, sendo tratadas com
nebulização de oxigênio a 100% (15 L/min) trinta minutos após a indução da lesão inalatória, após inalação de oxigênio (durante 30’), fez inalação de Carvacrol complexado em β-ciclodextrina a jato com fluxo a 8 L/min.
Grupo OxiCarvJato (GOCJ)
06 ratas
Sacrifício: 48h após lesão
4 Ratas com lesão inalatória, sendo tratadas com nebulização de oxigênio a 100% (15 L/min) trinta minutos após a indução da lesão inalatória, após inalação de oxigênio (durante 30’), fez inalação de Carvacrol complexado em β-ciclodextrina tipo ultrassônico.
Grupo OxiCarvUltra (GOCU)
06 ratas
Sacrifício: 48h após lesão
Total de animais utilizados 24 ratas
4.4 Indução da lesão inalatória
Para gerar a lesão inalatória, as ratas foram submetidas à inalação de fumaça produzida pela queima de algodão, 30 g/Kg de peso corporal, dentro de uma câmara de gás, nas seguintes dimensões: 40,5 cm x 35 cm x 23 cm, respectivamente comprimento x largura x altura. As ratas foram expostas a períodos sucessivos de 09 minutos de inalação de fumaça, seguido de 30 segundos de exposição ao ar ambiente. Esse processo foi repetido três vezes de acordo com QIU et al., 2012 e LI et al., 2013, o que totalizou 27 minutos de exposição à fumaça (Figuras 1A, 1B, 1C).
Figura 1. (A) Imagem da câmara para indução da lesão inalatória com o algodão distribuído para combustão; (B) Demonstração da fumaça gerada durante o processo de queima do algodão; (C) Rata submetida à lesão inalatória.
55 4.5 Intervenção terapêutica
Cerca de 30’ após a indução da lesão inalatória, todas as ratas inalaram oxigênio a 100%. A fração inspirada de oxigênio preconizada na abordagem da vítima de lesão inalatória é de 100%, conforme descrito em estudos com roedores desenvolvidos por Belli et al. (2011) e Abali et al. (2013); com ovinos, como trabalhos de Demling et al. (1996), Murakami et al. (2007), Park et al. (2004), Shimoda et al. (2008) e Yamamoto et al. (2012). No intuito de ofertar oxigênio a valores aproximados de 100%, faz-se necessário utilizar maiores fluxos de oxigênio (valores aproximados de 15 L/min) (RODRIGUES, 2008).
A promoção da hiperóxia, cumpre a recomendação de especialistas e visou reduzir em até seis vezes, a meia vida da carboxihemoglobina (BIDANI et al., 1998; COX et al., 2005; ABALI et al., 20013; BASSI et al., 2014;). Após administração do oxigênio, conforme programação para cada grupo (Quadro 1), as ratas inalaram soro fisiológico com ou sem carvacrol complexado em β-CD por sistema ultrassônico ou a jato.
A fim de favorecer uma adequada inalação dos gases medicinais e do produto inalatório (soro fisiológico com ou sem carvacrol), uma câmara inalatória em acrílico foi desenvolvida (Figuras 2A, 2B e 2C). Esta câmara possui orifícios que previnem tanto a reinalação do gás carbônico (CO2), quanto a pressurização pelo elevado fluxo de oxigênio. A ela foram acoplados o espaçador e o copo para nebulização.
Figura 2- (A) Imagem da câmara desenvolvida para favorecer inalação de oxigênio e carvacrol inalatório; (B) Sistema de inalação de oxigênio, soro fisiológico ou carvacrol inalatório contendo: micronebulizador + espaçador aderido à câmara de inalação; (C) Rata adaptada à câmara de inalação.
56 O fluxo estabelecido para a nebulização a jato foi o mesmo utilizado por Boskabady et al. (2005), 8 L/min. A inalação dos produtos (soro e/ou carvacrol) foi repetida após 24h da indução da lesão.
4.6 Sedação, anestesia e eutanásia dos animais
Ao final do tempo experimental de 48h, as ratas foram pesadas e anestesiadas para o sacrifício com uma injeção intraperitoneal de Ketamina (80-90 mg/Kg de peso intraperitoneal) e Xilazina (2%- 10 a 13mg/Kg de peso intraperitoneal). A Ketamina associada à Xilazina pode produzir sedação por tempo hábil de 30 min, nos casos em que o animal ainda apresentaram reflexos ou vieram a ter durante o experimento, foi administrado mais 10% da dose. Para o procedimento da eutanásia foi dado o dobro desta dose para o animal.
Após a eutanásia, as ratas foram acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados como material biológico. A carcaça foi enviada ao Biotério do Departamento de Fisiologia da UFS para descarte adequado, de acordo com a legislação vigente.
4.7 Retirada das amostras
Após confirmação da sedação e anestesia, com testes reflexos negativos, o animal foi cirurgiado e o sangue retirado da artéria mesentérica. Parte do sangue coletado foi acondicionado em tubos EDTA para posterior análise de hemograma e outra parte em tubos com gel para análise bioquímica. Esta segunda porção foi centrifugada com resfriamento a 5ºC, durante 5 minutos. Ambos foram analisados no mesmo dia da coleta. Em seguida foram coletados: fígado, traquéia e pulmões.
O pulmão direito foi prontamente resfriado em -20ºC e mantidos em -80ºC. As variáveis pesquisadas para avaliação do estresse oxidativo, foram: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), mieloperoxidase (MPO), potencial antioxidante total do tecido (FRAP) e glutationa reduzida (GSH).
As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS são formadas como subproduto da peroxidação lipídica que podem ser detectadas pelo ensaio TBARS usando ácido tiobarbitúrico como um reagente. O uso da análise do teste de TBA e
57 interpretação de sua resposta em estudos de peroxidação lipídica exigem cautela e discrição, especialmente em sistemas biológicos.
Para determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), pesou-se a amostra de pulmão e homogeneizou-se em tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 7,4) contendo hidroxitolueno butilado (12,6 mM). Em seguida, alíquotas do homogeneizado (em duplicata) foram incubadas (90ºC por 45’) com ácido tiobarbitúrico (0,37%) em uma solução ácida (ácido tricloroacético a 15% e ácido clorídrico a 0,25 N). No final da incubação, os homogenatos foram centrifugados (5 min, 8000 x g), e alíquotas dos sobrenadantes foram extraídas com n-butanol, seguido por agitação em vótex durante 30 s e centrifugação adicional (2 min, 8000 x g). A absorvância do sobrenadante foi medida a 535 nm em leitor de microplacas (corrigido pelos valores de absorvância a 572 nm).
Os resultados foram calculados utilizando um coeficiente de extinção molar de 1,55 x 105 x M-1mL-1 e expressos como nMol por mg de tecido (LOPES et al., 2011). Para a determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO), recolheu-se a amostra de pulmão, pesou-se e homogeneizou-se com tampão de fosfato de potássio (50 mM, pH 6,0 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamónio) e centrifugou-se 1 mL do homogenato (2 min, 8000 xg, 4ºC). Em uma placa de 96 porços, alíquotas do sobrenadante foram incubadas em uma solução de cloridrato de o-dianisidina (0,167 mg /mL contendo 0,005% de H2O2). A atividade de MPO foi medida cineticamente em scanner de placa de microlitro (Labsystem Multiskan) a 460 nm e intervalos de 15 s durante um período de 5 min. Os resultados foram expressos como unidades de MPO por mg de tecido (UMPO/mg de tecido). Um UMPO foi considerado como a quantidade de enzima que degrada 1 mmol de peróxido de hidrogênio/min (BRADLEY et al., 1982; SANTANA et al., 2012).
A porção superior da traquéia, o pulmão esquerdo e o fígado foram acondicionados em frasco plástico contendo formol a 10% (tampão fosfato, pH 7,4). Posteriormente, tais hemissecções foram desidratadas em soluções crescentes de etanol a 70, 95 e 100º GC, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina (técnica histológica convencional), de acordo com o protocolo de rotina de procedimentos histológicos (MELO, 2011). Foram reduzidas a uma espessura de 5 μm e coradas com hematoxilina e eosina (HE), e avaliadas por microscopia luminosa, seguindo um protocolo numérico
58 fechado, de forma que o patologista não teve ciência de qual grupo estava sendo avaliado (MELO, 2011).
A lesão pulmonar aguda foi classificada de forma cega por dois pesquisadores independentes. A infiltração de marcadores inflamatórios/ reação de granulação, epitélio pavimentoso estratificado e enfisema pulmonar, foram mensuradas da seguinte forma: 0= mínima; 1= suave; 2= moderada; 3= severa; e 4= máxima (SUN et al., 2009). O edema intra-alveolar foi mensurado: 0= ausente e 1= presente (SHIMODA et al., 2003, SUN et al., 2009).
4.8 Análise estatística
O pequeno número de animais utilizados nesta pesquisa, respeita a indicação das Normas para Experimentação Animal da Agência Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA – Resolução nº 90/2004.
Para análise das variáveis do hemograma, bioquímica e estresse oxidativo (FRAP, GSH, TBARS and MPO) foram calculadas as médias e erro padrão das variáveis obtidas em cada grupo. O teste de Shapiro-Wilk foi aplicado e as distribuições normais analisadas com o Teste Anova One Way e as não-paramétricas utilizando o Teste de Kruskal-Wallis. O post test utilizado foi o de Dunnet, para pequenos grupos.
As análises foram realizadas comparando o GOS com os grupos tratados com carvacrol por equipamento a jato (GOCJ) e ultrassônico (GOCU). Foi prefixado um nível de significância em 95% (p<0,05). O programa utilizado para análise estatística foi o Prisma.
59 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante o experimento não ocorreram perdas de animais. Os dados encontrados revelam que a inalação de fumaça no modelo aqui proposto, foi suficiente para induzir lesão pulmonar aguda com alterações estruturais e funcionais no sistema respiratório das ratas. Achados semelhantes foram encontrados em trabalho prévio realizado por este grupo, na pesquisa de Carvalho (2016).
O maior dano é atribuído às lesões químicas causadas pelos agentes orgânicos nocivos presentes na fumaça (Enkhbaatar et al., 2016), uma vez que o tipo de fluxo aéreo, a anatomia do sistema respiratório e os mecanismos fisiológicos para transferência de calor são eficazes para minimizar as lesões térmicas em níveis subglóticos (Rong et al., 2011).
Apesar da lesão ter acontecido no sistema pulmonar as repercussões podem ser constatadas em nível sistêmico. Ao avaliar as variáveis hematológicas dos grupos Controle e tratados com carvacrol em relação ao GOS, apenas as variáveis hemoglobina e hematócrito apresentaram alteração. A hemoglobina do grupo GOCU foi maior que o GOS, enquanto o GC foi menor (p=0,08). A taxa de hematócrito de todos os grupos GOS, GOCJ e GOCU foram maiores que o GC (Tabela 1).
Tabela 1- Distribuição da média e erro padrão das variáveis hematológicas dos grupos avaliados (hemograma). Parametros Hematológicos GRUPOS Controle (GC) OxiSoro (GOS) OxiCarvJato (GOCJ) OxiCarvUltra (GOCU) Valor p Eritrócitos (RBC) (106/mm3) 7.98±0.14 8.09±0.15 8.49±0.30 8.47±1.66 0.218 Hemoglobina (HGB) (g/dL) 14.07±0.20* 15.33±0.43 15.70±0.49 16.00±2. 66* 0.008 Hematócrito (HCT) (%) 39.98±0.58** 45.25±0.82 47.27±1.31 45.95±0.92 0.001 Plaquetas (PLT) (103/mm3) 930.7±51.85 956.2±31.1 712.3±153.1 956±35.26 0.150 Volume de Plaquetas Médio (VPM) (µm3) 6.03±0.09 6.08±0.07 6.76±0.46 6.167±0.10 0.160 (PCT) (%) 0.56±0.03 0.56±0.01 0.45±0.07 0,58±0,01 0.128
