AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA E PERFIL DE
SENSIBILIDADE DE CEPAS ISOLADAS DE POLPAS DE
FRUTAS CONGELADAS COMERCIALIZADAS EM FEIRAS
LIVRES DO MUNICÍPIO DE SÃO LUÍS-MA
A.N. Mouchrek1, A.M.Teles2, G.O. Everton3, N. E. Mendes Filho4, G.C. Santos5
1-Departamento de Tecnologia Química – Universidade Federal do Maranhão, Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água – CEP: 65080-805 – São Luís – MA – Brasil, Telefone: 55 (98) 0000-0000 – e-mail: (adenild@bol.com.br)
2- Departamento de Tecnologia Química – Universidade Federal do Maranhão, Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água – CEP: 65080-805 – São Luís – MA – Brasil, Telefone: 55 (98) 0000-0000 – e-mail: (damarateles@hotmail.com)
3 - Departamento de Tecnologia Química – Universidade Federal do Maranhão, Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água – CEP: 65080-805 – São Luís – MA – Brasil, Telefone: 55 (98) 0000-0000 – e-mail: (gustavooliveiraeverton@gmail.com).
4 - Departamento de Tecnologia Química – Universidade Federal do Maranhão, Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água – CEP: 65080-805 – São Luís – MA – Brasil, Telefone: 55 (98) 0000-0000 – e-mail: (:
nestormendesfilho@yahoo.com.br).
5 - Departamento de Tecnologia Química – Universidade Federal do Maranhão, Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água – CEP: 65080-805 – São Luís – MA – Brasil, Telefone: 55 (98) 0000-0000 – e-mail: (:geisacorreiasa@gmail.com).
RESUMO – O alimento após ter sido contaminado, serve como meio de crescimento microbiológicos. Dessa forma, este estudo teve por objetivo avaliar polpas de frutas congeladas, sendo estas bacuri, goiaba, murici, graviola, acerola, cupuaçu, caju e cajazinho comercializadas em São Luís-MA quanto a presença de coliformes a 45°C, identificação de Escherichia coli e contagem de bolores e leveduras com avaliação do seu perfil de sensibilidade quanto a antibióticos convencionais. As análises microbiológicas foram realizadas com base na metodologia descrita no Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of toods – APHA. Das 120 amostras analisadas, 13,33% (16)
confirmaram a presença de coliformes a 45°C, sendo 1,67% (2) acima dos padrões máximos de 100 NMP/g estabelecidos pela legislação vigente, 10,83 % (13) estiveram acima dos padrões para bolores e leveduras. Obteve-se ação antimicrobiana dos antibióticos testados frente as cepas de Escherichia
coli. Diante disto, faz-se necessário uma fiscalização da qualidade higiênica das polpas de frutas
congeladas.
ABSTRACT – The food after being contaminated, serve as microbiological growth medium. Thus, the objective of this study was to evaluate frozen fruit poles, being these bacuri, guava, murici, graviola, acerola, cupuaçu, cashew and cajazinho marketed in São Luís-MA as a presence of coliforms at 45 ° C, identification of Escherichia coli and counting of molds and yeasts with evaluation of their sensitivity profile for conventional antibiotics. Microbiological analyzes were performed based on the methodology described in the Compendium of Methods for Microbiological Examination of toods (APHA). Of the 120 samples analyzed, 13.33% (16) confirmed a presence of coliforms at 45 ° C, being 1.67% (2) above the maximum standards of 100 MPN / g established by current legislation, 10.83% (13 ) They are above standards for molds and yeasts. Antimicrobial action of the antibiotics tested as Escherichia coli strains was obtained. In view of this, it is necessary to inspect the hygienic quality of frozen fruit pulps.
PALAVRAS-CHAVE: polpa de frutas; avaliação; antibióticos. KEYWORDS: fruit pulp; evaluation; antibiotics.
1. INTRODUÇÃO.
O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) através da Instrução Normativa de n° 01 de 07 de janeiro de 2000 define polpa de fruta o fruto não fermentado, não concentrado, não diluído, extraída de frutos polposos, por meio procedimentos tecnológicos apropriados, com um teor mínimo de sólidos totais, derivado da parte comestível do fruto” (Brasil, 2000).
A polpa deve ser obtida de frutos limpos, sadios, livres de material ferroso, parasitas e de restos de origem animal ou vegetal. Não devem existir partes não consumíveis dos frutos e plantas, como caroços, cascas e sementes, além de substâncias incomuns na sua composição comum (Costa et al., 2013). Pois inúmeros fatores contribuem para o surgimento de microrganismos, tais como: presença de fragmentos de partes não comestíveis da fruta e/ou substâncias estranhas à sua composição normal, grande volume ou massa de alimentos colocadas no refrigerador dificultando o processo de resfriamento e erros durante o processo de manipulação do alimento (Pelczar; Chan; Krieg, 2010).
Porém, grande parte da produção de frutas se deteriora devido a sua alta perecibilidade, durante a colheita, transporte, comercialização e armazenamento (Batista et al. 2013). Em diversas regiões do Brasil a fruticultura destaca-se pela importância econômica e muitas vezes tem se tornado a principal geradora de emprego e renda, bem como promotora do desenvolvimento rural. (FAO, 2012). A polpa de fruta congelada por apresentar eficiência e praticidade ao consumidor, além de maior tempo de validade quando comparado coma fruta fresca, garante que o consumidor possa consumir em qualquer época do ano, garantindo ao mercado consumidor a oferta desse produto mesmo em períodos de entre safras (Kepler; Fair, 2007; Evangelista; Vieites, 2006).
Os microrganismos responsáveis por doenças alimentares podem ser provenientes de fezes, manipuladores de alimentos com hábitos de higiene precários, por água contaminada e também por insetos rasteiros ou voadores (Jay, 2009). O alimento após ter sido contaminado, serve como meio de crescimento microbiológicos, podem alterar as características físico-químicas do alimento, sofrer deterioração e também podem ser os causadores de intoxicações e infecções transmitidas por alimentos (Pelczar; Chan; Krieg, 2010).
Dessa forma, este estudo teve por objetivo avaliar polpas de frutas congeladas, sendo estas bacuri, goiaba, murici, graviola, acerola, cupuaçu, caju e cajazinho comercializadas em São Luís-MA quanto a presença de coliformes a 45°C, identificação de Escherichia coli com avaliação do seu perfil de sensibilidade quanto a antibióticos convencionais e contagens de bolores e leveduras.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizadas analises para determinação do Número Mais Provável de Coliformes termotolerantes, contagem de bolores e leveduras e identificação de Escherichia coli. Com base na metodologia descrita no Compenduim of Methods for the Microbiological Examination of toods – APHA. As cepas de Escherichia coli isoladas e confirmadas bioquimicamente tiveram sua sensibilidade frente a antibióticos convencionais testada.
2.1 Amostragem
As amostras de polpas de frutas congeladas foram coletadas e analisadas no período de outubro de 2017 a janeiro de 2018, em nove (9) feiras livres com grande fluxo de clientes no município de São Luís/MA. Foram analisadas cento e vinte (120) amostras de polpas de frutas congeladas, sendo bacuri (15), goiaba (15), murici (15), graviola (15), acerola (15), cupuaçu (15), caju (15) e cajazinho (15).
Após a coleta, as amostras foram assepticamente acondicionadas em caixas isotérmicas e transportadas, imediatamente, para o Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água da Universidade Federal do Maranhão (UFMA) para o início das análises. Todas as análises microbiológicas foram realizadas conforme as técnicas recomendadas pelo Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods (APHA, 2001).
2.2 Pesquisa e quantificação de coliformes a 45°C (NMP/g)
A determinação de coliformes a 45ºC foi feita através da técnica dos tubos múltiplos. Onde se diluiu 25g da amostra em 225 mL de solução salina estéril a 0,85% de NaCl, de modo a obter-se a diluição 10-1, posteriormente foram realizadas diluições sucessivas, 10-2 e 10-3. Alíquotas de 1000µL de cada diluição foram inoculadas em série de três tubos contendo o caldo Lauril Sulfato Triptose e tubos Durham invertidos, sendo incubados a 35ºC por 24-48 horas. A partir dos tubos onde foi evidenciado o consumo do meio e aprisionamento de gás no tubo de Durham, procedeu-se com teste confirmativo. Inoculou-se alíquotas de 100µL com auxílio de alça de platina para o caldo EC, sendo posteriormente incubados em banho-maria a 45ºC por 24 horas. Os valores para NMP/g foram determinados com auxílio da tabela de Hoskis.
Isolamento e identificação de Escherichia coli: As análises realizadas para a identificação de
Escherichia coli foram feitas a partir dos tubos positivos provenientes do caldo E.C., com seu inóculo
semeou-se utilizando-se a técnica de esgotamento em placa com Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) e Ágar MacConckey (MC) incubou-se a 35ºC por 24 horas. Submeteram-se posteriormente as colônias características de bactérias fermentadoras de lactose às provas bioquímicas convencionais, sendo esta rosa em Ágar MC e verde metálico em Ágar EMB. Sendo previamente isoladas em superfície de Ágar TSA e incubadas a 35°C/24h.
2.3 Contagem de bolores e leveduras (UFC/g)
Para contagem de Bolores e Leveduras utilizou-se a técnica de inoculação por profundidade semeando 1000µL as diluições 10-2, 10-3 e 10-4 em placas de petri, empregando Ágar Batata Dextrose acidificado a 10%, com incubação das placas a 25º C em estufa B.O.D. sendo padronizada em cinco dias a leitura das placas.
2.4 Perfil de sensibilidade – Método da Difusão de Disco (MDD)
Culturas microbianas puras de Escherichia coli mantidas em ágar TSA foram repicadas para caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a 35ºC até atingirem fase exponencial de crescimento (4-6h). Após esse período, as culturas tiveram sua densidade celular ajustada em solução salina 0,85% estéril, de modo a se obter uma turbidez comparável à da solução padrão de McFarland 0,5, o que resulta em uma suspensão microbiana contendo aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2003).
As cepas encontradas nas polpas de frutas e identificadas pelos testes bioquímicos foram testadas frente a antimicrobianos comerciais com concentrações definidas: cefalotina (CFL, 20 µg), ampicilina (AMP, 10 µg), gentamicina (GEN, 10 µg), cloranfenicol (CLO, 30 µg), tetraciclina (TET, 30 µg), cefoxitina (CFO, 30 µg), cefotaxima (CTX, 30 µg) e ácido pipemídico (PIP, 30 µg). Onde foi adotado o método de difusão de disco (MDD), também conhecido como Kirby-Bauer.
A técnica de difusão de disco foi realizada segundo Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2003) que padroniza os testes de sensibilidade de antimicrobianos por disco-difusão..
Os diâmetros dos halos de inibição foram mensurados, incluindo o diâmetro do disco. Esses ensaios foram feitos em triplicata. Os valores dos halos de inibição foram as médias das medidas dos três resultados.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa (2005) classifica os halos de inibição obtidos pelo Método de Difusão de Disco, conforme a Tabela 1.
Tabela 1– Classificação dos halos de inibição por perfil de sensibilidade de cepas frente a antibióticos
Agente Código Discos Halo de inibição
Resistente (R) Intermediária (I) Sensível (S)
Ampicilina AMP 10 µg ≤13 14-16 ≥17 Gentamicina GEN 10µg ≤12 13-14 ≥15 Tetracilina TET 30 µg ≤11 12-14 ≥15 Cloranfenicol CLO 30 µg ≤12 13-17 ≥18 Cefoxitina CFO 30 µg ≤14 15-17 ≥18 Cefotaxima CTX 30 µg ≤22 23-25 ≥26 Ác. Pipemídico PIP 30 g ≤13 14-18 ≥16 Cefalotina CFL 20 g ≤14 15-17 ≥ 18 Fonte: (Anvisa, 2005)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das cento e vinte 120 amostras analisadas, 13,33% (16) confirmaram a presença de coliformes a 45°C, sendo 1,67% (2) acima dos padrões máximos de 100 NMP/g estabelecidos pela legislação vigente, de acordo com a Tabela 2, estando dessa forma impróprias para o consumo.
Tabela 2 – % Coliformes a 45°C em polpas congeladas de frutas de São Luís-MA
Polpa %
Coliformes a 45°C
% Acima dos padrões legislativos -100 NMP/g) Presença de Escherichia coli Acerola (15) 13,33% (2) 0,00% (0) 0,00% (0) Bacuri (15) 46,67 % (7) 13,33% (2) 6,67% (1) Cajazinho (15) 0,00% (0) 0,00% (0) 0,00% (0) Caju (15) 0,00% (0) 0,00% (0) 0,00% (0) Cupuaçu (15) 20,00% (3) 0,00% (0) 0,00% (0) Goiaba (15) 13,33% (2) 0,00% (0) 0,00% (0) Graviola (15) 13,33% (2) 0,00% (0) 6,67% (1) Murici (15) 0,00% (0) 0,00% (0) 0,00% (0) Total (120) 13,33% (16) 1,67 % (2) 1,67% (2) Fonte: (Autor, 2018).
Resultados semelhantes foram relatados por Santos, Coelho, Carreiro (2008), que avaliaram 98 amostras de polpas de frutas, e dentre essas apenas 5 amostras de diferentes frutos exibiram presença para coliformes termotolerantes e confirmaram a presença de E. coli.
A maioria das polpas de frutas exibem alto valor de pH sendo este um fator limitante para o aumento de bactérias patogênicas (Santos; Coelho; Carreiro; 2008)
Dantas et al. (2012), em seu estudo analisaram 19 amostras de polpas de frutas e para coliformes foram encontrados valores acima do permitido pela legislação vigente, demonstrando que não estão sendo satisfatórias as condições higiênico e sanitário no processamento das polpas de frutas. Segundo o mesmo estudo, uma marca apresentou crescimento para E. Coli, estando, portanto, fora dos padrões exigidos pela legislação.
Tabela 3 – % Bolores e Leveduras em polpas congeladas de frutas de São Luís-MA
Polpa %
Bolores e Leveduras
Intervalo de contagem (UFC/g)
% Acima dos padrões legislativos -5*103 UFC/g Acerola (15) 33,33% (5) 1,3*102 – 5,8*104 13,33% (2) Bacuri (15) 53,33 % (8) 1,3*102 - 9,8*103 26,67% (4) Cajazinho (15) 0,00% (0) 0,00% (0) 0,00% (0) Caju (15) 0,00% (0) 0,00% (0) 0,00% (0) Cupuaçu (15) 33,33% (5) 2,8*101 – 4,8*104 6,67% (1) Goiaba (15) 60,00% (9) 3,8*102 - 1,49x104 20,00% (3) Graviola (15) 53,33% (8) 4,2*102 – 6,7 *103 20,00% (3) Murici (15) 46,67% (7) 3,2*102 -3,7*102 0,00 % (0) Total (120) 35,00 % (42) 2,8*101 – 5,8 *104 10,83 % (13) Fonte: (Autor, 2018).
Pariz (2011) relata em seu estudo sobre as polpas de frutas industrializadas e comercializadas na cidade de Bento Gonçalves (RS), foi observado que segundo informações dos fornecedores, das 9 amostras que tiveram resultados de contaminação por bolores e leveduras, 7 haviam passado por processo de pasteurização com posterior congelamento, evidenciando que o tratamento térmico não demonstrou eficácia.
Franco e Landgraf (2003) afirmam que o baixo número de bolores e leveduras são julgados normais em alimentos frescos e congelados. Todavia, altos valores representam um importante fator deteriorante que pode gerar várias conseqüências, desde à rejeição do produto para comercialização até um risco à saúde pública, devido a uma possível produção de micotoxinas por algumas espécies de bolores. Algumas medidas podem ser aplicadas para minimizar a contaminação das frutas com fungos e/ou bactérias.
Os resultados para o diâmetro dos halos de inibição médios em mm são apresentados na Tabela 4. Observou-se ação antimicrobiana por todos os antibióticos testados, porém a Escherichia coli não foi inibida pelo antibiótico Ampicilina.
Tabela 4 – Diâmetros dos halos de inibição dos antibióticos testados frente às cepas de Escherichia
coli.
Diâmetros dos halos de inibição médios (mm)
Polpa de Bacuri Polpa de Goiaba
Código Conc. Escherichia coli Escherichia coli
AMP 10 µg 00,00 08,00 GEN 10 µg 12,00 14,60 TET 30 µg 00,00 22,00 CLO 30 µg 29,00 19,30 CFO 30 µg 22,00 16,00 CTX 30 µg 34,00 03,60 PIP 30 µg 24,00 13,00 CFL 20 µg 11,00 08,60 Fonte: (Autor, 2018).
Os resultados para o perfil de sensibilidade dos diâmetro dos halos de inibição médios como foi observado e apresentados na Tabela 1 podemos observar que todas a Escherichia coli isoladas da polpa de bacuri demonstrou-se sensível aos antibióticos cloranfenicol, cefoxitina e cefotaxima. Por outro lado, a Escherichia coli isolada da polpa de goiaba demonstrou-se sensível ao cefoxitina, ácido pipemídico e cefalotina.
4. CONCLUSÕES
Portanto, os resultados evidenciam que as condições higiênicas sanitárias em polpas de bacuri comercializadas em São Luís-MA necessitam de uma fiscalização maior visto que amostras estiveram fora dos padrões vigentes para este alimento.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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