UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
BRUNA RAMOS INOUE
ENVOLVIMENTO DE METALOPROTEINASES NAS RESPOSTAS
CARDIOVASCULARES À PEÇONHA DE BOTHROPS ALTERNATUS EM RATOS ANESTESIADOS
INVOLVEMENT OF METALLOPROTEINASES IN CARDIOVASCULAR
RESPONSES TO THE VENOM OF BOTHROPS ALTERNATUS IN ANESTHETIZED RATS
CAMPINAS 2015
BRUNA RAMOS INOUE
ENVOLVIMENTO DE METALOPROTEINASES NAS RESPOSTAS
CARDIOVASCULARES À PEÇONHA DE BOTHROPS ALTERNATUS EM RATOS ANESTESIADOS
INVOLVEMENT OF METALLOPROTEINASES IN CARDIOVASCULAR
RESPONSES TO THE VENOM OF BOTHROPS ALTERNATUS IN ANESTHETIZED RATS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Farmacologia
Paper presented to the State University of Campinas School of Medical Sciences as part of the requirements for obtaining a Master's degree in Pharmacology
ORIENTADOR: Prof. Dr. Stephen Hyslop
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA BRUNA RAMOS INOUE E ORIENTADA PELO PROF. DR. STEPHEN HYSLOP.
CAMPINAS 2015
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 134397/2013-4
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Inoue, Bruna Ramos, 1982-
In71e Envolvimento de metaloproteinases nas respostas cardiovascular à peçonha de Bothrops alternatus em ratos anestesiados / Bruna Ramos Inoue.
– Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Stephen Hyslop.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Venenos de serpentes. 2. Bothrops alternatus. 3. Metaloproteinases de matriz. 4. Serpentes. 5. Inibidores de proteases. 6. Inibidores de metaloproteinases de matriz. I. Hyslop, Stephen,1964-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Involvement of metalloproteinases in cardiovascular responses to the venom of Bothrops alternatus in anesthetized rats
Palavras-chave em inglês:
Snake venoms Bothrops alternatus Matrix metalloproteinases Snakes Protease inhibitors
Matrix metalloproteinase inhibitors
Área de concentração: Farmacologia Titulação: Mestre em Farmacologia Banca examinadora:
Stephen Hyslop [Orientador] Edson Antunes
Soraia Kátia Pereira Costa Data de defesa: 15-12-2015
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
BRUNA RAMOS INOUE
ORIENTADOR: PROF. DR. STEPHEN HYSLOP
MEMBROS:
1. PROF. DR. STEPHEN HYSLOP
2. PROF. DR. EDSON ANTUNES
3. PROFA. DRA. SORAIA KÁTIA PEREIRA COSTA
Programa de Pós-Graduação em [PROGRAMA] da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu marido Roberto, pelo seu amor, carinho, dedicação e apoio às minhas realizações pessoais e por sempre acreditar em meus sonhos. Você é minha vida.A minha filha Rafaela, pelo sorriso lindo ao final de todas as tardes, pela compreensão do tempo dispensado a este trabalho, por ser a razão da minha vida.
Te amo filha!
A minha mãe Clêda, por ser este exemplo de mulher guerreira e determinada me incentivando sempre a continuar e nunca desistir, me guiando pelo caminho do bem e principalmente da honestidade. Devo a você o que sou e o que pretendo ser. Obrigado por acreditar em mim! Amo você!
A minha irmã Sara pela sua amizade, pelos conselhos, pelo ombro amigo nos momentos mais difíceis. Obrigada por você existir, te amo muito.
Aos meus irmãos Leandro e Rodrigo e ao meu pai Jonas pelo simples de fato de vocês existirem em minha vida, amo vocês.
A minha sogra Helena e ao meu sogro João pelo carinho e acolhimento, sempre dispostos a ajudar e amparar. Sem vocês este sonho não seria possível. Fica aqui o meu muito obrigada de coração.
A minha grande amiga Flávia Renata, pelo apoio incondicional em todos os momentos, pelo ombro realmente amigo de todas as horas. Você amiga é muito importante em minha vida...
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me guiar no caminho certo e pela força para concluir mais essa etapade minha vida, graças a sua infinita bondade e sabedoria.
Ao Prof. Dr. Stephen Hyslop, pela oportunidade de realizar esse trabalho sob sua orientação. Por compartilhar de seus conhecimentos científicos para conclusão desta etapa em minha vida. Sem sua grandiosa colaboração nada seria possível.
Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), pelas condições oferecidas para a realização deste trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro que tornou possível a realização deste trabalho.
À grande pesquisadora Lourdes Dias, que me ensinou andar pelos caminhos da pesquisa, e sempre me apoiou nesta etapa de minha vida.
Tenha certeza que você é uma pessoa muito especial, iluminada por Deus.
Às amigas Mariana Pitocco e Alessandra Stroka, pela amizade e companheirismo durante esta jornada. Sem vocês eu não conseguiria realizar esse trabalho. Obrigada por tudo.
Aos amigos Leandro, Norma, Elionai, Priscila, Beatriz, Rafael, Mariana
Tamascia, Frank e Delkia, pela paciência e pelas risadas nos momentos de folga.
Ao José Ilton dos Santos e Patrícia Costa Panunto, técnicos do Laboratório de Farmacologia Bioquímica do Departamento de Farmacologia, pela grandiosa ajuda em meus experimentos e pela amizade.
Srs. Miguel, Antonio, Aguinaldo e Ivani, pelo cuidado e dedicação dispensados aos animais.
Aos colegas de programa de pós-graduação em farmacologia, pela amizade e pelos momentos de descontração.
Aos animais que deram suas vidas em benefício da pesquisa científica. Meu mais sincero respeito e agradecimento.
EPÍGRAFE
“Os sonhos não determinam o lugar onde iremos chegar, mas produzem a força necessária para tirar-nos do lugar em que estamos.”
RESUMO
Neste trabalho, investigamos o envolvimento de metaloproteinases nas alterações hemodinâmicas provocadas pela peçonha da serpente Bothrops alternatus (urutu) em ratos machos Wistar anestesiados. Os ratos foram injetados por via intravenosa (i.v.) com peçonha nas doses de 0,4 mg/kg (não letal) ou 0,5 mg/kg (letal) na ausência e presença de pré-tratamento com doxiciclina (DOX; 30 mg/kg, i.v., 20 min antes da peçonha); em outros protocolos, a peçonha foi pré-incubada (1 h, temperatura ambiente) com doxiciclina (10 mM), fenantrolina (20 mM ou 30 µM) ou EDTA (30 µM) antes da injeção. A peçonha sozinha causou hipotensão nos primeiros 15 min, com retorno gradual aos valores basais nos 45 min seguintes; não houve alteração nas frequências cardíaca e respiratória e todos os ratos sobreviveram até 120 min após o envenenamento. Já a dose de 0,5 mg/kg causou hipotensão acentuada irreversível, bradicardia marcante e queda na respiração, com morte em ~10 min. O pré-tratamento com DOX atenuou a hipotensão significativamente nos primeiros 15 min com a dose menor de peçonha, e protegeu completamente contra as alterações hemodinâmicas causadas pela dose maior, além de impedir a morte dos ratos. Um perfil de respostas semelhante foi observado quando a peçonha foi pré-tratada com a DOX antes de ser injetada. De modo semelhante à DOX, a pré-incubação da peçonha com fenantrolina ou EDTA protegeu os ratos contra os efeitos da dose maior (hipotensão, bradicardia e morte), porém a queda na pressão nos primeiros 15 min não foi tão atenuada quanto com a DOX. Não houve alteração na atividade plasmática das metaloproteinases de matriz (MMP) -2 e -9 nos 30 min após o envenenamento com a dose menor e nos 10 min até a morte com a dose maior. Apenas a dose maior de peçonha causou trombose intravascular pulmonar significativa (~12% dos vasos afetados), principalmente em vasos menores. Esta trombose foi significativamente inibida em ratos pré-tratados com a DOX. Em vasos isolados a peçonha causou relaxamento dependente do endotélio (83±6,7% com 15 µg/ml em artéria mesentérica superior e 41±6,8% com 50 µg/ml em artéria pulmonar esquerda). Estes resultados indicam que as metaloproteinases da peçonha exercem papel importante na hipotensão causada pela peçonha de B. alternatus.
Palavras-chave: Veneno de serpente, serpentes, metaloproteinases de matriz,
ABSTRACT
In this work, we investigated the involvement of metalloproteinases in the hemodynamic alterations caused by Bothrops alternatus (urutu) snake venom in anesthetized male Wistar rats. Rats were injected intravenously (i.v.) with venom doses of 0.4 mg/kg or 0.5 mg/kg with or without pre-treatment with doxycycline (DOX; 30 mg/kg, i.v., 20 min before venom). In some protocols, venom was preincubated (1 h, room temperature) with 10 mM doxycycline, 20 mM or 30 M phenanthroline or 30
M EDTA before injection. Venom (0.4 mg/kg) caused hypotension within 15 minfollowed by a gradual return to basal values over the next 45 min; there were no changes in heart rate or respiratory rate and all rats survived for 120 min after envenomation. A venom dose of 0.5 mg/kg caused marked irreversible hypotension, bradycardia and respiratory failure, with the rat dying within 10 min. Pre-treatment of rats with DOX attenuated the hypotension caused by the non-lethal dose of venom in the first 15 min and completely protected the rats against the hemodynamic alterations associated with the lethal dose, in addition to preventing death of the rats. A similar profile of responses was obtained when venom was pre-incubated with DOX prior to injection. As with DOX, pre-incubation of venom with phenanthroline or EDTA protected the rats against the effects (hypotension, bradycardia, respiratory failure and death) of the lethal dose of venom, although the hypotension in the first 15 min was attenuated to a lesser extent than with DOX. There were no changes in plasma activities of matrix metaloproteinases (MMP) -2 and -9 in the 30 min after the non-lethal dose of venom or in the 10 min after the lethal dose. Significant intravascular pulmonary thrombosis was seen only with the higher dose of venom (~12% of vessels affected), principally in small caliber vessels. This thrombosis was significantly attenuated in rats pre-treated with DOX. In isolated blood vessels, venom caused endothelium-dependent relaxation (83±6.7% with 15 µg/ml in superior mesenteric artery and 41±6.8% with 50 µg/ml in left pulmonary artery). These results indicate that venom metalloproteinases have an important role in the hemodynamic alterations caused by B. alternatus venom.
Keyword: Snake venoms, snakes, matrix metalloproteinases, proteases inhibitors,
LISTA DE FIGURAS
FIGURA TÍTULO PÁGINA
Figura 1 Mecanismo de ação das peçonhas botrópicas na inflamação,
coagulação e hemorragia ... 19
Figura 2 Bothrops alternatus e sua distribuição geográfica no
Brasil ... 20
Figura 3 Principais componentes da peçonha de B. alternatus e suas
ações ... 21
Figura 4 Alterações hemodinâmicas causadas pela peçonha de B.
alternatus (0,4 e 0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 36
Figura 5 Efeito do pré-tratamento com doxiciclina sobre as alterações
hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,4
mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 38
Figura 6 Influência da pré-incubação da peçonha de B. alternatus (0,4
mg/kg, i.v.), com doxiciclina (10 mM) sobre as respostas hemodinâmicas à peçonha em ratos anestesiados ... 40
Figura 7 Influência da pré-incubação com fenantrolina sobre as
alterações hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg; i.v.) ... 42
Figura 8 Efeito do pré-tratamento com doxiciclina sobre as alterações
hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,5
44
mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados...
Figura 9 A pré-incubação com doxiciclina (10 mM) protege contra as
alterações hemodinâmicas e letalidade da peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 46
Figura 10 A pré-incubação com fenantrolina (20 mM) protege contra as alterações hemodinâmicas e letalidade da peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 49
Figura 11 A pré-incubação com fenantrolina (30 µM) protege contra as
alterações hemodinâmicas e letalidade da peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 50
Figura 12 A pré-incubação com EDTA (30 µM) protege contra as
alterações hemodinâmicas e letalidade da peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados ... 51
Figura 13 Ausência de alteração nas atividades da MMP-2 e MMP-9 em
plasma de ratos tratados com salina ou peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg ou 0,5 mg/kg, i.v.) ... 54
Figura 14 Porcentagem de vasos pulmonares com trombos em ratos
tratados com peçonha de B. alternatus (0,4 e 0,5 mg/kg, i.v.) ... 56
Figura 15 Ocorrência de trombos nos vasos pulmonares de ratos pré-
tratados com doxiciclina (30 mg/kg, i.v.) 20 min antes da injeção de peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg, i.v.) ... 59
Figura 16 Ação da peçonha de B. alternatus (15 e 50 µg/ml) em anéis de
artéria mesentérica superior e artéria pulmonar esquerda
isoladas de ratos ... 61
Figura 17 Atividade residual (%) da azocaseina e BApNA após
LISTA DE TABELAS
TABELA TÍTULO PÁGINA
Tabela 1 Parâmetros eletrocardiográficos dos grupos: controle,
peçonha na dose letal e não letal... 37
Tabela 2 Parâmetros eletrocardiográficos do pré tratamento com
doxiciclina ... 39
Tabela 3 Parâmetros eletrocardiográficos do pré-incubação de
peçonha na dose não letal com doxiciclina ... 41
Tabela 4 Parâmetros eletrocardiográficos do pré-incubação de
peçonha na dose não letal com fenantrolina ... 43
Tabela 5 Parâmetros eletrocardiográficos do pré tratamento com
doxiciclina e peçonha na dose letal ... 45
Tabela 6 Parâmetros eletrocardiográficos do pré-incubação de
peçonha na dose letal com doxiciclina ... 47
Tabela 7 Parâmetros eletrocardiográficos do pré-incubação de
peçonha na dose letal com inibidores (fenantrolina e EDTA) ... 52
SIGLAS E ABREVIATURAS
SIGLA/ABREVIATURA DEFINIÇÃO
ACh Acetilcolina
ALT-C Alternagina C
ANOVA Análise de variância
Bpm Batimentos por minuto
CRISP Proteína secretora rica em cisteína
DP Desvio Padrão
ECA Enzima conversora de angiotensina
DOX Doxiciclina
ECG Eletrocardiograma
EPM Erro padrão da média
FC Frequência cardíaca
FR Frequência respiratória
HE Hematoxilina-eosina
i.v. Intravascular (intravenosa)
IL-1 Interleucina-1
IL-6 Interleucina-6
IRA Insuficiência Renal Aguda
KCl Cloreto de Potássio
LAAO L-Aminoácido-oxidase
MEC Membrana Extracelular
MB Membrana basal
MMPs Metaloproteinases de matriz
MPs Metaloproteinases
MS Ministério da Saúde
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido Nítrico Sintase
PA Pressão arterial
PAD Pressão arterial diastólica
PAM Pressão arterial média
PAS Pressão arterial sistólica
PP Pressão de pulso
PPB Peptídeos potencializadores de bradicinina
SINAN Sistema de Informações de Agravos de Notificação SVMPs Metaloproteinases da peçonha de serpente
SVSPs Serinoproteases da peçonha de serpente
TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
SUMÁRIO
1.0. INTRODUÇÃO ...18
1.1. Envenenamento botrópico ...18
1.2. Composição da peçonha botrópica ...18
1.3. Bothrops alternatus ...19
1.4. Metaloproteinases de peçonhas ofídicas (snake venom metalloproteinases – SVMPs) ... 22
1.5. Serinoproteases (snake venom serine proteinases - SVSPs) ...23
1.6. Metaloproteinases de matriz (MMPs) ...23 1.7. SVMPs e MMPs ...25 2.0. OBJETIVOS ...27 3.0. MATERIAL E MÉTODO ...28 3.1. Animais ...28 3.2. Peçonha ...28 3.3. Reagentes ...28 3.4. Protocolos experimentais ...28
3.4.1. Procedimentos experimentais gerais ...28
3.4.2. Pré-tratamento dos ratos com inibidores de metaloproteinases ...29
3.4.3. Pré-incubação da peçonha com inibidores de metaloproteinases.. 30
3.4.4. Zimografia do plasma ...31
3.4.5. Histologia e avaliação da formação de trombos no tecido pulmonar de ratos tratados com peçonha B. alternatus ... 31
3.5. Protocolos com vasos isolados ... 32
3.5.1. Vasos (anéis de artéria mesentérica superior e artéria pulmonar) isolados de rato ... 32
3.6. Atividades enzimáticas ... 33
3.6.1. Atividade proteolítica ... 33
3.6.2. Atividade arginina amidase ... 34
3.6.3. Incubação com inibidores ... 34
3.7. Análise estatística ... 34
4.0. RESULTADOS ... 35
4.1. Alterações cardiovasculares e respiratórias ... 35
4.2. Efeito de inibidores de metaloproteinases sobre as alterações hemodinâmicas causadas por uma dose não letal da peçonha de B. alternatus ... 37
4.2.1. Pré-tratamento dos ratos com a doxiciclina ...37
4.2.2. Pré-incubação da peçonha de B. alternatus com doxiciclina ...39
4.2.3. Pré-incubação da peçonha de B. alternatus com fenantrolina ...41
4.3. Efeito de inibidores de metaloproteinases sobre as alterações hemodinâmicas causadas por uma dose letal da peçonha de B. alternatus ... 43
4.3.1. Pré-tratamento dos ratos com doxiciclina ...43
4.3.2. Pré-incubação da peçonha com doxiciclina ...45
4.3.3. Pré-incubação da peçonha com fenantrolina e EDTA ...47
4.4. Avaliação das atividades da MMP-2 e MMP-9 através da zimografia ... 53
4.5. Análise histológica de tecido pulmonar de ratos tratados com peçonha de B. alternatus na ausência e presença de inibidores
de metaloproteinases ... 55
4.6. Ação vascular direta da peçonha de B. alternatus em anéis de artérias mesentérica superior e pulmonar... 60
4.7. Inibição das atividades proteolíticas e esterásicas da peçonha de B. alternatus por substâncias quelantes ... 62
5.0. DISCUSSÃO ...64
6.0. CONCLUSÕES ...70
7.0. REFERÊNCIAS ...71
1. INTRODUÇÃO
1.1. Envenenamento botrópico
Os acidentes ofídicos representam um importante problema de saúde pública, principalmente nas áreas rurais dos países tropicais e subtropicais. As serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos ocorridos na América Latina. Essas serpentes estão distribuídas em uma grande extensão que vai do México até a Argentina [1]. As serpentes presentes no território brasileiro pertencem a quatro gêneros: Bothrops (jararaca, jararacuçu, urutu, caiçaca, entre outras), Crotalus (cascavel) e Lachesis (surucucu) e Micrurus (corais) [2]. No Brasil o gênero Bothrops é responsável pela maioria dos acidentes ofídicos (87%), seguido dos gêneros Crotalus (9%), Lachesis (3,8%) e Micrurus (0,9%), com uma média de aproximadamente 28.000 acidentes/ano [3-8].
A ocorrência dos acidentes ofídicos registrados de 2009 a 2013 (SINAM – MS) mostra maior índice nas regiões sudeste, norte e nordeste, e menor nas regiões sul e centro oeste [7,8]. As taxas de acidentes ofídicos estão diretamente relacionadas a fatores climáticos e à densidade populacional humana nas áreas rurais, sendo os acidentes mais prevalentes no sexo masculino com faixa etária entre 15 e 49 anos [9], enquanto a gravidade e letalidade do acidente ofídico estão relacionadas ao intervalo de tempo entre o acidente e o atendimento médico, bem como o tipo de envenenamento [6].
1.2. Composição da peçonha botrópica
As peçonhas botrópicas são compostas de misturas complexas de enzimas, peptídeos e compostos não enzimáticos com diferentes atividades no organismo da vítima [10-12] e que tem a função de imobilizar e matar a presa, contribuindo também na digestão da mesma. Estas peçonhas exercem três atividades principais: (1) atividade edematogênica e inflamatória, mediada principalmente pela atividade de fosfolipases A2 (PLA2) e proteases, (2) atividade
coagulante, mediada por enzimas trombina-símile que ativam protrombina e o fator X promovendo assim o consumo dos fatores de coagulação e alterando a coagulação sanguínea, e (3) atividade hemorrágica, mediada por metaloproteinases que atuam
no endotélio vascular local e sistêmico causando sangramento sistêmico [11,13-18] (Fig. 1). A Atividade inflamatória B Atividade na coagulação Proteases Prostaglandinas Bradicinina Esterases Leucotrienos PLA 2 Prostaciclinas Lectina Tromboxanos 2 Enzimas liberadoras de cininas
Ativação de Fator X
Diminuição do fibrinogênio e
Atuação em fatores formação de fibrina Conversão de protrombina da coagulação
em trombina
Degradação de fibrina
C
Atividade Atuação de Degradação de componentes da MEC
hemorrágica metaloproteinases Ativação de metaloproteinases
de matriz (MMPs)
Figura 1. Mecanismo de ação das peçonhas botrópicas na inflamação (A),
coagulação (B) e hemorragia (C).
Os envenenamentos botrópicos geralmente causam efeitos locais e sistêmicos. Dentre os efeitos locais estão: dor, edema, formação de bolhas, necrose e hemorragia [17]. Os efeitos sistêmicos consistem em sangramento, choque cardiovascular, coagulação intravascular disseminada e insuficiência renal aguda (IRA), podendo levar à morte nos casos mais graves [17,18].
1.3. Bothrops alternatus
No Brasil, a serpente B. alternatus (urutu, urutu-cruzeiro) é encontrada em Minas Gerais, Goiás, sul de São Paulo, Paraná, Santa Catarina e no Rio Grande do Sul; também ocorre em Mato Grosso ao longo do Rio Paraná e no extremo sul deste estado (Fig. 2). Habita áreas pantanosas, ribeirinhas, brejos e outros hábitats úmidos. É uma serpente terrestre, podendo medir até 1,7 m de comprimento [19].
Comparado a outras peçonhas botrópicas, a de B. alternatus é pouco ativa quanto às atividades enzimáticas [19] e tem baixa atividade caseinolítica e fibrinolítica [20-22]. Entretanto, esta peçonha apresenta considerável ação sobre o plasma total, fibrinogênio e alguns fatores de coagulação [20,22]. Quanto aos danos locais apresentam baixa atividade hemorrágica e necrosante [20-23], baixo conteúdo de miotoxinas básicas características de peçonhas botrópicas [24,25], mas ainda assim provoca mionecrose do tipo coagulativa [26].
A
A
B
Figura 2. (A) Bothrops alternatus (Foto: Kayena Delaix Zaqueo, Belo Horizonte –
A gravidade do envenenamento causada por B. alternatus reflete em parte a elevada quantidade de peçonha que esta serpente produz [20,28]. Dentre os efeitos locais mais frequentes causados por estas serpentes se destacam: edema, hemorragia e necrose [29]. Quanto aos efeitos sistêmicos, os distúrbios na cascata de coagulação são os mais marcantes [30].
Estudos proteômicos e transcriptômicos mostraram que a peçonha de B.
alternatus é composta, em sua maioria, por metaloproteinases (SVMPs – snake
venom metalloproteinases), principalmente as da classe P-III que são as mais
hemorrágicas, além de serinoproteinases (SVSPs – snake venom serine
proteinases), PLA2, lectinas do tipo C, peptídeos potencializadores da bradicinina
(PPB), e outras toxinas em quantidades menores, tais como a L-aminoácido oxidase (LAAO), proteínas secretoras ricas em cisteínas (CRISP), dipeptidilpeptidases IV, hialuronidases e outras (Fig. 3). Esta composição se assemelha à de outras peçonhas botrópicas [31, 32, 33]. Metaloproteinases PPBs PLA2 Serinoproteases B. alternatus Lectinas
Degradação da MEC, levando à hemorragia.
Atuam na ECA, inibindo a formação de angiotensina II e a degradação de bradicinina, causando hipotensão.
Neurotoxicidade in vitro, cardiotoxicidade, mionecrose, atividade anticoagulante, inibição da agregação plaquetária, indução de edema e dor.
Ação sobre a cascata de coagulação e liberação de bradicinina.
Hemoaglutinação, agregação plaquetária, edema, modulação de
Ca2+ do retículo sarcoplasmático do
músculo esquelético.
1.4. Metaloproteinases de peçonhas ofídicas (SVMPs - snake venom metalloproteinases)
As SVMPs fazem parte do grupo das reprolisinas [34]. Atualmente sabe se que as SVMPs são as principais toxinas presentes em peçonhas botrópicas. Com o surgimento dos primeiros dados de sequências destas proteínas, foi possível classificá-las, notando-se que a diferença mais evidente entre elas estava no tamanho e nos domínios estruturais. A classificação estrutural atual das SVMPs reconhece quatro classes: PI (SVMPs tendo apenas um domínio metaloproteinase), PII (SVMPs com domínios metaloproteinase e desintegrina), PIII (SVMPs com domínios metaloproteinase, desintegrina e rico em cisteína) e PIV (SVMPs com domínios iguais às PIII, com um domínio lectina adicional) [34].
As SVMPs possuem domínio para ligação do zinco, sendo, portanto, zinco-dependentes, o que faz com que elas sejam inibidas por substâncias quelantes deste metal. As SVMPs da classe PI apresentam pouca ou nenhuma atividade hemorrágica, enquanto as da classe PIII são consideradas as de maior atividade hemorrágica; já as SVMPs da classe PIV tem atividade hemorrágica considerada baixa [35]. As SVMPs da classe PIII são a mais intrigante em termos de complexidade e sua função na peçonha [36].
As SVMPs das peçonhas botrópicas contribuem para a hemorragia sistêmica observada em animais [11, 16, 36, 37] e humanos [38]. Esta hemorragia resulta, em grande parte, da capacidade das SVMPs de degradar diversas proteínas da matriz extracelular (MEC), tais como colágeno tipo IV, entactina, fibronectina e proteoglicano [39]. A degradação destes componentes da MEC pode levar ao desprendimento das células endoteliais da lâmina basal. Pela sua capacidade de liberar TNF-α e prostanóides as SVMPs contribuem para a nocicepção em patas de ratos [35, 36, 40]. . Além das atividades acima, as SVMPs também têm atividade fibrinogenolítica, fibrinolítico, apoptótica, ativação de protrombina, a ativação do Fator X, a inibição de agregação de plaquetas [41].
Baseado em análises proteômicas [31] e transcriptômicas [32, 33] da peçonha de B. alternatus sugere-se que os efeitos hemorrágicos locais e sistêmicos podem ser explicados pela alta concentração de SVMPs na mesma, sendo na sua maioria da classe PIII. Duas SVMPs foram isoladas da peçonha de B. alternatus, a saber, baltergina e alternagina. A alternagina é um inibidor da ligação de colágeno à
integrina [33] e a baltergina é uma metaloproteinase hemorrágica capaz de produzir mionecrose, edema e hemorragia pulmonar grave, além de afetar o rim e o fígado [33].
1.5. Serinoproteases (snake venom serine proteinases - SVSPs)
As serinoproteases são glicoproteínas que se diferenciam umas das outras pelo número de sitio de glicosilação e sua sequência. São enzimas que atuam sobre componentes da cascata de coagulação, células e outros constituintes do sangue, com a finalidade de promover um desequilíbrio no mecanismo de coagulação das presas [42-45].
Algumas SVSPs são conhecidas como enzimas thrombin-like pelo fato de “imitarem” os mecanismos bioquímicos da trombina como quebra de moléculas de fibrinogênio (dando origem a fibrina), indução de agregação plaquetária, ativação do fator V e da proteína C, o que causa coagulação do sangue [46]. Há também as SVSPs conhecidas como kallikrein-like que liberam bradicinina a partir de cininogênio, o que leva a hipotensão [47,48]. Existem SVSPs com ação específica na ativação de plasminogênio, transformando-o em plasmina, tendo assim a função anticoagulante por clivar fibrina [44]. Por outro lado existem SVSPs com capacidade de clivar fibrinogênio e atuar na produção de bradicinina simultaneamente [49]. E finalmente, há SVSPs ativadoras de protrombina dos tipos C e D [50].
1.6. Metaloproteinases de matriz (MMPs)
As metaloproteinases de matriz (MMPs) formam uma extensa família de enzimas proteolíticas dependentes de metais como o zinco e o cálcio que clivam ligações internas de substratos proteicos, sendo classificadas, portanto, como endopeptidases [51]. Essas enzimas estão envolvidas em processos fisiológicos tais como a cicatrização de feridas, reabsorção óssea, involução mamária e embriogênese. Já nos processos patológicos estão presentes nas artrites e osteoartrites, doenças periodontais, fibrose hepática, doenças cardiovasculares e metástases neoplásicas [52].
A família de MMPs é composta de aproximadamente 25 enzimas, divididas em cinco grupos, de acordo com suas estruturas e especificidade aos substratos: colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13 e MMP-18), gelatinases (MMP-2
e MMP-9), estromelisinas 3, MMP-10, MMP-11 e MMP-26), matrilisina (MMP-7) e metaloproteinases de membrana (MT1-MMP a MT6-MMP, também conhecidas como MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 e MMP-25) [51,52]. As MMPs degradam os componentes da matriz extracelular (MEC) e também da membrana basal [53].
Os leucócitos polimorfonucleares, queratinócitos, monócitos, macrófagos, fibroblastos e as células mesenquimais são as principais células que sintetizam e liberam MMPs, sendo que esta liberação depende de citocinas e fatores de crescimento [54]. As MMPs são liberadas em sua forma latente como pró-enzimas, se tornando ativas em ambiente pericelular quando ocorre à quebra proteolítica do domínio amino-terminal rico em cisteína. Suas atividades dependem da presença de zinco, por isso são conhecidas como enzimas zinco-dependentes [53]. Todas as MMPs possuem íons Zn²+ em seu sítio catalítico e íons Ca²+ para manter sua estabilidade e atividade [55,56].
A inibição da atividade enzimática das MMPs in vivo é feita por inibidores teciduais de metaloproteinase (TIMP), que são proteínas secretadas com a função de manter a integridade da matriz extracelular [52]. Um desequilíbrio na expressão de TIMP e MMP pode ser indicativo de processo patológico como, por exemplo, uma neoplasia, pois em condições fisiológicas a expressão de TIMP e MMP é mantida em equilíbrio [55].
Das MMPs, as gelatinases MMP-2 e MMP-9 têm sido bastante estudadas por estarem presentes em vários eventos patológicos como: doenças cardiovasculares, neoplasias, doenças periodontais e outras. Elas atuam no remodelamento celular em casos de injúrias cardíacas. De acordo com alguns estudos, a MMP-2 tem papel importante nas doenças cardiovasculares, sendo ativada no miócito cardíaco em lesões relacionadas com aumento do estresse oxidativo, clivando proteínas que são essenciais para regular a contração da célula, como a troponina I. Neste órgão, as MMP-2 são expressas por miócitos normais e fibroblastos, o que dificulta definir o seu papel na fisiologia normal do coração. As MMP-2 também são expressas de forma constitutiva em células endoteliais da musculatura lisa vascular tanto nas veias como nas artérias [57,58].
Na hipertensão muitos mecanismos complexos interagem levando a alterações estruturais e funcionais tanto do coração como da vasculatura. Estudos
com o modelo de hipertensão em ratos de dois rins-um clip (2R1C) demonstram que as MMPs têm papel importante nestas alterações [59]. Por outro lado, estudos usando modelos de endotoxemia para avaliar a hiporreatividade vascular, uma das causas de hipotensão em condições inflamatórias graves, mostraram melhora na disfunção vascular inflamatória, quando usado inibidores de MMPs como a doxiciclina, um antibiótico de ação bacteriostática pertencente à classe das tetraciclinas que é capaz de inibir MMPs independente de seus efeitos antibacterianos. Também foi observada melhora da hiporreatividade vascular usando GM6001, um inibidor de MMPs que não possui ação antibiótica [60].
O aumento exacerbado da produção do óxido nítrico (NO) em condições inflamatórias leve à maior biossíntese de peroxinitrito e à produção de citocinas na parede da artéria aorta, evento este que aumenta a atividade das MMPs [60]. Sabe-se que as MMPs são ativadas por concentrações baixíssimas de peroxinitrito, isso sugere um mecanismo para o aumento de MMPs observado em aorta [61].
A interrupção da ligação entre o zinco e a cisteína é considerada um mecanismo de ativação das MMPs, isso ocorre por proteólise ou mudanças conformacionais da pro-MMP causada por fatores oxidantes. Suas atividades são reguladas por: tradução e transcrição, fosforilação e glutatiolação (pós-tradução e interação com inibidores endógenos) [62].
Estudos sugerem que a MMP-2 pode estar relacionada à regulação do tônus vascular através da proteólise de peptídeos vasos ativos. Elas clivam endotelina I, formando dessa maneira um potente vasoconstritor, podem se unir a calcitonina inativando assim sua ação vasodilatadora, degradam adrenomedulina (peptídeo vasodilatador) formando dois peptídeos (um vasodilator e um vasoconstritor) e podem ter propriedades vasodilatoras no músculo liso vascular, inibindo a entrada de Ca2+ [62].
1.7. SVMPs e MMPs
A ação das SVMPs com potente efeito proteolítico sobre proteínas da MEC altera o equilíbrio hemostático por inibir a agregação plaquetária, levando à intensa hemorragia interna [11,16]. De acordo com Gutiérrez et al. [16] as SVMPs da classe PIII, quando distribuídas sistemicamente, podem induzir a disfunção endotelial e, dependendo da severidade dos efeitos, podem causar hemorragias e
consequências cardiovasculares complexas. A ação conjunta de proteases sobre a coagulação e a parede vascular o que parece estar relacionada à liberação de citocinas pró-inflamatórias de precursores endógenos através da ação de metaloproteases das próprias peçonhas ou ainda da ativação de proteases endógenas, o que levaria a hipovolemia [63]. Assim, Rucavado et al. [64] observaram que a MT-III (uma PLA2 miotóxica) e a BaP1 (uma SVMP da classe PI)
isoladas da peçonha de B. asper, quando injetadas em músculo de camundongo, produziram alterações teciduais nos níveis de interleucinas IL-1 e IL-6, além de aumentar discretamente a atividade das MMP-9 (gelatinase B).
As SVMPs tem um importante papel na fisiopatologia sistêmica em acidentes causados por B. asper [16, 65] e o uso de inibidores quelantes de metal (zinco) como a doxiciclina e o clorodonato possuem eficácia limitada, sendo necessária uma investigação de inibidores mais eficientes para as atividades metaloproteásicas [65]. Rucavado et al. [63] relatam que os inibidores batimastat e PMSF aboliram completamente o efeito coagulante induzido por serinoproteases (trombina-símile).
Embora já se tenha alguns conhecimentos dos efeitos sistêmicos causados por peçonhas botrópicas, de interesse clínico, existem poucos estudos sobre as alterações cardiovasculares causadas por estas peçonhas. Além disso, o conhecimento sobre o envolvimento de mediadores endógenos que possam estar sofrendo a interferência dos venenos ainda necessita de maiores esclarecimentos, o que nos levou a desenvolver este projeto com o intuito de melhor elucidar esta participação.
2. OBJETIVOS
Baseado nas considerações acima, neste projeto investigamos:
As alterações nas atividades da MMP-2 e MMP-9 plasmáticas (através da zimografia) em resposta à administração i.v. da peçonha de B. alternatus em ratos anestesiados.
A influência de inibidores de metaloproteinases (doxiciclina, fenantrolina e EDTA) sobre as respostas hemodinâmicas à peçonha de B. alternatus.
A ação da peçonha de B. alternatus sobre vasos isolados (artérias mesentérica e pulmonar) e a influência de inibidores de metaloproteinases sobre esta atividade da peçonha.
3. MATERIAL E MÉTODO 3.1. Animais
Ratos machos Wistar (300-400 g) foram obtidos do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB/UNICAMP) e mantidos no biotério do Departamento de Farmacologia, sob ciclo de luz/escuro de 12 h a 23 ± 2 °C, com livre acesso à comida e água, até o momento do experimento. Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA/UNICAMP, protocolo n° 1433-1), e realizados de acordo com os princípios éticos gerais da Sociedade Brasileira para a Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL).
3.2. Peçonha
A peçonha liofilizada de B. alternatus foi fornecida pela Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, MG) foi obtida de exemplares adultos de ambos os sexos, liofilizada e estocada a -20 °C até o uso. A peçonha foi diluída em 100 µl de salina a 0,9% no momento do experimento.
3.3. Reagentes
A heparina e isoflurano foram adquiridos da Cristália (Itapira, SP), o cloridrato de doxiciclina foi comprado da Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA), a fenantrolina foi obtida da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) e o EDTA da J.T. Baker (Phillipsburg, PA, EUA).
3.4. Protocolos experimentais
3.4.1. Procedimentos experimentais gerais
Os ratos foram anestesiados em cuba com isoflurano 100% para indução, e a manutenção da anestesia foi feita com isoflurano (2% em 1 litro de ar) usando um sistema de nebulizador/bomba apropriado. A artéria carótida foi cateterizada com cânula de polietileno heparinizada, para o registro dos parâmetros hemodinâmicos (pressão arterial sistêmica, frequência cardíaca) e coleta de sangue para posteriores análises (zimografia). A veia femoral foi cateterizada com cânula de polietileno heparinizada (10 U/ml), para a administração das substâncias testadas (peçonha e inibidores farmacológicos).
Os parâmetros cardiorrespiratórios foram visualizados, continuamente, através da tela de um monitor multiparâmetro modular (Power Lab, ADInstruments, New Castle, Austrália), que incluíam: 1) pressão arterial (sistólica, diastólica, média e pressão de pulso (PAS, PAD, PAM, PP) monitorado através de um transdutor de pressão, 2) frequência cardíaca (FC) e o eletrocardiograma (ECG), registrados através de um eletrocardiógrafo de superfície (derivação D2), por meio de eletrodos
colocados nas posições adequadas, e 3) frequência respiratória (FR), contada manualmente
3.4.2. Pré-tratamento dos ratos com inibidores de metaloproteinases
Para avaliar o possível papel de metaloproteinases endógenas nas respostas à peçonha, os ratos foram pré-tratados com doxiciclina por 20 min antes da administração de peçonha. Entretanto, em experimentos preliminares, observamos que a fenantrolina causava morte em todos os animais nas várias doses testadas (1, 5, 10 e 15 mg/kg). Devido a isso, não foram realizados experimentos de pré-tratamento do animal com este inibidor. Com a doxiciclina, foram avaliadas várias doses (10, 20 e 30 mg/kg) em experimentos preliminares, e a que causou mínimas alterações hemodinâmicas (30 mg/kg, i.v.) foi escolhida para estes protocolos. Não foram realizados experimentos de pré-tratamento com o EDTA.
Os grupos experimentais usados para investigar a ação da doxiciclina foram:
Grupo 1 (controle). Salina (100 µl, i.v.)
Grupo 2. Peçonha de B. alternatus (dose não letal de 0,4 mg/kg,
i.v.) Grupo 3. Doxiciclina (30 mg/kg, i.v.)
Grupo 4. Doxiciclina (30 mg/kg, i.v., 20 min antes da injeção de peçonha) +
Peçonha (0,4 mg/kg, i.v.)
Grupo 5. Peçonha de B. alternatus (dose letal de 0,5 mg/kg).
Grupo 6. Doxiciclina (30 mg/kg, i.v., 20 min antes da injeção de peçonha) +
3.4.3. Pré-incubação da peçonha com inibidores de metaloproteinases
Para avaliar o possível papel de SVMPs nas alterações hemodinâmicas à peçonha, a mesma foi pré-incubada com os inibidores (doxiciclina (1), fenantrolina (2), fenantrolina (3) e EDTA (4) por 1h a temperatura ambiente (1 e 2) e por 2h a 25
oC (3 e 4) antes de injetá-la nos animais.
Grupo 1 (controle). Doxiciclina – uma solução de 10 mM preparada em
Salina.
Grupo 2. Peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg, i.v.) pré-incubada com
Doxiciclina 10 mM.
Grupo 3 - Peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) pré-incubada com
Doxiciclina 10 mM.
Grupo 4 - (controle). Fenantrolina – uma solução de 20 mM diluída em 2% de
DMSO e 98% de água MilliQ.
Grupo 5 - Peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg, i.v.) pré-incubada com
Fenantrolina (20 mM).
Grupo 6 - Peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) pré-incubada com
Fenantrolina (20 mM).
Grupo 7 – (controle) Fenantrolina uma solução de 30 µM diluída em 2% de
DMSO e 98% de água MilliQ..
Grupo 8 - Peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) pré-incubada com
Fenantrolina (30 µM).
Grupo 9 - (controle). EDTA – uma solução de 30 µM preparada em
salina 0.9%.
Grupo 10 - Peçonha de B. alternatus (0,5 mg/kg, i.v.) pré-incubada
com EDTA 30 µM.
Para todos os grupos (em ambos os protocolos) as injeções foram feitas em volume fixo de 100 µl pela veia femoral, e o monitoramento dos parâmetros hemodinâmicos foi feito por 2 h após administração das substâncias. Para análise zimográfica, foram coletadas amostras de sangue arterial (300 µl) via artéria carótida e acondicionadas em tubo Eppendorff contendo 10 µl de heparina nos tempos: 0 (basal, antes da injeção de substância), 5, 15, 30, 60 e 120 min após injeção de substância ou peçonha. As amostras foram centrifugadas (2.500 g, 4 ºC, 12 min) para obtenção do plasma e posterior análise zimográfica. Depois de cada coleta, o
cateter foi lavado com salina (100 l) para reposição do volume coletado. Ao término do experimento, os ratos foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia. Após a morte confirmada, foram retiradas amostras de pulmão para análise histopatológica.
3.4.4. Zimografia do plasma
Para a detecção da atividade gelatinolítica (MMP-2 e MPP-9), amostras contendo 10 µl de plasma foram corridas na presença de SDS em géis de poliacrilamida 7,5% contendo 0,1% de gelatina. Antes de serem aplicadas aos géis, as amostras foram diluídas em tampão de amostra (1:1). Após a corrida eletroforética (150 V), as proteínas foram renaturadas lavando-se os géis duas vezes, por 20 min cada vez, em tampão de lavagem (Tris contendo 2,5% de Triton X-100) para remover o SDS. Os géis foram posteriormente incubados durante 18 h a 37 ºC sob leve agitação em tempão de incubação (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4 contendo 0,15 M NaCl, 10 mM CaCl2 e 0,02% NaN3). No final da incubação, os géis foram
corados com azul brilhante de coomassie R250 por 2h sob leve agitação e em seguida foram descorados. As bandas com atividade gelatinolítica foram visualizadas como zonas claras sobre um fundo escuro. Em todas as corridas foram incluídas proteínas marcadoras de massa molecular. Os géis foram fotografados para análise quantitativa (pelo programa Image J).
3.4.5. Histologia e avaliação da formação de trombos no tecido pulmonar de ratos tratados com peçonha B. alternatus, injetados por via i.v.
Terminado o experimento, foram retirados os pulmões e amostras dos mesmos foram fixadas em formol tamponado 10% durante 18 h. Em seguida, os tecidos foram lavados três vezes por 15 min cada, em água. Para a desidratação dos tecidos, foram usados gradientes crescentes de álcool (etanol), seguido de diafanização em xilol, e embebição e inclusão em parafina (Histosec, Merck, RJ, Brasil). Secções de 5 µm de espessura foram obtidas usando um micrótomo (Leica RM 2245, Alemanha) e as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para posterior análise das alterações histológicas. As lâminas foram examinadas em microscopia de luz (Leica DM 5000B), em um aumento de 40 vezes. As imagens foram capturadas a partir da região central das lâminas para que não houvesse interferência de áreas de corte cirúrgico do tecido na interpretação dos resultados.
As imagens foram processadas e analisadas usando uma câmera CCD Leica DFC 300 FX e softwares de processamento e análises de imagem Leica Q Win Plus v.3.2.0. Os trombos foram avaliados após 120 min nos ratos que receberam salina, peçonha e nos animais tratados com doxiciclina, fenantrolina e EDTA. Para cada rato foram analisados cinco cortes, e em cada corte foram contados os vasos (número total e número com trombos) em sete campos não sobrepostos. A porcentagem de vasos foi calculada usando a relação: (número de vasos com trombos ÷ número total de vasos) x 100.
3.5. Protocolos com vasos isolados
3.5.1. Vasos (anéis de artéria mesentérica superior e artéria pulmonar) isolados de rato
Para investigar a ação direta da peçonha na vasculatura foi avaliada a capacidade da mesma em relaxar vasos isolados de rato. Para isso, foram selecionadas a mesentérica superior (vaso de médio calibre da vasculatura abdominal) e a artéria pulmonar (vaso de pequeno calibre do leito vascular pulmonar).
Ratos Wistar machos (300-400 g) foram eutanasiados com isoflurano e em seguida foram ex-sanguinados. Foi feita a toracotomia bilateral com exposição da aorta torácica. A artéria mesentérica e artéria pulmonar foram removida e em seguida colocada em solução de Krebs (composição, em mM: NaCl 125, KCl 4,8, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, MgSO41,2, CaCl2 2,5, EDTA 0,3 e glicose 11, pH 7,4)
mantida sob aeração com carbogênio (95% O2 e 5% CO2) a 37 ºC. Os vasos foram
limpos e seccionados em anéis de ± 2 mm de comprimento, sendo em um anel mantido o endotélio e no outro o endotélio foi removido por debridamento mecânico.
Em seguida os anéis foram montados em cubas de 10 mL contendo Krebs (aerado com 95% O2 e 5% CO2, a 37 ºC) a uma tensão de curva de 20 mN
(considerada tensão ótima) usada em todos os experimentos. Os vasos foram mantidos por 1 h sem tratamento para a estabilização. Após este período, os anéis foram contraídos com KCl (80 mM) para avaliar a integridade do tecido e então extensivamente lavados; em seguida, foram pré-contraídos com fenilefrina (3 µM, um agonista α-adrenérgico). Após o platô de contração produzido pela fenilefrina, foi adicionada a ACh (3 µM) para avaliar o relaxamento do tecido. Somente os anéis
que mostraram um relaxamento ≥60% foram considerados com função endotelial adequada enquanto que nos tecidos considerados sem endotélio o relaxamento à ACh foi <20%. Os anéis (com e sem endotélio) foram novamente lavados abundantemente, e mais uma vez pré-contraídos com fenilefrina até platonar. Em seguida foi adicionada ao banho a peçonha de B. alternatus (15 µg/ml (artéria mesentérica) para avaliar seu efeito direto sobre a vasculatura. Diferentes concentrações da peçonha (7,5; 15; 30 e 60 µg/ml) foram utilizadas e destas a que causou maior relaxamento foi a concentração de 15 µg/ml.
Em outro protocolo, anéis de artéria pulmonar (com e sem endotélio) foram previamente incubados com a peçonha de B. alternatus na concentração de 50 µg/ml [66]. Todo o procedimento de preparo e montagem dos vasos foi como citado acima. Neste protocolo foram testadas as concentrações de 25, 50, 100 e 200 µg/ml. Destas concentrações a que causou maior relaxamento foi a concentração de 50 µg/ml. A artéria pulmonar foi dissecada da mesma forma que a artéria mesentérica e todos os passos foram seguidos como citados acima. Em ambos os protocolos após a adição da peçonha botrópica, os anéis foram mantidos com a peçonha por 30 min. O relaxamento/contração dos anéis vasculares foram registrados através de transdutores isotônicos acoplados a um pré-amplificador e os registros foram visualizados, continuamente, através da tela de um monitor multiparâmetro modular (PowerLab), ligado a um computador.
3.6. Atividades enzimáticas 3.6.1. Atividade proteolítica
A atividade proteolítica sobre o substrato azocaseína foi determinada segundo o método de Wang & Huang [67]. Noventa microlitros de solução de azocaseína (5 mg/ml), em tampão Tris-HCl 5 mM, pH 8,0, foram misturados com 10 µl de peçonha seguindo por incubação por 90 min a 37 oC. A reação foi interrompida pela adição de 200 µl de ácido tricloroacético (5%, p/v) e depois as amostras foram centrifugadas (8.000 rpm, 10 min). Logo em seguida, 150 µl do sobrenadante foram misturados com 150 µl de NaOH 0,5 M e a atividade proteolítica foi monitorada pela determinação dos azo-peptídeos liberados pela atividades proteolítica sobre a azocaseína em 440 nm, usando um leitor de microplacas (SpectraMax, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EUA). Uma unidade de atividade proteolítica foi
definida como a quantidade de peçonha, em µg, que hidrolisa 1 µg de azocaseína por 30 minutos em pH 8,0 a 37 oC [68].
3.6.2. Atividade arginina amidase
A atividade arginina amidase foi determinada colorimetricamente usando o substrato BApNA, segundo o método de Torres-Huaco [69]. Foi preparada uma solução estoque do substrato BAρNA (0,1 M) em DMSO; a solução de trabalho foi preparada diluindo a solução de estoque em tampão Tris-HCl, 10 mM, 10 mM CaCl2,
100 mM NaCl, pH 8 (tampão de trabalho, 1:100). Em microplacas de ELISA foram misturados 200 µl da solução de trabalho, 50 µl de tampão de trabalho e 15 µl de água destilada e pré-incubados a 37 °C por 10 min. Logo foram adicionados 5 µl de amostra ou tampão de trabalho, em um volume final de 270 µl, a mistura de reação foi incubada a 37 °C por 30 min e as absorbâncias lidas em 410 nm em leitor de microplacas SpectraMax (Molecular Devices).
3.6.3. Incubação com inibidores
Quando necessárias amostras de peçonha foram incubadas com concentrações variadas de inibidores por 2 h a temperatura ambiente, e em seguida a atividade enzimática residual foi determinada. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
3.7. Análise estatística
Os resultados foram expressos como a média ± DP, e as análises estatísticas foram feitas através do teste t de Student ou da análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Tukey-Kramer. Valores de p<0,05 foram considerados significantes. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Prism versão 4 (GraphPad Inc., La Jolla, CA, EUA).
4. RESULTADOS
4.1. Alterações cardiovasculares e respiratórias
A administração de peçonha por via i.v. na dose de 0,4 mg/kg (dose não letal) causou uma hipotensão acentuada nos primeiros 15 min, retornando gradualmente aos valores basais. Esta diferença foi significativa aos 5 e 15 min quando comparado com o grupo controle e aos valores basais. Aos 30 min, houve queda significativa somente em relação aos valores basais. Este perfil foi visto com a pressão arterial sistólica, diastólica e média (Fig. 4C), porém na pressão de pulso (Fig. 4D) observou-se uma redução significativa mais tardia, aos 15 e 30 min em relação ao grupo controle. As frequências cardíaca (FC) e respiratória (FR) (Fig. 4E-F) não se alteraram durante todo o experimento, mostrando muita similaridade ao grupo controle. Todos os ratos que receberam a dose 0,5 mg/kg morreram nos primeiros 10 min (Fig. 4A-F). Os parâmetros eletrocardiográficos não mostraram nenhuma alteração com ambas as doses. Todos os ratos controle (salina 0,9%) apresentaram perfil normal nos valores pressóricos, cardíacos e respiratórios.
F req uên c ia c ard ía c a (bp m ) E 500 400 300 200 100 0 ººº *** -1 1 3 5 15 30 60 120 Tempo (min) F req uên c ia re s pi ra tória (e p m ) F 100 80 60 40 20 0 ººº *** -1 1 3 5 15 30 60 120 Tempo (min)
Figura 4. Alterações hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,4 e
0,5 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados. (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica, (C) Pressão arterial média, (D) Pressão de pulso, (E) Frequência cardíaca e (F) Frequência respiratória. O grupo controle recebeu salina (100 µl). Os pontos representam a média ± DP (n=4-5). ººp<0,01 e ***,ºººp<0,001 em relação aos valores basais (asteriscos) e ao grupo controle (círculos) (ANOVA seguido do teste de Tukey Kramer).
Grupo/ P P QRS QT QTc PR T Tempo (s) (mV) (s) (s) (s) (mV) 1 / 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,06±0,010 0,17±0,03 0,05±0,002 0,01±0,01 2/ 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,05±0,009 0,13±0,03 0,05±0,001 -0,03±0,01 3/ 0 min 0,02±0,002 0,028±0,01 0,01±0,002 0,04±0,004 0,09±0,01 0,05±0,002 0,00±0,01 1/ 5 min 0,01±0,002 0,004±0,01 0,01±0,002 0,007±0,018 0,18±0,06 0,05±0,001 0,03±0,01 2/ 5 min 0,01±0,001 0,004±0,01 0,02±0,003 0,04±0,009 0,11±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,01 3/ 5 min 0,01±0,002 0,004±0,01 0,01±0,002 0,04±0,011 0,10±0,03 0,05±0,003 0,04±0,02 1/ 15 min 0,02±0,001 0,003±0,01 0,01±0,002 0,04±0,003 0,09±0,01 0,05±0,002 0,02±0,01 2/ 15 min 0,01±0,002 0,003±0,01 0,02±0,003 0,05±0,009 0,12±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,02 3/ 15 min --- --- --- --- --- --- --- 1/120 min 0,02±0,002 0,011±0,01 0,01±0,002 0,04±0,002 0,10±0,01 0,05±0,002 0,04±0,01 2/120 min 0,03±0,006 0,011±0,01 0,02±0,002 0,06±0,008 0,14±0,03 0,06±0,005 -0,19±0,06 3/120 min --- --- --- --- --- --- ---
Tabela 1. Parâmetros eletrocardiográficos (ondas P, T, complexo QRS; intervalos
PR, QT e QTc) em ratos anestesiados injetados com salina (grupo 1), peçonha 0,4mg/kg (grupo 2) e peçonha 0,5mg/kg (grupo 3). Os resultados são a média ± EPM (n=5/5/7). Os cálculos foram obtidos através de software do eletrocardiógrafo.
4.2. Efeito de inibidores de metaloproteinases sobre as alterações hemodinâmicas causadas por uma dose não letal da peçonha de B. alternatus
4.2.1. Pré-tratamento dos ratos com a doxiciclina
A administração da doxiciclina sozinha causou uma redução não significativa dos valores pressóricos nos primeiros 15 min, com recuperação gradativa ao longo do experimento (Fig. 5). O pré-tratamento com doxiciclina (30 mg/kg, i.v.) 20 min antes da administração da peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) atenuou a hipotensão induzida pela peçonha nos primeiros 5 a 15 min. Dos 30 a 60 min após o envenenamento os parâmetros hemodinâmicos retornaram aos valores basais, assim permanecendo até o final do experimento. Não houve alteração nas frequências cardíaca e respiratória, e nem nos parâmetros eletrocardiográficos (dados não mostrados).
P res s ão a rteri al s is tól ic a (m mHg) A 150 125 100 ** *** 75 50 25 Controle (Salina) Doxiciclina (30 mg/kg, i.v.)
0 Peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) Peçonha + Doxiciclina
-1 1 3 5 15 30 ( m m H g ) C 125 150 m é di a 100 a rt e ri al 75 50 P re s s ã o 25 0 ( m m H g ) B 150 d i a s t ó l i c a 125 75 100 ar te ri al 50 Pr es sã o 25 0 60 120 -1 1 3 5 15 30 60 120 * -1 2 5 15 30 60 120 Tempo (min)
Figura 5. Efeito do pré-tratamento com doxiciclina sobre as alterações
hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg, i.v.) em ratos anestesiados. Os ratos foram tratados com a doxiciclina (30 mg/kg, i.v.) 20 min antes da administração da peçonha. (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica e (C) Pressão arterial média. Os dados sobre frequência cardíaca e respiratória não estão mostrados por não terem sido afetados pela doxiciclina. O grupo controle recebeu salina (0,9%, 100 µl). A peçonha e a doxiciclina foram diluídas em salina no momento do uso. Os pontos representam a média ± DP (n=4-6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 comparados ao grupo tratado somente com a peçonha (ANOVA seguido do teste de Tukey Kramer).
Grupo/ P P QRS QT QTc PR T Tempo (s) (mV) (s) (s) (s) (mV) 1/ 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,06±0,010 0,17±0,03 0,05±0,002 0,01±0,01 2/ 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,05±0,009 0,13±0,03 0,05±0,001 -0,03±0,01 3/ 0 min 0,02±0,002 0,029±0,01 0,01±0,001 0,06±0,011 0,16±0,04 0,05±0,001 -0,03±0,01 4/ 0 min 0,01±0,002 0,011±0,01 0,01±0,001 0,06±0,007 0,15±0,02 0,05±0,002 -0,04±0,02 1/ 5 min 0,01±0,002 0,004±0,01 0,01±0,002 0,07±0,018 0,18±0,06 0,05±0,001 0,03±0,01 2/ 5 min 0,01±0,001 0,004±0,01 0,02±0,003 0,04±0,009 0,11±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,01 3/ 5 min 0,02±0,002 0,004±0,01 0,01±0,001 0,06±0,010 0,15±0,04 0,05±0,002 -0,03±0,02 4/ 5 min 0,02±0,002 0,003±0,01 0,01±0,001 0,05±0,008 0,13±0,03 0,05±0,003 -0,03±0,01 1/ 15 min 0,02±0,001 0,003±0,01 0,01±0,002 0,04±0,003 0,09±0,01 0,05±0,002 0,02±0,01 2/ 15 min 0,01±0,002 0,003±0,01 0,02±0,003 0,05±0,009 0,12±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,02 3/ 15 min 0,02±0,002 0,003±0,01 0,01±0,001 0,06±0,011 0,15±0,04 0,05±0,001 -0,03±0,02 4/ 15 min 0,02±0,002 0,016±0,01 0,01±0,002 0,05±0,007 0,13±0,03 0,05±0,003 -0,03±0,02 1/ 120min 0,02±0,002 0,011±0,01 0,01±0,002 0,04±0,002 0,10±0,01 0,05±0,002 0,04±0,01 2/ 120min 0,03±0,006 0,011±0,01 0,02±0,002 0,06±0,008 0,14±0,03 0,06±0,005 -0,19±0,06 3/ 120min 0,02±0,001 0,011±0,01 0,01±0,001 0,04±0,013 0,08±0,04 0,05±0,003 0,1±0,01 4/ 120min 0,01±0,002 0,001±0,01 0,01±0,002 0,05±0,007 0,14±0,03 0,05±0,003 -0,04±0,02
Tabela 2. Parâmetros eletrocardiográficos (ondas P, T, complexo QRS; intervalos
PR, QT e QTc) em ratos anestesiados injetados com salina (grupo 1), peçonha 0,4mg/kg (grupo 2), doxiciclina 30mg/kg (grupo 3) e doxiciclina 30mg/kg antes da aplicação da peçonha 0,4mg/kg (grupo 4). Os resultados são a média ± EPM (n= 5/5/4/4). Os cálculos foram obtidos através de software do eletrocardiógrafo.
4.2.2. Pré-incubação da peçonha com doxiciclina
O envolvimento das SVMPs nas respostas hemodinâmicas à peçonha foi avaliado incubando-se a peçonha com doxiciclina 10 mM (1 h a temperatura ambiente). A pré-incubação com doxiciclina reduziu significativamente a hipotensão nos primeiros 5 a 15 min, em relação ao grupo que recebeu apenas peçonha (Fig. 6). Neste sentido, o perfil de inibição vista com a pré-incubação com doxiciclina foi muito semelhante àquele visto quando os ratos foram pré-tratados com este inibidor (compare com Fig. 5). Não houve alteração nas frequências cardíaca e respiratória, e nem nos parâmetros eletrocardiográficos (dados não mostrados).
P res s ão arter ia l s is tó lic a ( mm Hg) A 150 125 100 ** 75 50
25 Controle (Salina) Peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) 0 Peçonha + Doxiciclina Doxiciclina (10 mM) -1 1 3 5 15 30 60 120 P res s ão a rteri al di as tó lic a (mmHg) B 150 125 100 75 50 * 25 0 -1 1 3 5 15 30 60 120 P res s ão a rteri al mé di a (mm Hg) C 150 125 100 75 * 50 25 0 -1 1 3 5 15 30 60 120 Tempo (min)
Figura 6. Influência da pré-incubação da peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg, i.v.),
com doxiciclina (10 mM) sobre as respostas hemodinâmicas à peçonha em ratos anestesiados. (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica e (C) Pressão arterial média. Os dados sobre frequência cardíaca e respiratória não estão mostrados por não terem sido afetados pela doxiciclina. O grupo controle recebeu salina (0,9%, 100 µl). A peçonha e a doxiciclina foram diluídas em 100 µl de salina no momento do uso. Os pontos representam a média ± DP (n=4-6). *p<0,05 e **p<0,01 em relação ao grupo tratado apenas com a peçonha (ANOVA seguido do teste de Tukey Kramer).
Grupo/ P P QRS QT QTc PR T Tempo (s) (mV) (s) (s) (s) (mV) 1/ 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,06±0,010 0,17±0,03 0,05±0,002 0,01±0,01 2/ 0 min 0,02±0,001 0,035±0,01 0,01±0,002 0,05±0,009 0,13±0,03 0,05±0,001 -0,03±0,01 3/ 0 min 0,01±0,001 0,008±0,00 0,01±0,002 0,05±0,009 0,14±0,03 0,05±0,001 -0,03±0,01 4/ 0 min 0,02±0,002 0,033±0,00 0,02±0,003 0,01±0,008 0,02±0,02 0,05±0,002 0,00±0,00 1/ 5 min 0,01±0,002 0,004±0,01 0,01±0,002 0,007±0,018 0,18±0,06 0,05±0,001 0,03±0,01 2/ 5 min 0,01±0,001 0,004±0,01 0,02±0,003 0,04±0,009 0,11±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,01 3/ 5 min 0,01±0,002 0,004±0,01 0,01±0,003 0,07±0,009 0,16±0,03 0,05±0,001 -0,04±0,02 4/ 5 min 0,02±0,001 0,004±0,01 0,02±0,004 0,02±0,009 0,04±0,03 0,05±0,002 0,00±0,00 1/ 15 min 0,02±0,001 0,003±0,01 0,01±0,002 0,04±0,003 0,09±0,01 0,05±0,002 0,02±0,01 2/ 15 min 0,01±0,002 0,003±0,01 0,02±0,003 0,05±0,009 0,12±0,03 0,05±0,002 -0,01±0,02 3/ 15 min 0,01±0,002 0,003±0,01 0,01±0,003 0,05±0,010 0,13±0,03 0,05±0,001 -0,04±0,02 4/ 15 min 0,02±0,002 0,003±0,01 0,02±0,003 0,03±0,007 0,07±0,02 0,05±0,001 0,01±0,00 1/ 120min 0,02±0,002 0,011±0,01 0,01±0,002 0,04±0,002 0,10±0,01 0,05±0,002 0,04±0,01 2/ 120min 0,03±0,006 0,011±0,01 0,02±0,002 0,06±0,008 0,14±0,03 0,06±0,005 -0,19±0,06 3/ 120min 0,01±0,002 0,011±0,01 0,01±0,002 0,01±0,010 0,03±0,03 0,05±0,001 0,02±0,01 4/120min 0,02±0,003 0,011±0,01 0,02±0,002 0,04±0,001 0,09±0,01 0,05±0,003 0,02±0,00
Tabela 3. Parâmetros eletrocardiográficos (ondas P, T, complexo QRS; intervalos
PR, QT e QTc) em ratos anestesiados injetados com salina (grupo 1), peçonha 0,4mg/kg (grupo 2), doxiciclina 10mM (grupo 3) e doxiciclina 10mM pré-incubada com a peçonha 0,4mg/kg (grupo 4). Os resultados são a média ± EPM (n= 5/5/4/5). Os cálculos foram obtidos através de software do eletrocardiógrafo.
4.2.3. Pré-incubação da peçonha de B. alternatus com a fenantrolina
A pré-incubação com a fenantrolina (20 mM) mostrou tendência para atenuar a hipotensão causada pela peçonha (0,4 mg/kg, i.v.), especialmente aos 5 e 15 min, porém esta atenuação não foi significativa quando comparada aos ratos tratados apenas com a peçonha (Fig. 7). Não houve alteração nas frequências cardíaca e respiratória, e nem nos parâmetros eletrocardiográficos (dados não mostrados).
P res s ão arter ia l s is tó lic a ( mm Hg) A (m m Hg ) B 150 150 125 di a st ól ic a 125 75 75 100 100 50 art eria l 50
25 Controle (Salina) Peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) 25
P r e s s ã o
0 Peçonha + Fenantrolina Fenantrolina (20 mM) 0
-1 1 3 5 15 30 60 120 -1 1 3 5 15 30 60 120 ( m m H g ) C 125 150 m é d i a 100 a r t e r i a l 75 50 P r e s s ã o 25 0 -1 1 3 5 15 30 60 120 Tempo (min)
Figura 7. Influência da pré-incubação com fenantrolina sobre as alterações
hemodinâmicas causadas pela peçonha de B. alternatus (0,4 mg/kg; i.v.). A peçonha foi pré-incubada com a fenantrolina (20 mM) por 1 h a temperatura ambiente antes de ser testada. (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica e (C) Pressão arterial média. O grupo controle recebeu salina (100 µl). A peçonha foi diluída em salina e a fenantrolina foi diluída em DMSO (2%) no momento do uso. Os pontos representam a média ± DP (n=3-6) (ANOVA seguido do teste de Tukey Kramer).
