Avaliação da expressão de neuropeptídeo Y em hipocampo de ratos com epilepsia induzida pela pilocarpina

Texto

(1)1. UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NEUROPEPTÍDEO Y EM HIPOCAMPO DE RATOS COM EPILEPSIA INDUZIDA PELA PILOCARPINA.. MARCELO DE PAULA ALVES DA SILVA. São Paulo 2010.

(2) 2. MARCELO DE PAULA ALVES DA SILVA. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NEUROPEPTÍDEO Y EM HIPOCAMPO DE RATOS COM EPILEPSIA INDUZIDA PELA PILOCARPINA.. Dissertação apresentada à UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.. ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO SILVA JUNIOR.. São Paulo 2010.

(3) 3. FICHA CATALOGRAFICA. Silva, Marcelo de Paula Alves da Avaliação da expressão de neuropeptídeo y em hipocampo de ratos com epilepsia induzida pela pilocarpina. / Marcelo de Paula Alves da Silva. 2010. 63 f. Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho – UNINOVE – Ciências da Reabilitação, São Paulo, 2010. Orientador (a): Profº Dr Jose Antonio Silva Junior 1. Neuropeptídeo Y. 2. Pilocarpina e Epilepsia. CDU 616.

(4) 4.

(5) i. Dedico aos meus pais Gilberto e Julia; meus irmãos. Paola,. Carolie. e. Nicole,. Polarah. sobrinhos Yam e Luan. Eu os amo!. e.

(6) ii. Ao Rabi Dr. Jose Antonio Silva Junior: Ser humano maravilhoso, dotado de olhar periférico,. audição. seletiva,. palavras. edificadoras, movimento corporal elegante e inteligência contagiante. Minha profunda admiração e carinho. Agradeço-te do fundo do meu coração. DEUS te abençoe!.

(7) iii. AGRADECIMENTOS. Agradeço a Santíssima Trindade ao DEUS PAI, DEUS FILHO e ao ESPÍRITO SANTO!. O intrigante e engrandecedor nesta odisseia é perceber, a cada dia, a importância do relacionamento na construção do novo.. A minha gratidão ao time intelectual da UNINOVE, que me estimularam ao questionamento: Carla Malaguti, Carlos Alberto, Claudia Santos, Daniela Gonzalez, Dirceu Costa, Edgar Vieira, João Corrêa, Jorge Nascimento, José Antônio, Kristianne Fernandes, Luciana Sampaio, Luis Vicente, Manoela Martins, Nádia Marconi, Raquel Ferrari, Sandra Bussadori e Simone Dal Corso. Hoje, meu ser tem um pouco de cada um.. Ao meu grande irmão Moises Silva, quando em diálogos desafiadores, sempre iluminava o caminho. Eu te amo, irmão. Obrigado por sua contribuição!. Aos amigos Martha Manchini, Raphael Boiati, Thiago Araujo e Eduardo Santana, pela troca de saberes.. Aos parceiros de estudos científicos do Laboratório de Biologia Celular da UNINOVE, Tábata Oliveira, Jorge Gabriel, Dannylo Wesley, Fernanda Carvalho, Gabriela Fernanda, Marcio Gomes, Natalia Aruelo, Marcio Parente, Regina Guimarães, Rhaissa e Rodrigo Fock..

(8) iv. Aqui ratifico a importante relação interpessoal e parcerias construtivas no laboratório de Fisiologia Cardiovascular da UNIFESP: Paulo Tucci, Andrey Serra, Danilo Bocalini, Ednei Antonio, Mario Oliveira, Camila Picolo, Leslie Portes e Eduardo Carvalho. Quão excepcional é a intervenção de vocês nas descobertas científicas.. Aos colegas do Laboratório de cirurgia experimental da UNICAMP: Carina Malaguti e o Paolo, pouco momentos grandes trocas, obrigado.. Aos grandes colegas do laboratório de morfologia cardiovascular e genética INCOR – USP: Marcio Chaves, Juliana, Orlando, Suzana, Gabriela e Rafael, foram muitos aprendizados.. Aos amigos Renata Kelli, Juliana Silva e Samuel Silva, valeu!. Importante aqui deixar um singelo agradecimento a todos que me auxiliaram, no emprestar de um livro, em auxílios administrativos e demais ações dos atores que fazem e constroem o mundo acadêmico, muito obrigado a todos.. À Instituição de Ensino Superior Universidade Nove de Julho pela concessão de bolsa de estudo no stricto sensu em Ciências da Reabilitação..

(9) v. RESUMO. O neuropeptídeo Y foi descoberto na década de 80 e é constituído por 36 aminoácidos. O objetivo deste estudo foi a avaliação da expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo Y (NPY) em hipocampos de ratos epiléticos. Ratos Wistar machos foram submetidos ao modelo de epilepsia induzido por pilocarpina. Os hipocampos foram removidos 6 h (fase aguda), 12 h (fase aguda atrasada), 5 dias (fase silenciosa) e 60 dias (fase crônica) após o inicio do estado epilético (SE); e dos animais que receberam a pilocarpina, mas não desenvolveram o SE (grupo parcial). Os hipocampos coletados foram usados para expressão de RNAm específico, usando PCR em tempo real. A expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo Y aumentou no grupo parcial (1.67 ± 0.22) e na fase silenciosa (1.45 ± 0.29), quando comparada com o grupo controle (0.36 ± 0.12). Os resultados sugerem que o neuropeptídeo Y pode atuar no mecanismo de proteção ocorrido durante o fenômeno epilético (como anticonvulcionante). Este peptídeo neuroativo pode estar envolvido na neuroproteção do hipocampo na epilepsia.. Palavras chaves: Neuropeptídeo Y; Pilocarpina; Epilepsia..

(10) vi. ABSTRACT. Neuropeptide Y was discovered in the decade of 80 and consisting of 36 amino acids. The aim of this study was to analyze the neuropeptide Y (NPY) RNAm expression in hippocampi of epileptics rats. Male Wistar rats were submitted to the pilocarpine model of epilepsy. Hippocampi were removed 6h (acute phase), 12h (late acute), 5d (silent) and 60d (chronic) after status epilepticus (SE) onset, and from animals that received pilocarpine but did not develop SE (partial group). Hippocampi collected were used to specify RNAm expression using Real time PCR. Neuropeptide Y RNAm expression increased in the partial group (1.67±0.22) and in the silent phase (1.45±0.29) when compared to control group (0.36±0.12). Results suggest that neuropeptide Y (as anticonvulsant) might act in protective mechanisms occurred during epileptic phenomena. This neuroactive peptide could be involved in hippocampal neuroprotection in epilepsy.. Words keys: Neuropeptide Y; Pilocarpine; Epilepsy..

(11) vii. SUMÁRIO. Lista de figuras Lista de abreviaturas Contextualização 1 Epilepsia ......................................................................................................... 02 2 Pilocarpina ...................................................................................................... 05 3 Neuroproteção ................................................................................................ 07 4 Neuropeptídeos .............................................................................................. 07 4.1 Neuropeptídeo Y ........................................................................................ 09 4.2 Ações neurofisiológicas do NPY ............................................................... 09 4.3 Neuropeptídeo Y e a Epilepsia.................................................................... 10 5. Objetivo ........................................................................................................ 12 6. Tradução do Estudo publicado ..................................................................... 14 7. Resultados obtidos neste estudo ................................................................... 40 7.1 Comportamento animal .............................................................................. 40 7.2 Expressão do RNAm de NPY .................................................................... 42 8. Discussão ...................................................................................................... 44 Conclusão ......................................................................................................... 47 Referências Bibliográficas.................................................................................48 Apêndice............................................................................................................56.

(12) viii. LISTAS DE FIGURAS. Figura 1 - Técnica da tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT – Tomografia computadorizada com emissão de fóton)........................................ 4. Figura 2 – Imagem de localização e liberação de neuropeptídeos...................... 8. Figura 3 – Sequencia do NPY.............................................................................. 9. Figura 4 – Esquema de visualização das crises no decorrer do tempo............... 40. Figura 5 – Gráfico da expressão do RNAm do NPY ......................................... 41.

(13) ix. LISTA DE ABREVIATURAS NPY = Neuropeptídeo Y ILK = Integrina associada a quinase RNAm = Ácido ribonucléico mensageiro PCR = Reação de polimerização em cadeia SE = Status epileticus SRSs = crises epiléticas espontâneas e recorrentes EEG = Eletroencefalograma SPCT = Tomografia Computadorizada Com Emissão De Fóton Único HPLC = Cromatografia liquida de Alto Desempenho GAPDH = Desidrogenase de Gliceraldeído 3-fosfato Ct = ciclo Limiar µ = micrômetro RT = Transcrição Reversa mM = milimol dNTPS = Deoxynucleotidetriphosphates kDa = kilodalton Kb = kilobase NMDA = N metil D-aspartato ICV = intracérebro ventricular AKT = proteína quinase B CA1, 2 e 3 = corno de Amon 1, 2 e 3 PI-3 quinase = Fosfatidilinositol 3-quinase FKHR = forkhead em rabdomiossarcoma.

(14) 1. CONTEXTUALIZAÇÃO.

(15) 2. 1. EPILEPSIA. A epilepsia foi a primeira síndrome neurológica descrita na área da saúde. Dados atuais relatam que a doença afeta aproximadamente 50 milhões de pessoas ao redor do mundo1. No passado, a doença, decorrente de superstições e preconceitos, era associada ao mau ou a DEUS. O termo epilepsia vem da palavra grega epilambanein1, que significa ataque ou apreender. A epilepsia, assim como outros transtornos neurológicos, é exaustivamente estudada com foco na busca da qualidade de vida da pessoa com epilepsia2. Para denominar a epilepsia, os estudos descrevem a ocorrência de pelo menos duas crises afebris e não sintomáticas. A etiologia da crise epilética é eclética e idiopática, decorrente de alterações. congênitas,. lesões. peri. natais,. anomalias. metabólicas,. distúrbios. neurodegenerativos, infecções, tumores e lesão encefálica3. Em 1981, a Liga Internacional de Epilepsia (ILAE) publicou uma versão modificada da Classificação Internacional de Crises Epiléticas (ICES), que continua a ser um sistema muito útil 3,4:. I Crises parciais: A. Parcial simples, com sinais motores, somatosensoriais, autonômicos de consciência não danificada; B. Parcial complexo, crises parciais simples seguidas de perda da consciência; C. Crise parcial simples, podendo evoluir para as crises secundárias generalizadas..

(16) 3. II Crises generalizadas: A. Ausência de crises; B. Crises tônico-clônicas, caracterizada por rigidez muscular, contrações musculares rítmicas e violentas e perda de consciência, causada por atividade elétrica anormal nas células nervosas cerebrais. Estas características são peculiares a avaliações clínicas, sendo estes eventos padrões denominados epileptogênicos. Somando as análises, o eletro encefalograma (EEG)5, as técnicas de neuroimagem6 e a tomografia computadorizada com emissão de fóton único (SPCT)6 são muito importantes para diagnóstico mais acurado do foco gênico da crise. Tais técnicas permitem a detecção do desencadeamento da excitabilidade aumentada de uma coleção de neurônios (o início da crise), evento este denominado epileptiforme5. Os 55neurônios envolvidos na crise apresentam respostas elétricas estereotipadas e sincronizadas chamadas de mudança paroxística da despolarização. Logo, a crise epilética tem sua origem no desequilíbrio das descargas neurofisiológicas e eletroquímicas do sistema nervoso central, tendo estudo eletrográfico mostrado que as origens das descargas epiléticas ocorrem na maioria dos casos na região do hipocampo, difundindo-se para amígdala e córtex7. Informações anteriores expressam que a epilepsia é resultante de excitabilidade e a maior permeabilidade ao Ca2+, dessensibilização de seus canais, sendo uma doença relacionada ao sistema colinérgico constituído do arcabouço morfofisiológico, a acetilcolina (Ach), seus receptores nicotínicos e muscarínicos e as enzimas responsáveis por sua síntese e degradação8. Estas informações são produtos de pesquisas e ensaios clínicos com observações criteriosas em pacientes com epilepsia e pesquisas com modelos experimentais, as quais são,.

(17) 4. também, realizadas com fármacos de ação convulsionante, sendo um deles, a pilocarpina, que mimetiza os eventos que ocorrem nas crises epiléticas ou período ictal.. DIEGUES; M.E. et all; Radiol Brás; 2004 Fig.01: Paciente sexo masculino 54 anos. SPECT com descargas ictais (momento da crise) temporal bilateral. Hiperfixação de radiofarmaco á direita (setas). Corte transversal (a esquerda) e coronal (a direita)..

(18) 5. 2. PILOCARPINA. No Brasil, regiões do Norte e Nordeste, nas florestas tropicais, cresce um arbusto do gênero Pilocarpus. Deste arbusto, conhecida como Pilocarpus jaborandi, é extraído a pilocarpina, um alcalóide imidazólico9, com propriedades farmacêuticas muito utilizadas atualmente. No sistema nervoso central a pilocarpina tem ações parassimpaticomiméticos, que excita as estruturas inervadas por fibras colinérgicas pós-ganglionares (ação muscarínica da acetilcolina). Estudos in vivo em roedores, com injeções agudas de pilocarpina no encéfalo com orientações estereotáxicas e sistêmicas na região intraperitoneal, mimetizam a epilepsia com episódios de status epilepticus (SE), produto da aguda estimulação colinérgica. A efeito tem-se um modelo experimental, que inclui lesões semelhantes á esclerose mesial de lobo temporal em seres humanos acometidos da epilepsia10. Esses achados foram observados por TURSKI e colaboradores (1983), em que injeções agudas de agonistas muscarinicos colinérgicos em ratos e camundongos produziram lesões no prosencéfalo. Posteriormente a administração sistemática de pilocarpina, foi conduzida e resultou em diversas alterações comportamentais indicando o SE 11,12. A administração de pilocarpina para induzir o SE é amplamente difundido na pesquisa experimental possibilitando a investigação da patogênese e a viabilidade de novas drogas antiepiléticas. O modelo suscita alterações eletrográficas e comportamentais, divididos em três períodos distintos13, 14..

(19) 6. 1. Período agudo, depois da administração de pilocarpina, o animal evolui progressivamente para o SE, o qual perdura por até vinte e quatro horas; 2. Período silencioso onde ocorre a normalização progressiva do comportamento e do EEG e pode ter uma duração de 4 a 44 dias; 3. Período crônico, em que há o aparecimento de crises epiléticas espontâneas e recorrentes (SRSs), sendo estas semelhantes às crises parciais complexas dos seres humanos. A freqüência das crises é de duas a três vezes por semana e mantém-se durante a sobrevida do animal. Proporcionando observações clínicas, análises biomoleculares, avaliações histológicas e fisiopatológicas, as quais são publicadas nos ambientes acadêmicos e midiáticos que propagam as novas descobertas..

(20) 7. 3. NEUROPROTEÇÃO. Estudos sugerem a ação neuroprotetora endógena do sistema nervoso central frente a mecanismos deletérios diversos. No encéfalo, injurias subletais como hipóxia, isquemia global e crises epiléticas de curta duração protegem células neuronais de danos letais subseqüentes. Este fenômeno é conhecido como tolerância ou pré-condicionamento15. Em estudos com modelo experimental, terapia eletroconvulsivante e análises gênicas através de PCR, foi observado um aumento de níveis de neurotransmissores, neuropeptídeos, remodelamento sináptico e neurogênese; observações estas verificadas dentre outras estruturas encefálicas, o hipocampo16. Atualmente, pesquisas com terapia celular tem sugerido a participação do neuropeptídeo Y na neurogênese. Situa-se nesta ótica o trabalho que destaca as propriedades próneurogênicas17 do NPY na zona subventricular do encéfalo, participando da neuroproteção e neurogênese em mamíferos.. 4. NEUROPEPTIDEOS. Os neuropeptídeos participam da comunicação das células do sistema nervoso e tendem a modular. funções. sinápticas. lentas18.. Os. neuropeptídeos. diferenciam-se. dos. neurotransmissores pelo tamanho, por serem responsáveis por eventos de longo prazo, terem.

(21) 8. sua síntese no soma dos neurônios e serem armazenados em vesículas eletrodensas, nome este decorrente de se mostrarem densas a microscopia eletrônica (Figura 02).. PURVES. D. et al. 2005. Fig.02: Liberação diferencial de neuropeptídeos em vesículas grandes e eletrodensas e neurotransmissores em vesículas pequenas e eletrolúcidas. Estimulação de baixa freqüência eleva a concentração de Ca2+ próximo à membrana liberando os neurotransmissores. Estimulação de alta freqüência conduz a um aumento mais difuso de Ca2+ causando a liberação tanto dos neuropeptídeos das vesículas grandes e eletrodensas, bem como dos neurotransmissores..

(22) 9. 4.1. NEUROPEPTÍDEO Y: Na década de oitenta, o pesquisador Kazuhiko Tatemoto19 publicou na Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) a sequencia completa do neuropeptídeo Y (NPY) (Figura 03), utilizando o método de Cromatografia líquida de Alto Desempenho (HPLC), em amostras de tecido cerebral de porco. O NPY mostrou características homologas com o peptídeo YY (70%) e o polipeptídeo pancreático (50%); levando-o a considerar naquele momento, que o NPY, peptídeo YY e o polipeptídeo pancreático eram membros de uma mesma família de peptídeos. No que tange às investigações sobre o NPY; este evento é um marco inicial.. 1. Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-ArgTyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr36-Nh2. Fig 03: Sequencia peptídica do neuropeptídeo Y.. 4.2. AÇÕES NEUROFISIOLÓGICAS DO NPY. Estudos relatam a sua distribuição ubíqua no organismo e sua ação dependente de seus receptores. Utilizando a técnica de PCR, pesquisadores mostraram a modulação do RNAm de NPY nas células gustativas, sugerindo o papel do NPY no processo de sinalização junto ao receptor subtipo Y1.20 Outros estudos sugerem a correlação entre NPY com a estimulação a inibição do apetite, a obesidade e no tratamento da arterosclerose21,. 22. , bem como na angiogênese em reparo de. tecidos e como vasodilatador em estudos na retina23. Alguns autores sugerem a participação.

(23) 10. do NPY na regulação e na proliferação de precursores de células; além da diferenciação de inter neurônios24. Em estudos eletrofisiológicos de imunorreatividade, de imunofluorescência e microscopia eletrônica; foi observada a expressão de NPY e seus receptores Y1 e Y2 nas células de músculo liso, nas arteríolas da base do encéfalo, nos gânglios da raiz dorsal, na medula, nos nervos simpáticos e no hipocampo; em especifico uma observação positiva no núcleo arqueado 25, 26. Também foi observada a correlação do NPY e o peptídeo leptina nos neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo, influenciando o peso corporal e balanço energético27.. 4.3. NEUROPEPTÍDEO Y E A EPILEPSIA. Há informações na literatura científica da existência de seis receptores de NPY acoplados a proteína G; sendo eles: Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e y628. Estudos sugerem a participação do receptor Y2 na excitabilidade neuronal e na epilepsia. O receptor Y2 tem características farmacológicas elevadas de afinidade com NPY e é um receptor pré-sináptico. O NPY atua na neuromodulação de diferentes neurotransmissores e hormônios29. Somando-se a estas evidências tem sido relatado um papel importante do NPY via interneurônios na excessiva excitabilidade durante a epilepsia30, atuando como um anticonvulsionante..

(24) 11. OBJETIVO.

(25) 12. 5. OBJETIVO. Avaliar a expressão do RNA mensageiro de neuropeptídeo Y em hipocampo de ratos com epilepsia induzida pela pilocarpina..

(26) 13. ESTUDO TRADUZIDO.

(27) 14. 6. ESTUDO TRADUZIDO PUBLICADO NA REVISTA “NEUROPEPTIDES”. Via de ativação da AKT e aumento da expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo Y em hipocampos de ratos: implicações no bloqueio da crise.. Eduardo M.Goto a.1, Marcelo de Paula Silva b.1, Sandra R. Perosa c, Gustavo A. Argañaraz c, João B. Pesqueiro d, Esper A. Cavalheiro c, Maria G. Naffah-Mazzakoratti c, Vicente P.C. Teixeira a, Jose A. Silva Jr. b.* a. Departamento de Patologia. Universidade Federal de São Paulo. UNIFESP. Brasil. Departamento de Ciência da Reabilitação. Universidade Nove de Julho. UNINOVE. Brasil. c Departamento de Neurocirurgia / Neurobiologia. Neurologia Experimental. UNIFESP. Brasil. d Departamento de Biofísica. UNIFESP. Brasil. b. *. Autor Correspondente. Rua Vergueiro, 253, Liberdade, São Paulo, SP 01504-001, Brasil. Tel/fax: +55 11 33859222. Endereço email: josejr@uninove.br (J.A. Silva). 1. Igual contribuições. __________________________________________________________________________.

(28) 15. RESUMO. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de moléculas relacionadas à sobrevivência celular, tais como a AKT e a quinase ligada à integrina (ILK) Avaliou-se a ativação da via AKT no processo da epileptogênese, em epilepsia induzida por pilocarpina. Além disso, também se investigou a expressão do mRNA do neuropeptídeo Y, considerado um neuropeptídeo antiepiléptico. Ratos Wistar machos foram submetidos ao modelo pilocarpina de epilepsia. Os hipocampos foram removidos 6 h (fase aguda), 12 h (fase aguda atrasada), 5 dias (fase silenciosa) e 60 dias (fase crônica), seguidos ao inicio do estado epilético (SE); e dos animais que receberam a pilocarpina, mas não desenvolveram o SE (grupo parcial). Os hipocampos coletados foram usados para expressão de RNAm específico usando o PCR em tempo real. Ensaio de imuno-histoquímica foi empregado para localizar a distribuição de ILK no hipocampo e a técnica de Western blot, foi usada para determinar o nível de ativação da AKT. Uma diminuição no índice do RNAm de ILK foi encontrada durante o período da fase aguda (0,39 ± 0,03) e fase crônica (0,48 ± 0,06), quando comparado com o grupo controle (0,87 ± 0,10). Níveis protéicos de ILK também estavam diminuídos durante ambos os períodos. O grupo parcial mostrou aumento na expressão de ILK (0,80 ± 0,06), quando comparados com animais na fase aguda. O grupo silencioso teve RNAm de ILK e imunorreatividade similar ao grupo controle. O ensaio de Western blot mostrou um aumento na ativação AKT no período silencioso (0,52 ± 0,03) em comparação com o grupo controle (0,44 ± 0,01). A expressão do RNAm do neuropeptídeo Y aumentou no grupo parcial (1,67 ± 0,22) e na fase silenciosa (1,45 ± 0,29), quando comparada com o grupo controle (0,36 ± 0,12). Os resultados sugerem que o neuropeptídeo Y pode atuar no mecanismo de proteção ocorrido durante o fenômeno epilético (como anticonvulsivante). A expressão de ILK e ativação da AKT, estas moléculas podem estar envolvidas na neuroproteção do hipocampo na epilepsia. Palavras chaves: Quinase ligada à integrina, AKT, neuropeptídeo Y, modelo pilocarpina de epilepsia, biologia molecular..

(29) 16. 1. INTRODUÇÃO. Receptores de integrinas são receptores heterodiméricos de membrana, que consistem de receptores com canais α e β. Os receptores de integrinas podem assumir uma larga escala de funções, além do seu papel de mediar à ligação entre o citoesqueleto e a matriz extracelular. As integrinas podem atuar na fisiologia de células não neuronais controlando a propagação celular, diferenciação, proliferação e sobrevivência celular (Clark e Brugge, 1995). No sistema nervoso central, receptores de integrinas podem participar de numerosos processos. A ativação dos receptores de integrinas em cones de crescimento, pode promover a parada de crescimento dos neuritos e controlar sua orientação durante o desenvolvimento (Weaver et al. 1996; Jones, 1996), enquanto a sinalização de integrinas em terminais sinápticos pode estar envolvida em vários processos, tais como a potencialização de longo prazo (Staubli et al., 1998). Sethi et al. (1999) mostrou que as integrinas podem também prevenir a morte de células não neuronais, enquanto Gary e Mattson (2001) demonstraram o mesmo comportamento em neurônios. Embora integrinas não tenham atividade enzimática intrínseca, elas podem ativar uma larga escala de vias de sinalização intracelular. Depois da ativação das integrinas, há um recrutamento de algumas moléculas de sinalização, como as quinases, para a porção citoplasmática dos receptores de integrinas, sendo estas quinases os principais efetores na condução da sinalização das integrinas (Yamada et al; 1995). A quinase associada à integrina (ILK) possui peso molecular de 59 kDa, contém um domínio de anquirina – sendo uma proteína quinase de serina e treonina, que interage com os domínios citoplasmáticos de integrinas β 1, β 2 e β 3 (Hannigan et al., 1996). Seu transcrito de 1,8 Kb é largamente expresso em tecidos humanos, tais como a placenta, o coração, os.

(30) 17. músculos esqueléticos, o cérebro, o pulmão, o fígado, os pâncreas e os rins (Chung et al. 1998; Huang et al., 1999). ILK tem sido demonstrado como o efetor crítico da via de sinalização dependente de 3 fosfatidilinositol quinase (PI-3) abaixo da ativação com fatores de crescimento e ativação de receptores de integrinas (Deohar et al 1999; Wu et al, 1999). A estimulação de ILK após exposição a fatores solúveis ou fibronectina resulta na ativação da AKT (Proteína Quinase B) e inibição de glicogênio sintetase quinase – 3 (GSK-3) (Delcomente et al., 1998; Attwell et al.; Dedhar, 2000; Persad et al., 2000). A via de sinalização AKT relacionada com PI-3 quinase tem mostrado estar envolvida na diferenciação neuronal e está posicionada na cascata de ativação abaixo das integrinas (Sarner et al, 2000) e de fatores de crescimentos, como o Fator de Crescimento Neuronal – NGF (Kaplan e Miller, 2000). ILK é um conhecido efetor dentro das vias de sinalização da AKT e tem sido apontado como regulador de migração e diferenciação (Ishii et al., 2001; Wu e Deahar, 2001). A sistemática administração de pilocarpina em roedores reproduz as principais características da Epilepsia no Lobo Temporal (TLE) em humanos (Cavalheiro et al., 1991). A pilocarpina é um agonista colinérgico muscarínico, que induz crises límbicas, evoluindo para crises secundárias generalizadas, envolvendo o SE (status epilepticus), que dura até 18 horas (período agudo). O SE é seguido por um período silencioso “livre de crises” e por um período crônico, caracterizado por crises espontâneas recorrentes (Cavalheiro et al., 1994; Leite et al., 1990). As mudanças hipocampais seguidas ao SE incluem um aumento de mobilização de glutamato (Cavalheiro, 1995, Costa et al., 2004), perda celular, gliose (Turski et al., 1993) e crescimento de fibras musgosas (Mello et al., 1993). Levando em consideração que diversos modelos de epilepsia em animais apresentam padrões similares de morte de células do hipocampo, nós podemos presumir que essa perda.

(31) 18. neuronal seletiva é uma das primeiras consequências da atividade das crises prolongadas, geralmente mediada por excitotoxicidade induzida por glutamato em TLE (Cavalheiro et al., 1994; Smolders et al., 1997; Khan et al., 1999; Costa et al., 2004). Gary et al. (2003); mostraram, que AKT mediada por ativação de ILK é capaz de proteger neurônios do hipocampo de apoptose induzida por glutamato. Considerando este efeito e que diversos modelos de epilepsia mostram perda neuronal associado à excitotoxicidade por glutamato (Oxbury e Whitty, 1971; Milan et al., 1993; Costa et al., 2004), nós especulamos se ILK participa no controle da sobrevivência neuronal no modelo pilocarpina de epilepsia. Além do mais, a estimulação dos receptores de glutamato pode estar envolvida no desencadeamento da liberação do RNA mensageiro (RNAm) de neuropeptídeo Y (NPY) (Vezzani e Sperk, 2004); e um forte efeito antiepiléptico do NPY foi igualmente reportado em numerosos estudos, propondo um papel endógeno crítico ao NPY em crises regulares por controle da excitabilidade neuronal (Vezzani et al., 1999; DePrato Primeaux et al., 2000; Sorense et al., 2009). Foi demonstrado em numerosos estudos, que a expressão de neuropeptídeos é dramaticamente alterada, aumentada na maior parte, em modelos de epilepsia em animais e isto ocorre em sub-regiões específicas da formação hipocampal (Fetissov et al., 2003). Luton e Cavalheiro (1997) mostraram uma pronunciada imunorreatividade para NPY localizada nas regiões terminais das fibras musgosas em animais tratados com a pilocarpina. O NPY pode atuar como um agente antiepiléptico endógeno no hipocampo em resposta à crise (Gruber et al., 1994). O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNAm de NPY e ILK; e níveis de ativação de AKT no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de indução de epilepsia pela pilocarpina..

(32) 19. 2. METODOS. 2.1. Procedimentos com os animais:. Ratos adultos machos Wistar (230 – 250 g. n=100) foram mantidos em condições laboratoriais padrões, abrigados em grupos de três a quatro animais por gaiola e mantidos em salas com controle de temperatura, umidade e ciclo de 12 horas de claro-escuro; com água e ração disponíveis e á vontade. Os animais receberam única dose intraperitoneal de pilocarpina (350mg/kg, Sigma, Saint Louis, MO). Em 80 ratos foi administrada uma dose de 1 mg/kg de metilescopolamina (Sigma), via subcutânea, 30 min antes da pilocarpina, para prevenir efeitos colinérgicos periféricos da pilocarpina. Um grupo de animais (n=14) foi morto 6 horas depois do inicio do Status epileticus (6h SE) (Grupo agudo); e outro 12 horas depois do inicio do SE (12h SE) (Agudo tardio, n=14). Outro grupo (n=14) foi morto 5 dias depois do inicio do SE, período de livre de crises (Grupo silencioso). O último grupo de animais (n=14) foi morto 60 dias depois da indução do SE (Grupo crônico), período em que os animais iniciam as crises espontâneas recorrentes. Ratos, que receberam pilocarpina, mas não desenvolveram o SE, apresentando somente crises parciais (Grupo parcial n=14) foram mortos 6 horas depois da injeção de pilocarpina. Animais do grupo crônico foram mortos 24 horas depois de uma crise, durante período interictal. Nove (9) animais morreram nas primeiras 72 horas após administração de pilocarpina. Os animais do grupo controle foram mortos 6 horas (n=7), 5 dias (n=7) e 60 dias (n=7); depois da injeção de metilescopolamina e salina. O hipocampo dos grupos experimentais foram dissecados e utilizados para quantificação por PCR de RNAm de ILK e NPY (n=7, por grupo); e para localização de ILK utilizando imuno-histoquímica (n=3, por grupo); e ativação de AKT por Western blot (n=4, por grupo)..

(33) 20. Os procedimentos experimentais foram aprovados pela UNIFESP respeitando todos os requerimentos éticos. Além disto, durante o período de recuperação, os animais receberam assistência para alimentação e hidratação, para melhorar o estado clínico geral e reduzir a mortalidade, diminuindo o número de ratos usados.. 2.2. Extração de RNA total:. Níveis de RNAm de neuropeptídeos Y e ILK foram quantificados nos grupos de animais mencionados acima. Os animais foram mortos por decapitação, os cérebros foram extirpados do crânio e o hipocampo foi rapidamente dissecado e congelado em gelo seco, antes do armazenamento em - 80° C. Descongelado, o tecido foi homogeneizado em 1 ml de reagente Trizol (Gibco BRL, Gaithesburg, MD) e o RNA total foi isolado de acordo com as orientações do fabricante.. 2.3. PCR em tempo real quantitativo:. Um micrograma de RNA Total foi utilizado para síntese de cDNA e análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Inicialmente, possível DNA contaminante foi removido usando DNASE I (Invitrogen, Carisbad, CA), em uma concentração de 1 unid/µg RNA na presença de 20 mM de Tris-HCL, pH 8,4, contendo 2 mM MgCl2, por 15 minutos a 37 °C, seguido por incubação a 95 °C por 5 min para inativação enzimática. Então, a reação de Transcrição Reversa (RT) foi realizada em 200 µl de reação na presença de 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 10 mM de dithiothreitol, 0,5 mM dNTPS, e 50 ng de primers randômicos com 200 unidades de Moloney Murine Leukemia Reverse Transcriptase.

(34) 21. (Invitrogen). As condições da reação foram: 20 °C por 10 min, 42 °C por 45 min e 95 °C por 5 min. O produto da reação foi amplificada por PCR em tempo real em Sistema de Detecção Sequencia 7000 (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, CA) usando um Kit de reação SYBRGreen (Applied Biosystems). As condições para ciclagem térmica foram: 50 °C por 2 min, a 95 °C por 10 min, seguidos por 40 ciclos a 95 °C por 15 seg e 60 °C por 1 min. Os experimentos foram executados em triplicatas para cada ponto. A abundância de RNAms de neuropeptídeos Y e ILK foram quantificados com valores relativos comparados com referências internas, GAPDH (Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase), na qual a abundância foi creditada para não mudar a variação entre as condições experimentais. Primers usados para PCR em tempo real: Neuropeptídeos Y para rato (GenBankTM accession number NM 012614), primer senso 5’- TGGCCAGATACTACTCCGCT-3’ e primer reverso 5’- ATGGAAGGGTCTTCAAGCCT-3’; ILK para rato (GenBankTM accession number NM 133409), primer senso 5’- ACCCAACCCTCATCACACACT -3’ e primer reverso 5’- GCCTCTTGCCATGTCCAAA -3’; GAPDH para rato (GenBankTM accession number NM 017008) primer senso 5’- TGCACCACCAACTGCTTAGC -3’ e primer reverso GCCCACGGCCATCA -3’. Um microlitro de RT foi usado para o PCR em tempo real. Valores quantitativos de transcrição do RNAm de neuropeptídeos Y, ILK e GAPDH; foram obtidos a partir do número de ciclos do ponto inicial, onde o aumento no sinal foi associado com um crescimento exponencial dos produtos do PCR que começaram a ser detectados. Curvas de melting foram geradas ao fim de cada funcionamento assegurando um produto uniforme. O nível do gene alvo foi normalizado com a base na expressão de GAPDH como controle endógeno de RNA. Valores de variação ∆Ct da amostra foram determinados por subtração da média de valores Ct alvos de genes RNAm e a média de valores Ct do controle interno para GAPDH..

(35) 22. Como não é comum usar variação ∆Ct para dados relativos devido a suas características logarítmicas, o parâmetro 2 -∆Ct foi usado para expressar a relativa expressão de dados (Livak, 1999).. 2.4 Imuno-histoquímica para ILK:. Cérebros foram fixados em solução de formalina (5%, 48 h), incluídos em parafina e cortes coronais foram realizados. As espécies oriundos da formalina foram incluídas em parafina, sendo as recuperações antigênicas de ILK para imunorreatividade obtida pelo método de Shi et al, (2007) modificado. Inicialmente, os cortes (3 µm de espessura) foram desparafinados e a peroxidase endógena foi inativada com 3 % H2O2 em solução salina por 15 min. Os cortes foram, então, incubados com 50 mM de Tris-HCl, pH 9,5, e reaquecidos em forno de microondas a uma potencia de 700 W por 4 minutos, depois um período de 1 minutos de intervalo e por período adicional de 3 minutos de reaquecimento. Todas as incubações seguintes foram realizadas à temperatura ambiente. Os cortes foram tratados em microondas e colocados em tampão Tris-glicina (0,1 M glicina, pH 7,4) por 30 minutos para extinção da reação do grupo de aldeído. Os cortes então foram incubados com 20 mM de solução de fosfato de sódio, pH 7,4; 0,45 M NaCl (PBS), 0,3% Triton X-100 (Solução Triton, sigma) e 5% de solução de leite em pó sem gordura por 5 horas. Os cortes foram incubados por 24 horas com anticorpo monoclonal primário anti-ILK (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) diluídos em solução de bloqueio 1:100. Protocolos experimentais em tecidos controles, no qual o anticorpo primário foi substituído por soluções de bloqueio, foram igualmente realizadas. Os cortes foram lavados quatro vezes em PBS e anticorpo ILK foi detectado com anti-camundongo IgG biotinilizada (Calbiochem, Biosciences Inc., La Jolla, CA) diluída em solução de bloqueio 1:100 por 60.

(36) 23. minutos. O complexo foi incubado com Kit ABC (Vectastain Elite, Burlingame, CA) e visualizado usando 3, 3’ – diaminobenzidina (1 mg/ml em 1% H2O2). Os cortes foram desidratados, cobertos com as lamínulas e analisados com microscopia de luz de campo claro. Análises imuno-histoquímicas foram realizadas por dois patologistas através do método duplo cego, que obtiveram contagens da reação de imunorreatividade para anticorposantígenos. O grau das colorações foi classificado pelos seguintes critérios provisionais: 1+, baixa marcação detectada por fotomicroscopia na x 200; 2+, moderada coloração extensamente distribuída, detectada na x 100; ou 3+, abundante coloração prontamente detectada na x100 (10x objetiva).. 2.5 Análise por Western blot:. Para quantificação de ativação de AKT, a técnica Western blot foi executada nos hipocampos dos animais submetidos ao modelo pilocarpina de epilepsia. Hipocampos foram dissecados e armazenados a -80°C até o uso. Amostras foram homogeneizadas em soluções de lise contendo: 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris – HCl, pH 7,6, 0,001M EDTA pH 8,0, 1% NP -40, 10% Glycerol, 10 µM PMSF, 1mM sódio metavanadato, 0,05M NaF; 2nM acido ocadáico com coquetel inibidor de protease. O método de Lowry (1951) foi utilizado para determinar o conteúdo protéico. O homogenato foi diluído em solução de Laemmli e fervido por 5 minutos. 60 µg de proteína foram carregados em 10% gel de poliacrilamida, separados por eletroforese, e transferidos para a membrana de nitrocelulose por eletroblotting. O bloqueio foi executado em 5% de leite desnatado por 2 horas em temperatura ambiente. As membranas foram resolvidas utilizando para anticorpo policlonal Akt (Ser473) (Santa Cruz Biotecnologia, Inc.) em TBS-T (50 mM Tris-HCl, 154 mM Nacl, pH 7,5 + 0,1% Tween 20) + 2% de leite sem.

(37) 24. gordura. Depois de 12 horas de incubação em temperatura ambiente, a membrana foi lavada em TBS-T (3x10 minutos) e incubada por 2 horas em imunoglobulina biotilada anti-coelho (Vector Laboratorios, Inc., Burlingame, CA), diluído 1:200 em TBS-T + 2% de leite sem gordura. As membranas foram lavadas em TBS-T (3x10 minutos) e incubados por 1 hora em peroxidase-estreptavidina (Vector Laboratórios, Inc.). Após lavagens, reagentes de realce de quimioluminescência foram aplicados nas membranas (ECL, Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA) as quais foram expostas a uma película de raio X (Amersham Biociência) e quantificadas por análises das reações de peroxidadese-estreptavidina. Equivalente carregamento protéico foi mostrado por stripping e ressondagem da membrana com anticorpo anti-GAPDH como padrão interno (1:2000, Proteimax Biotecnologia Ltda., Cotia Brasil).. 2.6 Análise Estatística:. Níveis de expressão RNAm de ILK e neuropeptídeo Y e ativação da AKT durante diferentes fases do modelo experimental foram comparados usando ANOVA uma-via seguido por Teste-t. Dados apresentados como media ± S.E.M.; p < 0,05 foi considerado como significante..

(38) 25. 3. RESULTADOS:. 3.1 Comportamento Animal:. Injeções de pilocarpina causaram, inicialmente, acinesia, vacilação atáxica e tremor, automatismo mastigatório com mioclonia de músculos faciais e agitações tipo cão molhado, persistindo por 10 -15 minutos. Como relatado anteriormente (Turski et al., 1984; Cavalheiro et al., 1991), estas alterações comportamentais progridem para crises do sistema límbico motor que duraram de 45 a 60 minutos, evoluindo, então, para SE em 75% dos ratos Wistar. Os remanescentes 25% dos ratos restantes retornaram progressivamente a um comportamento normal após 3-5 horas. SE persistindo por 12 horas sem remissão. Aproximadamente 30% dos ratos com SE morreram durante este período. O padrão normal para comportamento retornou progressivamente, apesar de alguma resposta agressiva à manipulação.. Durante 14 dias, não foram observados sinais de atividade epiléptica no. comportamento, caracterizando o período silencioso. Crises espontâneas recorrentes começaram a ser observadas com uma frequência de 3 a 4 vezes por semana, e cada crise durou em média 50 – 60 segundos..

(39) 26. 3.2 Analise da expressão do RNAm de ILK:. A expressão de RNAm de ILK diminuiu em 55% no grupo de ratos que entraram em SE 6 horas, quando comparada com o grupo controle (p=0,0040), como visto na figura 1. Seguidos 5 dias (grupo silencioso), a expressão retornou a níveis normais, e depois de 2 meses (grupo crônico), a expressão RNAm de ILK apresentou diminuição de 45% quando comparada com o grupo controle (p=0,0154) (figura 1). A expressão RNAm de ILK dos grupo agudo e grupo crônico, quando comparada com o grupo silencioso foi significativamente diferente (p=0,0017 e p=0,0073, respectivamente). Nós procuramos determinar se a expressão RNAm de ILK variava os níveis nos estágios iniciais da epileptogênese, e nós encontramos um aumento no grupo agudo tardio (12 horas do SE), mas não foi estatisticamente significante (figura 1). Animais, que apresentaram somente crise parcial, mostraram altos níveis de RNAm de ILK, quando comparada com o grupo agudo (p=0,0006), sem diferença em comparação com o grupo controle (figura 1).. Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico. Parcial. Fig.1. Níveis de expressão RNAm de ILK no hipocampo dos ratos submetidos ao modelo de indução de epilepsia por pilocarpina por ensaio de PCR em tempo real. Todos os dados representam uma relativa quantificação para expressão de nível de GAPDH para cada amostra. A média dos dados ± SEM. (n=7 por grupo) (*p=0,05, agudo – 6h e crônico versus.

(40) 27. controle; &p < 0,05, agudo – 6h e crônico versus silencioso #p < 0,05, agudo - 6h versus parcial).. (Fig.1). Animais apresentaram somente crise parcial, mostrada com níveis altos de RNAm ILK, quando comparada com o grupo agudo (p=0,0006), sem diferença em comparação com o grupo controle (Fig.1).. 3.3 Imuno-histoquímica de ILK no hipocampo:. A análise imuno-histoquímica mostrou padrões de distribuição similares de ILK em toda parte da formação hipocampal de todos os grupos estudados (Figuras 2-4). Regiões de interesse tais como CA1, CA3 e hilus, assim como as células granulares vindas do giro denteado, foram marcadas. Os grupos controle (A) e silencioso (C) mostraram aumento da imunorreatividade em toda formação hipocampal, quando comparados com os grupos agudo (B) e crônico (D) (Figuras 2-4). O grupo parcial apresentou distribuição similar para ILK comparada com o grupo controle (dados não mostrados). Todos os dados de imunorreatividade são apresentados na Tabela 1..

(41) 28. Fig. 2. Distribuição de ILK na região de CA1 do hipocampo dos grupos experimentais. Fotomicrografias da região CA1 do hipocampo processado para imuno-histoquímica de ILK: (A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo silencioso e (D) grupo crônico – barra de escala: 0,02 mm.. Fig. 3. Distribuição de ILK na região de CA3 do hipocampo dos grupos experimentais. Subtítulos a ilustração fotomicrografias da região CA3 do hipocampo processada para imunohistoquímica de ILK: (A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo silencioso e (D) grupo crônico – barra de escala: 0,03 mm..

(42) 29. Fig. 4. Distribuição de ILK na região do hilo no hipocampo dos grupos experimentais. Subtítulos a ilustração fotomicrografias da região do hilo no hipocampo processada para imuno-histoquímica de ILK: (A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo silencioso e (D) grupo crônico – barra de escala: 0,02 mm.. Tabela 1 – Imunoreatividade para ILK na formação hipocampal: Formação. Grupo. Grupo. Grupo. Grupo. Grupo. Hipocampal. Controle. Agudo 6 h. Silencioso. Crônico. Parcial. Geral. +++. +. ++. +. ++. CA1. ++. +. +++. ++. ++. CA3. +++. +. +++. ++. ++. HILO. ++. +. +++. ++. ++. Intensidade da marcação: + baixa; ++ moderada; +++ intensa..

(43) 30. 3.4 Níveis de ativação da AKT:. Utilizando extratos proteicos do hipocampo dos grupos controle, agudo, silencioso e crônico, o anticorpo fosfo Akt (Ser 473) marcou uma proteína de 60 kDa. Análise desintométrica e normalização (com iguais quantidades de carregamento das proteínas) de imunorreatividade mostrou que a Akt fosforilada foi mais expresse no grupo silencioso (0,5194 ± 0,300), quando comparada com o grupo controle (0,4377 ± 0,0129, p=0,0461) (Figura 5).. Fig. 5. Análise de Western blot para Akt fosforilada (ativada) no hipocampo dos grupos experimentais. (A) Representatividade da analise de Western Blot. Linhas: (CT) Grupo Controle; (AC) Grupo Agudo 6 h SE; (SL) Grupo Silencioso; (CHR) Grupo Crônico (n=4 por grupo). (B) Análise densitométrica e normalização do sinal de imunoreatividade para Akt fosforilada. – O.D. – Densidade Óptica (§ p < 0,05)..

(44) 31. 3.5 Expressão RNAm do Neuropeptídeo Y:. Uma maior expressão de RNAm do neuropeptídeo Y foi encontrada na fase silenciosa (1,45 ± 0,29), onde as crises não são observadas e no grupo que recebeu pilocarpina mas não desenvolveu SE (1,67 ± 0,22, grupo parcial) quando comparado com o grupo controle (0,36 ± 0,12, Figura 6). Animais do grupo agudo e crônico não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle (0,23 ± 0,07 e 0,19 ± 0,09, respectivamente). Nenhuma diferença significativa foi observada na expressão de RNA mensageiro de NPY entre o grupo agudo 6 e 12 horas (agudo tardio) seguidas à injeção de pilocarpina (Figura 6).. Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico. Parcial. Fig. 6. Níveis de expressão de RNAm do neuropeptídeo Y no hipocampo dos ratos submetidos ao modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina por ensaio de PCR em tempo real. Todos os dados representam a quantificação relativa para níveis da expressão de GAPDH de cada amostra. Media dos dados SEM. (n=7 por grupo) (Grupos. *. p < 0,05,. Silencioso vs Controle, Agudo e Crônico; # p < 0,05, Parcial vs Controle, Agudo e Crônico)..

(45) 32. 4. DISCUSSÃO:. Nosso grupo tem empregado muitos esforços na identificação de genes específicos que participam do processo de epileptogênese (Argañaraz et al., 2004; Perosa et al., 2007; Silva Jr et al., 2008), considerando que esta seja a primeira etapa para adquirir observações terapêuticas mais exatas, conduzindo a tratamento mais específicos para aqueles que sofrem desta síndrome. A ILK é uma proteína quinase serina/treonina descoberta há mais de uma década (Hannigan et al., 1996). Esta molécula tem funções enzimáticas e também promove interações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular. Esta quinase apresenta uma grande variedade de funções, como sua participação na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência (Delcommene et al., 1998; Dedhar et al., 1999; Dedhar, 2000), entre outras. Sabe-se, que a ILK é uma das principais ativadoras da proteína quinase B ou AKT, uma molécula que é essencial no ciclo de vida e morte das células. Esta é a principal razão que a ILK se transformou num possível alvo terapêutico para vários tipos de câncer (Koul et al., 2005; Troussard et al., 2006), isquemia cardíaca (Bock-Marquette et al., 2004) e glomerulonefrites (Kagami et al, 2006). Nossos resultados mostraram, que a síntese do RNAm ILK está alterada em diferentes fases do status epileticus induzido por pilocarpina em ratos. Esta observação pode ser de grande valor no desenvolvimento do mecanismo fisiopatológico da epilepsia, uma vez que a ILK foi descrita como um regulador chave no mecanismo de sobrevivência celular (Atwell et al., 2000; Persad et al., 2000) e diversos estudos tem demonstrado uma relação entre a perda neuronal no hipocampo e o processo de epileptogênese (Meldrum e Burton, 1992; Mello et al., 1993; Fuerst et al., 2003)..

(46) 33. Nós também mostramos que os níveis de RNAm ILK foi significativamente diminuídos nos períodos agudo e crônico (Figura 1), sugerindo que a síntese da enzima possa estar inibida no hipocampo dos ratos Wistar. A expressão da proteína ILK está de acordo com os níveis de RNAm (Figuras 2-4). Uma vez que o declínio da expressão da ILK pode ser observado exatamente no período da crise, pode-se especular que a inibição de sua síntese poderia ser uma etapa de uma cadeia de eventos que culmina na morte neuronal induzida pela crise. Este fato pode ser uma evidência da importância da sinalização ativada da ILK no mecanismo de sobrevivência neuronal neste modelo experimental. Análise da Akt fosforilada mostrou que no período silencioso foi observado um aumento da ativação desta proteína (Figura 5), quando os níveis de RNAm de ILK estavam igualmente elevados (Figura 1). Como observado na fase crônica, nós poderíamos especular que com uma menor quantidade de ILK nos neurônios hipocampais, sua atividade enzimática manteria os níveis de atividade da Akt. Este tipo de compensação é crucial para a biologia celular. Mesmo sendo uma das principais ativadoras da Akt, a ILK não é a única quinase com esta função, e, até o momento, nós não podemos eliminar a hipótese que outras moléculas participem deste complexo mecanismo de sobrevivência celular. Aparentemente, esta ativação alterada da Akt pode estar relacionada com o mecanismo de resposta ao dano celular induzido pela crise no período agudo, na tentativa de diminuir a extensão da lesão e o número de estruturas cerebrais envolvidas. Kim et al, (2002) mostraram resultados similares, demonstrando que a ativação da Akt é necessária para a prevenção da excitotocidade e morte celular induzida pelo acido caínico. Além disso, Henshall et al, (2002) observaram que a administração de um inibidor de fosfatidilinositol 3-quinase (LY294002), provavelmente um ativador da Akt, agravou a.

(47) 34. apoptose cortical depois de crises induzidas pelo acido caínico, enquanto o córtex ileso exibiu fosforilação aumentada da Akt. A relação entre Akt e Bim, um poderoso pró-apoptótico membro da família Blc-2, foi estudada por Shinoda et al, em 2004, em córtex de ratos submetidos ao acido caínico como modelo de indução a epilepsia. O controle da expressão de Bim foi realizado por fatores transcricionais vindo da família FKHR (forkhead in rhabdomyosarcoma) e estes, são inibidos por sua vez diretamente pela fosforilação da Akt. Estes autores observaram que o papel da Akt foi promove a sobrevivência neuronal por interações FKHR-Bim, que foram evidentes no córtex dos animais submetidos ao modelo do acido caínico. O bloqueio da atividade de Akt resultou no aumento nos níveis de ativação FKHR, conduzindo a uma expressão mais elevada do Bim. Estes eventos são seguidos por um aumento significativo de fragmentação de DNA, provavelmente por intensa morte apoptótica celular mediada por Bim, evidenciando a importância da Akt na sobrevivência neuronal e, consequentemente, o papel de seu ativador, a ILK. Ainda considerando o modelo de epilepsia induzido pelo acido caínico; o efeito neuroprotetor atribuído a melatonina foi a ativação da via de sobrevivência da Akt/PKB. Lee et al, (2006) mostraram, que administração de melatonina uma hora antes da injeção intracérebro ventricular de acido caínico é capaz de diminuir a morte de neurônios piramidais vindo da região CA3 do hipocampo, também através de ativação da Akt. Soriano et al, (2006) mostraram uma neuroproteção relacionada com baixa ativação do receptor de NMDA. Este receptor tem suas ações fisiológicas mediadas principalmente por Akt. Estes resultados corroboram com Chong et al, (2006), os quais mostraram, em um modelo de danos celulares por estresse oxidativo, que atividade neuroprotetora é relacionada à ativação da via Akt..

(48) 35. Mills et al, (2003) mostraram uma participação in vitro da ILK nos fenômenos de crescimento axonal, estimulado pelo fator de crescimento neuronal (NGF). O NGF participa de várias funções celulares tais como a diferenciação, sobrevivência, e crescimento axonal e suas ações são mediadas principalmente pela via da PI-3 quinase. Estes autores verificaram que ativação de ILK após estimulação por NGF, foi seguida de ativação da Akt. Após inibição de ILK, o NGF não ativou Akt, demonstrando que ILK é a principal molécula na sinalização desta neurotrofina. Interessantemente, em nosso estudo, os animais que receberam a pilocarpina, mas não desenvolveram o SE (grupo parcial) apresentaram altos níveis de expressão RNAm de ILK em hipocampos. Há pelo menos duas interpretações para este resultado: primeiro é que a pilocarpina, por si só, não seria responsável pela diminuição da expressão de RNAm da ILK e as crises seriam a chave para esta observação. A outra hipótese é que os animais do grupo parcial que não entraram em SE poderia estar associada a uma falta de inibição da via ILKAkt, conduzindo-nos à hipótese que esta via poderia ser um dos mecanismos da progressão da epilepsia. Além disso, podemos supor, que a fase crônica de recorrentes crises periódicas poderia estar associada a um alto nível de expressão de ILK e, assim a uma ativação elevada da Akt. A Akt ativada poderia exercer suas funções sobre o FKHR, conduzindo a diminuição da expressão de Bim, entre outros efeitos. Levando em consideração que Bim pode ser o maior responsável pelas mortes neuronais seguidas a crises, este cenário representaria uma resposta neuronal contraria à estimulação deletéria constante, tornando-se, desta maneira menos vulnerável a estes eventos. Na epilepsia, a hiperatividade que causa as crises epiléticas está associada ao aumento da sinalização glutamatérgica (Cavalheiro et al., 1994; Costa et al., 2004). Este aumento na liberação do glutamato é responsável pela morte neuronal por excitotocidade (Meldrum et al.,.

(49) 36. 1991). Gary et al. (2003) encontraram in vitro, que a via de ativação da ILK é capaz de proteger os neurônios hipocampais da morte celular induzida por glutamato. O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos, primeiramente caracterizado e isolado de extratos de cérebro de suíno. Diversos estudos têm estabelecido a distribuição difusa do NPY no cérebro e nos neurônios simpáticos. No cérebro de rato, uma alta densidade de imunoreatividade de corpos celulares e fibras são observadas no córtex, núcleo caudado, putamen e hipocampo (Danger, 1990; Noé et al., 2007). Uma elevada expressão de NPY no hipocampo foi relatada em vários modelos de crises, incluindo o SE, abrasamento e crises determinadas geneticamente. Esta elevada expressão consiste no aumento do nível de RNAm e peptídeos relacionados nas células granulares e nas fibras musgosas e em interneurônios hilares (Vezzani et al., 1999; Vezzani e Sperk, 2004). Alterações induzidas por crises na expressão do NPY são acompanhadas por modificações em seus subtipos de receptores, o que sugere que a neurotransmissão mediada por NPY encontrase alterada no tecido epilético (Verzzani e Sperk, 2004). Nosso estudo corrobora esta hipótese uma vez que observamos que nos períodos em que as crises já não eram observadas ou que havia ausência das crises, o RNAm do neuropeptídeo Y foi fortemente detectado (Figura 6). O aumento da expressão de RNAm de ILK no período silencioso (Figura 1) sugere que ILK pode estar participando do remodelamento no hipocampo seguida ao SE. É conhecido que no período silencioso acontece uma alta reorganização sináptica, associada com o fenômeno de crescimento axonal. A expressão de neuropeptídeo Y elevada nesta fase pode ser uma resposta aos danos ocorridos na fase prévia ao SE. Camundongos deficientes para NPY são mais propensos à crises (Erickson et al., 1996; Baraban et al., 1997), sendo que os ratos com superexpressão de NPY diminuem a susceptibilidade às crise e a epileptogênese (Vezzani et al., 2002). Expresso em um subconjunto de interneurônios GABAérgicos, o NPY é preferencialmente liberado em.

(50) 37. frequência alta de disparos neuronais (Thureson-Klein et al., 1986; Kits e Mansvelder, 2000). O NPY pode modular a inibição mediado por GABA (Sun et al., 2003) e excitação mediado por glutamato (Haas et al., 1987) na transmissão sináptica. No hipocampo, NPY apresenta efeito inibitório na liberação pré-sináptica do glutamato e pode reduzir o influxo de Ca2+ nos terminais axonais dos principais neurônios glutamatérgicos (Colmers et al., 1988), diminuindo a magnitude das respostas excitatórias evocadas (Colmers et al., 1985). Os dados vindo deste estudo mostram menores níveis de RNAm de ILK e distribuição hipocampal desta quinase nos períodos agudos prévio e crônicos de epilepsia induzido por pilocarpina, quando crises são frequentes. Além disso, um aumento da expressão do RNAm de neuropeptídeo Y e ativação da Akt foram observados no período quando as crises já não foram observadas. Estas evidências fortemente sugerem que a via ILK-Akt e o neuropeptídeo Y contribuem para o estabelecimento do mecanismo de sobrevivência celular, tornando um possível alvo terapêutico no tratamento da epilepsia..

(51) 38. AGRADECIMENTOS. Nós agradecemos à Hilda Silva Reis pela assistência técnica e Dr Henrique Costa pela captura de imagens. Este trabalho foi assistido pela CNPq, Fapesp, PRONEX, CAPES e UNINOVE.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS No apêndice junto ao estudo em inglês..

(52) 39. RESULTADOS OBTIDOS NESTE ESTUDO.

(53) 40. 7. RESULTADOS OBTIDOS NESTE ESTUDO. 7.1 COMPORTAMENTOS ANIMAL. Injeções de pilocarpina causaram, inicialmente, acinesia, ataxia e tremor, automatismo mastigatório com mioclonia de músculos faciais e agitações, semelhante a um cão molhado, persistindo por 10 -15 minutos. Como observado em estudos anteriores. 32,33. , estas alterações. comportamentais progrediram para crises do sistema límbico motor que duraram de 45 a 60 minutos, evoluindo, então, para SE em 75% dos ratos Wistar. Os remanescentes 25% dos ratos retornaram progressivamente a um comportamento normal depois de 3-5 horas. SE persistindo por 12 horas sem remissão. Aproximadamente 30% dos ratos com SE morreram durante este período. O padrão normal para comportamento retornou progressivamente ao normal, apesar de alguma resposta agressiva à manipulação. Durante 14 dias, não foram observados sinais epiléticos no comportamento, caracterizando o período silencioso. Então, crises espontâneas recorrentes começaram a ser observadas com uma freqüência de 3 a 4 vezes por semana, e cada crise durou em média 50 – 60 segundos (figura 4), configurando o período crônico..

(54) 41. A.N. SE. 1h. SRSs. 5h. 12 h. 14 dias. Tempo. Fig.04: Esquema de visualização das ações neurofisiológica (A.N.) no decorrer do tempo, onde se verifica o período do Status Epiléticos (SE) e das Crises Recorrentes Espontâneas (SRSs). Construção a partir das informações dos estudos 32,33..

(55) 42. 7.2. EXPRESSÃO de RNAm de NEUROPEPTÍDEO Y. Um aumento de RNAm de neuropeptídeo Y foi encontrado na fase silenciosa (1,45 ± 0,29), onde as crises não foram observadas e no grupo que recebeu pilocarpina mas não entrou no SE (1,67 ± 0,22, grupo parcial) quando comparado com o grupo controle (0,36 ± 0,12, Figura 5). Animais do grupo agudo e crônico não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle (0,23 ± 0,07 e 0,19 ± 0,09, respectivamente). Nenhuma diferença significativa foi observada na expressão NPY entre o grupo agudo 6 e 12 horas (agudo tardio) seguidas à injeção de pilocarpina. (Figura 5).. Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico. Parcial. Fig. 05: Níveis de expressão RNAm de neuropeptídeo Y no hipocampo dos ratos submetidos ao modelo de epilepsia induzida pela pilocarpina por ensaio de PCR em tempo real . Todos os dados representam a quantificação relativa para níveis da expressão de GAPDH de cada amostra. Media dos dados SEM. (n=7 por grupo) (Grupos * p < 0,05, Silencioso vs Controle, Agudo e Crônico; # p < 0,05, Parcial vs Controle, Agudo e Crônico)..

(56) 43. DISCUSSÃO.

(57) 44. 8. DISCUSSÃO. Este estudo quantificou o RNAm do NPY, no intuito de interagir às avaliações da expressão do RNAm da ILK, que é uma proteína quinase serina/treonina34, que tem funções enzimáticas e promove interações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, bem como participa na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência35,36,37. Sabe-se, que a ILK é uma das principais ativadoras da proteína quinase B ou AKT, uma molécula essencial no ciclo de vida e morte das células, Como uma das principais ativadoras da Akt, a ILK não é a única quinase com esta função, e, tanto quanto longe este estudo vá, nós não podemos eliminar a hipótese que outras moléculas participem deste complexo mecanismo de sobrevivência celular, contribuindo ao processo de neuroproteção. Na epilepsia, a hiperatividade que causa as crises epiléticas está associada ao aumento da sinalização glutamatérgica38, 39. Este aumento na liberação do glutamato é responsável pela morte neuronal por excitotocidade. 40, 41. , encontraram in vitro, que a via de ativação da ILK é. capaz de proteger os neurônios hipocampais da morte celular induzida por glutamato. O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos, primeiramente caracterizado e isolado de extratos de cérebro de suíno. Diversos estudos têm estabelecido a distribuição difusa do NPY no cérebro e nos neurônios simpáticos. No cérebro de rato, uma alta densidade de imunoreatividade de corpos celulares e fibras são observadas no córtex, núcleo caudado, putamen e hipocampo. 42, 43. . Uma elevada expressão de NPY no hipocampo. foi relatada em vários modelos de crises, incluindo o SE, abrasamento e crises determinadas geneticamente. Esta elevada expressão consiste no aumento do nível de RNAm e peptídeos relacionados nas células granulares e nas fibras musgosas e em interneurônios hilares. 44, 45. .. Alterações induzidas por crises na expressão do NPY são acompanhadas por modificações em seus subtipos de receptores, o que sugere que a neurotransmissão mediada por NPY encontra-.

(58) 45. se alterada no tecido epilético. 45. . Nosso estudo corrobora esta hipótese uma vez que. observamos que nos períodos em que as crises já não eram observadas ou que havia ausência das crises, o RNAm do neuropeptídeo Y foi fortemente detectado (Figura 5). O aumento da expressão de RNAm de ILK no período silencioso sugere que ILK pode estar participando do remodelamento no hipocampo seguida ao SE. É conhecido que no período silencioso acontece uma alta reorganização sináptica, associada com o fenômeno de crescimento axonal. A expressão de neuropeptídeo Y elevada nesta fase pode ser uma resposta aos danos ocorridos na fase prévia ao SE. Camundongos deficientes para NPY são mais propensos à crises. 46, 47. , sendo que os ratos. com superexpressão de NPY diminuem a susceptibilidade às crise e a epileptogênese. 48. .. Expresso em um subconjunto de interneurônios GABAérgicos, o NPY é preferencialmente liberado em frequência alta de disparos neuronais mediado por GABA. 51. 49, 50. . O NPY pode modular a inibição. e excitação mediado por glutamato. 52. na transmissão sináptica. No. hipocampo, NPY apresenta efeito inibitório na liberação pré-sináptica do glutamato e pode reduzir o influxo de Ca2+ nos terminais axonais dos principais neurônios glutamatérgicos. 53. ,. diminuindo a magnitude das respostas excitatórias evocadas 54. Os dados vindo deste estudo mostram menores níveis de RNAm de ILK e distribuição hipocampal desta quinase nos períodos agudos prévio e crônicos de epilepsia induzido por pilocarpina, quando crises são frequentes. Além disso, um aumento da expressão do RNAm de neuropeptídeo Y e ativação da Akt foram observados no período quando as crises já não foram observadas..

(59) 46. CONCLUSÃO.

(60) 47. CONCLUSÃO. Estas evidências fortemente sugerem que a via ILK-Akt e o neuropeptídeo Y contribuem para o estabelecimento do mecanismo de sobrevivência celular, tornando um possível alvo terapêutico no tratamento da epilepsia..