Fumo em ratas grávidas : envolvimento do fator induzível por hipóxia (HIF-1alpha), do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e da eritropoietina (EPO) sobre a ontogênese renal e a função renal da prole de ratos machos

i

DANIEL BUENO BLOCK

“FUMO EM RATAS GRÁVIDAS: ENVOLVIMENTO DO FATOR INDUZÍVEL POR

HIPÓXIA (HIF-1α), DO FATOR DE CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR

(VEGF) E DA ERITROPOIETINA (EPO) SOBRE A ONTOGÊNESE RENAL E A

FUNÇÃO RENAL DA PROLE DE RATOS MACHOS”

CAMPINAS

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

DANIEL BUENO BLOCK

“FUMO EM RATAS GRÁVIDAS: ENVOLVIMENTO DO FATOR INDUZÍVEL POR HIPÓXIA (HIF-1α), DO FATOR DE CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR (VEGF) E DA ERITROPOIETINA

(EPO) SOBRE A ONTOGÊNESE RENAL E A FUNÇÃO RENAL DA PROLE DE RATOS MACHOS”

Orientador: José Antonio Rocha Gontijo

Co-Orientador: Flávia Fernandes Mesquita Vieira

Dissertação apresentada à Comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO APRESENTADA PELO ALUNO DANIEL BUENO BLOCK

E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSE ANTONIO ROCHA GONTIJO. Assinatura do Orientador

______________________________________________________

CAMPINAS 2013

vii

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho à minha mãe e aos meus irmãos Fábio e Dayara, que são meus pilares e exemplo.

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)

ix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, autor e consumador da minha fé.

A meu orientador Prof. Dr. José Antônio Rocha Gontijo, MUITO obrigado pela oportunidade, confiança, paciência e orientação. A minha Co-Orientadora Profa. Dra. Flávia pelos ensinamentos profissionais e exemplo de pessoa, pela paciência (que parece não ter fim). Foi, e é, um grande prazer trabalhar com pessoas brilhantes como vocês!

Aos professores Dra. Patrícia Boer pela crucial ajuda nas imunos e pela ajuda nas análises dos resultados, Dr. Figueiredo pelas aulas e discussões dos dados, Dr. Rodrigo Catharino, Dra. Simone Appenzeller, Dra. Elaine de Oliveira pela ajuda, sugestões e avaliação deste trabalho.

Aos funcionários do NMCE, Erica, Cris, Willian, Miguel, Ana, Benedito, Sr. José, Marino, Sr. Antônio, Adriana Zaparolli, Ivonete, Cida...

Agradeço (muito) aos meus amigos e colegas de laboratório. Augusto (Lafaiete), Canale (Gotárdo), Barbara e Luiz - graças a vocês o dia a dia de trabalho, sempre, torna-se mais leve e divertido – Ize (mãe de todos) – não fosse sua ajuda seria ainda mais difícil a realização deste trabalho, Benito – pelas engenhosas ideias na construção da caixa de fumo, Carmen Mir, Marcelo, Eduardo, Vinícius, Amanda, Silmara, Heloisa, Agnes, Daniele, Noemi, Sonia, Rafael, Virginia, Nelson, Jéssica,

Alessandra, Carmen Porto, Andreia.

À minha família, minha mãe e meus irmãos Fábio e Dayara e a meus irmãos (emprestado) Marcelo Silva, Leandro Moura, Flávio (treva/Mike), Juliana Godoy, Giane (bixcoitim), a vocês devo muito mais que um simples obrigado. Valeu pela a força, conversas, abraços, risos e (muitas) lágrimas. Obrigado por estar sempre presente em todos os momentos. Que Deus lhes recompense com infinita felicidade e sucesso.

Ao programa de Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas e a Unicamp. À Capes, Cnpq e Fapesp pelo apoio financeiro.

xi

RESUMO

xiii

Resumo

O ambiente em que vivemos tem grande influência no desenvolvimento e na vida adulta do feto, sendo que a alimentação ou o tabagismo veem como hábitos e estilo de vida que estão diretamente relacionados a modificações na organogênese fetal. O tabagismo é um dos fatores de maior preocupação das autoridades em saúde pública, devido aos graves problemas à saúde causados pelo cigarro, os custos sociais e econômicos decorrentes destas afecções e, atualmente às possíveis implicações epigenéticas dada incidência do tabagismo em gestantes que pode repercutir sobre gerações futuras. Vários estudos tratam dos efeitos danosos e das repercussões do cigarro no organismo de gestantes e no desenvolvimento do feto, tais como hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, maior prevalência de aborto espontâneo, morbidade intrauterina , retarde no crescimento fetal, entre outros. A inalação de monóxido de carbono (CO) pelas gestantes, através do cigarro, causa no feto um estado de hipóxia que pode ser, muitas vezes, fatal. Em resposta a este déficit de oxigênio alguns mecanismos fisiológicos podem ser observados, como: o aumento da expressão do hormônio endógeno eritropoietina (EPO) que regula a eritropoiese e consequentemente, os níveis de hemoglobina e a hematose dos tecidos. O fator induzível por hipóxia (HIF-1) atua na regulação da expressão EPO, sobre a angiogênese, e na viabilidade e proliferação celular vascular entre outras funções. Nesta emaranhada rede de estímulos, está intimamente envolvido o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) que tem na hipóxia um dos principais estímulos a sua expressão. Este fator é o mais importante mediador do desenvolvimento vascular renal, principalmente do processo de diferenciação do corpúsculo glomerular. Observamos que a inalação de tabaco não modificou significativamente a evolução da massa corporal das mães durante a prenhes (figura 6). No entanto, a prole de animais submetidos ao fumo apresentou uma expressiva redução da massa corporal ao nascer - Ct 7,2± 0,05DPM g vs. Fm 6,3± 0,24DPM g (figura 7), e da nona e décima semana de vida - Ct 322± 20,5DPM g vs. Fm 286± 32,3DPM g e Ct 329± 20,4DPM g vs. Fm 294± 32,6DPM g, respectivamente (figura 8). Os resultados referente à função renal na prole Ct e Fm na 5ª semana de vida não mostraram diferenças significativas na filtração glomerular (CCr) tão pouco na reabsorção proximal de sódio. Contudo, a prole Fm apresentou um aumento significativo na excreção de sódio (FENa+ _{24,5%, FEK}

13,8%, FEPPNa+ _{25,3% e CENa}+ _{20%) quando comparado ao Ct (figura 13). Por outro lado, na 10ª}

xiv

17,7%, na prole Fm vs. Ct. Nestes animais não houve diferença na reabsorção de Na+ _{no túbulo}

proximal e pós-proximal, consequentemente não observamos diferenças significativas na FENa+ _e

FEK (figura 14). Nos animais Fm de 13 semanas de vida nenhum dos parâmetros das provas funcionais renais se alteraram (figura 15). Contudo, estritamente nesta idade podemos observar um elevação na pressão arterial (p=0,02) entre os grupos Ct e Fm - 134± 9,79DPM mmHg e 146± 11,07DPM mmHg, respectivamente (figuras 11). Não observamos modificações significativas, através da estereologia renal, no volume renal (Ct 0,12 ±0,01 vs. Fm 0,11 ±0,004), na massa renal (Ct 0,43 ±0,03 vs. Fm 0,37 ±0,01) nos animais com 12 dias de vida. Embora, não estatisticamente significativo, a prole Fm apresentou uma redução de 10% no volume glomerular (Ct 16420 ±2411

vs. Fm 15860 ±1078) e 8,2% menos glomérulos (Ct 10450 ±2030 vs. Fm 8628 ±900) quando

comparados ao Ct (figuras 16 a 19). Os resultados quantitativos das proteínas envolvidas na angiogênese e eritropoiese - VEGF e EPO, dados pelo ensaio de western blotting, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos (figuras 20 a 22). Contudo, os resultados semi-quantitativos por imunolocalização mostrou uma elevada intensidade fluorocrômica do VEGF nos animais Fm e de HIF1α nos animais Ct no período embrionário - E17 (figuras 23 a 27). Observamos, também, uma expressiva modificação na estrutura da matriz extracelular por deposição de proteinas no sitio intersticial e perivascular renal nos animais Fm de 16 semanas vida comparadas ao Ct dadas pela histoquímica de picrossíruis e imunofluorêscencia de fibronectina (figura 29 a 32). Assim, podemos concluir que, a exposição intrauterina ao fumo e seus componentes, podem levar a uma modificação morfofuncional renal na vida adulta que reflete diretamente na manutenção da pressão arterial.

Palavras chave: desenvolvimento fetal, tabagismo, hipertensão, fibrose, transição

xv

ABSTRACT

xvii

Abstract

Prior study about developmental plasticity hypothesis suggests that various adverse intra-uterine exposures lead to persistent fetal developmental adaptations. Maternal smoking is a very important modifiable adverse fetal exposure in western countries and leads to a decrease in the offspring’s birth weight. Thus far, the specific adverse fetal smoking exposures and mechanisms underlying these associations on renal development and functional disorder are unclear. The present study investigates, in adult male rats, the effect of smoking exposure (Sk) in utero on blood pressure (BP), and its association with nephron structure and function changes. In the current study, showed in 13-week old Sk offspring enhanced arterial blood pressure, reduced nephron number are associated with higher TGF-β1 glomerular expression. Sk glomeruli also presented an upregulated collagen and fibronectin deposition intrinsically related to fibrotic process as compared to age-matched control group. From our present knowledge, these are the first data showing renal morphological and functional modifications in the gestational smoking model of fetal programming. The fetal-programmed adult rats showed structural kidney disorders associated with a striking stage of fibrosis, which led us to state that the glomerular overflow and subsequently TGF-β1 activity inducing fibrotic protein expression that may cause glomerular EMT.

xix

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

11β-HSD-1/2 HidroxiesteróideDesidrogenase tipo 1 e 2

μm Micrômetro

μL Microlitro

ARNT Translocador Nuclear de Aril Hidrocarbono bHLH Domínio basic-helix-loop-helix

Ccr Clearence de Creatinina

Ck Clearence de Potássio

CLi Clearence de Lítio

CNa Clearence de Sódio

CCr Clearence de Creatinina

CEk+ Carga Excretada de Potássio

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

COHb Carboxihemoglobina

Ct Controle

DDP Deslocamento Prematuro da placenta

DPM Desvio Padrão da Média

E17 17 dias Embrionário

EPO Eritropoietina

xx FEK+ Fração de Excreção de Potássio FENa Fração de Excreção de Sódio

FEPNa Fração de Excreção Proximal de Sódio FEPPNa Fração de Excreção Pós Proximal de Sódio HBS Sítio de ligação do HIF

HIF1α Fator Induzível por Hipóxia 1 HRE Elemento Responsivo a Hipóxia HPA Eixo Hipotálamo Pituitária Adrenal

KDa Quilo Dalton

Li+ Lítio

LiCl Cloreto de Lítio

mRNA Ácido Ribonucléico Mensageiro

mmHg Milímetros de Mercúrio

Na+ Sódio

P450cc Enzima de Clivagem da Cadeia Lateral do Colesterol

P12 12 Dias pós-natal

PAS Domínio Comum Encontrado nos Genes per1, arnt, ahr e sim StAR Proteína Reguladora Aguda da Esteroidogênese

TGFβ 1 Fator de transformação de crescimento beta 1 VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular

xxi

LISTAS DE FIGURAS

Pág.

Figura 1: Aparato de exposição tabagica... 41

Figura 2: Caixa de aquecimento... 42

Figura 3: Aparato para aferição da pressão arterial caudal. Aparelho de plestimografia e contentor...42

Figura 4: Imagem capturada do software utilizado para a quantificação de colágeno...46

Figura 5: Gaiolas metabólicas para realização das provas funcionais renais através dos clearences de creatinina e lítio...47

Figura 6: Evolução da massa corporal das mães durante a gestação...52

Figura 7: Massa corporal dos filhotes machos e fêmeas no dia do nascimento...53

Figura 8: Evolução da massa corporal da prole...53

Figura 9: Média da Pressão Arterial Caudal Sistólica (mmHg) da prole com 5 semanas de vida...54

Figura 10: Média da Pressão Arterial Caudal Sistólica (mmHg) da prole com 10 semanas de vida...54

Figura 11: Média da Pressão Arterial Caudal Sistólica (mmHg) da prole com 13 semanas de vida...55

Figura 12: Evolução média da Pressão Arterial Caudal Sistólica (mmHg) da prole com 5, 10 e 13 semanas de vida...55

Figura 13: Gráficos de função renal da prole com 5 semanas de vida...56

Figura 14: Gráficos de função renal da prole com 10 semanas de vida...57

Figura 15: Gráficos de função renal da prole com 13 semanas de vida...58

Figura 16: Gráfico da estereologia, mostrando o volume renal dos animais com 12 dias pós-natal...60

Figura 17: Gráfico da estereologia, mostrando o peso do rim dos animais com 12 dias pós-natal...60

Figura 18: Gráfico da estereologia, mostrando o número total de glomérulos nos animais com 12 dias pós-natal...61

xxii

Figura 19: Gráfico da estereologia, mostrando o volume glomerular nos animais com 12 dias pós-natal...61 Figura 20: Expressão da proteína VEGF (%) no rim de prole de animais Controle e Fumantes com 5 semanas de vida...62 Figura 21: Expressão da proteína VEGF (%) no rim de prole de animais Controle e Fumantes com 10 semanas de vida...63 Figura 22: Expressão da proteína EPO (%) no rim de prole de animais Controle e Fumantes com 10 semanas de vida...63 Figura 23: Imunolocalização de HIF1α...65 Figura 24: Imunolocalização de VEGF...66 Figura 25: Imunolocalização de EPO...67 Figura 26: Controle negativo da imunolocalização de HIF1α, VEGF e EPO...68 Figura 27: Imunolocalização de fluorescência de HIF1α, VEGF e EPO...69 Figura 28: Imunolocalização de TGF-β1...70 Figura 29: Imunolocalização de Fibronectina...71 Figura 30: Controle negativo da imunolocalização de fibronectina...72 Figura 31: Rins de animais Ct e Fm com 10 semanas de vida submetidos a técnica de

picrossírius...72

Figura 32: Rins de animais Ct e Fm com 16 semanas de vida submetidos a técnica de

picrossírius...73

Figura 33: Gráficos referentes a porcentagem de fibras colágenas...74 Figura 34: Hipótese esquemática mostrando as consequências da exposição fetal a elevados níveis

de glicocorticoides maternos...82

Figura 35: Esquema mostrando os impactos morfológicos renais causados pelo fumo durante a

gestação...83

Figura 36: Ilustração esquematizando a cascata da p66Shc induzida por estresse

oxidativo...85

Figura 37: Esquema demonstrando a regulação da pressão arterial pelo clearence de

xxiii

SUMÁRIO Pág. RESUMO...2 ABSTRACT...4 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS...5 LISTAS DE FIGURAS...7 1. INTRODUÇÃO...25

1.1. O cigarro e suas consequências...26 1.2. Programação Fetal e Insultos Ambientais...27 1.3. Utilização Celular de Oxigênio e a Hipóxia...29 1.4. O sistema urinário...30 1.5. Fator Induzível por Hipóxia 1- HIF-1...32 1.6. Função da Eritropoietina – (EPO) e a Hipóxia...33 1.7. Fator de crescimento endotelial vascular - VEGF...34 1.8. Fator de transformação de crescimento beta 1 – TGF-β1...35 1.9. Fibronectina...36 2. OBJETIVOS...37 2.1. Objetivo geral...38 2.1.1Objetivos específicos...38 3. MATERIAIS E MÉTODOS...39 3.1. Animais...40 3.2.Exposição dos Animais ao Fumo...40 3.3. Aferição da Pressão Arterial Caudal (PAC)...41 3.4. Estereologia Renal...43 3.5. Imunohistoquímica...43 3.6. Western Blotting...44 3.7. Estudos Imunohistoquímicos da Expressão de Colágeno I em Tecido Renal pela Técnica de Picrossírius...45

3.8.Testes Funcionais Renais – Clearance de Creatinina e Lítio...46 3.8.1 Fórmulas para Cálculo do Clearance e de Fração de Excreção...47

xxiv

3.8.1.1 Clearance de Creatinina (CCr)...47

3.8.1.2 Fração de Excreção de Sódio (FENa)...48

3.8.1.3. Fração de excreção de Potássio (FEk)...48

3.8.1.4. Fração de excreção proximal de sódio (FEPNa)...48

3.8.1.5. Fração de excreção pós-proximal de sódio (FEPPNa)...48

3.9. Determinação das Concentrações de Sódio, Lítio, Potássio e Creatinina Plasmáticas...48

3.10. Análise Estatística dos Resultados...49 3.11 Drogas, Reagentes e Anticorpos...49

4. RESULTADOS...51

4.1 Caracterização Antropométrica e Pressórica...52 4.2 Testes Funcionais Renais...56 4.3 Estudos Morfométricos Renais através da Técnica de Estereologia...59 4.4 Estudos por western blotting da Expressão de EPO e VEGF em Extrato Renal...62

4.5 Estudos por microscopia confocal e imunofluorescência de HIF-1, EPO, VEGF, TGF-β1 e Fibronectina em Tecido Renal...64

4.6 Estudos histoquímicos da Expressão de Colágeno I em Tecido Renal pela Técnica de

picrossírius...72

5. DISCUSSÃO...75 6. CONCLUSÃO...89 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...91

25

1. INTRODUÇÃO

26

1.1. O cigarro e suas consequências

Há relatos que em 15 de outubro de 1492, foram oferecidas a Cristovão Colombo folhas secas de tabaco como presente dos índios americanos, e que estes já utilizavam o tabaco em práticas religiosas e médicas desde o primeiro século de nosso calendário. A partir de então, o tabaco começou a ser difundido em toda a Europa. Por volta de 1600 tornou-se tão popular a ponto de ser utilizado como “moeda” em transações comerciais. Contudo, em 1610 começa a ser relatado os efeitos nocivos de seu uso, como a dependência química, ainda não compreendida a época. Ainda assim, em 1760, Pierre Abraham Lorillard criou uma empresa de processamento de tabaco em Nova York (EUA) que persiste até hoje como a empresa mais antiga e fortemente atuante no processamento de tabaco (B.U.M.C., 1999; Kesmodel, 2011).

No inicio desconhecida, a composição química do tabaco evoluiu muito ao longo dos anos. Graças ao desenvolvimento dos estudos químicos e de respostas biológicas em estudos fisiológicos e farmacológicos foram identificados compostos que incorporados ao cigarro que potencializam seus efeitos. Neste sentido, substancias tais como a amônia que promove uma maior absorção da nicotina, aumentando seus efeitos e o ácido levulínico que torna o sistema respiratório mais resistente ao fumo, possibilitando tragadas mais profundas (Martins, 2007) foram reconhecidas. Desta forma, na composição do cigarro podem ser identificadas mais de 4700 substâncias, dentre elas gases tóxicos (cianeto, xileno, butano), metais pesados tóxicos (cádmio, arsênio, acetato de chumbo), e inúmeras outras substancias cujos efeitos ainda não estão bem esclarecidos a despeito de alguns efeitos identificados sobre a função de órgãos e tecidos e a patogênese em animais a curto e longo prazo (Ambrose & Barua, 2004).

Segue um trecho do relatório da organização mundial da saúde relatando o resultado do tabagismo:

“O uso do tabaco é a principal causa de morte evitável, estima-se que mais de 5 milhões de pessoas morrem por ano em todo o mundo. Se as tendências atuais persistirem, o tabaco matará mais de 8 milhões de pessoas no mundo a cada ano até 2030” (WHO, 2009 p-8).

Segundo a organização mundial da saúde existem 250 milhões de mulheres fumantes em todo o mundo (WHO, 2009). No Brasil, uma pesquisa da VIGITEL - órgão vinculado ao Ministério da Saúde para a vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico, mostrou que 15,1% da população fuma e que 12,7% deste percentual são mulheres

27

(VIGITEL, 2010). Nos Estados Unidos, uma a cada cinco mulheres fumantes continuam fumando durante a gravidez (Mathews, 2001; Gao et al., 2008).

Alguns trabalhos relatam que fumantes estão predispostas à arteriosclerose – termo genérico que inclui doenças vasculares caracterizadas pelo espessamento e rigidez da parede das artérias de qualquer calibre (D.H.H.S., 1983), associada à angina (baixa oxigenação com isquemia miocárdica), infarto tecidual (Ambrose & Barua, 2004). Nesta situação, ocorre um decréscimo na concentração tecidual de eNOs - molécula responsável por vasodilatação, regulação do processo inflamatório, adesão de leucócitos, ativação de plaquetas, trombose, ativação de moléculas pró-aterogênicas, alteração da interação célula-célula e dano no DNA (Mayhan et al., 2003; Napoli et al., 2001; Mazzone et al., 2001; Kalra et al., 1994). Estes eventos estão intrinsecamente ligados a várias doenças que levam ao óbito, como as doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC) responsáveis por 85% das mortes por tabagismo, doenças coronarianas (em 15% relacionadas ao tabagismo) e as neoplasias, de várias origens, que somam 30% no número de mortes relacionadas ao tabagismo (WHO, 2009). Tabagistas podem desenvolver, também, hipertensão arterial, aumento do estresse oxidativo, toxicidade renal ocasionando modificações estruturais, anormalidades na estrutura epitelial tubular proximal renal, isquemia renal o que promove disfunção tubular e glomerular e consequentemente a diminuição da taxa de filtração glomerular (Talukder, et al., 2011; Arany, et al., 2011; Cobanoglu, et al., 2007).

Alguns compostos, não apenas tem seu efeito deletério imediato, assim que inalados, mas também promovem danos por tempo prolongado, uma vez que podem permanecer no organismo por dias, meses ou anos. É o caso do cádmio e do acetato de chumbo, metais cancerígenos, estes podem permanecer no organismo por até 20 anos (Martins, 2007). Outra característica, de inúmeros compostos do cigarro, é a capacidade ultrapassar barreiras ultra-seletivas, como por exemplo, a barreira hemato-encefálica e a barreira placentária. É isto que os tornam mais nocivos, não só para quem fuma, mas também para quem ficam expostas passivamente, a estas substâncias químicas.

1.2. Programação Fetal e Insultos Ambientais

Nos dias atuais é comumente observado o aumento na incidência de doenças relacionadas ao nosso estilo de vida e/ou por fatores genéticos ou epigenéticos, muitas vezes definidas na fase

28

intrauterina. É sabido que o ambiente em que vivemos tem grande influência no desenvolvimento e formação do individuo e podem expressar fenotipicamente, durante a idade adulta (Barker, 1990), a isso chamamos de “programação fetal”. Um conjunto crescente de evidências tem sustentado a ideia de que distúrbios ocorridos em períodos críticos do desenvolvimento fetal podem determinar alterações permanentes ou de longo prazo na fisiologia ou morfologia de um determinado órgão (Ashton, 2000). O conceito de “programação fetal” sugere que o feto pode ser programado durante o desenvolvimento intrauterino para desenvolver doenças na idade adulta. O estresse gestacional, pré-natal, é o modelo mais extensamente estudado de programação fetal que tem sido utilizado como uma das chaves para entender a origem de doenças relacionadas à hipertensão arterial (Langley-Evans, 1998; Edwards et al., 2001). De acordo com essa teoria, alterações no período gestacional materno, refletidas no peso ao nascer da prole à ação intrauterina de glicocorticoide (Langley-Evans, 1997), seria a base para o desenvolvimento da elevação da pressão sanguínea durante a infância, adolescência e ao estado hipertensivo no adulto (Barker et al., 1989; Law et al., 1991; Williams et al., 1992).

O primeiro relato da associação de eventos precoces da vida com o desenvolvimento posterior de doença cardiovascular foi feita em 1977, por Forsdahl. Na população estudada, a mortalidade por doença cardiovascular e cerebrovascular se correlacionou com as taxas de mortalidade infantil da mesma população. Em seguida, uma série de investigações epidemiológicas demonstraram correlações entre a pressão sanguínea materna e de sua prole, sugerindo ser este um fator determinante. Vários modelos de retarde de crescimento fetal foram desenvolvidos, nos quais o baixo peso da prole ao nascer era associado à elevação pressórica na idade adulta (Persson & Jansson, 1992; Woodall et al., 1996; Prentice, 1991; Godfrey et al., 1996). Posteriormente, Barker (1995; 1997; 1998) mostrou a associação entre o peso ao nascer e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares no adulto, onde foi sugerida a hipótese de que o retarde do crescimento fetal aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares na fase adulta.

As melhores evidências acerca das influências fetais na programação de doenças cardiovasculares bem como a hipertensão arterial, surgiram a partir de trabalhos que empregaram métodos de manipulação da dieta materna de ratos durante a gestação, como meio de induzir restrição proteica materno-fetal. Variações no conteúdo de proteína da dieta foram planejadas para produzir restrição leve (12% de caseína), moderada (9%) e severa (6%) (Langley-Evans, 1996). Esses experimentos resultaram em alterações variáveis no peso dos recém-natos e no

29

tamanho das placentas. Os animais desenvolveram hipertensão arterial a partir da quarta semana de vida e mantida até a idade adulta (Langley-Evans, 1994; 1995). A restrição proteica materna anterior à gestação não afetou os resultados e mesmo períodos curtos (1 semana) de restrição proteica gestacional foram suficientes para induzir alterações na pressão arterial (Langley-Evans, 1996). A ação de outros fatores ambientais sobre a programação fetal, tais como o tabagismo, tem sido pouco estudado. Estes resultados se revestem de grande importância quando correlacionados com os achados epidemiológicos em humanos. Achados de baixo peso ao nascer, relacionados à desnutrição materna e ao desenvolvimento futuro de hipertensão arterial são inteiramente compatíveis com a “hipótese de Barker”.

Estudos prévios, em nosso laboratório, têm demonstrado que modificações dietéticas (estresses nutricionais) durante a gestação podem causar modificações morfofuncionais renais que repercutem no futuro sobre a sobrevida, a morfologia e expressão gênica e, a pressão arterial da prole (Mesquita et al., 2010; Vaccari et al., 2013; Sene et al., 2013). Da mesma forma, o efeito do fumo vem sendo amplamente discutido por trazer significativas alterações na organogênese fetal, trazendo riscos significativos ao feto (Rosemberg, 2002; Butler et al., 1972) tais como: aumento da mortalidade infantil, maiores taxas de aborto espontâneo, prematuridade, morbidade fetal, retarde no crescimento fetal, pré-eclâmpsia e ocorrência de anomalias placentárias e congênitas (Duffus et

al., 1968; Low, 1981; Lowe, 1959; Meyer, 1975; Naeye, 1978; Young, 1983). Segundo Slattery e

colaboradores (2008), o peso dos bebês de mães fumantes é cerca de 350g menor em comparação com mães não tabagistas. Esta menor massa corporal de bebês recém-nascidos pode estar associada a complicações cardiovasculares e a hipertensão arterial na vida adulta (Barker et al., 1988; Wadsworth et al., 1985; Barker et al., 1989). Entretanto, as repercussões do tabagismo, clinica ou experimentalmente, sobre a função e morfologia renal são ainda pouco estudadas.

1.3. Utilização Celular de Oxigênio e a Hipóxia

A teoria endossimbiótica, proposta por Lynn Margulis em 1981, diz que num dado momento, que não se pode precisar, organismos unicelulares eucarióticos anaeróbios foram invadidos por organismos unicelulares aeróbicos, possibilitando ao primeiro utilizar o oxigênio na otimização da produção energética. Este evento foi um grande marco na evolução, pois a partir destas células teve origem todos os organismos eucarióticos, inclusive o ser humano. Ao longo da

30

evolução o oxigênio tornou-se, então, uma das moléculas mais importantes da química orgânica e de grande relevância para os organismos aeróbicos atuando no ciclo energético e na fosforilação oxidativa da respiração aeróbia. Por isso, seu déficit no organismo pode levar a inúmeras complicações fisiopatológicas, como já descritas anteriormente. E na ontogênese não é diferente. Desde a fecundação à concepção, vários processos bioquímicos, a proliferação e diferenciação celular requerem um aporte ideal de oxigênio que garanta a sobrevida do indivíduo e o sucesso da gestação. Estudos realizados por Naeye (1981) e Rosemberg (1981) revelaram que altas taxas de monóxido de carbono e a grande concentração de carboxi-hemoglobina materna que alcançam a placenta, causam consequentemente, variáveis níveis de hipóxia fetal. Por outro lado, a nicotina age sobre os gânglios simpáticos e na medula suprarrenal liberando acetilcolina e mediando a secreção de epinefrina e norepinefrina, causam hiperatividade simpática refletida na elevação da frequência cardíaca (Neto, 1990). Lehtovirta e colaboradores (1978) demonstraram que o fluxo sanguíneo placentário é significativamente reduzido em até 15 minutos após o fumo de apenas um cigarro, sendo que o uso prolongado de tabaco produz lesões escleróticas nas pequenas artérias uterinas, modificando permanentemente o fluxo de sangue neste órgão. Dados coletados por Doppler em mães fumantes indicam alterações no fluxo da circulação uterina e umbilical causando elevação da resistência vascular e déficit de oxigenação da placenta do lado fetal aumentando a incidência de placenta prévia, descolamento prematuro da placenta - DPP e, frequentemente, necrose da decídua basal com dequitação precoce da placenta (Morrow, 1988; Beck, 1988; Naeye, 1983).

1.4. O sistema urinário

Os rins desempenham funções homeostáticas fundamentais para a adequada função do organismo. Além de excretar a maior parte dos produtos terminais do metabolismo proteico, controlam a pressão arterial, as concentrações da maioria dos constituintes dos líquidos orgânicos, a síntese de peptídeos e alguns hormônios, estão envolvidos no controle e regulação da osmolaridade, pH e temperatura corporal.

Aparentemente, tudo começou com o fenômeno evolutivo conhecido como "recapitulação", quando supostamente os organismos em desenvolvimento passam por fases que reprisariam sua ascendência evolutiva, foi incorretamente mal interpretada por muitos anos, mas aos poucos

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ajudou-nos a entender a evolução e o funcionamento de estruturas e órgãos. A recapitulação pode ser entendida pela frase "ontogenia recapitula a filogenia", sendo a "ontogenia" o processo de desenvolvimento e "filogenia" a "ordem através das quais evoluiu os ancestrais". Assim, em alguns casos as etapas do desenvolvimento de órgãos e sistemas em mamífero corresponde e precede à uma ordem filogenética que caracteriza o desenvolvimento ontogênico de ancestrais. Esta formação embriológica bizarra de três rins primordiais, onde os dois primeiros assemelham-se a de primitivos vertebrados aquáticos ou anfíbios mostram órgãos muito semelhantes a de nossos antepassados. Suspeita-se que este fenomeno evolutivo seja um processo tão integrado em que é "mais econômico" para a seleção natural seria remodelar os recursos existentes do que formar novos de novo. O rim pronéfrico, por exemplo, forneceria a chave morfológica ou química que precederia estímulos para a diferenciação de rins mesonéfricos e estes, a do rim metanéfrico. Recapitulação é um fenômeno, não um direito. Enterrado na nossa embriologia estão inumeráveis sinais dos nossos ancestrais — inúmeras provas da evolução. como Darwin anotou em A origem

das Espécies, e a usou como evidência para a evolução.

Em síntese, nos mamíferos, os rins maduros são produtos finais daqueles três órgãos excretores primordiais que se formam a partir de células do mesoderma intermediário. Assim, o pronéfro, precursor do sistema urinário adulto, é transitório, não apresenta função e é análogo aos rins dos peixes primitivos. Em um segundo momento, o mesonefro, é desenvolvido e funcional. É formado por glomérulos, túbulos mesonéfricos e ducto mesonéfrico ou ducto de Wolff. Este começa a surgir com a regressão do pronéfro e é análogo aos rins de anfíbios. O terceiro e último, metanefro, são os rins permanentes. Estes se formam do crescimento do broto uretérico, na porção final do ducto mesonéfrico, na massa mesonéfrica. O broto uretérico bifurca-se inúmeras vezes durante a maturação renal, e na ponta do broto se dá a glomerologênese, num processo complexo que começa com a transição fenotípica e genotípica de células mesenquimais em células epiteliais. Essa transição é regulada por fatores epigenéticos, onde há silenciamento de genes característicos de células mesenquimais e ativação de genes característicos de células epiteliais (Moore & Persaud 2000; Faa et al., 2011; Moritz et al., 2008).

Segundo Zimanyi e colaboradores (2002) o rim de ratos Wistar-Kyoto contêm cerca de 30 mil nefros. Cada nefro, por sua vez, tem per si só a capacidade de formar urina. Desta forma, não é necessário considerar todo o rim, mas apenas um único nefro, para explicar a função renal de depurar o plasma sanguíneo de substâncias indesejadas no momento de sua passagem ao longo do

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nefro. As substâncias que devem ser depuradas incluindo, em particular, os produtos finais do metabolismo, como ureia, creatinina, ácido úrico e uratos. Muitas outras substâncias, como íons sódio, potássio, cloreto e hidrogênio, tendem a acumular-se no organismo em quantidades excessivas, sendo também função do nefro controlar a concentração plasmática desses constituintes. O nefro é formado basicamente por um glomérulo, pelo qual o sangue é filtrado, e diferentes segmentos tubulares, com funções específicas, ao longo dos quais o filtrado glomerular sofre grandes modificações em seu trajeto sendo exposto a mais de 30 tipos de células que constituem estes segmentos tubulares até a pelve renal (Guyton & Hall, 1997). Como dito acima, a principal e mais conhecida função dos rins é a excreção de substâncias tóxicas oriundas do metabolismo, como por exemplo, a ureia e creatinina. No entanto, os rins também desempenham muitas outras funções tais como: a manutenção do equilíbrio de eletrólitos no corpo humano, tais como sódio, potássio, cálcio, magnésio, fósforo, bicarbonato, hidrogênio, cloro e outros; a regulação do equilíbrio acidobásico, mantendo constante o pH sanguíneo; a regulação da osmolaridade e do volume dos compartimentos líquidos corporais eliminando o excesso de água do organismo; a excreção de substâncias exógenas como por exemplo medicações e antibióticos; produção de hormônios tais como eritropoietina, renina , vitamina D, cininas e prostaglandinas e funções metabólicas como recuperação de aminoácidos, síntese de glicose e de ácidos graxos.

1.5. Fator Induzível por Hipóxia 1- HIF-1

Os rins, por serem os maiores responsáveis pela síntese e por secretar o hormônio EPO na idade adulta, são sensíveis a mudanças no aporte de oxigênio. Além disso, as células do segmento S3 do túbulo proximal e o segmento espesso do ramo ascendente da alça de Henle são particularmente vulneráveis à privação de oxigênio devido à atividade metabólica elevada e à atividade da Na/K-ATPase basolateral. Desta forma a regulação da produção de EPO é mediada pelo fator de transcrição induzível por hipóxia - HIF (Nangaku et al., 2007). O HIF possui, também, um papel fundamental em processos fisiopatológicos como: angiogênese, viabilidade e proliferação celular, desenvolvimento de câncer, isquemia cerebral, hipertensão pulmonar, retarde no crescimento fetal, pré-eclâmpsia e isquemia miocárdica (Fandrey et al., 2006).

O HIF apresenta-se livre no citosol. Durante a organogênese os tecidos embrionários se desenvolvem rapidamente e muitas vezes ultrapassam seu suprimento vascular, apresentando

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diferentes tensões de oxigênio. Este processo promove a ligação do complexo proteico HIF promovendo a transcrição e a síntese nuclear do fator de crescimento do endotélio vascular e de seu receptor (VEGFR) que estimula a mitogênese e morfogênese de células progenitoras endoteliais e a criação de novas redes vasculares (Freeburg et al., 2003).

HIF-1 pertence a uma ampla família de fatores de transcrição basic-helix-loop-helix-PAS, formando um heterodímero com um domínio bHLH e um domínio PAS. Compondo esta molécula temos as subunidades HIF-1α e HIF-1β (conhecido também como translocador nuclear com receptor hidrocarboneto-aromático - ARNT) (Chilov et al., 1999). A subunidade HIF-1α é uma proteína constituída de 826 aminoácidos com 104 a 116 kDa e possui uma porção N-terminal, com um domínio de degradação dependente de oxigênio, e uma porção C-terminal capaz de interagir com coativadores transcricionais (Richard et al., 1999; Semenza, 2000). A subunidade ARNT é uma proteína nuclear de 789 aminoácidos com 94kDa que participa na resposta transcricional a agentes xenobióticos (Ferreira et al., 2007).

1.6. Função da Eritropoietina – (EPO) e a Hipóxia

A eritropoietina é uma glicoproteína de baixo peso molecular (30 kDa) e foi o primeiro fator de crescimento hematopoiético clonado (Schuster et al., 1992). Estudos preliminares de Reissmann (1950) e Erslev (1953) sobre o mecanismo da eritropoiese demonstraram que a eritropoietina é capaz de induzir a produção e liberação de precursores de eritrócitos pela medula óssea e, inferiram que essa glicoproteína presente no plasma poderia ser um hormônio. Hoje, sabe-se que a homeostasabe-se de oxigênio tecidual é garantida por este hormônio endógeno chamado eritropoietina (EPO). Este hormônio induz a eritropoiese em situação de hipóxia, ou seja, promove a diferenciação de eritrócitos a partir da medula óssea (Scortegagna et al., 2005; Halvorsen et al., 2002; Wolber et al., 2002). A EPO é encontrada em baixos níveis em indivíduos prematuros ou com baixo peso. Durante o período fetal a EPO é produzida predominantemente no fígado e durante o desenvolvimento embrionário ocorre uma transição da produção da eritropoietina do nível hepático para os rins (Zanjani, 1980); Por outro lado, tem sido demonstrado que a produção de EPO é menos sensível à hipóxia a nível hepático em comparação com a produção renal (Dallman, 1984). Estas observações são confirmadas por Ohls (1994), sugerindo também uma possível imaturidade dos sensores de oxigênio renais. Schuster (1987) sugeriu como mecanismo de

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resposta à produção de EPO frente ao estímulo hipóxico, a síntese de novo, regulada pela mudança da quantidade de RNA mensageiro específico; e o sítio desta síntese localizar-se-ia na região dos túbulos renais e seu interstício.

Estudos realizados em animais nefrectomizados demonstraram que os rins são os maiores fornecedores de EPO e que sua síntese é feita por um grupo de células intersticiais corticais localizadas adjacentes ao túbulo proximal (Jacobson et al., 1957; Koury, 2005). A EPO tem também, um importante papel na modulação do desenvolvimento embrionário. Autores têm mostrado que camundongos knockout para EPO ou para seu receptor morrem no 13º dia de desenvolvimento embrionário, e que sua distribuição tissular conspícua e disseminada em todo embrião demonstra seu papel como fator de crescimento somático (Juul et al., 1998).

Os níveis de EPO, por sua vez, são controlados através da regulação da transcrição do seu gene por um promotor (Semenza et al., 1991) que possui um elemento responsivo à hipóxia (HRE), região regulatória, onde o fator induzível por hipóxia 1 (HIF-1) se liga - sitio de ligação do HIF-1 (HBS) (Wang et al., 1993). Outro elemento importante na regulação e controle gênico da EPO é o fator de transcrição 1 ligado ao tumor de Wilms (WT1), conhecido também como gene de supressão tumoral (Dame et al., 2006) e importante na formação de novos órgãos, principalmente o sistema geniturinário (Kreidberg et al., 1993; Hammes et al., 2001).

1.7. Fator de crescimento endotelial vascular - VEGF

A hipóxia é um dos principais estímulos à expressão do fator de crescimento endotelial vascular - VEGF, sendo este o mais importante mediador do desenvolvimento vascular embrionário (Gera et al., 1999; Freeburg et al., 2003). Este importante fator pró-angiogênico foi isolado pela primeira vez em 1983 e caracterizado como indutor do aumento da permeabilidade vascular 10.000 vezes mais potente que a histamina (Senger et al., 1983). Os podócitos são as principais fontes de VEGF, que é pivô no desenvolvimento vascular renal, principalmente do sistema vascular que compõe o corpúsculo glomerular (Kitamoto et al., 1997). Contudo sua expressão é mantida também nas células endoteliais de rins maduros, atuando na maturação e diferenciação de células endoteliais e podócitos (Abrahamson et al., 2003). São descritos 5 isoformas diferentes de VEGF que se distinguem em peso molecular e propriedades biológicas como a capacidade de se ligar a proteoglicanos, como a heparina e o heparan-sulfato, na superfície

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celular. Estas isoformas são produzidas por splicing alternativos do mRNA do VEGF (Houck et al., 1991; Poltorak et al., 1997).

1.8. Fator de transformação de crescimento beta 1 – TGF-β1

O TGF-β foi inicialmente descrito por De Larco e Todaro em 1978 ao qual descreviam um fator de crescimento polipeptídico - nomeada então de SGF (sarcoma growth fator), capaz de estimular a divisão e proliferação de fibroblastos em cultura, bem como promover significativas mudanças fenotípicas.

A citocina TGF-β possui três isoformas (1, 2 e 3). São expressas praticamente em todo tipo celular e se diferenciam por suas sequencias de aminoácidos, forma de ligação a seu receptor, distribuição e função (Mozes, et al., 1999). Em humanos encontramos as três isoformas, contudo, a β1 é a mais comumente descrita em mamíferos (Ask, et al., 2008; Jenkins, 2008; Ghayur & Margetts, 2013). Estas variações do TGF-β são codificadas por genes distintos e sua função biológica é determinada pela porção C-terminal da molécula. Apesar das isoformas apresentarem variações na composição e conservação, C-terminal, dos resíduos de cistina em relação ao seu precursor de 112 aminoácidos, estes se diferenciam pela cadeia N-terminal com sequencias distintas (Yu, et al., 2003). A ativação da via do TGF-β através de seu receptor induz inúmeras cascatas de sinalização intracelular em resposta a processos fisiológicos, patológicos e de desenvolvimento celular, além de promover ativação de fibroblastos, adesão de leucócitos e quimiotaxia (Schnaper, et al., 2009; López-Hernández & López-Novoa, 2012). Está também intrinsecamente ligado a doenças crônicas renais que levam a progressão da falha renal por modificações glomerulares, tubulointersticiais e renovasculares, principalmente por fibrose (Schnaper, et al., 2009; López-Hernández & López-Novoa, 2012; Mozes, et al., 1999). A integridade estrutural, ultraseletiva, que compõe a barreira de filtração glomerular pode ser seriamente acometida por altos níveis de TGF-β. Os principais componentes glomerulares – podocitos, células endoteliais e mesangiais, participam do processo fibrótico glomerular causando expansão mesangial, fibrose intersticial e consequentemente déficit na taxa de filtração glomerular (Kopp, et

al., 1996). Além disso, a expressão aumentada de TGF-β induz a apoptose podocitária por vias da

MAP (mitogen-activated protein), p38 e caspase-3, hipertrofia mensangial estimulando a produção de colágeno I e IV, laminina e fibronectina (Schiffer, et al., 2001; Das, et al., 2010; McKay, et al.,

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1993), promove a transição de células endoteliais em células mesenquimais – miofibroblastos, atuando na fibrose glomerular (Zeisberg, et al., 2008), ativa fibroblastos residentes, miofibroblastos e células epiteliais tubulares a aumentar a síntese de elementos de matriz extracelular e diminuir sua degradação nas regiões peritubulares (Grande & López-Novoa, 2009).

1.9. Fibronectina

A fibronectina é uma glicoproteína presente em todos os vertebrados, em muitos invertebrados e em poríferos (esponjas) sugerindo uma implicação importante no processo de evolução dos seres vivos (Akiyama, et al., 1981). É um heterodímero proteico de alto peso molecular sintetizado por inúmeros tipos celulares estando presente na superfície celular, fluidos extracelulares e no plasma e tem função estrutural na arquitetura da matriz auxiliando na adesão e migração celular (Ruoslahti, 1981). A fibronectina é altamente versátil por participar de múltiplas interações com outras moléculas que compõem a matriz, como colágeno e glicosaminoglicanos. Sua porção N-terminal possui um domínio de ligação com a fibrina e actina seguido por um domínio de ligação com o colágeno e na porção C-terminal possui um domínio de ligação com a heparina (Ruoslahti, et al., 1982). Nos rins a síntese de fibronectina pode ser dada por diversos estímulos, da aldosterona às células mesangiais através da via do TGF- β, bem como ativação de fibroblastos por via ERK entre outras (Inoki, et al., 2000; Chen, et al., 2013).

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2. OBJETIVOS

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2.1. Objetivos Gerais

Este estudo experimental foi desenvolvido para avaliar os efeitos do tabagismo materno sobre alguns aspectos morfológicos e funcionais renais, na prole. Considerando os efeitos danosos do tabaco descritos acima, para o desenvolvimento fetal, sobre vários aspectos, faz-se necessário um maior entendimento dos efeitos do fumo sobre a organogênese, em particular na formação do sistema urinário, mais especificamente sobre a formação vascular renal e o desenvolvimento do corpúsculo glomerular. Este foco sobre a ontogênese e repercussões renais do tabagismo torna-se relevante uma vez que a função glomérulo-tubular está intimamente envolvida no controle estrito da homeostase hidrossalina. Assim, o adequado funcionamento renal reflete na manutenção do controle hemodinâmico e da pressão arterial, atenuando a progressiva alteração na estrutura dos vasos (DHHS, 1983), e consequentemente, as repercussões vasculares futuras sobre o fluxo sanguíneo de tecidos e órgãos (Ambrose et al., 2004). As repercussões congênitas do fumo sobre a função suprarrenal também não é bem conhecida o que pode levar a modificações na homeostase de diferentes hormônios secretados por esta glândula (Neto, 1990).

2.1.1. Objetivos específicos

Nossos objetivos específicos foram:

1. Avaliar a repercussão do tabagismo materno sobre o ganho de massa corporal materna durante a prenhes; a massa corporal da prole; o crescimento e a evolução da pressão arterial da prole;

2. Entender e responder questões sobre a influência do cigarro, com inalação predominante de monóxido de carbono (CO) associadas às baixas tensões de oxigênio (O2) (Naeye, 1981; Rosemberg, 1981), sobre: (a) a formação do sistema vascular renal e do corpúsculo glomerular fetal, bem como a influência destas alterações morfológicas sobre a (b) função glomérulo-tubular renal e a (c) pressão arterial da prole, associadas ou não a modificações na expressão molecular dos fatores (d) a expressão de HIF-1, VEGF, e do hormônio EPO envolvidos na organogênese renal e, (e) a expressão de mediadores que aumentam a deposição de matriz extracelular no parênquima renal.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

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3.1. Animais

Os estudos foram realizados na proles de ratas Wistar (Rattus novergicus var, albinus,

Rodentia, Mammalia) pesando de 250 a 300g, de uma colônia estabelecida no Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica na área de Ciências em Animais de Laboratório - CEMIB da Universidade Estadual de Campinas, SP, de matrizes originarias de Hannover, Germany, 1987, e mantidos no biotério institucional. Os procedimentos experimentais seguiram as normas éticas para manipulação de animais em experimentação preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e submetida à aprovação pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal CEEA/UNICAMP sob o protocolo nº 2419-1. Imediatamente após o desmame, os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (25o_{C) e}

luminosidade (07:00h to 19:00h) com livre acesso a água e a ração standard para roedores (Purina

rat chow: Na+ _{content: 135}  ₃ _{Eq/g; K}+ _{content: 293}  ₅ _Eq/g).

Após o período de adaptação às condições ambientais de Biotério, ao atingir 10 a 12 semanas de idade os animais machos e fêmeas foram colocados juntos em gaiolas, em sistema de harém (2 ou 3 fêmeas para cada macho), durante toda a noite, e às 8h da manhã seguinte, separados e verificado por lavado vaginal a presença de espermatozoides. Quando houve a detecção da presença destes, as ratas foram consideradas no primeiro dia de prenhes. Durante todo este período e subsequentemente, continuaram alimentadas com ração padrão para roedores, recebendo água ad libitum. As mães receberam ração isocalórica e normossódica, durante a amamentação e a prole permaneceu com este mesmo tipo de ração até a 16ª semana de vida pós-natal.

3.2. Exposição dos Animais ao Fumo

Ratas Wistar foram subdivididas em 2 grupos como se segue: (1) grupo controle (Ct) e (2) grupo fumante (Fm). O método de exposição tabágica foi adaptado ao utilizado por Gomes e colaboradores 2010 e Mello e colaboradores 2005. Brevemente, os animais do grupo Fm, cinco animais de cada vez, foram colocados em uma câmara acrílica transparente conectada a um compressor mecânico, capaz de introduzir no interior desta, fumaça advinda de 5 cigarros (Figura 1). Os animais foram cuidadosamente colocados dentro da câmara acrílica e submetidos à inalação de tabaco por 30 minutos, uma vezes ao dia, durante a primeira semana. Passado esse período de

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adaptação, os animais foram acasalados conforme descrito anteriormente, e a partir de então foram submetidos à inalação de tabaco, uma vez pela manhã e uma vez à tarde durante todo o período gestacional de três semanas. Os cigarros utilizados para exposição dos animais foram da marca Hollywood (Souza Cruz), embalagem vermelha com 20 unidades. Cada cigarro contém 0,8 mg de nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de monóxido de carbono, valores descritos no rótulo do produto. O período de prenhes está incluído nestes 30 dias de exposição ao fumo.

Figura 1: Aparato de exposição tabagica.

3.3. Aferição da Pressão Arterial Caudal (PAC)

A pressão arterial da prole foi aferida na prole durante a 5ª, 10ª e 13ª semana após o nascimento, pela técnica indireta de plestimografia de cauda (Programmed Electro-Sphygmomanometer PE-300, Narco Bio-Systems USA), baseada originalmente naquela descrita por Byron & Wilson (1938) e por Williams e colaboradores (1939). Antes do procedimento em si, os ratos foram colocados em uma caixa pré-aquecida (~40°C) e deixados por 10 minutos para causar vasodilatação da artéria caudal. Assim que é retirado da caixa de aquecimento, o animal

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vigil, foi colocado dentro de um contentor fixo em uma mesa, com a finalidade de restrição dos movimentos do animal no momento da aferição. Um manguito pneumático (cuff) ao qual é anexado um transdutor (sensor) foi colocada e posicionada na porção proximal da cauda. A pressão na bainha pneumática, a qual é conectada a um manômetro de mercúrio para adequada calibração, foi progressivamente elevada à 250mmHg e em seguida procedeu-se a desinsuflação do manguito para que a pressão sistólica fosse aferida e registrada digitalmente pelo equipamento. Os resultados pressóricos foram compilados em um software IITC Life Science – BpMonWin Monitor Version 1.33. (Lovenberg, 1987). Em cada rato, a pressão arterial foi aferida três vezes, utilizando-se o valor médio das aferições e desprezando aquela cujo valor utilizando-se afaste mais da mediana.

Figura 2: Caixa de aquecimento.

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3.4. Estereologia Renal

Ao 12º dia (P12) pós-natal os rins foram extraídos cuidadosamente, de ambos os grupos (Ct e Fm), e fixados em paraformol 4% por 10 minutos, lavados com PBS e conservados em álcool 70% até o dia da inclusão em parafina.

Os rins foram incluídos em blocos de parafina e seccionados exaustivamente até o final, em cortes de 5µm, ordenados na lâmina, sequencialmente. Após a confecção das lâminas, os cortes foram desparafinizados e corados com hematoxilina-eosina. O método utilizado para contagem de glomérulos foi o Fractionator, baseado em Mandarim de Lacerda 2007. O software utilizado foi o

Image-Pro Express 6.0®.

Para tanto, determinamos o espaçamento entre os cortes coletados, ou seja, quantos cortes irão ser desprezados, de acordo com o tamanho médio dos glomérulos utilizando o calculo a seguir:

Xµm/5 = Y, onde X é o tamanho médio dos glomérulos, 5 é a espessura do corte e Y o número

de fatias a ser desprezadas. Após este processo foi feito, então, a histoquímica do material e determinado o número de glomérulos, volume do córtex e volume glomerular.

Para a determinação do número de glomérulos consideramos:

N[gl] = N[contagem] x fracionamento, onde fracionamento = peso total do rim (g) / peso

fatia (g). E, a determinação do volume do córtex, se dá por:

V córtex = ∑A x espaçamento x 5µm, a somatória da área do córtex é dada por ferramentas do

software. O volume glomerular, por sua vez, foi obtido através do:

V [gl] = V V [gl] x V córtex, o valor do V V [gl] é dado por ferramentas do software. E o valor médio calculado por:

V [gl] médio = V [gl] / N [gl]

3.5. Imunohistoquímica

Os rins de ambos os grupos foram coletados no 17ª dia embrionário (E17) e 16ª semana de vida e colocados diretamente na solução fixadora (paraformaldeido 4%). Ao retirar da solução fixadora o material foi lavado com solução PBS salina e incubado com PBS glicina por 2 horas. Após este processo os rins foram colocados em solução PBS sacarose overnight e na manhã seguinte,

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congelados com TissueTek em nitrogênio liquido, e mantidos em freezer -80°C até a confecção das lâminas.

Os rins foram cortados a 5µm em criostato Leica, e colocados em lâminas silanizadas. Estas foram submetidos à técnica imunofluorescência para detecção das proteínas da via da angiogênese, utilizando-se os respectivos anticorpos primários HIF-1α e VEGF (Rabbit policlonal - Abcam) e EPO (Rabbit policlonal - Santa Cruz) e Fibronectina (mouse monoclonal - Santa Cruz) e TGFβ1 (Rabbit policlonal - Santa Cruz) o fluoróforo Alexa 488 anti-rabbit e anti-mouse como anticorpo secundário. Os resultados foram analisados ao microscópio Olympus e fotodocumentados com software ImagePro.

3.6.Western Blotting

Cinco animais de cada grupo - Ct e Fm, foram sacrificados com 5 e 10 semanas pós-natal e os rins coletados e homogenizados rapidamente em aproximadamente 10 volumes de tampão de solubilização (10% Triton-X 100, 100 mmol/L Tris-HCl [pH 7.4], 10 mmol/L pirofosfato de sódio, 100 mmol/L fluoreto de sódio, 10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L ortovanato de sódio, 2 mmol/L PMSF, e 0,1 mg de aprotinina/ml) a 4 C em homogenizador tipo Polytron PTA 20S (model PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY) operado em velocidade máxima por 30 segundos. Os extratos foram centrifugados a 12000 rpm a 4 C em centrífuga refrigerada por 40 minutos para remover o material insolúvel e o sobrenadante será então utilizado para o ensaio. A determinação de proteína foi realizada pela técnica do biureto (Bradford) adicionando-se 3 µl do extrato em 200 µl de biureto e lidas em espectrofotêmetro (micronal 342II). Em seguida 400 µl do sobrenadante foi coletado e adicionado 100 µl do tampão de Laemmli (azul de bromofenol 0,1%, fosfato de sódio 1M pH7,0, glicerol 50%, SDS 10% e 0,015mg de DTT). As amostras foram fervidas por 5 minutos e conservadas em freezer -80ºC.

A expressão das proteínas (EPO e VEGF) foi analisada por western blotting. Amostras armazenadas da extração dos tecidos (250µg de proteínas) foram submetidas à eletroforese, sob condições redutoras, em gel de poliacrilamida. Após a corrida eletroforética, as proteínas serão eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose Hybond ECL (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% diluído em TBS-Tween (Trisma base 10mM, Tween 20 0,02%, cloreto de sódio 150mM) por 2 horas, seguida de 3

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lavagens de 10 minutos com solução basal, e então incubadas por 12 horas a 4º C com o mesmo anticorpo primário utilizado na reação imunofluorescência. Os procedimentos de bloqueio, incubação e revelação seguiram as mesmas metodologias utilizadas nas reações imunocitoquímicas, apenas a albumina bovina foi substituída por leite em pó desnatado. O peso molecular relativo das bandas foi determinado de acordo com o padrão de peso molecular marcado com biotina, também submetido a eletroforese. Análises semiquantitativas por densitometria das bandas foram realizadas pelo programa Un-Scan-It 6.1. A normalização adotada para a análise da expressão, em porcentagem, das proteínas do estudo foi feitas pela beta actina. Onde:

Valor normalização (VN)= Valor βActina (Vβ) ÷ Valor Proteína (VP). Valores dados pelo software.

3.7. Estudos histoquímicos da Expressão de Colágeno I em Tecido Renal pela

Técnica de Picrossírius.

Foram analisados o rim das proles Ct e Fm com 10 e 13 semanas de vida. As lâminas foram confeccionadas segundo o protocolo descrito anteriormente. Os cortes histológicos foram descongelados e hidratados. Seguindo, foi realizada a coloração pelo Picrossírius intercalando com ácido pícrico (13 minutos) para a análise das fibras colágenas (Junqueira et al., 1979). As lâminas foram lavadas rapidamente em água corrente e desidratadas com álcool 100% e xilol. Após estes procedimentos seguiu-se a montagem com lamínula e permount (Fischer Scientific). Nesta técnica as fibras colágenas se coram de vermelho. Para análise foi realizada a captura das imagens em fotomicroscópio acoplado a um computador usando software de análise de imagem Leica Qwin Versão 3.1 para WindowsTM _.

Foram efetuadas 10 medidas automáticas (detecção automática da cor vermelha pelo software) utilizando-se objetiva 20x, em 10 campos microscópicos da região cortical e 10 na região medular (no mínimo 4 animais por grupo) para cálculo da área ocupada por fibras colágenas (Lacorte et al., 2013).

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Figura 4: Imagem capturada do software utilizado para a quantificação de colágeno.

3.8. Testes Funcionais Renais – Clearance de Creatinina e Lítio

Os estudos sobre a função renal glomerular e tubular dos animais foram realizados na prole na 5ª, 10ª e 13ª semanas. Os estudos foram realizados em gaiolas metabólicas individuais com início dos ensaios às 17 horas. Os animais receberam LiCl 0.06 mM/100 g de peso corporal, administrados por gavagem 14 horas antes do inicio dos experimentos. A partir deste momento os ratos foram mantidos em jejum para ração sólida, ingerindo água ad libitum. Os animais foram submetidos a um período experimental de 120 minutos em estado vigil. Para a obtenção de um fluxo urinário regular e estável, neste intervalo de tempo, os animais receberam duas sobrecargas hídricas por gavagem correspondente a 5% do peso corporal, 90 e 30 minutos antes do inicio experimental. Em seguida, foi efetuada a coleta de urina destes animais através de funis adequadamente adaptados sob as gaiolas metabólicas, em tubos cônicos graduados com divisões de 0.2 mL. Posteriormente, os animais foram anestesiados com 75mg/kg de ketamina e 10mg/kg de xilasina e submetidos à coleta de sangue através de vasos da cauda. Foram coletados 1,5 mL de sangue em eppendorfs com 20 µL de heparina. As amostras foram centrifugadas a 3500 RPM por

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10 minutos. (O plasma aliquotado juntamente com as amostras de urina foram armazenadas a -20°C) para posteriores dosagens (Michelotto et al., 2002; Furlan et al., 2003; Boer et al., 2005; Menegon et al., 2008).

As variáveis da função renal avaliadas foram fluxo urinário, clearance de creatinina e lítio, fração de excreção de sódio, fração de excreção proximal e pós-proximal de sódio e fração de excreção de potássio e calculadas conforme fórmulas abaixo definidas.

Figura 5: Gaiolas metabólicas para realização das provas funcionais renais através dos clearances

de creatinina e lítio.

3.8.1. Fórmulas para Cálculo do Clearance e de Fração de Excreção 3.8.1.1. Clearance de Creatinina (CCr)

Representa a depuração plasmática da creatinina por unidade de tempo pela totalidade dos glomérulos renais funiconantes, calculada pela fórmula (UxV1_{/P), sendo U a concentração urinária}

de creatinina, V1 _{o fluxo urinário minuto e P a concetração plasmática de creatinina. Os resultados}

48 3.8.1.2. Fração de Excreção de Sódio (FENa)

Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada pela urina num deterimnado período de tempo, calculada pela fórmula (CNa/CCr x 100), sendo CNa o clearance de sódio e o CCr, o

clearance de creatinina. Os rsultados foram expressos em porcentagem (%). 3.8.1.3. Fração de excreção de Potássio (FEk)

Representa a fração de carga filtrada de postássio excretada pela urina num determinado pe’riodo de tempo, caluclada pela fórmula (Ck/CCr x 100), sendo Ck o clerance de potássio e o CCr, o

clearance de creatinina. Os resultados foram expresso em porcentagem (%). 3.8.1.4. Fração de excreção proximal de sódio (FEPNa)

Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada ao longo do túbulo proximal do nefro, calculada pela fórmula (CLi/CCr x 100). Sendo CLi o clearance de lítio e o CCr, o Clearance de

creatinina. Os resultados foram expressos em porcentagem (%). 3.8.1.5. Fração de excreção pós-proximal de sódio (FEPPNa)

Representa a fração de carga filtrada de sódio excretada ao longo dos segmentos distais do túbulos proximal do nefro, calculada pela fórmula (CNa/CLi x 100) sendo CNa o clearance de sódio e

o CLi, o clearance de lítio. Os resultados foram expressos em porcentagem (%).

3.9. Determinação das Concentrações de Sódio, Lítio, Potássio e Creatinina

Plasmáticas

As concentrações plasmáticas de sódio, lítio e potássio foram determinados por fotometria de chama (Micronal, B262, São Paulo, Brasil), A creatinina plasmática e urinária foi determinada pelo método calorimétrico por espectrofotometria utilizando-se um espectrofotômetro Micronal (Modelo 383, São Paulo).

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3.10. Análise Estatística dos Resultados

A análise estatística empregada foi o teste t de Student e a Análise de Variância (ANOVA

one-way) com Post-hoc pelo Teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como media ±

Desvio Padrão da Media (DPM). Em todos os cálculos foi fixado um nível critico de 5% (p<0,05). Os softwares utilizados em todos os testes estatísticos foram GraphPad InStat version 3.05, GraphPad

Software, San Diego Califórnia USA e GraphPad Prism 5, Copyright 1992-1998 GraphPad Software Inc.

3.11. Drogas, Reagentes e Anticorpos.

Os cigarros utilizados para exposição dos animais foram da marca Hollywood (Souza Cruz), embalagem vermelha com 20 unidades. Cada cigarro contém 0,8 mg de nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de monóxido de carbono, valores descritos no rótulo do produto. Todos os reagentes utilizados nos experimentos estão devidamente descritos acima, e os anticorpos utilizados para western blotting e imunohistoquímica foram: anticorpos primários HIF-1α (ab85886) e VEGF (ab6154) Rabbit policlonal - Abcam, EPO (sc7956) Rabbit policlonal - Santa Cruz, Fibronectina (sc18825) mouse monoclonal - Santa Cruz, TGFβ (sc146) Rabbit policlonal - Santa Cruz. O fluoróforo utilizado foi: Alexa® 488 (A11008) Goat anti-Rabbit - Life Technologies, como anticorpo

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4. RESULTADOS

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4.1. Caracterização Antropométrica e Pressórica

Os estudos mostraram que a inalação de tabaco não modificou significativamente a evolução da massa corporal das mães durante a prenhes (Figura 6). No entanto, como comumente observado em literatura (Slattery, et al., 2008) a prole de animais submetidos ao fumo apresentam uma expressiva redução da massa corporal ao nascer (figura 7). Contudo, observamos que a partir da quarta até a oitava semana de vida esta diferença na massa corporal não se mostrou estatisticamente diferente entre os grupos estudados. Já da nona à décima semana de vida a prole de animais fumantes voltou a apresentar uma diminuição significativa na massa corporal (figura 8).

Gestação

Figura 6: Evolução da massa corporal das mães durante a gestação. Os resultados estão expressos

como média ± DPM, n= 7 Controle e 8 Fumo. ANOVA post-hoc Bonferroni, nível crítico de 5% (p≤0,05).