UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DE FONTES LIPÍDICAS SOBRE OS ASPECTOS
COMPORTAMENTAIS E NUTRICIONAIS EM DUAS ESPÉCIES DE PEIXES TROPICAIS TILÁPIA (Oreochromis niloticus) E TAMBAQUI (Colossoma
macropomum)
CHARLLE ANDRERSON LIMA DE ALMEIDA
SALVADOR - BAHIA
OUTUBRO - 2018
AVALIAÇÃO DE FONTES LIPÍDICAS SOBRE OS ASPECTOS
COMPORTAMENTAIS E NUTRICIONAIS EM DUAS ESPÉCIES DE PEIXES TROPICAIS TILÁPIA (Oreochromis niloticus) E TAMBAQUI (Colossoma
macropomum)
CHARLLE ANDRERSON LIMA DE ALMEIDA
Engenheiro de PescaSALVADOR-BAHIA
OUTUBRO - 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA - UFBA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
CHARLLE ANDRERSON LIMA DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DE FONTES LIPÍDICAS SOBRE OS ASPECTOS
COMPORTAMENTAIS E NUTRICIONAIS EM DUAS ESPÉCIES DE PEIXES TROPICAIS TILÁPIA (Oreochromis niloticus) E TAMBAQUI (Colossoma
macropomum)
Orientador: Dr. Rodrigo Fortes da Silva
SALVADOR-BAHIA
OUTUBRO – 2018
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Zootecnia.
AGRADECIMENTOS
A Deus por iluminar o meu caminho....
Aos meus pais e á minha irmã, por todos os esforços que fizeram para que eu pudesse concluir meus estudos. Agradeço-lhes pelo amor, carinho, dedicação, empenho, todos os valores que me transmitiram, que fizeram de mim uma pessoa melhor e me deram forças para conseguir, hoje, estar muito perto de concluir meus estudos. Muito obrigado família.
Ao meu orientador Dr. Rodrigo Fortes da Silva, pelos ensinamentos, paciência e confiança.
Aos professores e pesquisadores Luiz Vitor, Albinati, Denise Soledade, Felipe Araujo, Edenilce Martins, Alexandre Pinheiro, Jerônimo Brito, Ana Patricia e ao professor Luciano, por contribuírem para conclusão da tese.
A minha irmã Cherlle Kally por não ter medido esforços em me ajudar de forma integral nas analises para conclusão da tese.
A FAPESB, pela bolsa de estudo e á Pós-graduação em Zootecnia.
As técnicas Núbia Amorim e Silvane da Silva Santos do laboratório de bromatologia e a Marilucia e Marcia do laboratório de Patologia clinica.
São tantas as pessoas para agradecer que possivelmente serei injusto me esquecendo de algumas delas...
Ao professor Phd. Martin Berssonart da Instituto de Ecología y Ciencias Ambientales (IECA), Facultad de Ciencias (UDELAR), Montevidéu, pela colaboração nas analises de ácidos graxos.
A todos os meus amigos e colegas que conheci ao longo dessa caminhada, Angela, Jessica, Edenilce, Jeffeson, Thiago, Bruno, John, Zé Antonio, Vanessa e a todos que fizeram e fazem parte do laboratório de nutrição e comportamento alimentar de peixe (AQUAUFRB).
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Síntese de malonil-CoA (Lehninger et al., 1995)... 16
Figura 02 - A biossíntese de três famílias de ácidos graxos poliinsaturados, Wen, & Chen,
2003 ... 19
Chapter 01: Oil sources administered to tambaqui (Colossoma macropomum): growth, body composition and effect of masking organoleptic properties and fasting on diet preference
Figura 1. The detailed scheme used in Experiment 2: Trial 1 “ability of tambaqui to select
oil sources by post-absorptive signals” and Trial 2 “effect of organoleptic properties vs. nutritional properties”. The solid line indicates the feeding period and the dashed line denotes the fasting period in days... 46
Figura 2. Daily evolution of the oil source selected in the absence of diet organoleptic
properties. Values (SD) represent the percentage of total diets selected as 100%. The grey bar indicates the fasting period ... 51
Figura 3. Daily evolution of the oil source selection “organoleptic properties vs. Capsules
content”. The grey bar indicates the fasting period. Values (SD) represent the percentage of total diets selected as 100% ... 52
CAPÍTULO 02: Influência da relação n6/n3 e da temperatura no desempenho, preferencia alimentar, parametos hematológicos e deposição corporal de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
Figura 1A. Evolução diária de relação n6/n3 selecionada na ausência de propriedade
dieta organoléptica propriedades ... 83
Figura 1B. Evolução diária de relação n6/n3 selecionada na ausência de propriedade dieta
LISTA DE TABELAS
Chapter 01: Oil sources administered to tambaqui (Colossoma macropomum): growth, body composition and effect of masking organoleptic properties and fasting on diet preference
Table 1 - Formulation and analysed centesimal composition of experimental diets ... 41 Table 2. Growth performance of the tambaqui juveniles fed experimental diets that
contained various oil sources ... 48
Table 3. Body composition of the tambaquis fed experimental diets with various oil
sources ... 49
CAPÍTULO 02: Influência da relação n6/n3 e da temperatura no desempenho, preferencia alimentar, parametos hematológicos e deposição corporal de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
Tabela 1 - Composição dos ingredientes e análise centesimal das dietas experimentais
... 71
Tabela 2 - Composição de ácidos graxos (% dos ácidos graxos totais) das dietas
experimentais ... 73
Tabela 3 - Parâmetros de qualidade da água dos sistemas de produção ... 78 Tabela 4 - Desempenho zootécnicos de juvenis de tilápia-do-Nilo, alimentadas com duas
relações n6/n3 de 3,85% e 12,02 %, submetidos a 20 °C e 30 °C ... 81
Tabela 5 - Parâmetros bioquímicos séricos de juvenis de tilápia-do-Nilo, alimentadas
com duas relações n6/n3 de 3,85 % e 12,02 %, submetidos a 20 °C e 30 °C ... 82
Tabela 6. Parâmetros hematológicos séricos de juvenis de tilápia-do-Nilo, alimentadas
com duas relações n6/n3 de 3,85 e 12,02, submetidos a 20°C e 30°C ... 85
Tabela 7 – Composição de ácidos graxos na carcaça de juvenis de tilápias do Nilo ... 86 Tabela 8 - Composição corporal total média de juvenis de tilápia do Nilo alimentados
CAPÍTULO 03: Respostas Fisiológicas de Enzimas digestiva e Intermediários Metabólicos em Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) submetidas ao Estresse
Térmico
Tabela 1 - Alterações nas atividades de AST, ALT e FAL no fígado (U/g prot) e rim (U/g
prot), e atividade das enzimas digestivas amilase (U/dL-1) e lipase (U/L-1) de tilápia do Nilo alimentadas com duas relações de ácidos graxos 12,0 e 3,8 ... 106
SUMÁRIO
Avaliação de fontes lipídicas sobre os aspectos comportamentais e nutricionais em duas espécies de peixes tropicais tilápia (Oreochromis niloticus) e tambaqui (Colossoma macropomum)
Página
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA GERAL ... 14
2.1. METABOLISMO LIPÍDICO EM PEIXES ... 14
2.1.1. Digestão, absorção e transporte ... 14
2.2. Lipogênese ... 15 2.3. Dessaturases e Elongases ... 17 2.4. Eicosanoides ... 20 2.5. β - oxidação ... 20 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 21 CAPITULO 01 Oil sources administered to tambaqui (Colossoma macropomum): growth, body composition and effect of masking organoleptic properties and fasting on diet preference Resumo ... 36
Abstract ... 37
1. Introduction ... 38
2. Material and Methods ... 40
2.1. Experiment 1 (growth and body composition): experimental design, animals, housing and diets ... 40
2.2. Experiment 2 (self-selection of encapsulated diets): experimental design, animals and housing ... 44
2.2.1. Ability of tambaqui to select oil sources by post-absorptive signals ... 44
2.3. Statistical analysis ... 46
3. Results ... 47
3.1. Experiment 1: growth and body composition ... 47
3.2. Experiment 2: (self-selection of encapsulated diet: effects of behavioural post-ingestive signals and sensorial proprieties) ... 51
4. Discussion ... 52
5. Conclusion ... 55
Acknowledgements ... 56
References ... 56
CAPÍTULO 02 Influência da relação n6/n3 e da temperatura no desempenho, preferencia alimentar, parâmetros hematológicos e composição corporal de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) Resumo ... 64 Abstract ... 66 1. INTRDUÇÃO ... 67 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 69 2.1. Condições experimentais ... 69 2.2. Dietas experimentais ... 70
2.3. Análise de Ácidos Graxos ... 72
2.4. Coleta de amostras e parâmetros de desempenho ... 74
2.5. Parâmetros Hematologicos ... 74
2.6. Índices somáticos ... 75
2.7. Análises de composição centesimal das dietas e carcaças ... 75
2.8. Seleção de dieta - Habilidade da tilápia em selecionar relação de ácidos graxos por sinais pós-absorção ... 76
2.9. Análise estátistica ... 77
3. RESULTADOS ... 78
4. DISCUSSÃO ... 87
6. Referências ... 91
CAPÍTULO 03 Respostas Fisiológicas de Enzimas digestiva e Intermediários Metabólicos em Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) submetidas ao Estresse Térmico Resumo ... 98
Abstract ... 99
1. Intrdução ... 100
2. Material e Métodos ... 102
2.1. Coleta de Material Biologico ... 102
2.2. Ensaios enzimaticos ... 102
2.2.1. Preparações dos homogeneizadores teciduais ... 102
2.2.2. Determinação da concentração da proteína tecidual ... 103
2.3. Determinações das Enzimas Digestivas ... 103
2.3.1. Atividade Lipolítica ... 103
2.4. Determinações dos Metabolitos Intermediários ... 103
2.4.1. Atividades das enzimas Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina Aminotransferase (ALT) ... 103
2.5. Atividade Fosfatase Alcalina (FA) ... 104
2.6. Análise estatística ... 105 3. Resultados ... 105 3.1. Enzimas metabólicas ... 105 3.2. Enzimas Digestivas ... 106 4. Discussão ... 106 5. Conclusão ... 109 6. Referência ... 109
1. INTRODUÇÃO GERAL
A temperatura da água é um dos fatores ambientais mais críticos na aquicultura, pois a flutuação térmica diária ou sazonal e qualquer alteração na temperatura da água de cultivo podem influenciar significamente o desempenho do animal, afetando a velocidade das reações químicas, portanto, exercendo efeito sobre o crescimento, afetando também a digestibilidade de nutrientes, sobrevivência, atividade enzimática e metabólicas (SOKOLOVA e LANNIG, 2008; LU et al., 2016) e defesas imunológicas (BOWDEN, 2008; KARVONEN et al., 2010; QIANG et al., 2013; LEE et al., 2014), com alterações na estrutura das membranas celulares e no metabolismo lipídico (HAZEL, 1984). Cada espécie possui uma ampla faixa de tolerância térmica que se encontram relacionadas com valores mínimo e máximo, contudo o crescimento é maximizado em uma temperatura considerada ideal dentro dessa faixa de tolerância térmica (BENDHACK, 2013; BERMUDES et al., 2010; DELUNARDO, et al., 2013; KATERSKY e CARTER, 2005). Estudos anteriores mostraram que o estresse causado pela temperatura ambiental pode exercer efeitos adversos sobre os peixes, incluindo comprometimento do metabolismo (SOKOLOVA e LANNIG, 2008) e uma diminuição acentuada de resistência a doenças (KARVONEN et al., 2010). Além disso, o estresse térmico pode alterar os níveis de várias substâncias, como proteína total e glicose (LIU et al., 2010), diminuir as atividades metabólicas (LU et al., 2016), bem como enfraquecer o sistema de defesa imune não específico (QIANG et al., 2013). Os peixes necessitam manter a homeostase fisiológica do organismo em temperatura ambiental desfavorável, para isso desenvolveram mecanismos de adaptação específicos para evitar ou compensar as variações térmicas (WEBER e BOSWORTH, 2005; TURCHINI et al., 2010; YAMASHITA et al., 2010; BELLGRAPH et al., 2010; SCHULTE e COLUMBIA, 2011).
Uma das principais respostas dos peixes em baixas temperaturas é aumentar os níveis de ácidos graxos insaturados em suas membranas celulares, a fim de garantir sua adequada funcionalidade (HSIEH et al., 2007; SARGENT et al., 2002; TURCHINI et al., 2010). Entretanto as exigências de ácidos graxos diferem entre as espécies e dentro de uma mesma espécie, fase de desenvolvimento e em condições ambientais desfavoráveis como mudança de temperatura (CASTELL, 1979).
Tendo em vista a necessidade de uma melhor compreensão das relações existentes entre a temperatura da água e o metabolismo, o armazenamento de lipídios/ácidos graxos suplementados e sua deposição nos peixes, isso estimulou siginificamente o esforço de pesquisas (EMERY et al., 2014; GUERREIRO et al., 2012; NG et al., 2004). Uma vez que os impactos da temperatura na nutrição lipídica de peixes necessitam de maiores esclarecimentos, de modo a colaborar para a produção de tilápia criadas em regiões onde exista uma sazonalidade térmica ao longo do ano.
Em termos comportamentais, os peixes podem manifestar diferentes necessidades nutricionais em condições ambientais desfavorável (FORTES-SILVA et al., 2016). Metodologias de alimentação, tais como alimentadores de demanda e dietas encapsuladas, estão sendo usadas para investigar a regulação da ingestão alimentar e as preferências alimentares (MADRID et al., 2009). As preferências alimentares dos peixes são motivadas por um conjunto de fatores específicos de cada espécie que incluem o própria alimento (gosto, tamanho, textura e cheiro) e as necessidades fisiológicas dos animais (RAUBENHEIMER et al., 2012; FORTES-SILVA et al., 2016).
Tem sido descrito que o animal usa mecanismos internos, tais como a absorção fisiológica de diferentes nutrientes utilizando o excesso de algumas fontes e a falta de outros, para atingir seu ponto nutricional (PEREIRA et al., 2018). Esse conhecimento herdado de auto regulação de nutrientes é chamada de "sabedoria nutricional" (FORTES-SILVA et al., 2016). O ajuste do consumo de ração envolve múltiplos mecanismos que interagem para controlar a fisiologia e o comportamento alimentar (PEREIRA et al., 2018). Entre esses mecanismos de controle, o sinal pré-ingestivo e pós-ingestivo fornece ao animal uma resposta comportamental antecipatória a alimentação (PEREIRA et al., 2018).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. METABOLISMO LIPÍDICO EM PEIXES
As rotas metabólicas de lipídios em peixes, estão envolvidas a digestão, absorção, transporte, lipogênese e β-oxidação estes acontecimentos são parecidos com àquelas observadas em mamíferos (NRC, 2011).
Para que os lipídios da dieta sejam incorporados como nutrientes para o corpo, é preciso que haja uma cadeia de processos que acontecem a partir de ingestão dos mesmos e que são: lipólise, solubilização, absorção no interior do enterócito, ré-esterificação e transporte em direção a linfa e, depois circulam para a corrente sanguínea (SARGENT et al., 2002; TOCHER, 2003; WATT et al., 2010).
A primeira etapa que o alimento sofre quando ingerido pelo peixe é a digestão, esta atividade lipolítica parece diferir entre as espécies de peixes, especialmente em relação às diferenças anatômicas do trato gastrointestinal. Na maioria das espécies de peixes, a hidrólise lipídica ocorre preferencialmente no intestino proximal e, caso existam nos cecos pilóricos (TOCHER, 2003; LÓPEZ-VÁSQUEZ et al., 2009; DODERO et al., 2011; JI et al., 2012; PRETTO et al., 2017).
Esse processo acontece por meio de enzimas de origem essencialmente pancreática que atua principalmente nas posições sn-1 e sn-3 das ligações éster de triglicerídeos (NRC, 2011). No caso dos triglicerídeos, sua digestão pode ser realizada pela da lipase glicerol éster hidrolases, (E.C 3.1.1.3) que atuam catalisando a hidrolise de ligações éster de triglicerídeos de cadeia longa, liberando ácidos graxos livres e monoglicerídeos (MENDES et al., 2013; LUNAGARIYA et al., 2014). Para os fosfolipídios, que compõem grande parte da dieta lipídica dos peixes, pelo fato de serem importantes como fonte de ácidos graxos são digeridos por enzimas especificas (TOCHER, 2003; GLENCROSS, 2009; TORSTENSEN e TOCHER, 2010). Portanto, os fosfolipídios da dieta são digeridos por enzimas específicas denominada fosfolipase A2
(PLA2). A fosfolipase A2 faz parte de uma família de enzimas definidas por sua
capacidade de catalisar a hidrólise específica da ligação sn-2 dos fosfolipídios, liberando um ácido graxo livre e um lisofosfolipídio (TOCHER et al., 2008; SÆLE et al., 2011; FUJIKAWA et al., 2012).
Finalizada a digestão, vários compostos foram degradados nos seus compostos estruturais dando origem a: ácidos graxos livres, acil gliceróis, predominantemente 2-monoacilgliceróis, mas também diacilgliceróis e glicerol resultante da digestão dos triglicerídeos, 1-acil-lisoglicerofosfolipídeo da digestão dos fosfoglicerídeos e colesterol
e longas cadeias de álcoois derivadas da hidrólise do colesterol e das ceras, respetivamente (TOCHER, 2003; BAKKE et al., 2010).
Deste modo, os produtos hidrolisados são solubilizados ou emulsionados pelas micelas dos sais biliares agregando-se para formar um pequeno glóbulo de gordura no meio da micela, sendo difundidos para a mucosa intestinal onde atravessam a membrana apical dos enterócitos principalmente por difusão passiva onde serão absorvidos (TOCHER, 2003; SANZ, 2009; BAKKE et al., 2010; GU et al., 2014).
A etapa de absorção acontece principalmente na parte proximal do intestino, região onde demonstra haver uma maior atividade lipolítica (TOCHER, 2003; CASTRO et al., 2013, 2016; PRETTO et al., 2017). Após absorção, no retículo endoplasmático liso das células da mucosa intestinal, a maior parte dos ácidos graxos e os monoglicerídios são ré-esterificados especialmente para a formação de novos triglicerídeos e se agregam a apolipoproteína, juntamente com o colesterol e os fosfolipídios formando macromoléculas denominada (quilomícrons) (SINGH et al., 2011; DODERO et al., 2011; GRIFFIN, 2013). Os quilomicrons são, então, transportados pelos vasos linfáticos do intestino para a corrente sanguínea e carregados até o fígado onde os triglicerídeos e os fosfolipídios são reagrupados em lipoproteínas, nomeadamente de lipoproteínas muito baixa densidade (VLDL) de origem hepática, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), de origem hepática, lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de alta densidade (HDL) (SARGENT et al., 2002; TOCHER, 2003; NANTON et al., 2006; DODERO et al., 2011; HERNANDES et al., 2010; GRIFFIN, 2013).
2.2. Lipogênese
A síntese de ácidos graxos em peixes ocorre principalmente no fígado (BELDA & POURCHET-CAMPOS, 1991). De forma geral todos os vertebrados compartilham de similar via lipogênica, para a biossíntese da gordura é necessária uma fonte de carbono, sendo derivada da transferência da acetil-CoA (proveniente da oxidação do piruvato como fonte de carbono) da matriz mitocondrial para o citoplasma (SARGENT et al, 2002; TOCHER, 2003; NRC, 2011). A coenzima A da molécula de acetil não pode penetrar a membrana mitocondrial. Mas o excesso de ATP na mitocôndria impede que o ciclo de
Krebs avance além do isocitrato, pela inativação da isocitrato-carboxilase. O acumulo de citrato escapa para o citosol, onde somada a coenzima A é convertido em acetil-CoA e oxalacetato (CHAMPE & HARVEY, 1997; SILVA et al., 2014). Um grupo carboxila (a partir do CO2) é introduzido na acetil-CoA para formar o malonil-CoA, esta reação,
catalisada pela acetil-CoA-carboxilase, é a etapa regulatória da síntese de ácido graxo (Figura 01), (WAKIL et al., 1983; SARGENT et al, 2002; TOCHER, 2003; SILVA et al., 2014).
Depois da síntese, a molécula de malonil-CoA é submetido a uma série de processos de condensação, desidratação e redução, facilitado pela presença de um complexo multi-enzimático da ácido graxo sintase (FAS), (SARGENT et al, 2002; TOCHER, 2003; CHIRALA e WAKIL, 2004). Para cada ciclo dois átomos de carbonos derivadas do malonil-CoA são acrescentados na porção inicial de uma molécula de acetil-CoA para formar o 16:0 (ácido palmítico), os átomos de carbono constituindo os grupos metila e carboxila do grupo acetil tornam-se, respectivamente, C-16 e C-15 do palmitato; os átomos de carbono restantes são derivados da acetil-CoA via malonil-CoA, esse ácido graxo pode sofrer sucessivos processos de elongação e dessaturação gerando formas mais complexas (FRØYLAND et al., 2000; REGOST et al., 2001; NELSON e COX, 2011).
2.3. Dessaturases e Elongases
Anteriormente acreditava-se que o processo de biossíntese em peixes acompanhava o mesmo padrão que em mamíferos. Posteriormente, verificou-se que os peixes marinhos não apresentavam a eficiência de obter tal processo de forma tão competente como a maioria das espécies de água doce. Esta diferença influenciou de
Figura 1 - Síntese de malonil-CoA (Lehninger et al., 1995).
forma expressiva as exigências de ácidos graxos entre as espécies de água doce e marinha (NRC, 2011; RIBEIRO et al., 2012).
A cadeia alimentar marinha é composta por seres ricos em ômega-3, como o EPA e o DHA. Assim, os peixes marinhos perderam, aparentemente, a capacidade de elongamento (elovl2) e dessaturação (Δ5 fad) de ácidos graxos devido as necessidades de adaptações evolutivas a um ecossistema marinho rico em EPA e DHA (MORAIS et al., 2009; MONROIG et al., 2011; NRC, 2011). Entretanto, foi encontrado a evidencias da atividade da Δ6 e Δ5 dessaturases em espécies de peixes marinhos herbívoros, o rabbitfish (peixe de coelho), e em salmonídeos e de elovl2 em uma espécie de peixe marinha carnívora, Senegalese sole (linguado), comprovam que a suposição de que os peixes marinhos não possuem tais genes não podem ser generalizadas (ZHENG et al., 2009; LI et al., 2010; MORAIS et al., 2012).
Ao contrário dos peixes de origem marinha, as espécies de água doce, de uma forma geral, possuem uma série de enzimas capazes de modificar o perfil da dieta e dos ácidos graxos, assim como dos produtos de sua biossíntese (NRC, 2011). Ressaltando aqueles pertencentes à série ômega-6, como os ácidos linoleico (C18:2 ω-6, LA) e o araquidônico (C20:4 ω-6, AA), e à série ômega-3 como os ácidos alfa-linolênico (C18:3 ω -3, ALA), eicosapentaenoico (C20:5 ω -3, EPA) e docosaexaenoico (C22:6 ω -3, DHA) (GLENCROSS, 2009; SIMOPOULOS, 2009; 2011; RIBEIRO et al., 2012).
Os vertebrados, incluindo os seres humanos, são incapazes de sintetizar LA e ALA por não possuírem as enzimas Δ12 e Δ15 dessaturases, expressas somente em plantas e alguns invertebrados desta forma quando ingeridos, LA e ALA precisam ter suas cadeias dessaturadas e alongadas para dar origem aos n-3 e n-6 fisiologicamente ativos, os ácidos graxos de cadeia longa (LC-PUFAS com 20 carbonos ou mais) isso varia entre as espécies de peixe, sendo dependente da presença e expressão de genes de dessaturases e elongases (SARGENT et al., 2002; TOCHER, 2003, 2010; MONROIG et al., 2013). As duas elongases acil graxa elongases (ELOVL2 e ELOVL5) atuam adicionando dois átomos de carbono à parte inicial da cadeia, de forma que as dessaturases acil graxa dessaturases Δ5 (FADSβD5) e Δ6 (FADSβD6), atuam oxidam dois carbonos da cadeia, dando origem uma dupla ligação com a configuração cis (SIMOPOULOS, 2009; BETANCOR et al., 2014). Provavelmente, ELOVL5 está relacionada no alongamento de C18 a C20,
enquanto a ELOVL2 parece ser a responsável pelo alongamento de C20 a C22 (MORAIS et al., 2009; SALINI et al., 2015).
O ácido oléico (C18:1 ω-9) é dessaturado por uma dessaturase Δ12 para formar o ácido linoléico (C18:2 ω-6) e uma dessaturase Δ15 para formar o ácido α-linolénico (C18:3 ω-3) não podendo ser realizados pelos peixes pela falta dessas duas enzimas, (CALDER & YAQOOB, 2009; CALDER, 2006, 2010).
A biossíntese dos ácidos graxos da família ω-3 tal como o EPA ocorre por meio de uma série de reações, podendo ser dividida em 2 etapas diferentes. A primeira é a síntese “de novo” do ácido oléico (C18:1 ω-9) a partir de acetato. A etapa é seguida pela conversão do ácido oléico em ácido linoleico (LA, C18:2 ω-6) e ácido α-linolénico (ALA, C18:3 ω-3) (WEN e CHEN, 2003; CALDER & YAQOOB, 2009). Este último é dessaturado por uma dessaturase Δ6, formando o ácido estearidonico (ETE, C18:4 ω-3). A seguir ocorre um alongamento da cadeia com adição de 2 átomos de carbono formando o ácido eicosatetraenoico (ETA, C20:4 ω-3). Este, por sua vez, é dessaturado por uma dessaturase Δ5, formando o ácido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 ω-3) (PENDER-CUDLIP et al., 2013; BLANCHARD et al., 2013; KANG & LIU, 2013). Após nova reação de alongamento forma-se o ácido gordo docosapentaenoico (DPA, C22:5 ω-3) que é dessaturado por uma dessaturase Δ4, formando o ácido docosaexanoico (DHA, C22:6 ω-3), (WEN, & CHEN, 2003) (Figura 2).
A Δ6 dessaturase é considerada enzima chave na regulação dos processos de conversão de ALA à DHA, uma vez que atua em dois pontos distintos na rota metabólica (GIBSON et al., 2011; PENDER-CUDLIP et al., 2013; BLANCHARD et al., 2013). Excesso de ácido linoléico ou ácido α-linolênico pode diminuir a produção de DHA (GIBSON et al., 2011). Como a Δ6 dessaturase atua tanto na conversão de LA a ácido γ -linoleico (18:3 n-6) quanto na conversão de ALA a ácido estereadônico (18:4 n-3), ela poderá ser escassa para conversão de ácido tetracosapentaenoico (24:5 n-γ) que após β-oxidação converte-se em DHA 22:6 n-3 (GIBSON et al., 2011).
Desta forma as duas acil graxa elongases, (ELOVL2 e ELOVL5) são responsáveis pelos processos de alongamento da cadeia carbônica (BETANCOR et al., 2014). Possivelmente o alongamento de C18 a C20 é realizada pela ação da ELOVL5, e muito pouco no alongamento de C20 a C22, enquanto essa última conversão parece ser de responsabilidade da ELOVL2 (MORAIS et al., 2009; SALINI et al., 2015). Do mesmo
modo que as dessaturases, as elongases agem produzindo tanto n-3 quanto n-6, existindo competição entre si. Na competição por substratos possui uma afinidade das enzimas por ácidos graxos n-3 em relação aos n-6, sendo, portanto, favorecida a formação de n-3 (ANDRADE e CARMO, 2006).
2.4. Eicosanoides
Segundo Andrade e Carmo (2006), o consumo dietético de ácidos graxos essenciais tem forte influência nas funções de mensageiros, receptores, liberação de citocinas, composição da membrana celular e na formação de eicosanoides.
O EPA e AA são os precursores de compostos eicosanóides em peixes e humanos, os quais têm papeis importantes na regulação dos processos fisiológicos (ANDRADE e
Figura 2 - A biossíntese de três famílias de ácidos graxos poliinsaturados, Wen, &
CARMO, 2006; KANG e LIU, 2013). Os eicosanóides são substâncias semelhantes a hormônios, incluindo as prostaglandinas (PG), trombonxanas (TXA e TXB), leucotrienos (LT), prostaciclinas (PGI) (KANG e LIU, 2013; XIAO et al., 2012). No entanto, os eicosanóides destes ácidos graxos são diferentes em estrutura e funcionalidade, e são, algumas vezes, antagônicos em seus efeitos. O substrato para formação dos eicosanóides são o ácido araquidônico (AA, 20:4 ω-6) e o ácido eicosapentanóico (EPA, 20:5 ω-3) (ANDRADE e CARMO, 2006; KANG e LIU, 2013). Quando metabolizados pela enzima COX os metabólitos derivados do AA recebem um sufixo “2” (PG2, TXA2, PGI2) e os derivados do EPA recebem o sufixo “3” (PG3, TXA3, PGI3) e quando metabolizados pela enzima LOX os metabolitos derivados do AA recebem um sufixo “4”, e os derivados do EPA recebem o sufixo “5” (Figura 03), (CALDER, 2010, 2012; KANG e LIU, 2013). Uma absorção equilibrada de EPA/AA pode prevenir disfunções de eicosanoides e podendo ser eficaz no tratamento de uma série de doenças e distúrbios metabólicas (GILL e VALIVETY, 1997; ALONSO e MAROTO, 2000).
Através da análise dos produtos da metabolização dos PUFAs, verifica-se que os PUFAs ω6 têm efeito maioritariamente inflamatório, devido à sua elevada conversão em moléculas inflamatórias e, pelo contrário, os PUFAs ω3 têm efeito maioritariamente anti-inflamatório, através da sua elevada metabolização em moléculas anti-inflamatórias e de resolução da inflamação, como as protectinas e as resolvinas (CALDER, 2006, 2012).
2.5. β - oxidação
A β-oxidação de ácidos graxos pode ocorer em duas diferentes organelas nas células por meio de um conjunto completamente diferente de enzimas, na mitocôndria e nos peroxissomos, e o potencial oxidativo de ambas irá depender da espécie, tecido em questão e da estrutura da molécula (TOCHER, 2003; SCHULZ, 2008; TORSTENSEN e TOCHER, 2010). A musculatura vermelha, fígado e coração podem ser considerados os mais importantes tecidos envolvidos com a ß-oxidação em peixes, além disto, o hábito de vida do animal está profundamente relacionado ao potencial oxidativo do tecido em questão (HASHIMOTO, 1999; KOMPARE e RIZZO, 2008). Desta forma, peixes com comportamento natatório constante oxidam ácidos graxos especialmente na musculatura (rápida disponibilidade energética para atividade locomotora), animais de hábitos
sedentários oxidam os ácidos graxos principalmente no tecido hepático (SHERIDAN, 1994; TOCHER, 2003; TORSTENSEN e TOCHER, 2010). A β-oxidação peroxisomal é beneficiada pela presença de ácidos graxos de cadeias muito longas (maiores que 22 carbonos), independente do tecido, sendo assim as organelas realizam a oxidação inicial, para em seguida estes ácidos graxos serem processados pelas mitocôndrias. O passo inicial e limitante da β-oxidação mitocondrial é realizado por uma aciltransferase específica nomeada de carnitine palmitoyl transferase-1 e 2 (CPT1 e CPT2) essas são enzimas chaves para a β-oxidação mitocondrial (HENDERSON, 1996; KOMPARE e RIZZO, 2008). Basicamente uma molécula de acil-CoA liga-se a uma de carnitina em reação facilitada por CPT1, formando o acilcarnitina, isto permite a transferência de ácidos graxos de cadeia longa do citosol para serem oxidados na mitocôndria (NELSON e COX, 2005). No interior da celula, a cadeia de ácidos graxos sofre atuação de quatro diferentes desidrogenases até ser inteiramente oxidada (KOMPARE e RIZZO, 2008). A desidrogenase específica para ácidos graxos de cadeia muito longa (como o DHA) é denominada de very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase (ACADVL), com isso CPT1 pode ser considerada uma enzima limitante na ß-oxidação mitocondrial de ácidos graxos (KOMPARE E RIZZO, 2008; TORSTENSEN et al., 2009).
A β-oxidação peroxissomal requer uma série de enzimas específicas para catalisar as reações desta via. A primeira e limitante enzima da β-oxidação peroxisomal é a
Peroxisomal acyl-CoA oxidase (ACOX) (RUYTER et al., 1997), atuando no transporte
de grupamentos acil para o interior do peroxissomo (FRØYLAND et al., 2000). O sistema de β-oxidação peroxissomal não possui a capacidade de oxidar LC-PUFA completamente, desta forma esta organela encurta a cadeia destes ácidos graxos, os convertendo em PUFA de cadeias médias, onde são transferidos por acil carnitinas para mitocôndria, onde a oxidação será concluída (HENDERSON,1996). Normalmente a taxa de oxidação decresce com o aumento da cadeia do ácido graxo. Para maior parte dos vertebrados, existe uma ordem preferencial de oxidação que é maior para Ácidos graxos saturados, seguido por Ácidos graxos monoinsaturados e Ácidos graxos polinsaturados (ANDRADE e CARMO, 2006; FORNAZZARI et al., 2007). Do mesmo jeito alguns ácidos graxos como o 16:0, 18:1n9, 20:1n9 e EPA são frequentemente oxidados, enquanto o DHA é preferencialmente retido, principalmente na musculatura, e isso se dá
devido ao alto valor biológico deste ácido graxo em diversos processos fisiológicos (TORSTENSEN e TOCHER, 2010).
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CAPÍTULO 01
Oil sources administered to tambaqui (Colossoma macropomum): growth, body composition and effect of masking organoleptic properties and fasting on diet
Resumo
O comportamento de alimentar de peixes tropicais e a ingestão de alimentos são regulados por uma série de fatores ambientais (por exemplo, estresse na aquicultura intensiva; tipo ou sazonalidade dos alimentos) e também por complexos mecanismos homeostáticos que envolvem necessidades nutricionais. Quando o acesso aos alimentos não é restrito, por ex. condições laboratoriais controladas, o crescimento e o comportamento dos peixes permanecem relativamente inalterados. Além disso, os peixes precisam de ácidos graxos na dieta e, embora alguns sejam notavelmente benéficos, como os óleos ômega-3 de cadeia longa, outras gorduras podem estar associadas a problemas de saúde, principalmente sob condições adversas. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho e a composição corporal de juvenis de tambaqui alimentados com diferentes fontes de óleo (peixe, linhaça e milho) (Experimento 1) e a influência de sinais pós-absortivos ou propriedades orossensoriais da fonte de óleo dietético na dieta (Experimento 2). Para o Experimento 1, juvenis de tambaqui (42,79 ± 0,92 g) foram colocados em dezoito tanques de 100 L (10 peixes por tanque). Três dietas (tratamentos) foram formuladas com três fontes de óleo (milho, linhaça e óleo de peixe). Três grupos de peixes foram alimentados separadamente com dietas duas vezes por dia durante 7 semanas. O experimento 2 avaliou a capacidade do tambaqui de selecionar fontes de óleo sem entrar em contato com as propriedades sensoriais da dieta. As mesmas dietas do Experimento 1 foram utilizadas, mas as dietas foram encapsuladas para isolar as propriedades sensoriais. Quarenta e oito peixes (41,26 ± 1,00 g, média ± DP) foram distribuídos em seis tanques de 250 L (oito peixes por tanque). No experimento 1, não encontramos efeitos da dieta sobre os parâmetros de crescimento, como peso corporal final, ganho de peso, consumo de ração, razão de eficiência alimentar, taxa de crescimento específica e eficiência proteica (p ≥ 0,05). No entanto, a proteína bruta corporal foi maior nos peixes alimentados com a dieta com óleo de milho (p ≤ 0,05), mas esse valor não afetou a taxa de eficiência proteica (p ≥ 0,05). Não houve diferenças entre os tratamentos para umidade, lipídios e cinzas (p ≥ 0,05). A composição de ácidos graxos do músculo refletia a fonte de óleo da dieta. No entanto, o tambaqui alimentado com óleo vegetal apresentou altos níveis de ácidos graxos poliinsaturados, enquanto a dieta com óleo de linhaça resultou em maior incorporação de
ácidos graxos n-3 altamente insaturados. No Experimento 2, os primeiros peixes não mostraram a capacidade de selecionar uma fonte de óleo sem propriedades orossensoriais, mas um desafio nutricional de privação de alimentar (10 dias) permitiu que os peixes selecionassem entre as dietas que continham fontes de óleo de peixe (p = 0,002) usando sinais pós-ingestivo. Nossos achados contribuem para o entendimento dos mecanismos relacionados ao metabolismo lipídico e ao comportamento alimentar em espécies da Amazônia de água doce, que vão além dos parâmetros de crescimento.
Palavras-chave: Perfil de ácidos graxos, Comportamento alimentar, Desafio nutricional,
Valor nutricional, Sinais pós-ingestivos, Seleção de dieta.
Abstract
Tropical fish feeding behaviour and food intake are regulated by a number of environmental factors (e.g.: stress in intensive aquaculture; type or seasonality of food), and also by complex homeostatic mechanisms that envolve nutritional requirements. When access to food is not restricted, e.g. controlled laboratory conditions, fish growth and behaviour remain relatively unaffected. Moreover, fish need dietary fatty acids and, while some are remarkably beneficial, such as long-chain omega-3 oils, other fats can be associated with poor health, mainly under adverse conditions. This study aimed to evaluate the performance and body composition of tambaqui juveniles fed different oil sources (fish, linseed, and corn) (Experiment 1) and the influence of post-absorptive signals or orosensorial properties of the dietary oil source on diet preference (Experiment 2). For Experiment 1, juvenile tambaqui (42.79 ± 0.92 g) were placed into eighteen 100 L tanks (10 fish per tank). Three diets (treatments) were formulated with three oil sources (corn, linseed and fish oil). Three groups of fish were fed each separate diets twice a day for 7 weeks. Experiment 2 assessed tambaqui’s ability to select oil sources without coming into contact with the sensorial properties of diet. The same diets of Experiment 1 were used, but diets were encapsulated to isolate sensorial properties. Forty-eight fish (41.26 ± 1.00 g, mean ± SD) were distributed into six 250 L tanks (eight fish per tank). In experiment 1, we found no effects of diet on growth parameters, such as final body weight, weight gain, feed intake, feed efficiency ratio, specific growth ratio and protein efficiency (p ≥0.05). However, body crude protein was higher in the fish fed the corn oil diet (p ≤0.05), but this value did not affect the protein efficiency ratio (p ≥ 0.05). No differences among treatments were observed for moisture, lipid and ash (p ≥ 0.05). The fatty acid composition of muscle reflected the dietary oil source. However, the tambaqui fed vegetable oil displayed high levels of polyunsaturated fatty acids, while the linseed oil diet resulted in a greater incorporation of n-3 highly unsaturated fatty acids. In Experiment 2, at first fish did not show the ability to select an oil source without orosensorial properties, but a nutritional challenge of food deprivation (10 days) enabled fish to select among the diets that contained fish oil sources (p =0.002) by using post-ingestive signals. Our findings contribute to the understanding of the mechanisms that relate to lipid metabolism and feeding behaviour in freshwater Amazon species, which goes beyond growth parameters.
Keywords: Fatty acids profile, Feeding behaviour, Nutritional challenge, Nutritional
1. Introduction
Fish oil (FO) has been used in feeding studies for farmed marine fish and some freshwater species, but it represents a finite resource (Rombenso et al., 2016). The use of alternative oils in freshwater fish feedstuff is increasing due to the rising cost of FO (Ng et al., 2013). Sustainable sources to substitute FO in fish feeds include vegetable oils, such as rapeseed oil and linseed oil, which are commonly used for nutritional studies (Costa et al., 2014; Ferreira et al., 2015). As the substitution of dietary FO for vegetable oils would lower the content of health beneficial long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) in these fish, research into finishing diets to enhance their nutritional value prior to harvest is increasing (Ng et al., 2013).
Freshwater fish are better able to desaturate and elongate the fatty acids (FAs) synthesised by plants into EPA and DHA than marine fish (Tocher, 2015). However, the use of various oil sources in tropical freshwater nutrition could have controversial effects. According to Bahurmiz and Ng (2007), the inclusion of dietary palm-origin oils compared to FO did not suffice to cause an effect on final body weight or blood parameters, such as haematocrit, but significantly diminished the total lipid digestibility of diets, due mainly to the reduced digestibility of saturated FAs by red tilapia (Oreochromis sp.). Nile tilapia brood fish reared in brackish water require a source of dietary n-3 highly unsaturated fatty acids (HUFAs) for optimum spawning performance, while plant oil (soya bean oil) may meet the requirements of brood fish reared in freshwater (El-Sayed et al., 2005). The effects of various dietary oil sources on tropical fish are poorly known. Moreover, some essential FA sources could provide animals with benefits by contributing to their health (Ferreira et al., 2015) and enhancing their FA profile, which is important for human nutrition (Ng et al., 2013). Part of the controversial results obtained in freshwater fish can be explained by the lack of a nutritional challenge, which is normally present under natural conditions. Under controlled laboratory conditions, fatty acids need not be necessarily limiting for growth to take place as freshwater fish can endogenously synthesise fatty acids, even a small amount, to recover their requirements, and generally less than saltwater fish can.
In behavioural terms, fish can express nutritional needs under environmental challenging conditions. Fish feeding preferences are influenced by a set of
species-specific factors that include food itself (taste and smell) and animals' physiological requirements (Raubenheimer et al., 2012). The mechanisms by which fish regulate their intake and use oil sources are particularly important to aquaculture because this knowledge enables aquaculture practitioners to avoid inefficient feeding regimes. It has been reported that animal uses inner mechanisms, such as physiological differential absorption of nutrients or overeating some sources and undereating others, to reach its nutrient target. This inherited auto-regulation ability is called ‘nutritional wisdom’ (Fortes-Silva et al., 2016). The feed intake regulation involves multiple mechanisms that interact to control both physiology and behaviour. Among these control mechanisms, the pre-ingestive and postingestive signal provides the animal with an anticipatory behavioural response to food. Methods that evaluate the nutrition and feeding behaviour of fish have been developed. The diet encapsulation method was initially validated in European seabass (Dicentrarchus labrax) (Rubio et al., 2003) and subsequently in other species, such as sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) (Almaida-Pagán et al., 2006, 2008) and tilapia (Oreochromis niloticus) (Fortes-Silva et al., 2011, 2012). These studies strongly suggest that in such species, diet preferences are a direct result of post-ingestive influences rather than the of the orosensorial characteristics of food, and these influences also regulate feed intake.
A flexible diet is a striking aspect of tropical riverine ichthyofauna. Most species respond to seasonal and spatial environmental cues by switching from one food item to another when the relative abundance of the available food resource fluctuates. These considerations highlight the difficulty of establishing reliable species-specific feeding patterns in tropical teleosts (Abelha et al., 2001). Tambaqui (Colossoma macropomum) is an omnivorous species from the Amazon and Orinoco rivers that feeds on fruit and seeds (Vidal et al., 1998), and is the most extensively cultivated native species in Brazil and several other South and Central American countries (Fiúza et al., 2015). Tambaqui carcasses present high lipid accumulation, which reflects the peculiar feeding behaviour associated with seasonal food variability. Nutrient deprivation periods are common in many wild fish life cycles and appear to be tolerated by many species as cultured fish can also endure such situations (Tian et al., 2013). Food deprivation can trigger behavioural and physical changes in juvenile and adult fish, but does not impair their capacity to grow (Souza et al., 1997). Under intensive culture conditions, fish are subject to increased stress
owing to water quality and health conditions, which can lead to lack of appetite. Thus research into lipid metabolism during fasting and re-feeding is important, and nutritional challenges have been designed to assess the nutritional needs of fish behavioural responses, as has a wellness component.
If the hypothesis of interesting intensive aquaculture and environmental feeding conditions is supported by the way animals choose nutrients, it must surely provide a new perspective as to how oil sources should change throughout the cultivation period. These nutritionalbehavioural requirements may have a welfare component, but may not necessarily influence fish performance. This work aimed to evaluate the effect of three oil sources (fish, corn and linseed) on the growth parameters, body composition and behavioural capability of tambaqui (C. macropomum) to detect oil sources after nutritional challenges and to isolate the sensory properties of diet.
2. Material and Methods
The animals used in those studies were approved by the Ethics Committee of Animal Welfare of the Federal University of Lavras, protocol number 036/2015.
2.1. Experiment 1 (growth and body composition): experimental design, animals,
housing and diets
This experiment was conducted at the Lavras University (Lavras, Minas Gerais, Brazil). Juvenile tambaqui, obtained from the Aquaculture Center-UNESP-Jaboticabal-Brazil, with an average initial weight of 42.79 ± 0.92 g were randomly placed into eighteen 100 L tanks at a density of 10 fish per tank, which provided a total of 180 fish. The feeding trial was conducted in an indoor recirculation system, with 10% water replenished daily. Firstly, fish were fed a commercial diet (Pirá 36, Guabi, Brazil, 36% crude protein) for 2 weeks to acclimate to the experimental condition. During the experimental period, fish were fed ad libitum experimental diets twice a day (at 08:00 h and 16:00 h) for 7 weeks.
The experimental diets (divided into three treatments and six replicates: diets made with corn, linseed and fish oil) were formulated to meet tambaqui’s nutritional
