Estudo de interações entre o emprego de compostos químicos com o tratamento térmico no controle da atividade da polifenol oxidase em frutas e hortaliças

Texto

(1)ESTUDO DE INTERACÕES ENTRE O EMPREGO DE COMPOSTOS QUÍMICOS COM O TRATAMENTO TERMICO NO CONTROLE DA ATIVIDADE DA POLIFENOL OXIDASE EM FRUTAS E HORTALICAS. MARIA EUGENIA MARQUES DE ALMEIDA Engenheira de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. JOÃO NUMES NOGUEIRA. Dissertação aoresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz". da Universidade de São Paulo, oara obtenção do titulo de Mestre em Agronomia, Área de e Ciência Concentração: Tecnologia de Alimentos.. PIRACICABA Estado de São Paulo - Brasil Março - 1991.

(2) Ficha catalogrifica preparada pela Seção de Livros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP Almeida, Maria Eugenia Marques de A447e Estudo de interações entre o emprego de compostos químicos com o tratamento térmico no controle da ati vidade da polifenol oxidase em frutas e hortaliças. Piracicaba, 1991. 112p. Diss. (Mestre) - ESALQ Bibliografia. 1. Fruta - Bioquímica 2. Fruta - Escurecimento enzÍmico - Controle 3. Hortaliça - Bioquímica 4. Hor taliça - Escurecimento enzÍmico - Controle 5. Polife nol oxidase I. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba CDD 634.

(3) li.. ESTUDO DE INTERACÕES ENTRE O EMPREGO DE COMPOSTOS QUíMICOS COM O TRATAMENTO TERMICO NO CONTROLE DA ATIVIDADE DA POLIFENOL OXIDASE EM FRUTAS E HORTALICAS ;. MARIA EUGENIA MARQUES DE ALMEIDA. Aprovada em: 15.04.1991 Comissão julgadora: Prof. Dr. João Nunes Nogueira. ESALQ/USP. Prof. Dr. Paulo Roberto Cantarelli. ESALQ/USP. Prof. Dr. Luiz Edurardo Gutierrez. ESALQ/USP. Prof..

(4) iiL. Aos 11geus. pai s. ODILA e ANTONIO FRANCISCO pelo estimulo e. incentivo.

(5) AGRADECIMENTOS A autora expressa seus agradecimentos as. se-. guintes pessoas e entidades: Ao Prof. Dr. João Nunes Nogueira. pela. dedi-. cada orientação e apoio. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico -. CNPq~. pela concessão do auxilio. pes-. quisa. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Nlvel Superior - CAPES,. pela. concessão. das. de. Pessoal. bolsas. de. estudo. Aos professores do Departamento de Ciência Tecnologia Agroindustrial da Escola Superior de. e. Agricultura. "Luiz de Queiroz". Aos funcionários do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Escola Superior de. Agricultura. "Luiz de Queiroz". Ã Sra. Vera. Bononi~. pesquisadora do Instituto. de Botânica pela doação de amostras de cogumelos. Ã Estação. Instituto Agronómicp de. Experimental Campinas. e. de ao. Pariqueraçú~. pesquisador. Furtado do Instituto Biológico pelo auxilio na obtenção palmitos.. do. Edson dos.

(6) "/. Ã Dra.. Són~a. quisadora do Instituto de. Dedeca da Silva de de. Tecnolog~a. Campos. Alimentos. ... oesITALl. pelo incentivo e orientação na obtenção das matérias primas. - Aos colegas do curso Ciência e Tecnologia de Agricultura. "Lu~z. Alimentos. do. da. Escola. em de. de Queiroz" e em especial à Engenheira. Ge. auxilio. na. realização. das. palm~to.. -. As. bibl~otecárias. Beatriz Helena. Eliana Maria Garcia Sabino da Escola tura "Luiz de Queiroz" pelo auxilio na rências. pós-graduação Superior. Alimentos Shirley Berbari pelo anál~ses. de. Superior correção. 6iongo. de. ==. Agriculdas. refe-. bibl~ográficas.. -. Ao Sr. Jorge Luiz. Diorio~. pelo. serviço. de. datilografia. E a todos que contribuiram para a deste trabalho.. realização.

(7) SUMÁRIO Página. LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS. .. .. . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . .. .. . . . ... . . . . . . . . .. ..... . ... ... viii xiii. RESUMO .................................................................. ;{ i v. SUMMARY. .............................................................. xv i. 1 • INTRODUÇÃO .•••...•••.•.•.••••..•.•••.••..••••••. 01. 2. REVISÃO DE LITERATURA .••••...••.••..•...••...... 05. 2.1.. Consideraç~es. gerais •.••••••••••••••••••••. 2.2. Métodos de controle do escurecimento. 05. enzi-. mico ............................................................ 18. 2.2.1.. Inativaç~o. pelo calor ••••••.•••••••. 20. 2.2.2.. Inativaç~o. por compostos quimicos ••. 22. 2.2.2.1. Anidrido sulfuroso ..•..•... 22. 2.2.2.2. Ãcidos. 27. 2.2.2.3. Outros compostos qui micos •. 30. 2.2.2.4. Outros meios de inativação.. 38. 3. MATERIAL E. M~TODOS. 41. 3.1. Matéria prima. 41. 3.2. Análise para caracterização. 3.4.. matéria -. da. prima ................................................. 42. Determinação da atividade da PFO. 42. Condiç~es. da PFO. em que foi estudada. a. atividade. ....................................................... 44. 3.5. Análise Estatistica......................... 47.

(8) "ii.. Página. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO •.......••••••....•....... 49. 4.1. Análises da matéria-prima •••••••••.•••••••. 49. 4.2. Atividade da polifenol oxidase. nas. frutas. e hortaliças "in natura" •••.••..•••.••••••. 49. 4.3. Comportamento da atividade das enzimas .•••. 52. 4.4. Efeito dos métodos de inativação enzimica •. 54. 4.4.1. Polifenol oxidase em frutas .••.••••. 54. 4.4.2. Polifenol oxidase em hortaliças .••••. 66. 4.5. Efeito comparativo dos métodos de. inativa79. ção enzimica por tipo de fruta 4.6. Efeito comparativo dos métodos de. inativa-. ção enzimica por tipo de hortaliça 5.. CONCLUS<:SE:5. REFER~NCIAS. 90. •••••••••••••••••••••••••••••••••••••. 96. BIBLIOGRÁFICAS ..••••....•••••..••...••. 100.

(9) 'r!. iii.. LISTA DE FIGURAS FIGURA N° 01. Pâgina Efeito da adição de ácido ascórbico (0,1%) e ácido citrico. (O~2%). na atividade da po-. lifenol oxidase em frutas 02. Efeito da. adiç~o. ácido citrico. 55. de ácido ascórbico. (0~2%). (O~1%). e calor (70°C/2 minu-. tos) na atividade da polifenol oxidase frutas. 03. em. ....•.••....•......••..•.......•.•.. Efeito da. adiç~o. de ácido ascórbico (0,1%). e EDTA (30 ppm) na atividade da. polifenol. oxidase em frutas . . . . . . . . . . . . . • . . . . • . . . • .. 04. Efeito da. adiç~o. EDTA (30 pm) e. Efeito da. calor (70°C/2. adiç~o. minutos)~. de ácido ascórbico. ácido citrico (0,2%) e EDTA. na. Efeito da. adiç~o. ácido cítrico. (30 ppm). na. (0~27.). , EDTA. (30 ppm) e capoli-. fenol o;·ddase em frutas Efeito da. adiç~o. 59. de ácido ascórbico (0,1%),. lor (70 o C/2 minutos) na atividade da. 07. 58. (O,1%)~. atividade da polifenol oxidase em frutas. 06. 57. de ácido ascórbico (0,1%),. atividade da polifenol oxidase em frutas.. 05. 56. de ácido ascórbico. 60. (0,1%). e metabissulfito de sódio (0,057.) na atividade da polifenol oxidase em frutas ..•••... 61.

(10) FIGURA N° 08. Página Efeito. da adição de ácido ascórbico. metabissulfito de sódio. (0~05%). (70°C/2 minutos) na atividade. e. (0,1%)~. calor. da polifenol. ox idase em f ru tas .•••..•••.•••••..••.••••••. 09. Efeito da adição de ácido ascórbico ~cido. c1trico (O,2%). sódio (0,057.). na. e. (0~1%)~. metabissulfito. atividade. da. de. polifenol. oxidase em frutas. 10. 6.3. Efeito da adição de ácido ascórbico. «(i~l%)~. ácido citrico. (O~2%)~. metabissulfito de só-. dio (0,057.) e. calor (70°C/2 minutos) na ati-. vidade da polifenol oxidase em frutas .•••••. 11. ó2. 64. Efeito da adição de ácido ascÓrbico (0,17.), e ácido citrico. (0~27.). na atividade da poli-. fenol oxidase em hortaliças Efeito da adição de àcido ascórbico (0.1%). ácido citrico (0,2%) e calor. (70°C/2 minu-. tos) na atividade da polifenol. oxidase. em. hortal iças • . • • . . • . • . . . . • . . • . . • . . . . . . • . . . . •. 13. Efeito da adição de ácido ascórbico (0.1%). e EDTA (30 ppm) na atividade. da. polifen01. oxidase em hortaliças ••••..•.••.•.•....••• 14. c::·a. 69. Efei to da adição de ácido ascórbico (O .1%) • EDTA (30 ppm). e calor. (70°C/2 minutos). na. atividade da polifenol oxidase em hortaliças. 70.

(11) FIGURA No 15. Página Efeito da adição de ácido ascórbico (0,1%), ácido citrico (0,2%) e EDTA (30 ppm) na atividade da polifenol oxidase em hortaliças.. 16. 71. Efeito da adição de ácido ascórbico (0,1%), ácido citrico (0,27.), EDTA (30 ppm) e calor. (70°C/2 minutos) na atividade. da polifenol. oxidase em hortaliças •••••••••••••.••••••• 17. Efeito da adição de ácido ascórbico. 72. (0,1%). e metabissulfito de sódio (0,05%) na atividade da polifenol oxidase em hortaliças ••• 18. Efeito da adição de ácido ascórbico (0,1%), metabissulfito de sódio. (0,057.). (70°C/2 minutos) na atividade. e. calor. da polifenol. oxidase em hortaliças •••••••••••••.••••••• 19. 74. Efeito da adição de ácido ascórbico (0,1%), ácido citrico (0,27.) sódio (0,057.). na. e. metabissulfito. atividade. da. de. polifenol. oxidase em hortaliças .•••••••••••••••••••• 20. 73. 75. Efeito da adição de ácido ascórbico (0,17.), ácido citrico (0,2%), metabissulfito de sódio (0,057.). e. calor. (70°C/2 minutos). atividade da polifenol oxidase em. na. hortali-. ç as • . . . . • • • . • . • . . • . . • • . . . • . • • • . • • . . . . • • . . .. 21. Efeito dos métodos de. inativação. 76. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em abacate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 81.

(12) FIGURA N° 22. Página Efeito dos métodos de. inativação. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em banana 23. Efeito dos métodos de. inativação. na atividade da polifenol oxidase Ana. 24. inativação. na atividade da polifenol oxidase Fuj i. 25. enzimica em. maçã. ••.••.•••••.•.•.•••••••..•••..•••••••••. Efeito dos métodos de. inativação. na atividade da polifenol oxidase. em. maçã. Efeito dos métodos de. inativação. na atividade da polifenol oxidase Golden . . . . . . . • .. ~. em. maçã. inativação. em. maçã. Efeito dos métodos de. inativação. Efeito dos métodos de. inativação. Efeito dos métodos de. inativação. 88. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em batata. 30. 87. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em pêssego 29. 86. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em pêra. 28. 85. enzlmica. . . . . •. . . . • . . . • •. . . . . . . . ••.. Efeito dos métodos de. 84. enzimica. Gala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 26. 83. enzimica. ....................................... Efeito dos métodos de. 82. 90. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em berinjela . . . . . . . . • . . . . . . . • . . . . . • . • . . • . . . . . . . . . •. 91.

(13) .... .1....1.. •. FIGURA N°. Página Efeito dos métodos de. inativaç~o. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em me 1 a. cogu-. ••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••. Efeito dos métodos de. inativação. 92. enzimica. na atividade da oolifenol oxidase em palmito (base) 33. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Efeito dos métodos de. inativação. enzimica. na atividade da polifenol oxidase em palmito (ponta). 94.

(14) LISTA DE TABELAS TABELA N° 01. Página pH e. sólidos solúveis das frutas lIin na-. tura". 02. pH e. 50. sólidos solúveis das hortaliças "in. natura" 03. Atividade da polifenol oxidase nas. 50. fru-. tas e hortaliças "in natura" 04. Caracterização do comportamento da polifenol oxidase em frutas •••....••••.•.•.. 05. 51. 52. Caracterização do comportamento da polifenol oxidase em hortaliças ••••••••••••. 53.

(15) :{~. v.. ESTUDO DE INTERAÇOES ENTRE O EMPREGO DE COMPOSTOS QU!MICOS COM O TRATAMENTO POLIFENOL. T~RMICO. NO CONTROLE DA ATIVIDADE DA. OXIDASE EM FRUTAS E HORTALIÇAS Autora: Maria Eugenia Marques de Almeida Orientador: Prof. Dr. João Nunes Nogueira. RESUMO. O presente trabalho teve como objetivo encontrar métodos alternativos mais eficientes para o controle da atividade da polifenol oxidase (PFO) visando especialmente a substituição ou redução do nlvel de S02 em frutas. e. liças quando empregado para aquela. Com. finalidade.. hortaeste. propósito foi estudado o efeito ae interações entre o emprego de compostos qUlmicos (ácido. ácido. ascórbico~. c1trico.. EDTA e metabissulfito de sódio) e destes com o calor. (70°C/. 2 minutos) no controle da atividade da PFO. nas. frutas e hortaliças em que o. enzlmico. titui. sério. problema. rio. escurecimento processamento:. seguintes. abacate. cons(Persea. a.ericana Mill.) vara Fortuna; banana (Husa cavendishi) vara. Nanica; macã Fuji~. (Hallus. sylvestris. Mill.)~. variedades. Gala e Golden; pêra (P),rus betulaerolia). pêssego (Prunus persica cv. ($olanu. tuberosu. l1lelongena. L.),. L.),. vara. vulgaris),. vara. Super. Bintje; F100 ,. vara. Ana~. vara d'água;. ~. Real;. berinjela cogumelo. batata (Solanum. (Agaricus.

(16) xv.. bisborus); palmito (Euterpe edulis Mart.). (Juçara).. A PFO do abacate e berinjela foi mais tente aos métodos de inibição empregados.. ~esis-. De um modo. geral. a PFO proveniente das frutas apresentou maior resistência. à. inativação que a PFO das hortaliças. Tanto para a PFO de. frutas~. Quanto para a. hortaliças o método de inativação enzímica menos eficaz a adição de ácido ascórbico e EDTA. incluiu a adição de ácido. O. ascórbico~. método. ácido. mais. d.. de foi. eficaz meta-. trico~. bissulfito de sódio e calor. Os resultados mostraram que o. método. alter-. nativo mais adequado para substituir o 502 na inativação PFO das frutas (exceto. abacate). empregou a. de. combinação. ácido. e. hortaliças asCÓrbico. cítrico lO,2%) e calor (70 °C/2 minutos).. foi. (O,1'l.),. o. da que. á.cido.

(17) xvi.. INVESTIGATIONS INTO THE INTERACTION EFFECTS OF CHEMICAL COMPOUNOS ANO HEAT TREATMENT ON POLYPHENOL OXIOASE ACTIVITY DF SOME FRUITS ANO VEGETABLES Author: Maria Eugenia Marques de Almeida Adviser~. Prof. Dr. João Nunes Nogueira. SUMMARY. The objective of this work was to effects of alternative methods on polyphenol. study. the. (PPO). oxidase. activity aiming to substitute ar to reduce the leveI of. S02. when used to control the. and. vegetables.. enzymic. With this purpose the. chemical campounds (ascorbic sodium. brawning. citric. the. effects. EDTA. acid, (70°C/2. treatmen~. on PPO activity were studied in. fruits. interaction. acid~. and heat. me~abissulfite). in. following. of and. minutesJ. fruits. and. vegetables, in which the enzymic browning represents a great problem: banana. avocado (Husa. (Persea. cavendishi). sysvestris Mill.),var. Ana, (Pyrus. betulaefolia. cv.vulgaris)~. Mill). aaericana. vara. Nanica,. Fuji~. Gala. vara. apple. (Hal1us. Golden-~. (Prunus. bisporus). (Juçara).. and. vara. Super. heart-of-palm. pear. persica. vara Real, potato (Solanu. tuberosu. L.). (Agaricus. edulis Mart.). Fortuna~. and. peach. Bintje, egg plant (Solanu • • elongena L.) mushraam. vara. vara F100,. (Euterpe.

(18) >:v ~ i. The PPO of avocado and e9g plant showed ;-esistance vegetables.. inacti '.Ia tion. t::J. than. ::Jther. the. «. more. ~;-uits. ~nd. In general fruits PPO showed more resistance to. inactivation than the vegetables PPO. The less efficient method to. inactivate. fruits and vegetables PPO was the adittion of ascorbic and. EDTA.. combination. The. most. efficient. ascorbic. of. method. included. citric. acid~. acid~. the acid the. sodium. metabissulfite and hea.t trea.tment. The method. most. results. suitable. showed. that. to substitute. the. inactivate fruits (except avocado) and the one which employed citric "C/minutesj.. acid. the (O,2'l.). alternative. use. of. vegetables. combination a.nd. the. heat. of. 502. PPO. to was. ascorbic. acid. treatment. (70.

(19) 1.. 1.. INTRODUCÃO As caracteristicas organolépticas de um. ali-. mento são a principio o que determina a aceitação deste pelo consumidor.. o. primeiro fator que faz com que. rejeitemos um alimento é. o seu. aspecto,. sua. aqui a cor exerce um papel fundamental. original de frutas e hortaliças após. aceitemos. ou. aparência,. e. Preservar. a. processamento. tanto de fundamental importância para. a. cor por-. é. aceitabilidade. do. produto.. o. escurecimento enzimico é a principal. ração de cor que ocorre em frutas processamento.. e. hortaliças. alte-. durante. o. De acordo com PONTING (1960) e REED & UNDER-. KOFLER (1966) a polifenol oxidase é. uma das principais enzi-. mas responsáveis por aquele escurecimento.. Vários. tem sido utilizados para controlar a atividade da oxidase e atualmente um dos métodos de menor custo. métodos polifenol e. maior. eficácia é o uso de anidrido sulfuroso (dióxido de enx6fre). O dióxido de alimento, dependendo de uma. enx6fre série. quando de. adicionado. variáveis. temperatura e presença de compostos ativos,. sofre. como. ao pH~. diversas.

(20) reaçaes que o mudam da forma livre para a que não tem efeito sobre a enzima. adicionado este. aditivo,. para. No. combinada~. forma alimento. controle. do. quando. ~. escurecimento. enzimico ou outro fim, ocorre um equilibrio entre as. formas. livres e as formas combinadas dissociáveis (TAYLOR et. alii,. 1986b). O sulfito ingerido com o alimento pelo nismo humano tem como via de metabolismo oxidação pela enzima sulfito oxidase à então eliminado por via urinária. sulfito~ mo~. orga-. principal, o. sulfato~. a. sua. qual. é. Com relação à toxidez do. estudos demonstraram que a niveis normais de consu-. a maioria da população está. adversa.. Entretanto,. livre. de. recentemente,. a. qualquer segurança. reação do. uso. continuo de sulfitos em alimentos tem sido questionada baseada em fatos que indicam a ocorrência de reações alér- gicas em individuos senslveis,. principalmente em pessoas asmáticas. (TAYLOR & BUSH, 1986). Numerosos casos de crise. asmática. relatados na literatura médica desde 1977.. têm. Estas. que ocorrem em individuos portadores de asma e com lidade a sul fitos podem. ser. implicar em riscos de vida Academia Americana de. suficientemente (TAYLOR. Alergia. e. et. reações sensibi-. severas. alii,. Imunologia. sido. para. 1986b).. A. registrou. casos de óbitos nos E.U.A. atribuidos a ingestão de sul fitos por asmáticos susceptiveis também tem. sido. implicados. a. estes em. uma. compostos. variedade. Sul fitos de. outras.

(21) '"'. ~'.. adversas como a urticária e. reaç~es. a. diarréia.. Segundo. TAYLOR et alii (1986a), a população em risco nos E.U.A. soma a 180.000 individuas. Devido a ocorrência destas. reaç~es. seis agentes sulfitantes: di6xido de enxófre, s6dio~. bissulfito de. bissulfito. de. s6dio~. sódio. e. adversas~. sulfito. bissulfito de potássio,. metabissulfito. de. de. metaque. potássio~. possuíam "status" GRAS (Generally Recognised as Safe). desde. 1959, foram reestudados pelo FDA, que em julho de 1986 estabeleceu um novo regulamento para uso destes compostos. O uso de agentes sulfitantes. ficou proibido para frutas e. liças "ir) natura", embaladas ou não.. horta-. Para alimentos proces-. sados contendo acima de 10 ppm de 502 total,. a presença. aditivo deve ser declarada nos dizeres da rotulagem do duto.. do pro-. Esta nova regulamentação entrou em vigor a partir. agosto de 1986 (TAYLOR et. alii~. 1986a).. Um substituto completo para os fitantes que possua todas as propriedades e. agentes. seria. contrar.. substitutos. Até o presente nenhum dos tão. sadores tem realizado é. identificar. dificil. eficiente. sulfitos numa ampl.a faixa de aplicação.. O. sul-. caracteristicas. desejáveis deste grupo de aditivos,. tem se mostrado tecnologicamente. de. que. substitutos. de. en-. estudados, quanto os. os. pesqui-. para. cada. aplicação individual exercida pelos agentes sulfitan- teso.

(22) 4.. Os estudos à respeito da toxidez dos sulfitantes prosseguem e especula-se que tal. agentes. ~lasse. de. ~di-. tivos será provavelmente proibida para uso em alimentos. num. futuro pró:-dmo.. o objetivo deste trabalho. é. fornecer. alternativos mais eficientes para controlar a polifenol. oxidase~. visando especialmente a. redução do nivel de concentação do 502 em liças~. atividade. aa. substituição. ou. frutas. e. horta-. quando empregado para aquela finalidade. Para tanto foi estudado o efeito. ç~es. métodos. entre o emprego de compostos quimicos e. calor, no controle da. atividade. da. de. destes. polifenol. interacom. oxidase. o. em. frutas e hortaliças em que a enzima representa maior problema..

(23) 5.. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1.. Consideraç~es. gerais. Quando as frutas e hortaliças. s~o. sujeitas. à. desorganização na sua estrutura natural, tais como descascamento,. corte~. trituração. e. injúrias. o. diversas~. produto. sofre mudanças, incluindo o desenvolvimento de uma cor escura não natural.. Estas. devido a. catalizadas por enzimas.. reaç~es. alteraç~es. na cor são em sua. O rompimento das células do que as. enzimas~. naturalmente. com diversos substratos. que~. presentes~. vegetal. entrem. na presença. de. senvolvem no produto uma coloração escura.. maioria. permite. em. contato. oxigênio, Esta. de-. reação. em. geral ocorre rápida e intensamente e consiste na oxidação de compostos fenólicos à. artaquinonas. pela. ação. de. uma. ou. múltiplas enzimas (MATHEW & PARPIA, 1971).. De acordo com PONTING (1960) e KOFLER. (1966)~. a maioria das. reaç~es. escurecimento em frutas. e. polifenol oxidase. embora~. (PFO)~. REED&. UNDER-. enzimicas, que causam o. hortaliças,. é. segundo. catalizada VOIROL. pela. (1972).

(24) 6.. WHITAKER. (1976)~. também. possa. ocorrer. a. participação. de. outras enzimas como a peroxidase. As. polifenol. oxidases. (o-difenol:oxigênio. oxidoredutase; EC 1.10.3.1) pertencem redutases.. grupo. das. oxido. Esta classe de enzimas possui uma série de nomes. triviais provenientes de seu tirosinase~. ao. cresolase~. substrato. preferencial~. como. ortodifenol oxidase e cate-. fenolase~. colase (REED & UNDERKOFLER, 1966;. ESKIN. et. alii,. 1971. e. WHITAKER, 1972). A enzima polifenol distribuida na. natureza~. maioria das plantas, altas. concentraç~es. oxidase. sendo provavelmente. estando. presente. em batatas,. encontrada. na. particularmente. em. bananas,. 1971. e. VÁMOS-VIGYÁZó,. A localização da enzima na célula vegetal depende da. espécie, idade e grau de maturidade. enzima encontra-se maçãs. amplamente. pêssegos,. abacate e cogumelos (ESKIN et alii, 1981).. está. pr~nc~palmente. Nas nos. folhas. verdes. cloroplastos.. a enzima foi localizada quase que exclusivamente. cloroplastos e mitocóndrias.. Espinafre e. ervilha. taram elevado teor da enzima em seus cloroplastos (. a Em nos. apresenJOSLYN,. 1970 e VÁMOS-VIGYÁZó, 1981). A. distribuição. oxidase em diferentes partes das. da. atividade frutas. e. da. polifenol. hortaliças. sido objeto de pesquisa por diversos autores.. tem. Ao realizarem. estudo sobre a atividade da polifenol oxidase. VÃMOS-VIGIÃZó. &. NADUV~RI-MARKUS. (1982) verificaram que a. distribuição. da.

(25) 7.. atividade enzimica nos tecidos se dá de forma não em vários cultivares de péra.. O. mesmo. roi. homogênea. verificado. em. pêssego e os autores afirmaram que tal desuniformidade devese à estrutura fibrosa do mesocarpo. Segundo MONTGOMERY & SGARBIERI. (1975)~. a ati-. vidade da polifenol oxidase de banana é mais concentrada interior da polpa e no. Verificaram também. imaturas. maturação~. de um modo. adjacente. tecido. geral~. que~. a atividade. sementes. às. durante. no. o. periodo. enzimica. de. decresce. na polpa e aumenta na casca. WEAVER enzimica. em. (1978),. verificou. batatas das variedades. Kennebec e Red La Soda foi. mais. que. White. elevada. a. atividade. Rose, nas. Norchip,. extremidades. inferior e superior do tubérculo e menor no centro deste. variedade. Lenampe~. por sua. vez~. apresentou. atividade. A. enzi-. mica semelhante em todas as partes do tubérculo. O grupo prostético da polifenol oxidase cobre~. estando presente na proporção de um. por molécula. combinação do. A. hidroxilação. cobre~. de. monofen6is. o. de. cobre. ocorre. pela. no estado cuproso, com o oxigênio mole-. cular e sua conversão para o estado cúprico difenol.. átomo. o. é. cobre pode ser removido e a. e. enzima~. será inativada. Porém sua reativação poderá. formação deste. ocorrer. do modo. com. a. adição de cobre ( REED & UNDERKOFLER, 1966 e JOSLIN, 1970). A polifenol oxidase pode catalizar dois tipos diferentes de reações, ambas envolvendo compostos. f~n6licos.

(26) Q. w.. e oxigênio molecular:. hidroxilação. (a). ortodiidroxifenóis correspondentes e diidroxifenÓis. a. (b) oxidação. (ESKIN. ortoquinonas. monofenóis3.. et. de. or~o-. alii,. 1971;. As enzimas provenientes de diferentes. fontes. 1972 e. WHITAKER~. dos. VÃMOS-VIGYÃZó~. 1981). possuem estas duas formas de atividades em. diferentes. pro-. que estão sujeitas a mudanças durante isolamento. porç~es~. purificação. das. enzimas.. Todas. as. possuem atividade sobre ortodifenóis. tratos enzimicos,. como~. por. polifenol A. de. exemplo~. cogumelos possuem ambas as atividades.. ( WHITAKER, 1972 e. VÃMOS-VIGYÃZó~. dos. em. ex-. maçãs. batatas~. enzimas provenientes de manga, banana, pêra e têm sido registradas como não atuantes. oxidases. maioria. Por outro. e. lado,. cereja. e. as doce. monoidroxifenóis. 1981).. A reação de hidroxilação pode. ser. ilustrada. pela oxidação da L-tirosina a 3.4 diidroxifenilalanina. :ES-. KIN et alii. 1971):. CH CH(NH )COOH. I. 2. I~I V I. OH L-Tirosina. CH CH(NH )COOH. 2. 22. 1. +. (O]. hidro:-!Í lação. I~I HO~ I. OH. (i). 3.4-dihidroxifenilalanina.

(27) 9.. o. segundo tipo. de. reação. catalizada. pela. polifenol oxidase é a oxidação de um ortodifenol a uma ortoquinona, como se vê na ilustração. ainda não é. O mecanismo desta reação. completamente conhecido.. liga-se primeiro à do o-di fenol •. enzima~. Sabe-se que o oxigênio. ocorrendo em seguida. Como exemplo, podemos. citar. a. a. formação. oxidação. do. catecol à o-benzoquinona (WHITAKER, 1972): OH. O. N. I. ~/OH. Il). +. I~I. [O]. catecol. HO. +. 2. o-benzoquinona. Uma vez formada a quinona, as. subse-. reaç~es. quentes ocorrem espontaneamente e não mais dependem da sença da enzima e do oxigênio.. Embora. sejam compostos coloridos (vermelho a. as. ortoquinonas. reaç~es. já. marrom-avermelhado)~. reação de escurecimento não pára neste ponto. Estes tos participam de. pre-. a. compos-. secundárias, gerando a formação de. compostos com coloração mais escura (ESKIN et alii, 1971). As. reaç~es. secundárias,. considerando-se. es-. pecificamente o escurecimento enzimico são, segundo MATHEW & PARPIA (1971):. (a). reaç~es. acopladas de. as quinonas podem promover a oxidação potencial de oxidação-redução é. outros de. substratos,. pequeno, de modo. compostos não são oxidados diretamente pela. substratos~. que. polifenol. cujo estes oxi-.

(28) 10. dase e, dentre eles, temos as antocianinas,. os. de. aminoácidos. flavonas~. proteinas.. os compostos polifenÓlicos com (b). complexação. com. aminoácidos. glicosideos. e. proteinas;. esta é a reação secundária mais importante, pois na. maioria. dos produtos alimenticios a intensificação da cor durante escurecimento ocorre após esta complexação.. ou. o. (c) condensação. e polimerização das quinonas; ocorre a formação de poli meros amorfos, insolúveis e altamente estáveis. Frutas e. hortaliças possuem uma ampla. dade de compostos fen6licos.. Entretanto, apenas. relativamente pequena destes. fen6is. para a polifenol oxidase.. Os compostos. que são usados como substrato são os nóis.. serve. uma. como. mais. varieparte. substrato. abundantes. monofen6is. Os substratos naturais mais importantes da. e. e. o-difepolifenol. oxidase em frutas e hortaliças são as catequinas, os és teres do ácido cinâmico, 3,4 diidroxifenilalanina (DOPA). e. tiro-. sina (ESKIN et alii, 1971 e VÁMOS-VIGYÁZó, 1981). A extensão na qual os naturalmente. presentes,. contribuem. substratos para. enzlmico de frutas e hortaliças, depende. o da. fen61icos,. escurecimento localização. e. concentração do substrato, assim como da intensidade de. cor. dos pigmentos macromoleculares obtidos das. Uma. quinonas.. diferença fundamental na composição em fen6is hortaliças é o fato de que, enquanto as antocianidinas e. leucoantocianidinas são. muns da maioria das frutas, elas somente. de. frutas. catequinas,. pro to-. constituintes ocorrem. e. co-. excepcio-.

(29) 11. nalmente em hortaliças.. Em. nenhum dos. cogumelos~. compostos. fenólicos presentes em plantas superiores pode ser do, sendo seus substratos principais. a. tirosina. detectae. L-DOPA. 1981).. (VÃMOS-VIGYÃZ6~. A contribuição de um dado substrato. endógeno~. para o escurecimendo enzimico, depende da sua concentração e d~. natureza dos outros substratos presentes no. presença de. traços. de. substrato. tem. n~o. tecido.. A. consequências,. enquanto concentraçaes de 100 mg/kg podem resultar em sérias alteraçaes.. A polifenol oxidase possui. ficos dependendo de sua origem.. substratos. especi-. A especificidade pelo subs-. trato depende não apenas do gênero e do cultivar, mas também da localização da enzima dentro da própria fruta liça.. o. ou. pH em que a atividade é determinada afeta. ferência pelo substrato.. A. seletividade. monoidroxifenóis parece ser maior que para (VÃMOS-VIGYÃZ6~. na. pre-. enzima. para. ortoidroxifenóis. 1981). PRABHA & PATWARDHAN. centração de substratos oxidáveis que a catequina. da. horta-. foi. o. (1980)~. em. substrato. estudando a. abacate,. principal. verificaram da. oxidase, proveniente da casca, polpa e semente.. polifenol Observaram. que a epicatequina também contribui grandemente para curecimento, embora não se apresente vada.. Por outro lado. em. ram que a polifenol oxidase da. polpa. de. o. concentraç~o. (1980),. IADEROZA et alii. con-. abacate. esele-. verificadas. va-.

(30) riedades Wagner e Quintal. apresenta maior. atividade. tendo. como substrato o catecol.. o. ácido clorogenico. e. o. catecol. foram. substratos que proporcionaram maior atividade para. a. fenol. et. oxidase~. (1980) •. proveniente de manga, segundo. PARK. os. poli3.1ii. De acordo com PRABHA & PATWARDHAN (1986a) , na casca. e polpa de. banana da variedade Robusta, o. único. endógeno sujeito à oxidação foi a dopamina. também cita a dopamina como substrato. substrato. GALEAZZI. preferencial. (1979) para. a. polifenol oxidase da banana. Recentemente,. &. WESCHE-EBELING. (1990), estudando a ação da polifenol. oxidase. verificaram que a maior atividade enzimica. MONTGOMERY de. morango,. ocorreu. para. o. substrato catequina. VAMOS-VIGYÁZó (1981), cita as seguintes tas e hortaliças e. seus. respectivos. ciais: pêra, àcido clorogenico,. ;:;referen-. substía~os. catecol. e. fru-. àcido. cafe~co;. batata, àcido clorogenico e catecol; berinjela. àcido clorogênico; cogumelo, catecol, DOPA e dopamina. A. polifenol. oxidase. possui como substrato preferencial. da o. fava. catecol.. pirogalol, segundo WILD-ALTAMIRANO (1969). PRABHA & PATWARDHAN (1985a) , a enzima oxida preferencialmente a. fenol oxidase. de. pêssego. varia. baun~lha. seguido. De. a.cordo. proveniente. epicatequina,. cis-clorogenico e da catequina.. de. do com. de. maçã. seguida. do. ácido. A especificidade. da. poli-. segundo. a. variedade. em.

(31) 13. De acordo com VÃMOS-VIGYÃZó &. estudo.. variedades seguintes. Fay. Halford~. substratos:. Elberta. e. MIHÃLYI. (1976). Redhaven. D-catequina,. catecol. as. ~. os. poss~em. e. pirogalol. respectivamente. VÁMOS-VIGYÃZó & GAJZÁGó. (1978)~. estudando. especificidade pelo substrato da polifenol oxidase variedades de maçãs encontraram, para king e. Jonatham~. atividade. máxima. as. para. de. duas. variedades o. a. Star-. 4-metilcatecol~. embora a primeira variedade tenha apresentado uma velocidade de reação 1,6 vezes mais elevada. como segundo. substrato. o. catecol. preferencial. para. apresentou-se ambas. varieda-. des. A ocorrência de múltiplas formas de polifenol oxidase tem sido citada por vários autores. múltiplas denominadas isoenzimas. apresentam. suas propriedades fisicas, quimicas e exemplo,. mobilidade. Estas. diferenças. cinéticas. eletroforética,. formas. como,. espeCificidade. em por pelo. substrato!,. pH ótimo,. temperatura ótima, efeito inibidor de. diversos. agentes. (CONSTANTINIDES. &. BEDFORD,. 1967;. GOODENOUGH, 1978 e GALEAZZI, 1984) Alguns pesquisadores múltiplas diferentes. formas enzimas. enzimicas com. questionaram. representam. funç~es. uma. similares,. formas da mesma enzima que diferem entre si,. se. familia ou. de. múltiplas. formando. unidades (CONSTANTINIDES & BEDFORD, 1967 e MATHEW & 1971).. estas. sub-. PARPIA,.

(32) 14. MONTGOMERY & SGARBIERI polifenol oxidase de parte interior da. 2ncontraram. banana~. polpa~. (1975)~. 9. estudando. a. isoenzimas. na. exterior. da. 8 isoenzimas na parte. polpa e 10 isoenzimas na casca. FLURKEY & JEN (1978), estudando tiplas de polifenol oxidase de. pêssegos~. isoenzimas apresentaram rápido grau de dendo do grau de. maturaç~o. (1973) mostraram a presença. fraç~o. duas. atividade. DE2 era responsável por. 3~1.. as. interconversão~depen-. formas. oxidase em cerejas da variedade Royal Ann. minada DEI continha 45% da. múl-. verificaram que. BENJAMIN &. da fruta. de. formas. de. A. MONTGOMERY polifenol. fraç~o. enzimica. deno-. total. e. da atividade.. O sistema da polifenol oxidase em tecidos cogumelos, batatas e DES & BEDFORD (1967).. maç~s. o. a. por. foi estudado. de. CONSTANTINI-. cogumelo apresentou 9 isoenzimas, a. batata exibiu 11 formas enzimicas, enquanto que a. maç~. (var.. Golden Delicious) mostrou 3 isoenzimas. GOODNOUGH(1978), por outro lado, ao estudar a. polifenol. oxidase. cogumelo, encontrou apenas 3 isoenzimas, ferença na especificidade. proveniente. de. todas possuindo di-. pelo substrato que variava. entre. DOPA, catecol e tirosina. O pH para a atividade ótima da polifenol oxidase varia com a fonte enzimica (espécie e variedade), de maturação, substrato doador, pureza da enzima e solução. tamp~o. composição utilizada.. casos, este valor situa-se entre pH. ~,O. de. grau. isoenzimas,. Na maioria dos. e 7,0. As isoenzimas.

(33) 15. podem ter pH de atividade ótima bem distintos. pH. ótimo~. fontes~. observada para. a. polifenol. oxidase. deve-se à presença de isoenzimas com. rentes de pH ótimo (AYLWARD. &. A de. de. algumas. valores. 1969;. HAISMAN~. faixa. dife-. MIHÃLYI. et. alii, 1978 e VÁMOS-VIGYÁZó, 1981).. Segundo McCORD & KILARA (1983),. o. pH. ótimo. para a polifenol oxidase proveniente do cogumelo é 7,0. mesmo valor foi. encontrado. para. a. polifenol. cereja (var. Royal Ann), de acordo com MERY (1973).. oxidase. O de. & MONTGO-. BENJAMIN. IADEROZA et alii (1980), estudando a atividade. da polifenol oxidase de. abacate. das. variedades. Quintal, encontraram os seguintes valores para. Wagner. a. atividade. ótima: pH 6,5 a 7,0 e pH 4,0 a 4,5 respectivamente. fenol oxidase extraida de manga possui atividade faixa de pH 5,6 a 6,0 (PARK et. alii~. e. A poli-. máxima. na. 1980).. KAHN (1975) encontrou para o extrato enzimico bruto de abacate das variedades Fuerte, Horeshim e Lerman pH ótimo entre 5,3 e 6,7 para os substratos DOPA.. De acordo com MIHÁLYI et. alii. 4-metil-catecol. (1978),. a. e. polifenol. oxidase de maçã, da variedade Starking, exibiu um valor. bem. definido de atividade máxima a pH 6,1, enquanto, a variedade Jonathan apresentou pH ótimo de 6,2.. As batatas. apresenta-. ram atividade enzimica máxima na faixa de pH 6,0 a 6,5 e pêssegos, na faixa de pH 6,0 a 6,4.. os.

(34) A berinjela apresenta polifenol atividade maxima na faixa de pH. 5~O. oxidase. a 5,2 para. com. substrato. Q. de acordo com estudos realizados por KNAPP. (1965).. A pêra da variedade Bartlett, segundo VÃMOS-VIGYÃZó. (1981)~. catecol~. tem pH Ótimo igual a. 6~2.. A temperatura Ótima de atividade tem sido bem menos investigada que o pH Ótimo oxidase.. Os dados até. ent~o. para. a. enzima. obtidos indicam. polifenol. que. tempe-. a. ratura ótima depende essencialmente dos mesmos fatores que o pH (VÁMOS-VIGYÃZó, 1981). A atividade da polifenol oxidase (var. Redhaven) aumenta na faixa de 37°C e diminui até 45°C. do valor máximo.. temperat~ra. 3°C de. As maçãs dos cultivares Jonathan e. 30°C e 25°C. Delicious~. para. ~axima. o. Para a. respectivamente.. a 501.. Star~cidc. var1e-. a temperatura ótima encontrada foi 30°C.. segundo SATJAWATCHARAHONG et alii. (1983).. A polifenol oxidase de tecol como. de. A 3°C a atividade é cerca. king apresentaram atividade enz1mica. dade Red. pêssego. Para abricós, a enzima atinge sua ativida-. de maxima a 25°C.. clorogênico a. do. substrato~. batata~. utilizando ca-. tem sua atividade máxima a. 22°C. (MI-. HÁLVI et alii, 1978). A susceptibilidade. ao. escurecimento,. tendência ao escurecimendo enz1mico em frutas tem sido relacionada diretamente ao teor de dase presente, ? concentração de comoostos. e. ou. a. hortaliças. polifenol fenÓlicos. oxiendÓ-.

(35) 17.. genos no. tecido~. fatores.. ou a uma combinação especifica destes. Os dados. publicados. em. literatura. dois. divergem. em. relação a qual dos dois fatores, enzima ou substrato, exerce papel fundamental na determinação da taxa do produto (KAHN, 1975; GÁJZÁGO alii~1977;. et. de. alii,. VÁMOS-VIGYÁZ6 et alii, 1977;. escurecimento. 1977;. GOLAN. &. WALTER. et. PURCELL~. 1980 e JAYARAMAN et alii, 1982). Diferentes taxas de escurecimento das por diferentes variedades de maçã foram. apresenta-. correlacionadas. ao teor de compostos fenólicos (PRABHA & PATWADHAN,. 1985b).. Dentre as variedades estudadas, a Aumburi apresentou maior taxa de escurecimento e maior teor. de. compostos. fenólicos. totais. De acordo com COSETENG & LEE (1987), dos sete cultivares de maçã estudados nem todos apresentaram a. mesma. relação entre o grau de escurecimento e. enzi-. mica.. a. atividade. Em alguns cultivares (Classic Delicious,. R.I.. ning, McIntosh e Cortland) a atividade da polifenol estava diretamente relacionada Entretanto, para outros. ao. cultivares. grau. de. Greeoxidase. escurecimento.. (Empire,. Rome,. Golden. Delicious), o grau de escurecimento foi relacionado ao. teor. de compostos fenólicos presentes. Recentemente, SAPERS et alii (1989a) caram que o variedade. baixo Atlantic. grau de. escurecimento. em. verifi-. batatas,. em relação à variedade Russet. está grandemente relacionado a seu baixo conteúdo de. da. Burbank, ~enóis.

(36) 18. totais e tirosina e. ~. em menor extensão, à. bai;·:a atividade da. enzima polifenol oxidase. A. tendência. ao. escurecimento. enz1mico. pêras pode ser relacionada ao teor de polifenóis, mente à. concentração de ácido clorogênico. e. em. especial-. catequina,. de. acordo com RANADIVE & HAAR (1971). A diferença na taxa de escurecimento de diferentes cultivares de abacate foi diretamente. relacionada. atividade da polifenol oxidase, segundo KAHN (1975). de acordo com VÁMOS-VIGYÁZó et alii a atividade enzimica e o se a. que. taxa de escurecimento de um determinado. relacionada à. Porém,. (1977), a relação. teor de substratos é. à. entre. determina. cultivar. está. atividade enzimica ou ao teor de polifenóis.. 2.2. Métodos de controle do escurecimento enzimico. A inibição do escurecimento enzimico, vendo a enzima polifenol oxidase, com aplicação do calor ou quimicos.Já que. o. o. é. emprego. escurecimento. em. obtida de. principalmente. certos. questão. envol-. compostos. envolve. reação enzimica, fatores como concentração de substrato,. uma pH. do meio e disponibilidade de oxigênio têm influência na taxa de inibição.. Entretanto, na prática, alguns destes. são de dificil controle durante. processamento. dos alimentos (MATHEW & PARPIA, 1971).. e. fatores estocagem.

(37) 19.. o escurecimento enzimico pode ser não só pela inativação enzimica, mas também pela de um dos dois fatores. necessários' para. a. eliminação. reação. polifen6is), ou pela reação com os produtos mados, visando a inibição dos compostos. prevenido~. e. primários. coloridos. for-. secundá-. rios produzidos na etapa não enzimica do escurecimento. maioria dos casos, não é. fácil a. distinção. dos. Na. diferentes. mecanismos de ação de um inibidor do escurecimento enzimico, alguns inibidores agem simultaneamente sobre a. uma vez que,. enzima, o substrato ou produtos. da. (VÁMOS-VI6YÁZó,. reação. 1981). A seleção de variedades de matéria prima menor. tendência. ao. escurecimento. um. é. processo. viável, embora s6 seja eficaz a longo prazo. este processo envolveria a seleção de menor teor. de. substrato. fen6lico,. Para. variedades, em. vez. de. com. também frutas~. contendo atividade. enzimica reduzida, uma vez que, para a maioria dos casos.. o. nível de atividade enzimica tem. a. menor. influência. taxa de escurecimento (MATHEW & PARPIA, 1971).. sobre.

(38) 20. 2.2.1.. Inativação pelo calor. A aplicação do calor tem sido um dos. métodos. o. mais utilizados para inativar a polifenol oxidase. é. comumente. aplicado. pasteurização~. em. processos. como. branqueamento. como pré-tratamento de vegetais que apertização~. conservados por. a. inativação. enzimica. exposição. depende. teor de enzima presente, variando para cada em particular.. do. Sabe-se que uma diminuição no. oxidase. pode. ser. valores de pH abaixo de 3. e. ser. inativada,. neces-. pH. fonte. resulta em decréscimo da atividade enzimica e fenol. vão. e. congelação ou desidratação.. A temperatura e o temoo de sários para. calor. do. enzlmica. valor que. e. do a. pH. poli-. irreversivelmente,. a. (REED & UNDERKOFLER, 1966).. necessário ter. um. controle. tempo de aquecimento quando se aplicam. altas. cuidadoso. do. temperaturas.. de modo a se obter a inativação enzlmica, evitando-se. alte-. significativas no sabor e textura do alimento.. En-. raç~es. tretanto, é. importante enfatizar a necessidade. de. se. efe-. tuar uma rápida inativação térmica da enzima, principalmente se a. faixa de temperatura não for muito. elevada,. alguns casos, o aquecimento lento pode resultar em. pois,. em. ativação. enzimica (MATHEW & PARPIA, 1971). A polifenol oxidase não pertence a classe enzimas extremamente estáveis ao calor.. Ao. pequeno periodo de exposição na faixa de. 70°C. de. contrário,. um. 90 o C.. na. a.

(39) 21. maioria dos casos é suficiente para total de sua função catalitica. destruição. parcial 1981).. (VÃMOS-VIGYÃZõ~. McCORD & KILARA (1983), investigando a. esta-. bilidade da polifenol oxidase de cogumelo, verificaram. apÓs 10 minutos de exposição a. diferentes. 70 o C, não foi detectada. que,. temperaturas,. enzima permaneceu ativa até 45°C a pH 6,5.. 70°C houve um declinio gradual. ou. Entre. na. atividade. atividade. enzimica.. e,. 45°C acima. a e de. Entretanto,. para pH 3,5, a enzima foi inativada rapidamente a 40°C. Segundo GALEAZZI & SGARBIERI (1981), a. poli-. fenol oxidase proveniente de banana foi completamente inatitivada a 95°C após 5 minutos de. exposição.. alii (1978), ao trabalharem com. palmito,. verificaram. após 20 minutos de incubação. 75°C,. enzima. a. a. et. BERNHARDT. oxidase teve apenas 48% de sua atividade perdida,. que,. polifenol mas. para. 100°C ela foi rápida e totalmente inativada. A polifenol oxidase de pêssego. possui. menor. estabilidade térmica que a de outras frutas e hortaliças. variedade Cortez possui 3 isoenzimas. com. valores. de. A. meia. vida a 55°C de 5,5, 14,1 e 14,6 minutos, enquanto uma quarta. isoenzima mais resistente permaneceu estável a 55°C minutos mas foi rapidamente inativada a 76°C. por. 50. (VÃMOS-VIGYÃZõ. & MIHALYI, 1976). SILVA & NOGUEIRA (1983a), estudando o do calor na. atividade. frutas e hortaliças. da. polifenol. oxidase. constataram que a pêra. em (var.. efeito diversas D'Ãgua).

(40) foi a fruta que demonstrou maior sensibilidade ao tratamento térmico. dade foi. minutos~. Após aquecimento a 70°C/2 inibida~. de inibição.. 90~5';~. da ativi-. enquanto que a 80°C/2 minutos, houve. A polifenol oxidase de. banana. também. total inativação quando submetida a 90°C durante 2. A enzima extraida da maçã. também. foi. sensivel. 100% sofreu. minutos. ao. calor~. sendo totalmente inibida a 80°C par 2 minutas.. 2.2.2. Inativação por compostos químicos. A inativação da polifenol. oxidase. obtida com produtos químicos agindo na própria um dos substratos ou produtos da reação.. A. pode. ser. enzima~. com. escolha. agente inibidor do escurecimento em alimentos é. de. um. restrita. e. dependente de requisitas especiais como ausência de toxidez, ausência de efeitos negativos sobre. sabor~. odor. e. textura,. tecnológica (VÃMOS-VIGYÃZó, 1981).. viabilidade económica e. 2.2.2.1. Anidrido sulfuroso. o. dióxido de enxófre e seus derivados são. compostos qui micos mais frequentemente usados em industriais.. Pode. ser. empregado. na. forma. as. práticas. gasosa,. como. dióxido de enxófre, ou na forma de soluções aquosas diluídas de sais de sulfito.. o. gás. penetra. com. maior. rapidez. ~o.

(41) 23.. tecido de frutas e facilmente. hortaliças~. manuseadas~. mas. as. soluçe5es. podendo ser empregadas. são. na. forma. banho por imersão ou ser aplicados por pulverização 1973; E5KIN et. mais de. (POTTER~. 1971).. alii~. Há vantagens e desvantagens no uso do 502, sulfitos~. Podem ser. especialmente, nos casos onde o. usados~. emprego do calor resultaria em alteraçe5es textura e desenvolvimento Também possui. de. propriedades. sabor. desfavoráveis. estranho. antissépticas. e. no. pode. conferir. sabor. estranho. de. produto.. contribui. preservação do teor original de vitamina C do produto. desvantagem,. ao. na Como. alimento,. clarear a sua cor original e acelerar a corrosão das. latas.. Outra séria desvantagem está no aspecto nutricional, pois 802 tem efeito destrutivo sobre a tiamina. (Vit.. tringindo seu uso a alimentos. desprovidos. Apesar destas desvantagens, o. 302. processamento de. alimentos,. ou. devido. vitamina.. amplamente. é. res-. Bi) ,. desta. o. usado. principalmente. eficácia e baixo custo (E8KIN et alii, 1971; MATHEW. à. no sua. & PAR-. PIA, 1971; WOODROOF & LUH, 1975). Embora os sul fitos sejam eficientes. no. trole do escurecimento enzimico, seu modo de ação é xo e o mecanismo exato da inibição da reação não pletamente elucidado.. o. 802 pode. gênio presente e tornando-o então~. agir,. indisponível. pode reagir com as ortoquinonas,. limerização e. consequente. formação. de. à. comple-. está. reduzindo. o. oxidação;. impedindo pigmentos. con-. sua. comoxiou, po-. escuros.

(42) 24. (EMBS & MARKAKIS, 1965; MATHEW & PARPIA, 1971). ceira corrente propóe que a ação do 502 sobre a enzima MERY~. (HAISMAN~. 1974. e. Uma. ocorre. ter-. diretamente. &. 5AYAVEDRA-SOTO. MONTGO-. 1986). Segundo EMBS & MARKAKIS. (1965)~. os. sul fi tos. inibem o escurecimento pela combinação irreversivel ortoquinonas para formar produtos incolores.. o. com. agente. bidor neste tipo de reação é gradualmente consumido.. as ini-. Desta. forma, a sua ação depende da sua concentração, assim como da natureza e concentração dos substratos fenólicos. presentes.. Se estiverem presentes apenas monofenóis, uma baixa tração de sul fitos será eficiente, pois. as. concen-. quinonas. serão. formadas a uma velocidade relativamente baixa e grande parte do S02 está disponivel para agir diretamente sobre a (MUNETA, 1966).. Na presença. de. orto-diidroxifenóis,. ocorrer total consumo do S02, antes que haja tivação enzimica. escura é. Em tais casos, a. formação. retardada e atenuada, mas não. completa da. enzima pode ina-. coloração. inteiramente. elimi-. nada (HAISMAN, 1974). Recentemente,. SAYAVEDRA-SOTO. &. MONTGOMERY. (1986), utilizando a polifenol oxidase proveniente de melo, pêra e banana, realizaram um estudo sobre o de ação do S02.. mecanismo. Concluiram que o S02 age diretamente. a enzima e propuseram a seguinte reação:. cogu-. sobre.

(43) 25. [EJ + HSOs -""'" (EJ. - S02a. .l... onde: [EJ -. ---'S-;;'. (EJ. + HSO .l... 3. concentração inicial da enzima ativa 2-. provável. (EJ.-SOa .l... inativa e [EJ. .l... reação~. HSO. formado. entre. enzima. a. concentração da enzima inativa •. o esta. complexo. valor do pH exerce grande influência. pois a concentração. da. espécie. responsável pela inibição da polifenol a diminuição do pH.. HSO ,. 2~0. aumenta. oxidase~. Para valores de pH acima de 7,. mg/ml.. Diminuindo-se o. inibição enzimica e, ao chegar em pH 4, a. oH~. que. 9. a. bição enzimica só ocorreu quando a concentração de foi superior a. sobre é. com ini-. sul fitos. aumenta-se. inibição. é. a. pra-. ticamente instantânea e completa para a concentração de 0,04 mg/ml.. Os. autores. inibição enzimica é. citados. ainda. afirmam. que. irreversivel.. A inibição direta da enzima pelo S02 piciada,. utilizando-se. conjuntamente. o. ácido. especialmente se houver uma escolha adequada ção relativa destes dois inibidores. ascórbico não ocorre a formação do na;. esta. consequentemente~. da. pro-. ascórbico, concentra-. Na presença comple:<o. é. de. ácido. sul f i to-quino-. há uma maior concentração. de. sulfito.

(44) 26.. remanescente para inativar a enzima (EMBS &. 1965 e. MARKAKIS~. HAISMAN ~ 1974).. o. efeito do. na. S02~. inibiçâo. da. Dolifenol. oxidase de algumas frutas e. hortaliças~. foi. SILVA & NOGUEIRA (1983b).. Os. observaram. polifenol. oxidase. analisadas~. da. autores dentre. banana~. da. 91~1%. atividade. desta. enzima. .ç.-. polifenol oxidase proveniente do completamente inibida. com. Com relação às. citado.. Por. 11go~. emprego. de. hortaliças,. a. frutas. inibição, O~2%. por. que. outras. apresentou maior resistência à. que o uso de metabissulfito de potássio a. estudado. sendo. inibiu apenas. outro. lado~. maçã e pêsseao do. 0,05%. a. foi. composto. verificaram. que. a. polifenol oxidase da couve-flor teve a sua atividade inibida em 100% com emprego de porém,. a. polifenol. :--esistente~. ~ão. concentração de. 0~05%. de metabissulfito de. oxidase. sendo. do. ~nibida. palmito ~e!~. palmito~. mostrou-se. ::omposto. ::i. taco. o metabissulfito de sódio. verificaram empregada. Ensaios com 200 ppm de S02, na. espera, mostraram ser suficiente para a. que~. na. centração de 3,3 mM proporcionou 100% de inibição fenol oxidase.. mais. 0,2%.. BERNHARDT et alii (1978) para. potássio:. con-. da. poli-. salmoura. manutenção. de. da. cor. (1980), ao estudarem as. ca-. natural até o enlatamento. IADEROZA et alii. racteristicas da enzima polifenol vares de abacate, ol'servaram. que~. oxidase dentre. de vários. dois. culti-. inibidores.

(45) 27. estudados~. o metabissulfito de sÓdio foi o mais eficaz. Para. os cultivares Wagner e Quintal foram necessários 5.8x10-3 % e. 6~lx10-3% de metabissulfito de sódio~ ~esoectivamente~. para. obtenção de 1001. de inibição enzimica. Maçã em fatias da variedade Golden foi tratada com 502 a. para um tempo de imersão de se 30 ppm de 502 residual. 17. horas. (PONTING &. PARK et alii ticas da polifenol. obtendo-se. 0~02%~. oxidase. melhor. a. pH. JACI(50N~. resultado. 2~4~. obtendo-. 1972).. estudando as caracteris-. (1980)~. de. Delicious. manga,. verificaram. que. emprego de metabissulfito de SÓdio, na concentração de mM, promoveu 677. de. inibiç~o. enzimica; porém, ao. ser. o. 0,01 apli-. cado na concentração de 0,05 mM, ocorreu 1007. de inibição.. 2.2.2.2. Ácidos. o utilizado para. emprego de ácidos é controle. do. como. málico, ácido fosfÓrico e ácido efeito inibidor é devido ao. método. escurecimento. ácidos empregados estão entre os mente nos tecidos vegetais,. um. que. já. o. ácido. enzimico. existem. tartárico.. abaixamento. amplamente. do. cf. natural-. trico, Em. pH. Os. ácido. geral, (E5KIN. o. et. a 1 i i, 1971). O ácido citrico duplo sobre a polifenol oxidase.. possui Esta é. um. efeito. inibidor. inibida. não apenas.

(46) 28. pelo abaixamento do pH do. mas. meio~. também. quelação do cobre do grupo prostético.. Entretan to ~. que o ácido citrico usado sozinho não. é. eficaz da polifenol oxidase (ESKIN et. alii~. McCORD & l<ILARA (1983), ao trole do escurecimento. um. pesquisarem. enzlmico. em. verificaram que o emprego do ácido. realizando. 1971).. muito Porém,. para. cogumelos. citrico~. parece. inibidor. métodos. a. con-. processados. reduzindo o pH a. 3,5, proporcionou a inativação enzimica. Recentemente~. ZEMEL et alii. (1990), utilizan-. do ácido inorgânico (ácido clorldrico) testaram a inativação da polifenol oxidase em suco de maçã,. pelo. abaixamento. do. pH. Verificaram que a enzima foi inativada em 987., 637. e 347., após 20 minutos, a valores de pH de 2,0, 2,25 pectivamente.. Em estudos realizados. em. e. 2,5,. planta. res-. piloto,. suco foi acidificado com HeI a pH 2,0 por 45 minutos e ~eceber. adiç~o. de NaOH para elevar o pH ao seu valor. naI, observaram que a atividade inibida em 88/... da. polifenol. ração adequada, ele possuia um sabor. salgado. resultante da formação de cloreto de sódio ajuste do pH.. Outros. compostos. em. origi-. uma. foi colo-. desagradável,. por. ocasião. substituição. estão sendo pesquisados para prevenir a. após. oxidase. Embora o suco tenha apresentado. o. formação. ao do. do NaOH. sabor. salgado.. o ácido ascórbico. também. é. empregado. para. controlar o escurecimento enzimico.. Segundo PONTING (1960),. o mecanismo de inibição pelo. ascórbico. ácido. é. devido. à.

(47) 29. redução. da. ortoquinona. ao. substrato. impedindo a polimerização posterior.. fenólico Por. original~. esta. razão~. o. alimento deve ser tratado com quantidade suficiente de ácido ascórbico~. senão. a. reação. de. escurecimento. será. apenas. retardada, até o ponto em que o ácido ascórbico seja oxidado (BAUERNFEIND & PINKERT, 1970).. o. ácido. ascórbico. vantagem de não possuir sabor detectável, nas. tem. a. concentrações. utilizadas, o qual possa interferir no produto acabado;. não. possui ação corrosiva sobre metais e é uma vitamina de valor nutricional bem conhecido (ESKIN et alii, 1971). Estudos. realizados. (1983b) demonstraram que. a. por. polifenol. SILVA oxidase. dentre as frutas analisadas, é a mais resistente menta por ácido ascórbico,. não tendo sido. maior concentração utilizada (1,0%).. Para. &. NOGUEIRA. de ao. inibida a. banana, tratanem. pêra,. figo,. maçã e pêssego, 0,5% de ácido ascórbico foi suficiente promover inibição total da enzima.. No caso das. para. hortaliças,. a polifenol oxidase da couve-flor foi inibida totalmente menor concentração de ácido ascórbico. na. na. Entretanto,. a polifenol oxidase do palmito apresentou maior resistência, especialmente a base, que na maior concentração. teve. (1~0%). sua atividade reduzida em apenas 6,8%. Ácido ascórbico na faixa de. concentração. de. 0,05% a 0,27., em ;<arope, mostrou-se eficaz para tratar maçãs e pêssegos. destinados. ao. congelamento.. Segundo. POTTER.

(48) 30. (1973), os pêssegos assim tratados não escurecem. dentro. 00. perlodo de 2 anos se mantidos a -18 Q C. NOGUEIRA (1973a.b) verificou pedaços da. variedade. Brucker. do. que.. Brasil. recebendo tratamento prévio com ácido. Beauty~. Ohio. e. ascórbico~. antes. apresentaram eficiente controle do escurecimento. congelação~. A proporção de ácido ascórbico empregada. enz~mico.. da. foi. de. 360 mg/l de xarope de sacarose 50° Brix.. Estudando NOGUEIRA. apertização~. ascórbico~empregado. o. processamento. (1979). na proporção. do. verificou de. 480. palmito. por. que. o. ácido. mg/kg. de. creme~. foi o melhor agente inibidor do escurecimento enzimico.. 2.2.2.3. Outros compostos quimicos. ~. inibição do escurecimento. também. 9nz~mico. pode ser efetuada com o uso de outros agentes. além. qu~micos~. dos ácidos e do anidrido sulfuroso. O cloreto de sódio tem sido em. soluç~es. de. espera~. antes da aplicação do. A concentração da salmoura utilizada é apenas inativação enzimica parcial. enzlmica. requereria. comumente. uma. elevada. tal,. branqueamento. que. se. obtém. Uma completa inativação concentração. tornaria o produto impalatável, principalmente frutas~. usado. do no. sal caso. o que limita seu uso (ADAMS & BLUNDSTONE, 1971).. e de.

(49) 31.. LUH & PHITHAKPOL do NaCl. na. inibição. polifenol. da. estudando. (1972)~. de. zando-se uma concentração de 37. do sal. MONTGOMERY. (1973)~. 400 mM. de. de. o~{idase. descobriram que se pode obter até 307.. NaCl. o. efeito. pêssegos~. inibição~. utili-. Segundo BENJAMIN. produz. apenas. inibição enz1mica da polifenol oxidase de cerejas. 187.. & de. da varie-. dade Royal Ann. A adição de agentes sequestrantes em tos permite a complexação com metais naturalmente prevenindo assim uma série de. bre, pertencente ao grupo prostético da. polifenol. pode complexar-se com agentes sequestantes, ou parcialmente a atividade enzimica.. que os. metais~. naturalmente. de. Em. o. inibindo muitos. no. compostos. co-. oxidase, total. casos,. branqueamento,. presentes. liberados para combinarem-se com. presentes~. indesejáveis.. reaç~es. elevada temperatura da operação. alimen-. a. permite. alimen t o, sejam. A. orgânicos.. adição de um agente sequestrante permite sua complexação com metais, prevenindo. alteraç~es. indesejáveis na cor.. etilenodiaminotetracético (EDTA) é. um. agente. o. ácido. sequestrante. que pode ser usado em alimentos (FURIA, 1977). IADEROZA. alii (1980). e~. empregaram. para prevenir o escurecimento enz1mico em. abacate. o. EDTA~. das. va-. riedades Wagner e Quintal e verificaram que houve apenas. 87.. de inibição da polifenol oxidase,. para. de. 0,03 mM.. de. Para obtenção. utilizaram a. conc~ntração. de. 1007.. de 0,06567... a. concentração. inativação. enzimica,.

(50) o EDTA não surtiu polifenol oxidase de tração de 263. ~M.. o. pêssego~. efeito. quando. adequado. empregado. sobre. na. pH do meio de reação afeta a. concenafinidade. do EDTA pelo cobre sendo os complexos de EDTA-cobre vamente estáveis em meio ácido Este mesmo efeito foi. &. (LUH. também. relati-. PHITHAKPOL~. verificado. em. a. 1972).. pêsseoos. por. VÁMOS-VIGYÁZó & MlHÁLYI (1976). BERNHARDT. e~. alii. (1978). verificaram. utilizando EDTA na concentração de 8,3 mM, não houve. que~. inibi-. ção enzimica mensurAvel na atividade da pfo de palmito.. o. EDTA foi. considerado. por. TWIGG. et. alii. (1974) como eficaz inibidor do escurecimento de batata .doce, quando usado em. concentraç~es. de 0,05%,. tendo sido. mantida. a estabilidade da cor do produto por até 1 ano após. o. pro-. cessamento. ~. dietilditiobicarbamato. pode agir como complexante do. cobre e. de. sódio. também. é. (DETEC) capaz. formar com as quinonas um complexo incolor estável,. de. inibin-. do o escurecimento enzimico (VÁMOS-VIGYÁZó, 1981). Segundo BERNHARDT et alii. (1978), a atividade. da polifenol oxidase de palmito pode ser totalmente inibida, usando-se 3,3 mM de DETEC.. A polifenol oxidase, proveniente. de abacate das variedades Wagner e. Quintal,. necessitou. 0,0794% e 0,01%, respectivamente, de DETEC para. ser. de. total-. mente inibida, de acordo com estudos realizados por IADEROZA et alii (1980)..

(51) Estudos realizados por KAHN uso do. DETEC~. para inibir a. polifenol. (1977). oxidase. sobre. de. o. abacate. proveniente das variedades Fuerte e Lerman, mostraram que uso deste composto na concentração de 0,6 mM. promoveu. o. 100%. de inibição. A cisteina também age impedindo a continuidade da. quinonas~. mento.. diretamente reação. sobre. de. escureci-. Devido à ausência de odor e sabor desagradável, é um. dos compostos sulfidrila mais adequado para esta (ADAMS &. BLUNDSTONE~. finalidade. 1971).. Fatias de maçãs das variedades Stumer e gherty~. consideradas como sendo muito susceptiveis ao. recimento~. ~a. escu-. exposição. Suco de maçã das mesmas variedades, contendo ciste1-. na proporção de 25 mg/100 ml, após. mento à. Dou-. foram tratadas com solução a 0,005 M de ciste1na,. e, somente sofreram escurecimento após 3 horas de ao ar.. as. ~. meses. de. armazena-. temperatura ambiente, não apresentaram escurecimento. enzimico. O uso de cisteina tem uma vantagem adicional sobre o ácido ascórbico, pois, embora seu custo seja elevado, pode ser usada em menores. concentraç~es.. formado com as quinonas é. relativamente estável, uma vez que. os alimentos tratados com cisteina podem espera de várias. horas. antes. de. serem. Também. ter. o. ela. um. composto. tempo. de. processados,. sem. ocorrer o risco de escurecerem (WALKER & REDDISH, 1964). Recentemente, KAHN (1985) afirmou que a teina pode formar complexos estáveis com o cobre,. cis-. devido. a.

(52) 34. seu grupo tiol e verificou que foi eficaz escurecimento~. mesmo quando usada. como 0,32 mM e 5 abacate e. banana~. mM~. nos casos. em. dos. na. prevenção. bai;-:as. do. concentraçê5es. extratos. enzimicos. de. pêra. da. respectivamente.. A polifenol oxidase do. suco. de. polpa de banana também foi inibida com adição sendo que a concentração. de. 1,0. mM. foi. de. e. cistelna,. suficiente. promover 100'l. de inibição enzimica em banana. para. (MONTGOMERY. SGARBIERI, 1975 e MONTGOMERY, 1983). Compostos fenólicos,. como o ácido p-cumárico,. ácido protocatechuico e p-cresol, podem agir da ação da polifenol oxidase sobre tecol~. impedindo. a. formação. das. o. como. substrato. inibidor 4-metilca-. ortoquinonas,. como. fo~. observado para a polifenol oxidase de abacate (KAHN. 1976). (1972). WARMBIER et alii. testaram. o. inibidor do diclorofluormetano, que é um composto se ligar a proteinas e alterar. sua. estrutura.. efeito. =.3.paz Verificaram. uma diminuição da atividade enzimica em relação ao controle. concluindo que pode ter. ocorrido. uma. associação. entre. molécula do diclorofluormetano e as regiê5es hidrofóbicas. a da. enzima, alterando sua conformação e reduzindo sua atividade.. o. efeito. inibidor. de. compostos. também é citado. mais recentemente. por PRABHA &. fenólicos PATWARDHAN. (1986b), que observaram que a hidroquinona. pirogalol. e. naftol promoveram aproximadamente BO'l. de inibição. poli-. fenol oxidase proveniente de. abaca~e.. banana. e. na maçã,. ,.:;t-. en-.

(53) 35. quanto o ácido p-cumárico e ácido ferrúlico. ocasionaram. em. média 30% de inibição. WALKER (1976) investigou o efeito do ácido cinâmico, ácido p-cumárico e ácido ferrúlico sobre a polifenol oxidase de maçã, variedade Granny Smith, e enzimica para a concentração de respectivamente.. 0~25. obteve. 0,5 mM. mM~. inibição. e. 1,0. Verificou, portanto, que o ácido. e p-cumárico foram mais. eficazes. que. o. ácido. mM,. cinâmico ferrúlico.. Pequenas concentrações destes ácidos foram capazes. de. pro-. mover um controle do escurecimento enzimico por longo período de tempo, especialmente. quando. comparado. com. o. controle. tratado com ácido asCÓrbico. Proteinas~. peptideos e aminoácidos podem afe-. tar a atividade da polifenol oxidase por. dois. meios. rentes: pela reação com as ortoquinonas e pela. sina~. e. glicina, L-histidina. quelação. Segundo KAHN (1985),. cobre no sitio ativo da enzima.. crescente de eficácia, inibiram. L-fenilalanina, a. atividade. na. da. Triglicina,. cina e glicina, em. foram. decrescente,. do. L-liordem. polifenol. oxidase de abacate, banana e cogumelo. ordem. dife-. digli-. eficazes. em. diminuir a intensidade da cor da melanina, formada pela ação da polifenol oxidase sobre DOPA. IADEROZA et alii (1980) verificaram o inibidor do 2-mercaptoetanol sobre a nol oxidase de abacate das variedades. atividade Wagner. da e. efeito polife-. Quintal. e. obtiveram 100% de inibição para as concentrações de 0,0037. e.