UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA/FITOTECNIA
MARIA BRUNA MEDEIROS ARAÚJO
CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS ASSOCIADOS A SEMENTES E À ANTRACNOSE DA CARNAUBEIRA
FORTALEZA 2017
MARIA BRUNA MEDEIROS ARAÚJO
CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS ASSOCIADOS A SEMENTES E À ANTRACNOSE DA CARNAUBEIRA
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Agronomia/Fitotecnia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Agronomia/Fitotecnia.
Orientador: Prof. Dr. Renato Innecco
Coorientador: Prof. Dr. Cristiano Souza Lima
FORTALEZA 2017
A69c Araújo, Maria Bruna Medeiros.
Caracterização de fungos associados a sementes e à antracnose da carnaubeira / Maria Bruna Medeiros Araújo. – 2017.
118 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Fitotecnia), Fortaleza, 2017.
Orientação: Prof. Dr. Renato Innecco.
Coorientação: Prof. Dr. Cristiano Souza Lima.
1. Colletotrichum. 2. Copernicia. 3. Sanidade de sementes. 4. Patogenicidade. 5. Filogenia. I. Título. CDD 630
A Deus.
A minha família. Ao meu companheiro.
Os homens semeiam na terra o que colherão na vida espiritual: os frutos da sua coragem ou da sua fraqueza.
Agradecimentos
A Deus que guia os meus caminhos e me dá força para ultrapassar as dificuldades que a vida oferece como fonte de fortalecimento espiritual e a Santa Catarina de Alexandria, quem abre passagens para o meu conhecimento e minha fé.
A Universidade Federal do Ceará, a qual me deu suporte para o meu crescimento profissional e pessoal.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Funcap). Aos professores do Programa de Pós Graduação em Agronomia/Fitotecnia por todo o conhecimento adquirido.
Ao Professor Cristiano, pela orientação de mais um trabalho e por sua amizade.
A todos os membros do Laboratório de Micologia por todas as contribuições em especial Israel e Leonardo.
Ao grande amigo Dr. Francisco Câmara do Laboratório BioAgri, por toda ajuda e dedicação. Agradeço imensamente.
Ao professor Sebastião e Charles do Laboratório de Tecnologia de Sementes por todo auxílio. Aos membros do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa - Agroindústria Tropical, Samara, Márcio, Joilson e Wéverson, por toda ajuda.
A minha família que sempre acreditou em meu potencial e me amparou nos momentos em que pensei não ser capaz de seguir em frente.
Ao meu querido companheiro e melhor amigo, Ikaro Cezar, por todos os incentivos, compreensão, carinho e respeito.
Aos meus amigos que me deram forças nesta jornada Luana sempre muito amiga, Leonardo, Edvânia, Jéssica, e em especial Ariana, Andreza e Caris, por me apoiarem desde o início, nos momentos de angustia e felicidade.
RESUMO
A carnaubeira (Copernicia prunifera) tem grande importância sócio-econômica pelo seu uso integral, onde as folhas, frutos, flores, caule e raízes são completamente aproveitados, dando origem a produtos industriais e artesanais. A elevada extração destas palmeiras em suas áreas nativas compromete a microbiota, fauna e flora local. As sementes são o meio mais eficiente de disseminação de patógenos em áreas isentas o que causa sérios prejuízos quando se trata da produção de mudas. A obtenção de mudas sadias destinadas à reposição de paisagens pode ser prejudicada pela associação de patógenos às sementes que, ao serem transmitidos às plantas, poderão comprometer o seu desenvolvimento e ou levá-las à morte. Objetivou-se nesse estudo, caracterizar fungos associados a sementes e testar a patogenicidade de isolados de
Colletotrichum associados a frutos de carnaubeira (Copernicia prunifera). Frutos em estádio
de maturação fisiológica foram coletados em três municípios do Estado do Ceará: Bela Cruz, Caucaia e Paraipaba, onde se encontram populações naturais remanescentes. O método do papel de filtro ou blotter test foi utilizado para avaliar a sanidade de 400 sementes de carnaubeira de cada região amostrada. O método do isolamento direto foi utilizado para a obtenção de isolados de Colletotrichum associados à antracnose. Para tal, frutos de cada município, com sintomas de antracnose, foram lavados com detergente neutro e desinfestados com hipoclorito de sódio e acondicionados em câmara úmida até a esporulação nas lesões. Três isolados dos frutos foram retirados como representantes de cada município de coleta (UFCM 0630-Caucaia, UFCM 0631-Bela Cruz e UFCM 0632-Paraipaba). Para a caracterização molecular e determinação das relações filogenéticas, foi realizado o sequenciamento de fragmentos de DNA do espaçador interno transcrito (ITS) do DNA ribossômico, para os isolados das sementes e as regiões ITS, actina (ACT), β-tubulina (βt), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPDH) e glutamina sintetase (GS), para os isolados de
Colletotrichum obtidos de frutos de carnaubeira. Realizou-se a caracterização morfológica e
cultural de todos os isolados. Os isolados UFCM 0630, UFCM 0631 e UFCM 0632 foram submetidos ao teste de patogenicidade em frutos sadios de carnaubeira e manga cv. Tommy Atkins e em mudas de cajueiro clone BRS 265. Foi possível a identificação dos gêneros
Alternaria, Aspergillus, Diaporthe, Fusarium, Lasiodiplodia, Penicillium, Rhizopus e
Schizophyllum. Na caracterização de Colletotrichum, os isolados UFCM 0630 e UFCM 0632
foram identificados como C. tropicale e o isolado UFCM 0631 como C. theobromicola, espécies pertencentes ao complexo Colletotrichum gloeosporioides. Os postulados de Koch
foram completados em frutos de carnaubeira sadios para os três isolados de Colletotrichum. Apenas os isolados UFCM 0630 e UFCM 0632 foram patogênicos à frutos de manga e mudas de cajueiro. Os fungos identificados em sementes no presente estudo representam o primeiro relato para C. prunifera. Colletotrichum tropicale e C. theobromicola são relatados pela primeira vez como agentes etiológicos da antracnose em carnaubeira.
ABSTRACT
The carnauba (Copernicia prunifera) has great socio-economic importance for its integral use, where the leaves, fruits, flowers, stem and roots are completely useful, giving rise to industrial and artisanal products. A large extraction of these palm trees in their native areas threatens the present natural ecosystems, compromising the microbiota, local fauna and flora. Seeds are the most efficient means of dissemination of pathogens into new areas which may cause serious losses if contaminated seeds are used for the seedling production. The production of healthy seedlings to the restoration of landscapes can be hampered by the association of pathogens with seeds, which can be transmitted to plants, compromising their development and leading to death. The objective of this study was to characterize morphologically and molecularly fungi associated with seeds and to test the pathogenicity of Colletotrichum isolates associated with carnauba fruit (C. prunifera). Fruits in a stage of physiological maturation were collected in three municipalities of the Ceará State: Bela Cruz, Caucaia and Paraipaba, where the remaining natural populations are found. The filter paper method or the blot test method was used to evaluate the healthy of 400 carnauba seeds from each sampled region. The direct isolation method was used to obtain Colletotrichum isolates associated with anthracnose. For this, fruits from each region, with symptoms of anthracnose, were washed with neutral detergent and disinfested with sodium hypochlorite and conditioned in a humid chamber until sporulation on the lesions. Three isolates from diseased fruits were obtained as representatives of each collection site (UFCM 0630-Caucaia, UFCM 0631-Bela Cruz and UFCM 0632-Paraipaba). Sequencing of DNA fragments from the internal transcribed spacer of ribosomal DNA was performed for seed isolates, and DNA fragments from the regions ITS, actin (ACT), β-tubulin), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPDH), and glutamine synthetase (GS), were sequenced for molecular characterization and determination of phylogenetic relationships of the Colletotrichum isolates obtained from carnauba fruits. A morphological and cultural characterization of all isolates was carried out. Isolates UFCM 0630, UFCM 0631 and UFCM 0632 were submitted to the pathogenicity test on healthy fruits of carnauba (C. prunifera) and mango cv. Tommy Atkins, and on cashew plantlets BRS 265. After characterization of the seed isolates, it was possible to identify the genera Alternaria,
Aspergillus, Fusarium, Lasiodiplodia, Penicillium, Phomopsis, Rhizopus and Schizophyllum.
In the Colletotrichum characterization, the isolates UFCM 0630 and UFCM 0632 were identified as Colletotrichum tropicale, and the UFCM 0631 isolate as Colletotrichum
theobromicola, species belonging to the Colletotrichum gloeosporioides species complex.
Koch's postulates were completed to confirm the pathogenicity of the three Colletotrichum species isolates on healthy carnauba fruits. Only isolates UFCM 0630 and UFCM 0632 were pathogenic on mango fruits and cashew plantlets. All the fungi identified on seeds in the present study represent the first report for C. prunifera. Colletotrichum tropicale and C.
theobromicola are reported for the first time as etiological agents of carnauba anthracnose.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ocorrência do gênero Copernicia na América do Sul...21
Figura 2 – Áreas de ocorrência da Carnaúba no Estado do Ceará...40 Figura 3 – Etapas do beneficiamento dos frutos de carnaubeira. A) Desidratação dos frutos
em estufa. B) Retirada da polpa seca. C) Raspagem com bisturi para retirada dos resíduos da
polpa. D) Processo do fruto seco à obtenção do
endocarpo...41
Figura 4 – Teste de sanidade de sementes. A) Rompimento do endocarpo e obtenção da
semente. B e C) Plaqueamento das sementes sem e com endocarpo. D) Incubação das sementes...42
Figura 5 – Caracterização morfológica de Alternaria tenuissima. A) Colônia em meio de
cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Cadeia de conídios. D) Conídios...53
Figura 6 – Caracterização morfológica de Aspergillus oryzae. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo. D) Conídios...54
Figura 7 – Caracterização morfológica de Aspergillus sp1. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo. D) Conídios...55
Figura 8 – Caracterização morfológica de Aspergillus sp2. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Cleistotécio. D) Ascos com ascósporos em seu interior (indicado com seta vermelha)...57
Figura 9 – Caracterização morfológica de Aspergillus sp3. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo. D) Conídios...58
Figura 10 – Caracterização morfológica de Aspergillus sp4. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo. D) Conídios em cadeia...59
Figura 11 – Caracterização morfológica de Aspergillus tubingensis. A) Colônia em meio de cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo. D) Conídios...60
Figura 12 – Caracterização morfológica de Fusarium sp. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Micélio aéreo em meio de cultura SNA, mostrando falsas cabeças e cordões de hifa. D) Conidióforo com conídios dispostos em falsas
cabeças. E) Monofiálide. F)
Microconídios...61
Figura 13 – Caracterização morfológica de Lasiodiplodia pseudotheobromae. A) Colônia em
meio de cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Picnídio imerso em acícula de pinheiro exsudando massa de conídios. D) Estroma picnidial multilocular. E) Paráfises (seta
vermelha). F) Conídios imaturos, hialinos e
unicelulares...62
Figura 14 – Caracterização morfológica de Lasiodiplodia theobromae. A) Colônia em meio
de cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Célula conidiogênica (seta
vermelha). D) Conídios imaturos, hialinos e
unicelulares...63
Figura 15 – Caracterização morfológica de Penicillium griseofulvum. A) Colônia em meio de
cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Conidióforo D) Conídios...64
Figura 16 – Caracterização morfológica de Diaporthe pseudomangiferae A) Colônia em
meio de cultura BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Picnídios imersos em acícula de pinheiro em meio SNA, com exsudação de massa de conídios. D) Picnídio. E) Células conidiogênicas. F) Conídios alfa (seta vermelha) e conídios beta (seta azul)...66
Figura 17 – Caracterização morfológica de Rhizopus oryzae. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Esporangióforo. D) Esporangiósporos elipsoidaisestriados... 67
Figura 18 – Caracterização morfológica de Schizophyllum sp. A) Colônia em meio de cultura
BDA. B) Verso da colônia em meio BDA. C) Esporangióforo. D) Esporangiósporos elipsoidais estriados...68
Figura 19 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Aspergillus...68 Figura 20 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Alternaria...70 Figura 21 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Diaporthe......70 Figura 22 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Fusarium......71 Figura 23 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Lasiodiplodia...72 Figura 24 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Penicillium......73 Figura 25 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Rhizopus...74 Figura 26 - Árvore filogenética de sequências de fungos do gênero Schizophyllum......74
Figura 27 – Caracterização morfológica de Colletotrichum tropicale (isolado UFCM
0630-Caucaia). A) Colônia em meio de cultura BDA após sete dias de incubação. B) Verso da
Colônia em meio BDA. C) Apressórios D)
Conídios...93
Figura 28 – Caracterização morfológica de Colletotrichum theobromicola (isolado UFCM
0631-Bela Cruz). A) Colônia em meio de cultura BDA após sete dias de incubação. B) Verso
da Colônia em meio BDA. C) Apressório. D)
Conídios...95
Figura 29 – Caracterização morfológica de Colletotrichum tropicale (isolado UFCM
0632-Paraipaba). A) Colônia em meio de cultura BDA após sete dias de incubação. B) Verso da
Colônia em meio BDA. C) Apressório. D)
Conídios...96
Figura 30 – Caracterização patogênica dos isolados de Colletotrichum em manga cv. Tommy
Atkins, após sete dias de incubação. A) Testemunha B) C. tropicale (isolado UFCM 0630). C)
C. theobromicola (isolado UFCM 0631). D) C. tropicale (isolado UFCM
Figura 31 – Caracterização patogênica dos isolados de Colletotrichum em mudas de cajueiro clone BRS 265, após dez dias de incubação. A) Testemunha, estágio 0. B) C. tropicale (isolado UFCM 0630), estágio 4. C) C. theobromicola (isolado UFCM 0631), estágio 0. D) C.
tropicale (isolado UFCM 0632), estágio
4...99
Figura 32 – Caracterização patogênica dos isolados de Colletotrichum em frutos sadios de C.
prunifera A) Testemunha B) C. tropicale (isolado UFCM 0630). C) C. theobromicola
(isolado UFCM 0631). D) C. tropicale (isolado UFCM 0632). E) Acérvulos em frutos de carnaubeira com produção de setas e massa de conídios, inoculados com C.
theobromicola......99 Figura 33 – Árvore filogenética inferida a partir da análise Neighbor Joining, através do alinhamento múltiplo das sequências das regiões gênicas ACT, TUB2, GS, GPDH e ITS
rDNA e bootstrap com comparações múltiplas para 1000
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Isolados utilizados nas análises filogenéticas...46 Tabela 2 - Isolados utilizados na análise filogenética de espécies de Colletotrichum...90
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Sanidade de sementes de carnaubeiras (C. prunifera) do município de Bela Cruz,
nos tratamentos - sem desinfestação superficial (SD) e com desinfestação superficial (CD)...49
Gráfico 2 – Sanidade de sementes de carnaubeiras (C. prunifera) do município de Caucaia,
nos tratamentos - sem desinfestação superficial (SD) e com desinfestação superficial (CD). ...50
Gráfico 3 – Sanidade de sementes de carnaubeiras (C. prunifera) do município de Paraipaba,
nos tratamentos - sem desinfestação superficial (SD) e com desinfestação superficial (CD). ...51
Gráfico 4 – Incidência geral de todos os fungos isolados de sementes de C. prunifera, em
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 22
2.1.CARNAUBEIRA [COPERNICIA PRUNIFERA(MILLER)H.E.MOORE] ... 22
2.1.1. Origem, distribuição e classificação botânica ... 22
2.1.2. Aspectos morfológicos e floração ... 23
2.1.3. Aspectos econômicos e utilitários ... 24
2.1.4. Aspectos ambientais ... 25
2.2.FUNGOS ASSOCIADOS A PLANTAS DA FAMÍLIA ARECACEAE ... 25
2.2.1. Ocorrência de antracnose em palmeiras da família Arecaceae ... 29
2.3.MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS ... 31
2.3.1. Caracterização cultural e micromorfológica ... 31
2.3.2 Caracterização patogênica de fungos ... 33
2.3.3 Caracterização molecular de fungos ... 34
CAPÍTULO I ... 36
RESUMO ... 37
ABSTRACT ... 38
1. INTRODUÇÃO ... 39
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 40
2.1.COLETA DO MATERIAL DE ESTUDO ... 40
2.2.EXTRAÇÃO DAS SEMENTES DOS FRUTOS ... 41
2.3.SANIDADE DE SEMENTES DE CARNAUBEIRAS ... 42
2.4.CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA ... 44
2.5.EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E AMPLIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DA REGIÃO ITS RDNA ... 44
2.6.ANÁLISES FILOGENÉTICAS ... 45
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 50
3.1.FUNGOS ASSOCIADOS ÀS SEMENTES DE CARNAUBEIRAS DOS MUNICÍPIOS DE BELA CRUZ,CAUCAIA E PARAIPABA. ... 50 3.2.CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA ... 53 3.3.ANÁLISE FILOGENÉTICA ... 69 4. CONCLUSÕES ... 80 CAPÍTULO II ... 81 RESUMO ... 82
ABSTRACT ... 84
1. INTRODUÇÃO ... 85
2. MATERIAIS E MÉTODOS ... 86
2.1.ESTABELECIMENTO DE UMA COLEÇÃO DE ISOLADOS DE COLLETOTRICHUM SPP. DE FRUTOS DE CARNAUBEIRAS (COPERNICIA PRUNIFERA) ... 86
2.2.CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA ... 87
2.2.1. Dimensão dos esporos ... 87
2.2.2. Caracterização dos apressórios ... 88
2.3.CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR ... 88
2.3.1. Extração de DNA... ... 88
2.3.2. Amplificação e sequenciamento de fragmentos de DNA ... 88
2.3.3. Análise filogenética ... 89
2.4.CARACTERIZAÇÃO PATOGÊNICA ... 90
3. RESULTADOS ... 94
3.1.CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA ... 94
3.1.1 Colletotrichum tropicale E.I. Rojas, S.A. Rehner & Samuels (Isolado UFCM 0630 - Caucaia) ... 94
3.1.2. Colletotrichum theobromicola Delacr. (Isolado UFCM 0631 – Bela Cruz) ... 95
3.1.3. Colletotrichum tropicale E.I. Rojas, S.A. Rehner & Samuels (Isolado UFCM 0632-Paraipaba) ... 96
3.2.CARACTERIZAÇÃO PATOGÊNICA ... 98
3.3.CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR ... 101
4. CONCLUSÕES ... 105
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 106
