Indução da ovulação em éguas

Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Ciências Veterinárias

Indução da ovulação em éguas

Alexandra Pereira de Castro Ferreira

Orientador Profª Drª Rita Payan Carreira Co-orientador- Dr. Vítor José Lopes Grácio

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Vila Real, 2010

Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Ciências Veterinárias

Indução da ovulação em éguas

Alexandra Pereira de Castro Ferreira

Orientador Profª Drª Rita Payan Carreira Co-orientador- Dr. Vítor José Lopes Grácio

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Vila Real, 2010

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Resumo

A inseminação artificial (IA) encontra-se, actualmente, amplamente difundida, sendo frequentemente utilizada em reprodução equina, revelando-se particularmente útil quando a cada garanhão é atribuído um elevado número de éguas, prática comum nas coudelarias. A crescente pressão económica actual para antecipar a época reprodutiva equina resultando em partos serôdios, tornou frequente o recurso à manipulação do ciclo éstrico, associado à implementação da técnica de IA, quer através da administração de produtos luteolíticos, quer através da indução da ovulação. A manipulação do ciclo éstrico e a planificação da ocorrência de ovulação é uma ferramenta reprodutiva que se tornou indispensável à difusão da IA com sémen refrigerado e sobretudo sémen congelado. Neste estudo procurou-se comparar alguns indicadores entre animais cujo ciclo foi interrompido ou não pela administração de um agente luteolítico, a PGF2α, e em que a ovulação ocorreu de modo espontâneo ou foi estimulada pela administração de hCG. Para isso foi utilizado um total de 89 éguas de diferentes raças, com idades compreendidas entre os 3 e os 22 anos. O controlo ecográfico da actividade ovárica entre a administração de hCG e a ovulação foi realizado diariamente. Neste estudo determinou-se o efeito da administração da hCG (Tratamento 1; n= 36), da PGF2α (Tratamento 2; n=9) ou da associação de ambos (Tratamento 3; n=16) sobre o intervalo de tempo até à ovulação e/ou o diâmetro folicular nos três dias que precederam a ovulação e, no caso particular da PGF2α, no intervalo de tempo até à manifestação de cio. Animais não sujeitos a qualquer tipo de tratamento foram agrupados no Grupo Controle (n=28). Estudou-se a influência de factores como a idade, raça e fase do ciclo reprodutivo (época de transição vs. época reprodutiva) na resposta ao tratamento avaliando-se ainda a influência dos tratamentos instituídos e da fase do ciclo reprodutivo na obtenção de uma gestação. Entre os factores avaliados, apenas se observou que a raça parece ter influído significativamente no intervalo de dias entre a administração de PGF2α e a ocorrência de cio (P=0,006).

Neste trabalho, a utilização ou não de hCG, seja isolada ou após a administração de PGF2α, não mostrou ter exercido influência nos parâmetros avaliados. Contudo estas informações deverão ser interpretadas com cautela devido às limitações inerentes ao estudo.

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Abstract

Currently, artificial insemination (AI) is widely widespread, being used often in equine reproduction, revealing himself particularly useful when at each stallion is attributed a great number of mares, wich is common in studs. The current crescent economic pressure to anticipate the equine reproductive season, resulting in serotinous births, became frequent the recourse to the manipulation of estrus cycle, associated to the implementation of equine AI, wether by the administration of luteolytic products, wether by the ovulation induction. Estrous cycle manipulation and planning for the occurrence of ovulation are a reproductive tool that became indispensable for the diffusion of AI with cooled and specially with frozen semen. In this study we tried to compare some indicators between animal whose cycle was interromped or not by the administration of a luteolytic agent, the PGF2α and in wich ovulation occurred spontaneously or was stimulated by the administration of hCG. For that, a total of 89 mares of different breeds, aged 3 to 22 years, was used. Ovarian activity between hCG administration and oculation was monitored daily by ultrasound. In this study it was determined the effect of hCG administration (Treatment 1; n=36), PGF2α administration (Treatment 2; n=9) or the association of both (Treatment 3; n=16) on the interval to ovulation and/or on the follicular diameter in the three days preceding ovulation and, in the case of PGF2α, on the interval to estrus behavior. Animals that didn´t receive any treatment were grouped in Control group (n=28). It was studied the influence of factors such age, breed and reproductive cycle phase (transition phase vs. reproductive phase) in the response to treatment and it was still evaluated the influence of treatments established and the reproductive cycle phase in achieving a pregnancy. Between all the factores evaluated, it was only verified that breed seems to have influenced significantly the PGF2α administration to estrous behavior interval (P=0,006).

In this study, the use of hCG, isolated or after PGF2α administration, revealed no influence on the parameters evaluated. However this information should be interpreted with caution due to the limitations of the study.

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Agradecimentos

Aos meus pais, pela educação e valores transmitidos, incluindo a paixão pelos animais, e por tudo o que me proporcionaram na vida, o que me permitiu entre outras coisas, ingressar e terminar o curso com que sempre sonhei.

Ao meu marido Marco, por todos estes anos juntos e pelo amor, carinho e força transmitidos o que me permitiu ultrapassar com maior facilidade as etapas “menos fáceis” que foram aparecendo ao longo do curso. Obrigada pela paciência.

À minha irmã Mafalda, por me ajudar a estudar as matérias menos “apelativas”.

À minha avó Adília, por todo o carinho, dedicação e cuidados prestados ao longo de toda a minha vida, o que me faz sentir privilegiada.

A toda a restante família, pelo interesse que sempre demonstraram para que eu tivesse sucesso não só neste curso como em todas as etapas da minha vida.

Às minhas “amigas de Vieira”, por todos os bons momentos passados e pela certeza de que continuaremos a testemunhar no futuro cada etapa importante das nossas vidas.

A todos os amigos (as) e colegas da UTAD, que de uma forma mais ou menos importante, participaram no meu percurso académico.

Ao Dr. Vítor Grácio, por todos os conhecimentos transmitidos, por me proporcionar um estágio muito “prático” e pela capacidade me “alertar” para a realidade da Medicina Veterinária Equina em Portugal, fruto da sua experiência.

À Professora Rita Payan Carreira, pelo apoio, paciência e conhecimentos transmitidos desde a elaboração do plano até à entrega da Tese de dissertação de mestrado.

Ao Professor Jorge Colaço, pelo entusiasmo, paciência, simpatia e disponibilidade que emprega na transmissão de conhecimentos.

Ao Dr. Mário Barbosa, pela simpatia e experiências pessoais que connosco partilhou. À Dra. Maria José, pela simpatia e conhecimentos transmitidos.

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Aos meus colegas de estágio, Francisco, Inês, Nelson e Nádia, pelo companheirismo e bons momentos passados.

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Índice Geral

Lista de siglas e abreviaturas ... vii

1.Introdução ... 1

1.1.Fisiologia do ciclo éstrico da égua ... 1

1.1.a Padrão de desenvolvimento folicular na égua ... 3

1.1.b Comportamento reprodutivo na égua ... 6

1.2.Previsão do momento da ovulação ... 7

1.3. Manipulação do ciclo éstrico na égua ... 9

2. Material e Métodos ...16

2.1. Animais ...16

2.2. Detecção do cio e avaliação das estruturas ováricas ...16

2.3. Tratamentos ...18

2.4. Beneficiação das éguas ...19

2.5.Recolha de dados ...19

2.6. Análise estatística ...20

3.Resultados ...22

4. Discussão ...27

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Índice de figuras

Detecção do cio ...Figura 1 Utilização do garanhão na detecção do cio ... Figura 1 A Elevação da cauda, abaixamento da garupa e micção ... Figura 1 B Realização do controlo ecográfico ...Figura 2 Por ecografia avaliava-se a dinâmica folicular e estudava-se o grau de edema do endométrio ... Figura 2 A Imagem ecográfica de um folículo com diâmetro superior a 35mm ... Figura 2 B Distribuição da população estudada em função dos percentis de idade ...Figura 3 Distribuição nos percentis de idade dos animais submetidos ao tratamento ...Figura 4

Índice de tabelas

Número de éguas por raça admitidas no estudo ... Tabela 1 Tratamentos realizados durante o estudo. ... Tabela 2 Diâmetros foliculares (em mm) registados no dia do tratamento com hCG e aos dias 3,2 e 1 antes da ovulação, em função do tratamento. ... Tabela 3

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Lista de siglas e abreviaturas

CL – Corpo Lúteo

EGF- Factor de crescimento epidérmico

erLH – Hormona Luteinizante recombinante equina FAR - Fundação Alter Real

FSH - Hormona Folículo-Estimulante

GnRH - Hormona Libertadora de Gonadotrofinas h - horas

IA - Inseminação Artificial

IM - administração intra-muscular IV - administração intra-venosa Kg – Quilograma

KWPN - Cavalo Warmblood dos Países Baixos (Cavalo holandês de equitação) LH - Hormona Luteinizante MHz - MegaHertz μg - micrograma mg – miligrama ng- nanograma mL – mililitro cm – centímetros mm - milímetros PGF2α - Prostaglandina-F-2-alfa PSA – Puro Sangue Árabe PSI – Puro Sangue Inglês PSL - Puro Sangue Lusitano SC - Subcutâneo

SF - Sela Francês SPZ- espermatozóides UI – Unidades Internacionais.

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1.Introdução

1.1.Fisiologia do ciclo éstrico da égua

O ciclo éstrico engloba um conjunto de alterações dos níveis hormonais, que se reflectem sobre o tracto reprodutivo e em alterações comportamentais da égua (Morel, 2005). A monitorização destas alterações e a compreensão do ciclo éstrico normal da égua são essenciais para a aplicação de programas reprodutivos eficientes (Evans et al., 2007). As éguas são animais poliéstricos sazonais, que no hemisfério Norte apresentam actividade reprodutiva concentrada entre a Primavera e o Outono (reprodutores de dias longos), mais precisamente entre Abril e Setembro (Nagy et al., 2000; Macpherson, 2009). Este padrão permite o nascimento de poldros durante os meses de Primavera e Verão, quando o tempo está quente e existe alimento em abundância (Crowell-Davis, 2007).

Ociclo reprodutivo sazonal é o resultado de um ritmo circanual reprodutivo endógeno regulado por factores ambientais externos, tais como o fotoperíodo, a temperatura, a nutrição e a condição corporal (Nagy et al., 2000). É geralmente aceite que, no cavalo, o fotoperíodo seja o factor externo mais importante na regulação do ritmo reprodutivo endógeno (Nagy et al., 2000).

Os equinos respondem positivamente ao aumento da quantidade de luz diária(Blanchard et al., 1998). A duração do fotoperíodo modula a actividade reprodutiva pela regulação da secreção de GnRH. A epífise é reconhecida como parte integrante do mecanismo para a monitorização dos eventos fotoperiódicos (Donadeu e Pederson, 2008). Esta modula a actividade hipotalâmica através da secreção de melatonina. Quando os dias são curtos, a melatonina produzida pela epífise suprime a produção e libertação de GnRH, observando-se o oposto em dias longos (Blanchard et al., 1998). Por sua vez, a GnRH é estimuladora da produção de duas hormonas – a hormona luteinizante (LH) e a hormona foliculo-estimulante (FSH) pela hipófise anterior (Blanchard et al., 1998). Estudos recentes revelaram a existência de um sistema neuro-endócrino complexo, que regula as alterações sazonais das actividades hipotâlamicas e pituitárias, que envolvem não só a melatonina, mas também outros neurotransmissores, tais como os opióides endógenos e as catecolaminas, entre as quais a dopamina (Nagy et al., 2000; Markovic et al., 2003).

O anestro sazonal, que se estende entre o fim do Outono e o início do Inverno, define-se como o período de incompetência reprodutiva (Crowell-Davis, 2007). Nesta fase os ovários mostram-se ecograficamente inactivos, com a presença de apenas um número reduzido de

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folículos de menor tamanho, com dimensões compreendidas entre os 5 a 10mm (Nie et al., 2007). Um estudo realizado por Fitzgerald e McManus (1999) demonstrou que o anestro se inicia mais cedo para as éguas mais jovens do que para éguas mais velhas, o que poderá ser devido ao facto de existir uma grande concentração de leptina em circulação, maior percentagem de gordura corporal e maior peso corporal nos animais mais velhos. Apesar da ocorrência de inactividade ovárica, foi descrito que as éguas podem exibir comportamento sexual durante o anestro, quando não há ovulação, ao contrário do que ocorre nos outros ungulados (Crowell-Davis, 2007). Crê-se que este comportamento de cio possa ser devido à estimulação hormonal de origem extraovárica. O córtex adrenal secreta androgénios, progestagénios e estrogénios, que podem estar envolvidos na manifestação de cio (Crowell-Davis, 2007). Este período em que não ocorre ovulação é classicamente dividido em três períodos: transição de Outono, que corresponde ao período inicial de redução da actividade do eixo hipotálamo-hipófise-ovários, o anestro profundo ou contra-estação, que corresponde ao período de inverno de menor actividade do eixo e a transição de primavera (Blanchard et al., 1998). Este último período, que se inicia por volta do dia 21 de Março no Hemisfério Norte (Murchie, 2005), é caracterizado por estros prolongados e erráticos, que finalmente culminam com a ovulação, iniciando-se assim a época reprodutiva (Blanchard et al., 1998). A transição de Primavera decorre lentamente, durando cerca de 6 a 8 semanas (Murchie, 2005). O número total de folículos aumenta de um para uma média de 8 a 10, à medida que este período evolui. Ecograficamente os folículos adoptam o padrão característico de “cacho de uvas” (Murchie, 2005). Em cerca de 50% das éguas, durante este período observa-se o crescimento de grandes folículos nos ovários, que frequentemente atingem o tamanho pré-ovulatório mas não chegam a ovular (Watson et al., 2003), permanecendo com cerca de 30 mm durante cerca de uma semana, regredindo em seguida, embora permanecendo com fluido no seu interior, enquanto se observa o crescimento de outro folículo (Murchie, 2005). Os níveis circulantes de estradiol nesta fase são baixos, pois os grandes folículos anovulatórios são esteróide-incompetentes (Samper et al., 1997), o que combinado com a produção de níveis inadequados de LH, impedem que a ovulação ocorra durante esta fase (Murchie, 2005).Carnevale et al. (1996), verificaram que existe menor actividade folicular em éguas velhas comparativamente com éguas novas durante a transição de Primavera, além de que éguas que pastam em erva verde ovulam mais cedo na Primavera do que éguas estabuladas e alimentadas com feno e ração.

Por tudo o que foi dito, este período é difícil de manipular pelo veterinário, dificultando a sua capacidade de resposta à pressão exercida para que as cobrições se iniciem muito cedo, ainda neste período, o que resulta num elevado número de serviços por égua e por ciclo, já que é

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difícil prever se um folículo irá ovular ou regredir, mesmo para um técnico experiente, recorrendo ou não a drogas indutoras da ovulação(Cuervo-Arango e Clark, 2010). Após várias ondas de crescimento folicular, desenvolve-se por fim um folículo esteróide-competente com capacidade para ovular. A primeira ovulação do ano põe termo à fase de transição (Nie et al., 2007).

Este padrão de ciclicidade sazonal é uma orientação geral e não inclui todas a éguas, pois uma pequena percentagem de fêmeas poderá ciclar durante todo o ano (Blanchard et al., 1998). No período de actividade reprodutiva observam-se ciclos recorrentes, com uma duração média total de cada ciclo de 22 dias (Markovic et al., 2003). Cada ciclo éstrico pode ser dividido numa fase lútea (diestro), com uma duração média de 13 a 14 dias, seguida por uma fase folicular que engloba o proestro (duração de 2 dias) e estro, com uma duração média de 7 dias (Markovic et al., 2003).

1.1.a - Padrão de desenvolvimento folicular na égua

O início do desenvolvimento das ondas foliculares e a selecção do folículo pré-ovulatório são precedidas por um pico da FSH circulante (emergência da onda folicular e selecção folicular) (Donadeu e Pederson, 2008). Ao longo de um ciclo éstrico observam-se dois picos de FSH, um por volta dos dias 9-12 do ciclo (é o mais pequeno), correspondendo ao período de emergência da onda folicular, e o outro aquando da ovulação, quando o folículo de maior dimensão tem cerca de 13 mm de diâmetro (Morel, 2005; Ginther et al., 2008).

Na égua, somente uma ou duas ondas foliculares maiores se desenvolvem em cada ciclo. Uma onda folicular maior, denominada por onda primária, emerge sempre a meio de cada ciclo éstrico (entre o dia 9 e 12) e produz o folículo ovulatório (Sirois et al., 1989; Bergfelt e Ginther 1993). Cerca de 25% (Sirois et al., 1989; Bergfelt e Ginther 1993) dos intervalos interovulatórios apresentam uma onda folicular maior adicional, ou onda secundária, que se desenvolve no início do diestro (Ball, 2005). O ritmo de crescimento do folículo pré-ovulatório e dos folículos não ovulatórios começa a divergir quando o diâmetro do folículo pré-ovulatório atinge uma dimensão média de 22,5 mm (Ball, 2005). Por esta altura, o folículo pré-ovulatório cresce a um ritmo de 3 mm/dia, atingindo os 35 mm cerca de 4 dias antes da ovulação, no inicio do período pré-ovulatório. O ritmo de crescimento mantém-se até 2 dias antes da ovulação, quando o folículo atinge um diâmetro médio de 41mm (Ginther et al., 2008).

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O estradiol produzido pelo folículo dominante exerce um efeito negativo sobre a concentração de FSH, e que é notório pela relação temporal entre as concentrações de estradiol/FSH. A concentração mínima de FSH observada ocorre em simultâneo com o pico pré-ovulatório de estradiol (Ginther et al., 2008).

Outra hormona de origem folicular que intervém na regulação da concentração de FSH é a inibina, produzida pelas células da granulosa e que inibe selectivamente a secreção de FSH. Os níveis circulantes de inibina, que aumentam abruptamente no momento da ovulação, decrescem depois dela devido ao desaparecimento da sua fonte de produção (Nambo et al., 2001). Nambo et al. (2001) referem que o aumento abrupto de inibina associado à ovulação seria consequência da libertação do líquido folicular para a cavidade abdominal, aquando da ruptura folicular na ovulação. Os níveis de inibina começam a aumentar no inicio do desenvolvimento da onda folicular, ainda antes da circulação de estradiol começar a aumentar (Donadeu e Ginther, 2001). A produção de inibina pelos três maiores folículos da onda de desenvolvimento folicular à medida que eles se aproximam dos 13mm de diâmetro é responsável pela diminuição da FSH circulante (Donadeu e Ginther, 2001). Contudo, as concentrações decrescentes de FSH continuam a assegurar o crescimento folicular até que o maior deles (folículo dominante) atinja o diâmetro esperado (aproximadamente 22 mm) no inicio da selecção (Donadeu e Pederson, 2008).A partir daí, as duas hormonas supressoras de FSH, o estradiol e a inibina, actuam em conjunto, exercendo um maior efeito sinérgico na supressão de FSH durante o processo de selecção do folículo dominante, que garante a regressão morfológica e funcional dos folículos subordinados (Miller et al., 1981; Gastal et al., 1998).

O estradiol produzido pelo folículo dominante vai aumentando, atingindo um pico cerca de 2 dias antes da ovulação, para depois diminuir. A concentração sanguínea de LH aumenta lentamente de início, evidenciando-se depois um rápido acréscimo da sua concentração simultâneo ao pico de estradiol, observando-se um pico de LH 1 dia após a ovulação. A diminuição do estradiol no final do crescimento do folículo pré-ovulatório, cerca de 2 dias antes da ovulação deve-se ao estabelecimento de um efeito negativo recíproco da LH na produção folicular de estradiol, a partir do momento em que a concentração de LH atinge um limiar critico. A diminuição inicialmente rápida nas concentrações de estradiol observada 1 a 2 dias antes da ovulação é consequência do efeito negativo que o rápido aumento de LH exerce sobre o estradiol, enquanto que a diminuição lenta de estradiol observada 1 dia após a ovulação é atribuída ao menor efeito negativo exercido pela LH, cujos níveis vão diminuído lentamente nesta fase (Ginther et al., 2008).

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Estudos realizados por Bergfelt et al. (2001), revistos por Donadeu e Watson (2007), comprovam a existência de uma relação temporal directa entre o aumento da circulação de LH, mas não de FSH, e o desenvolvimento de ondas foliculares maiores, suportando a tese de que o aumento da LH desempenha o papel principal na estimulação do desenvolvimento dos folículos dominantes. Donadeu e Watson (2007) tiraram a conclusão adicional de que concentrações de LH acima das necessárias ao crescimento do folículo dominante são necessárias para a aquisição da competência para ovular, isto é, para que o folículo dominante se torne totalmente responsivo ao aumento de LH (Donadeu e Pederson, 2008).Na égua, tem sido referida a existência de um número elevado de receptores de LH nos folículos dominantes, em contraste com o observado em folículos mais pequenos (Goudet et al., 1999). Estudos recentes indicam que o fluído folicular rico em hormonas passa através das fímbrias do oviducto para a cavidade peritoneal durante a ovulação, sendo estas depois absorvidas a partir do peritoneu, o que estará na origem das alterações das concentrações circulantes de estradiol e inibina, que por sua vez interferem com as concentrações de LH e FSH (Ginther et al., 2008). Ginther et al. (2008), constatou a ocorrência de um ligeiro aumento na concentração de progesterona no dia da ovulação. O decréscimo nas concentrações circulantes de LH observado no dia seguinte ao da ovulação está relacionado com o efeito negativo exercido pelo aumento pós-ovulatório de progesterona (Ginther et al., 2008). A concentração plasmática de progesterona aumenta rapidamente após a ovulação, mantendo-se elevada por 14-15 dias na égua não gestante (Morel, 2005)eatingindo um valor máximo, superior a 4ng/ml, aos 4-7 dias após a ovulação (Evans et al., 2007), e 4 a 5 dias antes da próxima ovulação os níveis de progesterona vão diminuindo. Na ausência de uma gestação, no final do diestro, por volta dos 14-15 dias após a ovulação, observa-se a produção de PGF2α pelo endométrio (Evans et al., 2007), que induz a luteólise e, consequentemente, a diminuição dos níveis plasmáticos de progesterona, que retornam a valores inferiores a 1ng/ml (Morel, 2005). Na égua, ao contrário do que está descrito em vacas e ovelhas, a PGF2α produzida pelo endométrio é absorvida pelo sistema venoso uterino, entra em circulação e chega ao ovário por via sistémica (Ginther et al., 2007). A progesterona actua como um promotor da produção de PGF2α, uma vez que é necessária para a produção de ácido araquidónico, um precursor da PGF2α (King et al., 2010). A diminuição da concentração circulante de progesterona no final do diestro, leva ao aumento dos níveis circulantes de FSH e LH necessárias para à ovulação do ciclo seguinte (Morel, 2005). O aumento da produção de estradiol pelo folículo dominante, no ciclo consecutivo, permite que a égua volte a entrar em cio 1 a 3 dias após a luteólise (Evans et al., 2007).

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1.1.b Comportamento reprodutivo na égua

Na estação reprodutiva, a produção de estradiol pelos folículos em desenvolvimento é responsável pela manifestação do comportamento sexual durante o estro. Uma égua em estro irá aproximar-se com maior frequência do garanhão, voltando-lhe os seus quartos traseiros. Frequentemente, adopta uma postura em que baixa a pélvis, desviando a cauda quer para o lado, quer para trás, afastando-a do seu corpo, expondo deste modo a área perineal. Esta postura é acompanhada pela eversão rítmica do clítoris, vulgarmente conhecida como “pisca-pisca” (Crowell-Davis, 2007; Rickets, 2008). Observa-se também a eliminação frequente de pequenas quantidades de urina, que neste período apresenta um odor característico e uma maior quantidade de sedimento, que lhe confere uma coloração amarela brilhante (Morel, 2005). As éguas em estro possuem uma expressão facial característica, com relaxamento dos músculos faciais, cabeça ligeiramente baixa e orelhas voltadas para os lados. No caso da cobrição natural, a égua permanece quieta encostando-se ao garanhão uma vez montada e, pode olhar em direcção deste durante a cópula (Crowell-Davis, 2007).

O nível de receptividade sexual pode ser negativamente afectado pelo elevado nível de reactividade emocional, característico de algumas raças (ex. PSI). Sinais de estro equívocos ou subtis resultam em baixas taxas de detecção de cio e consequentemente em programas reprodutivos ineficientes e baixas taxas de concepção (Górecka et al., 2005).

Associado ao aumento da concentração de estrogénios em circulação observa-se um aumento do edema do tracto reprodutivo e hiperémia moderada dos lábios vulvares e vagina, com o concomitante relaxamento do fórnix vaginal e da cérvix (Morel, 2005). Em simultâneo, observa-se aumento do edema uterino. Por sua vez, a progesterona pode alterar a resposta aos estrogénios, promovendo a redução do edema, que tende a desaparecer pouco depois da ovulação (Cuervo-Arango e Newcombe, 2008). O padrão de edema característico da fase folicular é visível à ecografia e, no pico de estrogénios observa-se um padrão ecográfico característico que pode ser descrito como padrão de roda de carro ou gomos de laranja devido ao edema das pregas endometriais, em particular na cérvix (Carnevale, 2008). Com o peso do edema, a cérvix toma uma posição mais baixa no vão vaginal.

O corpo lúteo produz progesterona que inibe o comportamento sexual. Durante a fase lútea (diestro), a égua irá relinchar, atacar e escoicear o garanhão quando ele tenta aproximar-se. Pode observar-se uma tensão da musculatura facial, orelhas voltadas para trás e uma ameaça constante de morder o garanhão, se este for persistente (Crowell-Davis, 2007; Rickets, 2008). Em resposta aos níveis crescentes de progesterona e aos baixos níveis de estrogénios em

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circulação, as secreções uterinas tornam-se viscosas e ocorre espessamento das paredes uterinas. A cérvix fica com uma aparência esbranquiçada, firme e seca, assumindo uma posição mais central (Morel, 2005).

1.2. Previsão do momento da ovulação

A longevidade dos espermatozóides (SPZ) no tracto reprodutivo feminino e a duração e viabilidade do óvulo, determinam o tempo óptimo para se inseminar. Está descrito que a longevidade dos SPZ varia entre 24h a 7 dias, enquanto que a viabilidade do óvulo é muito mais pequena, de cerca de 8h (Morel, 1993). No entanto, o sémen congelado sobrevive menos tempo no tracto reprodutivo da égua do que o sémen fresco ou refrigerado (Squires et al., 2003; Daels, 2003; Muller, 2008). Assim, para maximizar as taxas de concepção, a cobrição natural deve ser feita 48h antes da ovulação, a IA com sémen refrigerado 12-24h antes da ovulação e caso se trate de ser sémen de garanhões subférteis (Samper, 1997) ou de IA com sémen congelado, em 12 h antes da ovulação ou no máximo de 6h após a ovulação (Samper, 2008).

A determinação do momento da ovulação pode ser conseguida pela detecção do cio, pelo amolecimento de um folículo pré-ovulatório detectado por palpação rectal, por vezes pela aparência do folículo à ecografia e pelo diâmetro folicular (Samper, 1997).

O edema do endométrio aumenta progressivamente durante os primeiros dias do estro, atingindo um pico cerca dos 3,5-4 dias que antecedem da ovulação (Samper, 2008), após o que desaparece (Samper, 1997). É importante relembrar que a diminuição do edema que se observa após o seu pico é um melhor indicador da iminência da ovulação do que a presença de edema, só por si (Pelehach et al., 2002). Cuervo-Arango e Newcombe (2008) verificaram que as éguas tendem a desenvolver padrões de edema uterinos semelhantes no período peri-ovulatório. O grau de edema uterino, combinadocom a determinação do tamanho folicular, é um indicador importante para se saber quando uma égua deverá ser beneficiada (Samper, 1997). Segundo Samper (1997) e Watson et al. (2002) o edema uterino é o indicador mais fiável para a detecção de cio na égua saudável, mesmo quando esta não responde a um rufião1. No entanto, para Watson et al. (2002) a presença de edema uterino fora da estação

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Rufiar é uma técnica na qual a égua é exposta a um garanhão (o rufião), estando ambos separados fisicamente (Crowell-Davis, 2007).

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reprodutiva não é indicador de que um eventual folículo seja esteróide-competente e que venha a ovular.

Contudo, na época reprodutiva o diâmetro folicular é considerado um bom indicador para prever a ocorrência de ovulação (Koskinen et al., 1989) para uma mesma raça, apesar de existirem grandes variações inter-raciais no diâmetro do folículo pré-ovulatório às 24h antes da ovulação, podendo variar entre 34 a 70 mm (Ginther, 1995). Embora este facto possa tornar a previsão da ovulação baseada neste parâmetro duvidosa (Cuervo-Arango e Newcombe, 2008). Existe uma predisposição para no mesmo animal a dimensão dos folículos à ovulação ser relativamente constante, mau grado a existência de pequenas variações associadas a factores ambientais (Newcombe, 2007). A excepção ocorre no cio do poldro, durante o qual, o folículo dominante poderá ser significativamente maior (Carleton, 2007). Samper (2008) refere que algumas éguas irão consistentemente ovular com diâmetros foliculares de 35 mm, enquanto outras não irão ovular até o folículo atingir mais de 50 mm de diâmetro, considerando um intervalo de diâmetro à ovulação compreendido entre os 40-45 mm, 24 a 48h antes do fim do cio. Morel et al. (2010) utilizando éguas de raça Puro-sangue Inglês (PSI), obtiveram um diâmetro folicular médio de 39,95±4,84 mm, 24h antes da ovulação. Esta grande variação deve-se sobretudo a factores como a época do ano (Ginther et al., 1989), com os folículos maiores a ocorrerem no início da época reprodutiva (Abril-Junho), o número de folículos pré-ovulatórios (folículos pré-pré-ovulatórios duplos são aproximadamente 3mm menores do que um só folículo, para a mesma égua e na mesma época do ano) (Newcombe, 2007), a raça (raças pequenas com folículos ligeiramente mais pequenos) e variações individuais dentro de cada raça. Está descrito que as éguas tendem a ovular folículos de diâmetros semelhantes em dois ciclos consecutivos se não forem utilizados indutores da ovulação (Cuervo-Arango e Newcombe 2008). Ginther et al. (2008) referem também que há uma repetibilidade individual em muitos aspectos do ciclo, população de folículos e concentrações de gonadotrofinas entre ciclos éstricos consecutivos.

Morel et al. (2010) referem que as éguas mais velhas ovulam folículos de menor diâmetro no final da época reprodutiva e quando existe mais do que um folículo de grande diâmetro. Também a administração de hCG e PGF2α e a colocação de implantes de deslorelina (um agonista da GnRH) levaram à ovulação de folículos de menor diâmetro em comparação com ciclos espontâneos (Cuervo-Arango e Newcombe, 2008). Durante o estro, o diâmetro do folículo dominante cresce de 2 a 5 mm por dia, podendo o crescimento estacionar nos 3 a 4 dias que precedem a ovulação (Newcombe, 2007). Este ritmo de crescimento tende a ser mais lento em éguas velhas que em éguas jovens (Carnevale, 2008).

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Com o aproximar da ovulação, outras alterações características são observadas ao nível do folículo pré-ovulatório, para além do aumento do seu diâmetro: uma alteração da forma (forma de “pêra” (Atayde e Rocha, 2009)), o aumento da espessura e da ecogenicidade da parede folicular, uma separação das camadas da parede folicular e a diminuição da pressão intra-folicular (Bragg et al., 2001). O aparecimento de um bordo ecogénico a envolver um folículo irregular, doloroso e mole, é um sinal de ovulação eminente (Chan et al., 2003). Num estudo realizado por Ginther et al., (2008) observou-se a separação das camadas da parede folicular e uma diminuição da pressão intrafolicular num folículo superior a 35 mm de diâmetro, tanto em ciclos naturais como em ciclos manipulados hormonalmente. Nestes últimos, verificou-se que a hCG acelerava estes processos. Mais recentemente, a ecografia de modo-B e com doppler colorido, com as quais é possível avaliar diferentes combinações de características da parede folicular (ex. recorte serrado da granulosa e diminuição do fluxo sanguíneo na parede do folículo pré-ovulatório) têm sido utilizadas com sucesso para prever a eminência da ovulação (Gastal et al., 2010).

1.3. Manipulação do ciclo éstrico da égua

Antes do início da época reprodutiva, é prudente determinar qual o sistema de gestão mais apropriado para cada exploração. Os custos, disponibilidade de mão-de-obra e a história reprodutiva da égua são factores importantes a considerar (Macpherson, 2009). A história reprodutiva da égua e a idade são provavelmente os aspectos mais importantes que um veterinário deve ter em conta quando examina uma égua (Samper et al., 2008). O exame completo das estruturas reprodutivas é feito por palpação rectal e ecografia transrectal (Macpherson, 2009). A presença e tamanho dos folículos ováricos, a presença ou ausência de CL e de fluído uterino, o tónus da cérvix e útero e a presença de edema uterino, devem ser avaliados e registados (Macpherson, 2009). Qualquer patologia, incluindo o tamanho e localização de quistos uterinos devem ser registados. Isto tornar-se-á importante na altura de efectuar o diagnóstico de gestação. Devem rufiar-se as éguas diariamente, sendo possível, enquanto estas estiverem em estro, registando-se as alterações subtis no seu comportamento (Macpherson, 2009).

Numa tentativa para melhorar o sucesso reprodutivo de uma égua têm sido investigados e preconizados ao longo dos anos numerosos tratamentos hormonais (Morel e Newcombe, 2008). Baseado nos resultados obtidos através do exame reprodutivo, os agentes

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farmacológicos podem ser usados para aumentar a previsibilidade das ovulações (Macpherson, 2009).

Os dois procedimentos mais frequentemente utilizados no maneio reprodutivo das éguas procuram a indução da luteólise e a indução da ovulação. Embora ambos os procedimentos sejam normalmente alcançados, as condições fisiológicas da fêmea no momento do tratamento afectam o timing da resposta (Samper, 2008).

Numa égua normal a ciclar, o estro pode ser induzido através da administração de uma injecção de PGF2α, que põe fim à fase lútea (Samper, 2008). Por esta razão, esta prostaglandina e os seus análogos sintéticos têm sido usados efectivamente para induzir lise do CL e a indução do estro (Alcántara et al., 2005).

Originalmente, a utilização mais comum de prostaglandinas era a indução do estro numa égua com CL normal ou persistente (McKinon, 2009). Actualmente é usada também para a interrupção precoce da gestação (Newcombe et al., 2008), para indução da contractibilidade uterina para eliminação de fluídos (Squires, 2008), para a sincronização do estro e da ovulação e para induzir a ovulação, uma vez que para além da sua acção luteolítica também promove a libertação imediata de LH, resultando na indução da ovulação em muitas espécies, incluindo a equina (Newcombe et al., 2008). Ataman et al. (2000), demonstraram que a administração de PGF2α na ausência de CL, combinada com a administração de hCG, é efectiva na indução do estro e da ovulação em éguas na fase de transição. A administração de PGF2α poderá ser responsável pelo aumento da secreção de FSH e LH. No entanto, estudos recentes sugerem que a administração de prostaglandinas durante o diestro com o objectivo de encurtar o ciclo, está associada a taxas de gestação mais baixas (Lindeberg et al., 2002; Nielson et al., 2008), embora Metcalf e Thompson (2010) tenham confirmado que o uso de prostaglandinas para indução do estro não afecta as taxas de gestação. Cuervo-Arango e Newcombe (2009) verificaram que éguas tratadas com Cloprostenol (análogo da PGF2α) para induzir o estro têm maior probabilidade de desenvolver folículos anovulatórios hemorrágicos, quando comparadas com éguas com ciclos espontâneos ou tratadas unicamente com hCG. Ginther (2009), constatou também este facto, quando administrou uma dose luteolítica de PGF2α 10 dias após ocorrer a ovulação. Adicionalmente, verificou nas mesmas condições, que a frequência de ovulações duplas também era maior. Uma vez que, esta condição anovulatória tem uma elevada recorrência em ciclos seguintes, está desaconselhado o uso destas drogas para a destruir um folículo hemorrágico luteinizado (Cuervo-Arango e Newcombe, 2010).

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O CL é sensível às prostaglandinas a partir do 6º dia após a ovulação, podendo algumas éguas responder ainda mais cedo (Smith, 2007). Macpherson (2009) afirma que a administração da prostaglandina só é efectiva entre os dias 5 a 16 após a ovulação, enquanto que Squires (2008) refere o intervalo de 5 a 10 dias após a ovulação. Muitos autores consideram que um CL é funcional quando a concentração plasmática de progesterona é superior a 1 ηg/mL (Douglas et al., 1976; Starbuck et al., 1998), enquanto que para outros apenas quando esta é superior a 2 ηg/mL (Meyers, 1993).

Os intervalos para o estro e a ovulação dependem do tamanho do folículo maior no momento da administração da prostaglandina (Squires, 2008). Assim, folículos mais pequenos de 2,5 cm irão normalmente regredir e um novo folículo irá emergir e crescer até ocorrer a ovulação, em 7 a 10 dias. Éguas que possuam um folículo maior do que 2,5 cm virão a exibir sinais de estro pouco depois da administração e ovulam no espaço de 3 a 5 dias. As éguas que tiverem folículos muito grandes (3,5-5 cm), ovulam muito pouco tempo depois da administração de prostaglandina, muitas vezes sem exibirem sinais de estro (Smith, 2007). Num estudo realizado por Newcombe (2008), verificou-se que para cada dose de cloprostenol administrada, o intervalo de dias até à ocorrência de ovulação diminuía, à medida que o diâmetro folicular aumentava, sendo o intervalo até à ovulação mais curto observado, quando se administrou a dose máxima de cloprostenol (625μg), na presença de um folículo com o maior diâmetro considerado (≥36mm).

Por tudo o que foi dito anteriormente, é altamente desejável examinar o estado dos ovários antes da administração de prostaglandinas, primeiro para se verificar se a égua está em diestro e assim decidir o tratamento a implementar, e depois para estimar a idade do CL mais recente e em simultâneo medir o diâmetro do maior folículo presente (Pycock, 2008).

Segundo Samper (2008), numa égua em diestro tratada com PGF2α natural ou um seu análogo, o intervalo médio entre o tratamento e o início do cio é de 3 a 4 dias e a ovulação ocorre 8 a 10 dias depois do mesmo tratamento. Alcántara et al. (2005) afirmam que os sinais de cio surgem geralmente ao quinto dia após tratamento e Metcalf et al. (2010) dizem que o intervalo até a ovulação é em média de 7 dias. Bradecamp (2007), diz que em média as éguas entram em cio 5 a 7 dias após administração da prostaglandina, na presença de um CL maduro, e a ovulação ocorre 9 a 11 dias após o tratamento.

A PGF2α não actua só no CL, a nível do ovário, mas também tem efeitos em órgãos que possuem os mesmos receptores específicos (Vanderwall et al., 2000 citado por Alcántara et al. 2005). Por consequência, pode causar contracção da musculatura lisa do intestino, do tracto

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respiratório e do útero, causando reacções clínicas ou efeitos laterais (Goyngs et al., 1977 citado por Alcántara et al. 2005). A PGF2α é conhecida por causar aumento das frequências cardíaca e respiratória e por causar inquietude do animal, semelhantes àquelas observadas no síndrome abdominal agudo e ainda por provocar sudorese profusa do pescoço, peito e abdómen (Nelson, 1976). Esta condição pode causar incoordenação e o aumento dos movimentos intestinais pode resultar em diarreias aquosas e dor abdominal. Estes sinais são sempre breves e transitórios (Alcántara et al. 2005).

Os análogos sintéticos da PGF2α, à semelhança da PGF2α natural, possuem o mesmo efeito luteolítico em doses habitualmente inferiores à da hormona natural; além disso, tem-se mostrado que os seus efeitos colaterais são mínimos (Alcántara et al. 2005), o que permite reduzir os sinais clínicos e o desconforto do animal.

A dose de dinoprost recomendada é de 9μg/kg (5 a 10 mg por 1000lb/454kg) e a de cloprostenol é de 0,55μg/kg (250μg por 1000lb/454kg) (Bradecamp, 2007). LeBlanc (2006) administrando por via IM 0,5 mg de PGF2α ou 25 μg de cloprostenol aos 6 dias após a ovulação, conseguiram encurtar o ciclo éstrico na ausência de efeitos colaterais, o que foi também conseguido por Smith (2007) através da administração de 5 mg de dinoprost ou 250 μg de cloprostenol. No entanto estudos mais recentes demonstraram que doses mais baixas podem ser utilizadas com a mesma eficácia. Newcombe (2008) demonstrou que doses baixas de cloprostenol (8,75 μg, SC) possuem um efeito luteolítico que não difere em termos de resposta clínica do obtido com doses mais elevadas do mesmo produto farmacêutico (até 250 μg). Barker et al. (2006), administrando uma única dose de 12,5 mg IM de dinoprost por égua, induziu efectivamente a luteólise em éguas em diestro e a indução do estro subsequente foi caracterizada por uma dinâmica ovárica normal.

Embora tenha sido demonstrado que éguas beneficiadas com sémen de garanhões férteis podem conceber mesmo quando a ovulação ocorre passados vários dias, as taxas de concepção irão aumentar significativamente se a égua for beneficiada perto da ovulação (Woods et al., 1990). As principais vantagens da indução da ovulação são: assegurar que a ovulação ocorre entre 36-48h após a cobrição/IA para garanhões com fertilidade normal e assim, prevenir a repetição da cobrição/IA; planear o transporte da égua, caso tenha que ser deslocada para ser beneficiada pelo garanhão; potencializar as hipóteses de concepção quando se usa de sémen de garanhões com baixa fertilidade, associadas a má longevidade dos espermatozóides; assegurar intervalos entre cobrições adequados para os garanhões; um pedido de sémen por ciclo para garanhões muito requisitados; menor número de cobrições e

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redução de contaminação uterina (especialmente em éguas com baixa capacidade de drenagem uterina ou alta susceptibilidade a infecções uterinas); sincronização entre dadora e receptoras nos planos de transferência de embriões; reduzir o trabalho e custos veterinários e realizar inseminações próximas da ovulação, para sémen refrigerado ou congelado (Samper 2008; McKinnon, 2009).

Em associação com os esquemas de interrupção da fase lútea, é usualmente administrado a éguas em estro um agente indutor da ovulação para estimular a ovulação dentro de um período definido (McCue et al., 2007). Isto é importante na medida em que minimiza o número de inseminações necessárias com sémen de longevidade reduzida por ciclo ou por permitir prever a recolha de embriões ou oócitos (Carnevale e Cox., 2008), resultando num programa reprodutivo mais eficiente tanto a nível monetário como a nível de trabalho dispendido (Samper et al., 2002).

Os agentes hormonais usados incluem a Gonadotropina Coriónica Humana (hCG), os agonistas da Hormona Libertadora de Gonadotrofinas (GnRH), geralmente a Deslorelina e, mais recentemente, a Hormona Luteinizante Recombinante equina (reLH) (McCue et al., 2007; Squires, 2008; Miller, 2008). Estes agentes possuem máxima eficiência quando são administrados a éguas com edema endometrial óbvio, cérvix relaxado e na presença de um folículo com diâmetro superior a 35mm (Samper, 2008)e ausência de CL (McPherson, 2010). A hCG é uma hormona glicoproteica placentária grande, com uma semi-vida relativamente elevada (Morel e Newcombe., 2007), que actua através dos receptores de LH nas células que compõe a camada granulosa folicular. Pesquisas recentes demonstraram que a ligação da hCG ou LH às células da granulosa resulta na libertação de factores de crescimento semelhantes ao EGF. Estes ligam-se ao complexo do cumulus para que se inicie a maturação do oócito (Carnevale e Cox., 2008)e consequente ovulação(McCue et al., 2007).

Num estudo realizado por Ginther et al. (2008) a administração de uma dose de hCG capaz de induzir a ovulação traduziu-se na diminuição imediata das concentrações circulantes de estradiol e num aumento das concentrações circulantes de LH em 24h, semelhante ao observado na ovulação espontânea, indicando que o efeito da hCG se possa dever a um mecanismo indirecto entre estradiol/hCG (Ginther et al., 2008).

Após a administração de uma dose de 1500-3000 UI de hCG a éguas com folículo maior que 35mm de diâmetro, por via endovenosa (LeBlanc 2006) ou intramuscular (Samper, 2008), a ovulação irá ocorrer em 24-48h (uma média de 36h), (Ginther et al. 2008; LeBlanc, 2006;

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Pycock 2008). Gastal et al. (2006) refere um estudo que concluiu que a administração de uma dose de 1500UI ou 2500UI nas mesmas circunstâncias induz a cessação do crescimento folicular e assim, reduz o diâmetro do folículo pré-ovulatório nas éguas tratadas. As doses de hCG usadas pela maioria dos veterinários estão compreendidas entre as 2000-10000 UI. No entanto, existem casos que reportam que o uso de doses elevadas, na ordem dos 4500-6000 UI, pode reduzir as taxas de concepção (McKinnon., 2009). Embora a maior parte dos veterinários use uma dose de 1500 UI, uma dose mais baixa (750 UI), poderá ser igualmente efectiva, mais tarde na época reprodutiva (Newcombe, 2007). A administração de hCG também pode ser feita para induzir a ovulação na presença de um folículo com 40mm de diâmetro durante o final da época de transição, no entanto não é garantido que a ovulação ocorre dentro de um intervalo de tempo preciso (Blanchard et al., 1998).

Existe uma certa variação na resposta ao tratamento atribuída a factores individuais, tais como a idade, fase do estro e diâmetro folicular (Samper, 2008). Segundo Serres et al. (2010) a éguas com mais de 16 anos está associada uma distribuição mais ampla da ovulação, embora estes autores não tenham encontrado, ao contrário de LeBlanc (2006), uma menor eficácia em induzir uma ovulação programada desta forma. LeBlanc (2006) verificou que a administração de hCG a éguas nos meses de Maio, Junho e Julho aumentava a probabilidade destas ovularem em 12 a 24h em relação às que recebiam o mesmo tratamento nos meses de Fevereiro, Março ou Abril (80-92% destas éguas irão ovular próximo das 48h após a administração desta hormona), concluindo-se que o seu efeito depende também da estação do ano.

Serres et al. (2010) realizaram um estudo no qual administravam hCG em diferentes horas do dia e verificaram que a administração de hCG não suprimiu completamente o padrão diurno de ocorrência da ovulação, embora o efeito deste ritmo circadiano endógeno possa ser substituído pela administração de hCG sempre à mesma hora do dia.

A eficácia da hCG está reduzida quando esta é administrada repetidamente a uma égua durante uma época reprodutiva (Samper, 2008;Serres et al., 2010), traduzindo-se na não ocorrência da ovulação em 48h (LeBlanc, 2006), o que tem sido associado ao desenvolvimento de anticorpos anti-hCG (Carnevale e Cox, 2008; McKinnon, 2009). A via de administração IM, apesar de poder ser usada, tem maior probabilidade de induzir a formação de anticorpos (Smith, 2007). Em oposição,Gastal et al. (2006) verificaram que a eficiência da administração de hCG não parece estar afectada, mesmo quando esta é administrada em 3 ciclos éstricos consecutivos, na mesma época reprodutiva.

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A dose de hCG administrada também influencia o tempo que medeia desde a sua administração à ovulação, sendo este em média menor quando se administra 2500UI ou 1500UI comparativamente a 500UI (Gastal et al. 2006). Apesar desta última dose não ser adequada para induzir uma alta taxa de ovulação em 24-48 horas, é ainda assim suficiente para reduzir o intervalo até à ovulação quando comparado com éguas sem tratamento (Gastal et al. 2006). Morel et al. (2008) demonstrou que uma dose de 750 UI de hCG é tão efectiva como uma dose de 1500 UI para induzir a ovulação, e como tal devia ser preconizado o seu uso. Este autor concluiu ainda que não existem contra-indicações no que diz respeito ao aumento da ocorrência de ovulações e gestações múltiplas resultantes do uso de hCG e que, apesar desta hormona induzir eficazmente a ovulação e reduzir o aumento de ovulações múltiplas, isto parece não fazer aumentar as taxas de concepção em éguas manipuladas intensivamente, nem aumentar o risco de gestações múltiplas.

Um problema que surge quando se faz inseminação artificial com sémen refrigerado, é o dia em que deve ser feito o pedido da dose seminal. Há muitos garanhões que não estão disponíveis diariamente para recolhas de sémen, e o veterinário deve estar informado acerca dos dias em que o poderá receber. Além disso, a monitorização da dinâmica folicular a partir do momento em que a égua inicia o estro é essencial para que o sémen seja pedido no momento certo (Brinsko et al. 2000). Tendo em conta que a inseminação com sémen refrigerado deve ser realizada dentro das 12-24 horas que precedem a ovulação (Samper 2008) é boa prática que o sémen seja pedido quando a égua está em cio e apresenta um folículo de 30 a 35mm no ovário. O tempo que medeia entre o pedido e a recepção do sémen é geralmente de cerca de 24 horas (tempo necessário para o transporte rápido do sémen) pelo que é importante o pedido ser feito pelo menos 48 horas antes do momento previsto para a ovulação. O uso de agentes indutores da ovulação potencializa a sincronia entre a inseminação e a ovulação (Brinsko et al. 2000). Assim sendo, quando o folículo dominante atinge 35mm de diâmetro, a maioria das éguas ovula de 36 a 48 horas após administração de hCG, quer na dose 1500 UI ou 3000UI por via IV ou IM (Brinsko et al. 2000). Por essa razão, se não há dúvida que o sémen é recebido no dia seguinte, nesse momento pode ser feita a indução da ovulação. No caso de não haver certeza da recepção do sémen, é preferível não induzir a ovulação e evitar assim que esta ocorra a ovulação antes da chegada do sémen (Brinsko et al. 2000).

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2. Material e Métodos

2.1. Animais

Neste estudo, que decorreu entre os meses de Fevereiro e Maio de 2010, na Unidade de Reprodução e Obstetrícia da Fundação Alter Real (FAR), foram utilizadas 30 éguas de raça Puro-sangue Lusitano (PSL), 1 égua de raça Puro-sangue Árabe (PSA), 3 éguas de raça Sorraia, 53 éguas Cruzadas Portuguesas, 1 égua de raça Holandês de equitação (KWPN) e 1 égua de raça Sela Francês (SF), num total de 89 éguas (Tabela 1). As suas idades estavam compreendidas entre os 3 e os 22 anos, sendo a idade média de 10,22±4,4 anos. Em virtude dos meses em que decorreu o estudo, 27 (30,3%) éguas encontravam-se em época de transição de Primavera e 62 (69,7%) éguas encontravam-se na época reprodutiva. Todas a éguas estiveram alojadas nas instalações da FAR durante o estudo, sendo alimentadas com a mesma ração (ração comercial de manutenção) duas vezes ao dia bem como palha e água ad libitum.

Tabela 2 - Número de éguas por raça admitidas em estudo.

CP KWPN PSA PSL SF SORRAIA Total

n 53 1 1 30 1 3 89

Frequência relativa

(%) 59,6 1,1 1,1 33,7 1,1 3,4 100

2.2. Detecção do cio e avaliação das estruturas ováricas

Para a detecção do cio foi utilizado o método de rufiamento, recorrendo-se a um garanhão da Coudelaria, especialmente escolhido para este efeito. Durante a detecção do cio, a égua permanecia no interior da boxe, mantendo-se apenas a janela aberta, para permitir o contacto visual e físico (Figura 1A e 1B). Depois, cuidadosamente, deixava-se o garanhão aproximar-se e observavam-se e registavam-se as alterações comportamentais da égua. O comportamento da fêmea perante o garanhão era avaliado por um observador localizado numa boxe contígua, com visibilidade para a boxe da égua em causa. A égua era considerada em cio quando se mostrava fortemente interessada no garanhão, com eversão dos lábios vulvares e

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exteriorização do clítoris, elevação da cauda e abaixamento da garupa e quando urinava (Figura 1B). Contrariamente, uma égua que demonstrava agressividade para com o garanhão, que escoiceava, dava mãozadas, mordia e voltava as orelhas para trás, não era considerada em cio.

Figura 1 - Detecção do cio em éguas. [A] - Utilização do garanhão na detecção do cio. [B] - Elevação da cauda,

inclinação da garupa e micção.

Após detecção dos cios, realizava-se a avaliação do trato reprodutivo por palpação e ecografia transrectais, com o objectivo de determinar a fase do ciclo éstrico. Todo este trabalho era realizado diariamente e sempre que chegavam novos animais para serem beneficiados na FAR.

Através da palpação rectal avaliava-se o posicionamento, consistência, tamanho, sensibilidade e forma do útero e ovários. Todas as éguas recém-chegadas e éguas com desenvolvimento folicular eram ecografadas (ecógrafo Esaote PieMedical® Aquila, Servive, com sonda de 6.0MHz; Figura 2A). O diâmetro folicular era medido (dois diâmetros maiores, colhidos em ângulo recto; figura 2B) e registado, sendo considerado o maior valor verificado em sucessivas medições (em média 3 medições).

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Figura 2 - Realização de controlo ecográfico. [A] Por ecografia avaliava-se a dinâmica folicular e estudava-se o

grau de edema do endométrio. [B] Imagem ecográfica de um folículo com diâmetro superior a 35mm.

2.3. Tratamentos

Os animais incluídos neste estudo (n=89), e que foram recebidos na FAR para efeitos de beneficiação, nem sempre se encontravam em cio. Assim, 28 animais foram identificados em fase adequada à beneficiação imediata. Dos restantes, 36 em fase folicular precoce e com sinais de cio (presença de um folículo em desenvolvimento nos ovários) e 25 encontravam-se em diestro com um corpo lúteo maduro num dos ovários.

Em função do estádio funcional dos ovários, os animais foram seleccionados para distintos tratamentos:

Tratamento 1 (n=36) - Para indução da ovulação utilizou-se a administração de hCG

(Chorulon®,Intervet; 1500-3000 U.I. IV ou IM), ministrada quando o diâmetro folicular era igual ou superior a 35mm. Por precaução, a égua era vigiada nos minutos após a administração desta hormona, para se observar uma potencial reacção anafilática.

Tratamento 2 (n=9) - Em animais em diestro, com CL maduros (considerados maduros quando

tinham mais de 5 dias), ou quando na ausência de registos prévios apresentavam um ou mais CL nos ovários, com o objectivo de interromper o ciclo e promover a lise do corpo lúteo recorreu-se à administração de PGF2α (Dinolytic®, Pfizer 1,5 mL, IM - 7,5mg/égua). Estes animais eram submetidos a controlo ecográfico do desenvolvimento folicular a partir do dia 3 pós-administração. A estes animais não foi administrada hCG, ou porque se pretendia avaliar a evolução de um ciclo de desenvolvimento folicular até à ovulação (animais admitidos pela primeira vez para beneficiação na FAR) ou porque isso levaria à beneficiação numa data de indisponibilidade para a sua execução. Tal como com a administração de hCG, após a administração de PGF2α , as éguas eram mantidas sob vigilância por alguns minutos, para se observar a ocorrência de eventuais efeitos colaterais.

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Tratamento 3 (n=16) - administração consecutiva de PGF2α e hCG, sendo esta última administrada quando, após a interrupção do ciclo ovárico, um folículo em desenvolvimento apresentava mais de 35 mm de diâmetro.

Animais não submetidos a qualquer tipo de tratamento foram agrupados no Grupo controlo (n=28).

2.4. Beneficiação das éguas

Todos os animais integrados no estudo foram beneficiados com recurso à IA. No caso de se proceder à IA com sémen fresco esta era executada em simultâneo com a administração de hCG ou, se no momento da administração de hCG ainda existisse um grau elevado de edema uterino, era apenas realizada 24h após a administração de hCG. A ocorrência de ovulação era confirmada por ecografia transrectal 24h após a IA. Se até às 48h pós-IA a égua não tivesse ovulado repetia-se a IA. No caso do sémen utilizado ser de qualidade inferior, a IA repetia-se às 24h.

Quando se procedia à IA com sémen congelado, recorria-se sempre à indução da ovulação, mas a IA era apenas realizada depois de confirmada a ocorrência de ovulação, ou seja, quando à ecografia transrectal era visível um CL recém-formado. Isto obrigava à realização sistemática de ecografias, normalmente a intervalos de 3 a 4h, até se observar o CL.

O diagnóstico de gestação foi realizado por ecografia transrectal 14 dias após a realização da IA.

2.5. Recolha de dados

Para este trabalho, foram utilizados os dados relativos aos diâmetros foliculares no dia do tratamento com hCG e aos dias 3, 2 e 1 antes da ovulação. Por motivos alheios à nossa vontade (relativos ao proprietário ou à ocorrência de um fim de semana durante os trabalhos) nem sempre nos foi possível seguir adequadamente todos os animais.

Consequentemente, a recolha de dados relativos a éguas particulares nem sempre ficou completa, pelo que a avaliação dos parâmetros individuais foi baseada apenas nos dados que se conseguiram registar. Isto ocorreu sobretudo nos dados relativos aos diagnósticos de

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gestação. Das 89 éguas utilizadas no estudo, apenas foi possível obter dados relativos ao diagnóstico de gestação em 61 éguas (68,5%).

2.6. Análise estatística

Os dados recolhidos ao longo deste trabalho foram armazenados em folhas de dados Excell 2007 (Microsoft Office ®) que foram posteriormente transpostas para o programa de estatística utilizado, tanto para a sumarização dos dados através de estatística descritiva como para a realização da análise de variância (ANOVA).

Para calcular as frequências, intervalos de tempo e diferenças entre os parâmetros estudados a partir dos registos obtidos, recorreu-se ao programa estatístico SPSS 18 (2009). Estudou-se: (1) o intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio; (2) o efeito da época de realização dos tratamentos (época reprodutiva vs. época de transição) no intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio; (3) o efeito da raça no intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio; (4) comparação entre o efeito da associação de PGF2α e hCG (Tratamento 3) ou administração isolada de PGF2α (Tratamento 2) no intervalo de dias desde a administração de PGF2α até à ocorrência de ovulação; (5) comparação entre o efeito da associação de PGF2α e hCG (Tratamento 3) ou administração isolada de PGF2α (Tratamento 2) e da época reprodutiva/transição no intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a ocorrência de ovulação; (6) o efeito da idade sobre a resposta à administração de PGF2α e hCG (Tratamento 3) ou administração isolada de PGF2α (Tratamento 2) (tempo até à ocorrência de ovulação); (7) Associação entre o diâmetro folicular 1 dia antes da ocorrência da ovulação e o intervalo de tempo até ocorrer a ovulação para os animais tratados PGF2α e hCG (Tratamento 3) ou administração isolada de PGF2α (Tratamento 2); (8) o efeito da raça e do tratamento implementado (Tratamento1, 2 ou 3) no diâmetro folicular nos dias 3, 2 e 1 que antecederam a ovulação; (9) o efeito da época de tratamento (reprodutiva vs. transição) e do tratamento implementado (Tratamento1, 2 ou 3) no diâmetro folicular nos dias 3, 2 e 1 antes da ovulação; (10) o efeito da idade e do tratamento implementado (Tratamento1, 2 ou 3) no diâmetro folicular nos dias 3, 2 e 1 que antecederam a ovulação; (11) o efeito do tratamento implementado (Tratamento1, 2 ou 3) na obtenção de uma gestação; (12) Efeito da época de tratamento (reprodutiva vs. transição) na obtenção de gestação, consoante o tratamento implementado (Tratamento1, 2 ou 3).

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Dada a inexistência de registos respeitantes às éguas de raça KWPN e SF, os dados destas duas raças não foram considerados para efeito de análise estatística dos pontos 3 e 8.

Considerou-se que a interacção entre estes diferentes factores tinha carácter significativo quando o valor de P≤0.05.

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3. Resultados

Neste trabalho utilizaram-se dados relativos a 89 éguas, que deram entrada nas instalações da FAR para serem beneficiadas por IA. Destes animais, foram submetidos a tratamento médico para interrupção do ciclo e/ou indução de ovulação 61 animais. O número de éguas submetidas a tratamento com hCG (Tratamento 1) foi de 36 (40,45%); O número de éguas incluídas no Tratamento 2 (PGF2α) foi de 9 (10,11%) e o número de éguas tratadas no mesmo ciclo com a associação PGF2α+ hCG (Tratamento 3) foi de 16 (17,98%) (Tabela 2).

Tabela 2 - Tratamentos realizados durante o estudo.

Tratamentos n Frequência relativa (%)

1 36 40,45

2 9 10,11

3 16 17.98

Sem tratamento (Grupo controle) 28 31,46

Total de animais 89 100

A idade dos animais inseridos no grupo controlo variou entre os 6 e os 18 anos, tendo oscilado entre os 3 e os 22 anos no caso dos animais tratados. A distribuição da idade por percentis para estes animais é apresentada nos gráficos seguintes (Figuras 3 e 4).

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Figura 4 - Distribuição nos percentis de idade dos animais submetidos a tratamento.

Das 89 éguas utilizadas no estudo, 85 (95,5%) foram inseminadas com sémen fresco e apenas 4 (4,5%) foram inseminadas com sémen congelado. O diagnóstico de gestação só foi realizado em 61 animais, tendo a gestação sido confirmada em 31 éguas (50,8%) e sido emitido um diagnóstico de não gestação para 30 fêmeas (49,2%).

O menor número de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio foi de 2 dias, e o maior 10 dias. O intervalo médio entre a administração desta molécula e o início do cio foi de 4,96±1,97 dias.

Não se observaram diferenças significativas (P=0,057) entre o intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio entre éguas que se encontravam em época de transição (3,88±0,66 dias; n=8) e aquelas que se encontravam na época reprodutiva (5,47±0,45 dias; n=17).

Por seu lado, nos animais estudados a raça apresentou um efeito significativo (P=0,006) sobre o intervalo de dias desde a administração de PGF2α e a manifestação de comportamento de cio. Este intervalo médio foi mais curto para o CP e PSA (4,41±0,38 e 3,00±1,58 dias, respectivamente) do que para o PSL e o Sorraia (respectivamente 6,00±0,64 e 10,00±1,58 dias). Não se encontraram diferenças (P=0,194) no intervalo de dias até à ocorrência de ovulação entre as éguas tratadas com a associação PGF2α+hCG (Tratamento 3; 10,81±0,86 dias)e as éguas submetidas a tratamento isolado com PGF2α (Tratamento 2; 8,89±1,15 dias). Também a época em que se efectuou o tratamento (época de transição vs. época reprodutiva)