Relatório 3 - Eletroforese, SDS-PAGE, Gel Nativo, Zimograma

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE – CCB CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE – CCB

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR – DBB DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR – DBB

BIOQUÍMICA ANALÍTICA – BQI 305 BIOQUÍMICA ANALÍTICA – BQI 305

AULA PRÁTICA Nº 0

AULA PRÁTICA Nº 0

E!"#$%&%$"

E!"#$%&%$"'"(

'"( SDS)P

SDS)PAGE

AGE( ( G"! N*#+,%(

G"! N*#+,%( -+.%/$*.*

-+.%/$*.*

G"+** G%."')120 G"+** G%."')120 L"#4+* L%"')11367 L"#4+* L%"')11367 A$*.+' S+!,*)16708 A$*.+' S+!,*)16708 D9:%$* G%;,"+*)17<60 D9:%$* G%;,"+*)17<60 G$*=+"!* P*;!+%)6<172 G$*=+"!* P*;!+%)6<172 VIÇOSA VIÇOSA SETEMBRO( 20<8 SETEMBRO( 20<8

<> I#$%?;@%

A Eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração das substancias (proteínas, DNA, RNA, etc.) mediante a presença de um potencial elétrico, esta migração se baseia no tamano, forma molecular e também o tempo !ue se gasta durante todo o processo.

F = q. E/d

" # "orça do campo elétrico $ potencial em %olts&cm $ E&d

E # 'oltagem aplicada (diferença de potencial entre os dois eletrodos) d # distncia (cm) entre os eletrodos

! # carga da partícula

A eletroforese de proteínas é realiada normalmente em gel de poliacrilamida. * gel de poliacrilamida é formado pela polimeriação de mon+meros de acrilamida na  presença de pe!uena !uantidade de bisacrilamida. A bisacrilamida é formada por dois mon+meros de acrilamida ligadas por um grupo metileno e é utiliado como agente formador de ligaç-es cruadas.

A polimeriação da acrilamida é iniciada pela adição de E/ED (N, N, N0, N0 tetramet1lenediamine). E/ED catalisa a decomposição de íons persulfato em nion sulfato e radical sulfato.

S₂O₈−2 2 ._¿ −¿ → S O 4 −2_{+ S O} 4 ¿ e¿

*345 o representa o elétron desemparelado

* tamano do poro gerado no gel de poliacrilamida pode ser alterado %ariandose a  porcentagem de acrilamida. *s géis de acrilamida podem ser preparados na  porcentagem entre 6789 de acrilamida. 3ai:as porcentagens resultam em géis com

SDS)PAGE

4D4;A<E é um método em !ue as proteínas são separadas segundo o tamano, a an=lise de proteínas por 4D4;A<E também é >til para a determinação da massa molecular relati%a da proteína.

* 4D4 é um detergente ani+nico e ligase fortemente ? proteína desnaturandoa. @ma molécula de 4D4 ligase a dois resíduos de amino=cidos.

As amostras não são aplicadas diretamente no gel de separação e sim sob uma camada de gel mais poroso conecido como gel de empilamento. A função do gel de empilamento é concentrar a amostra de proteína para formar bandas mais finas antes de entrar no gel de separação, para !ue elas possam começar a correr no mesmo instante, assim a carga e ponto de partida não contribui para os possí%eis erros.

  * gel de empilamento possui poros maiores aos !uais permitem a li%re migração das proteínas sob a ação de um campo elétrico. uando a corrente é ligada, todas as espécies i+nicas precisam migrar com a mesma %elocidade. * comple:o  proteína4D4 carregado negati%amente migra para o nodo, e como todas as proteínas  possuem a mesma carga elétrica, elas migram no gel de separação com a mesma %elocidade. No entanto, ? medida !ue eles passam no gel de separação as proteínas de tamanos diferentes se separam de%ido ao tamano dos poros presentes no gel. Desta forma, !uanto menor a proteína mais facilmente ela migrar= no gel, en!uanto proteínas maiores tem sua migração retardada.

G"! N*#+,%

* 4D4;A<E não é %i=%el para e:perimentos em !ue o intuído é detectar uma  proteína com base em sua ati%idade biolBgica, pelo fato do 4D4 desnaturar 

completamente a proteína destruindo sua ati%idade biolBgica. Neste caso, utiliase o gel nati%o !ue é preparado utiliandose o gel de poliacrilamida na ausCncia de 4D4.

 Nestas condiç-es as proteínas possuem carga elétrica distinta no p do gel e as  proteínas são separadas com base em sua motilidade pelo gel. Nas an=lises utiliando gel nati%o é difícil informar o comportamento de cada proteína, mas de%ido ?s características distintas de cargas e formas, conseguese uma boa separação das  proteínas em uma mistura. A enima de interesse pode ser identificada incubandose o

D"#"4@% ?* P$%#"* % /"!

* corante mais comumente utiliado para detectar as proteínas em um gel é o oomassie 3rilliant 3lue R6FG (33). A coloração normalmente é feita com 4olução corante oomassieblue # G,89 oomassie3lue R6FG (p&%), 79 =cido acético glacial (%&%), HF9 metanol ou etanol (%&%). A mistura =cidometanol age como um agente desnaturante !ue precipita e fi:a as proteínas no gel, e%itando !ue as proteínas seIam  perdidas no processo de la%agem do gel.

2> MATERIAIS E REAGENTES

REA<ENE45

• RJ4base, 4D4, Acrilamida, 3isacrilamida, ;ersulfato de am+nio, 4olução

comercial de E/ED, glicerol, aul de bromofenol, Kmercaptoetanol, <licina, EDA, oomassie3lue R6FG, =cido acético glacial, metanol, etanol e =gua destilada.

/AERJA45

• 4istema de montagem de gel, pipetas autom=ticas, ponteiras para pipetas

autom=ticas, pisetas com =gua, cuba de eletroforese e fonte para cubas de eletroforese.

4*L@ME45

• ampão de 4eparação H: (ampão de 3ai:o3) # 8,F / RJ4base, G,H9 4D4,

 p O,OP

• ampão de oncentração H: (ampão de ima) # G,F / RJ4base, G,H9

4D4, p Q,OP

• 4olução Acrilamida&3isacrilamida  (G9, 6758)P • 4olução 8G9 de ;ersulfato de am+nioP

• 4olução comercial de E/EDP

• ampão de amostra : # glicerol G9, 4D4 7,69(%&%), aul de bromofenol 89

(p&%), Kmercaptoetanol 6G9 (%&%), G,6F / RJ4base p Q,OP

• ampão de corrida 8G: # G,6F / RJ4base, 8,7 / <licina, 8G m/ EDA, F

m/ 4D4P

• 4olução corante oomassieblue # G,89 oomassie3lue R6FG (p&%), 79 =cido

• 4olução descorante # S,F9 =cido acético glacial, 6F9 metanol ou etanolP • ampão de e:tração de proteínas # RJ4base FG m/ p Q,O.

2<> PROCEDIMENTO EPERIMENTAL

;rimeiramente o sistema de eletroforese %ertical foi montado com o au:ílio do  professor da aula pr=tica, a seguir o sistema gel foi também preparado seguindo os

seguintes passos5

Jdentificação de H bé!ueres5 (8) 4D4;A<Egel de cima, (6) 4D4;A<Egel de  bai:o, () Timogramagel de cima e (H) Timogramagel de bai:oP

;reparo dos géis seguindo a tabela5

GEL DE BAIO OU GEL DE SEPARAÇO

R"*/"#" C%4"#$*@% &+*! P*$* 1(5 .L H*$* ;. /"!>

Ugua .GHHuL

ampão de bai:o HV 8V 8OSFuL 3isacrilamida (G9) 8G9 6FGGuL ;ersulfato de Am+nia 8G9 SFuL

emed SuL

GEL DE CIMA OU GEL DE EMPILAMENTO

R"*/"#" C%4"#$*@% &+*! P*$* 3(2 .L H*$* ;. /"!>

Ugua 8SSO

ampão de cima HV 8V OGG 3isacrilamida (G9) F9 FQG ;ersulfato de Am+nio 8G9 OG

emed F

• Etapas feitas durante o procedimento5

 "oi adicionado e solubiliado alguns grnulos de 3romofenol aos bé!ueres com gel de cimaP

 Ao bé!uer WTimogramagel de bai:oX foi adicionado 8F,G mg de gelatina (para S,F mL de gel), depois o gel foi agitado e a!uecido no microondas por F segundo a 8GG9 de  potCncia, apBs foi dei:ado na bancada para esfriarP

 "oi adicionado, ao bé!uer W4D4;A<Egel de bai:oX, ;A e E/ED na solução do gel de separação (gel de bai:o), apBs omogeneiado F,F mL da solução foi %ertida no sistema de gel, utiliando uma pipeta de 8,G mL sendo dei:ado um espaço para o gel empilador (gel de cima)P

 Jmediatamente apBs foi adicionado lentamente a solução FGG uL da solução de n 3utanolP

 ApBs a polimeriação, o butanol foi descartado na pia e a superfície do gel foi la%ada com =gua deioniada, e seu e:cesso foi secoP

 "oi adicionado ao bé!uer WTimogramagel de bai:oX, ;A e E/ED na solução do gel de separação (gel de bai:o) !ue omogeneiado e adicionado F,F mL no sistema de gel, utiliando uma pipeta de 8,G mL, foi também dei:ado um espaço para o gel empilador  (gel de cima)P

 Jmediatamente apBs foi adicionado FGG uL da solução de n3utanol e feito seu descarte apBs a polimeriação do gelP

 Em seguida foi colocado ;A e E/ED no bé!uer W4D4;A<Egel de cimaX, o !ual foi omogeneiado e adicionado sobre o gel de separação até ter completado o sanduíce, o pente ade!uado foi também colocado no lugar ade!uadoP

 * mesmo procedimento descrito acima foi feito para WTimogramagel de cimaXP

 ApBs dos esses passos foi esperado o tempo de o gel polimeriar, os pentes foram retirados sua%emente.

As amostras foram preparadas seguindo as seguintes instruç-es do professor5

• ;reparo das amostras usando o tampão A sem agente redutorP • Timograma5 não fer%er as amostras a serem aplicadas no gelP

• ApBs a aplicação das amostras, conectar os cabos dos eletrodos na fonte, ligar 

selecionando amperagem de HG mA fi:aP

• ;roceder a eletroforese até !ue o corante aul de bromofenol a 8,G cm do final

do gel, desligar, desmontar o sistema e colocar os géis na solução corante por   pelo menos H orasP

• ;roceder ? descoloração faendo trocas de tampão de descoloração até !ue o gel

fi!ue transl>cido e as proteínas coradas em aul. A re%elação do Timograma seguiu os seguintes passos5

8). ApBs a corrida, la%ar  %ees com 8F mL de triton 6.F9 por HG minP

6). La%ar  %ees com 8F mL de tampão de incubação (tris base 8GG m/, p O.G, 6,G m/ al6 e riton G.GGF9) por G minutosP

). Jncubar a So&8O oras em HG mL de tampão de incubação, sem agitaçãoP H). orar com FG mL comassie R6FG por 6 orasP

F). La%ar com solução de descoloração. 'isualiar as bandas claras indicati%as de  proteBlise da gelatina no gel.

3> R"';!#*?%' " ?+'4;''J"'

* gel de 4D4 # page do grupo 8 , obte%e uma Btima corrida de proteínas,  permite %isualiar nitidamente, a separação das proteínas presente na amostra de acordo com a massa molecular, I= !ue, o 4D4 torna a carga e a forma da proteínas insignificante, assim a corrida de eletroforese separa !uase !ue e:clusi%amente por  massa molécula. As bandas mais salientes, na imagem, são proteínas de peso molecular  maior, no caso da banda referente a !uimiotripsina a banda mais forte, pode representar  a !uimiotripsina em sua integridade !uase total ou o domínio funcional da enima,  podemos %erificar isso pelo peso molecular.

* imograma mostra, !ue a corrida foi bemsucedida na caneleta  (!uimiotripsina), nas canaletas F e Q, (Amaciante de carne e e:trato proteico de fungo respecti%amente), a cor esbran!uiçada, é de%ido a ação da enima na sua conformação nati%a, bem como, das proteases em sua conformação nati%a, o esbran!uiçamento é resultado da digestão, ou seIa, !uebra das ligaç-es peptídicas do gel de eletroforese,  pois, ele é composto de proteínas !ue comp-e a gelatina.

G$;% 2

Em relação ao gel de 4D4 do nosso grupo, nota se !ue ou%e a separação de  proteínas de diferentes massas moleculares, no entanto, a corrida não foi muito

eficiente, por!ue, as proteínas correram pouco, o !ue atrapala a separação das mesmas, essa corrida ineficiente, pode ser resultado de contaminantes nas amostras, mas, o erro

mais pro%=%el, é o fato de o tampão de corrida, não cobrir totalmente a cuba, o !ue dificulta a passagem da corrente elétrica.

*bs.5 o ní%el do tampão de corrida, esta%a bai:ando durante a corrida do gel de 4D4 # ;age, e te%e !ue ser monitorado e resposto, a causa desse %aamento, foi a montagem imperfeita da parte interna da cuba, e como não notamos esse %aamento, na  presença de =gua, não corrigimos o erro a tempo.

Em nosso imograma, notamos a presença de ati%idade de proteases, nas canaletas referentes ao amaciante de carne e ao e:trato proteico de fungo, o !ue mostra, !ue as proteases estão em sua conformação nati%a. No entanto, a canaleta  referente a !uimiotripsina, não mostrou ati%idade, pro%a%elmente por!ue, a enima est= desnaturada, ou ainda, não = enima (de%ido a erros de e:ecução da pratica, como  pipetagens).

G$;% 3 

* gel de 4D4 do grupo , te%e uma e:celente corrida, permitindo a separação das proteínas presentes nas amostras, por diferença de massa molecular. As bandas destacadas pelas setas %ermelas, possuem peso molecular de apro:imadamente de FGYDa (canaleta 6), QGYDa (canaleta H), 6GYDa (canaleta ) e de HG # FG YDa (canaleta S).

> D+'4;''% /"$*! ?* $K#+4*

Alguns pontos importantes da pratica de%em ser discutidos como5

*s erros referentes a separação de proteínas (4D4;A<E) e %isualiação da ati%idade proteica (imograma), podem ser resultados de pipetagens erradas, corrida insuficiente, preparo dos géis, soluç-es tamp-es não ade!uadas e&ou contaminadas, e de condiç-es de trabalo inade!uadas.

A eletroforese permite %erificamos tanto o grau de purea !uanto a comple:idade da amostra, esta >ltima, pode ser %erificada pela a separação de bandas na corrida eletroforetica, o grau de purea pode ser %erificado atra%és do peso molecular  das bandas de referCncias (caso esteIamos analisando uma proteína conecida) e também pela corrida da amostra, por e:emplo, caso a amostra em estudo esteIa contaminada ela pode correr pouco, ou ainda, nem cegar a correr, isso acontece por  e:emplo, !uando a proteína e:traída do meio biolBgico est= agregada a outras moléculas do meio.

Além disso, é possí%el estipular o peso molecular das proteínas, !uando dispomos de marcadores de peso molecular, e permite também a %isualiação da

ati%idade proteolítica das enimas (Timograma), desde de !ue essas se encontrem em sua conformação funcional, !uando as proteases estão em sua conformação nati%a, elas são capaes de digerir a gelatina, !ue constitui o gel, dei:ando um rastro& manca esbran!uiçada, um e:emplo disso, é ati%idade proteolítica na canaleta referente ao amaciante de carne, a !uimiotripsina e ao e:trato proteico de fungo, sendo assim essas enimas estão em sua conformação funcional (esta%am integras), o !ue mostra a eficiCncia da corrida e do tampão de incubação, além, da coerCncias dos procedimentos  pr=ticos. Essas enimas ti%eram ati%idade contra o gel, por!ue o gel é constituído em

sua grande parte, por gelatina, !ue é uma substncia proteica.

5> C%4!;'%

Apesar dos erros e:perimentais, alguns I= discutido acima, foi possí%el separar as proteínas das amostras, estimar sua massa molecular e obser%ar sua ati%idade.

REFERÊNCIA

Roteiro de aula pratica, 3io!uímica Analítica 6G8Q @"', 'içosa, /<.

Zilson [ Zal\er. ;rinciples and ecni!ues of 3iocemistr1 and /olecular  3iolog1, Sed, p77. Disponí%el em5 ttp5&&]]]6.i!.usp.br&docente&mi1amoto&DE<^F^ecnicas^eletroforeticas.pdf .