Marcadores Moleculares em Equinos

Marcadores Moleculares em

Equinos

Universidade Federal de Pelotas CDTec - Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Biotecnologia Animal

Julho, 2013

Priscila M. M. de Leon

Dra., Médica Veterinária PNDP Biotecnologia/UFPel

Criação de Cavalos

• Finalidades:

Esporte

_{Trabalho no campo}

Comercial

_Hobby

Shire

Lusitano Andaluz Árabe

PSI

Raças de Equinos:

Marcadores Moleculares em Equinos

• Cavalos são valorizados como indivíduos;

• Selecionados de acordo a performance → fatores fisiológicos e reprodutivos são prejudicados.

Marcadores Moleculares em Equinos

Biomarcadores aplicados à

Reprodução

Biomarcadores aplicados à clínica e

características morfológicas

Biomarcadores de performance

orfologia

 Possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a

Biomarcadores para características específicas (clínica, morfologia,

Genoma Equino - 1 milhão de SNPs

Banco de dados - SNPs por cromossomos

http://www.uky.edu/Ag/Horsemap/welcome.html

Marcadores Moleculares na Reprodução Equina

• Biomarcadores na Embriologia (1000 genes participam do

desenvolvimento sexual) → aplicação de Biotécnicas da Reprodução; • Identificação de Marcadores Moleculares de Viabilidade e Competência

• CRISP3 - cysteine-rich secretory protein 3

• uma das principais proteínas do plasma seminal equino;

• SNPs no gene CRISP3 são positivamente relacionadas com a fertilidade; • SNP (G>A) tem um efeito sobre a fertilidade: garanhões heterozigotos

apresentam uma fertilidade reduzida em relação aos homozigotos; • SPATA 1: Spermatogenesis associated protein 1

• Proteína associada a espermatogênese;

• SNP (BIEC2-968854) foi associado a taxa de prenhes: garanhões

heterezigotos apresentaram melhor taxa de prenhes em relação aos homozigotos para este SNP;

• INHBA: inhibin beta A

• Controle da secreção de FSH, controlando a espermatogenese; • 5 SNPs em garanhões foram associados com taxas de prenhez

(regulação do eixo hormonal hipotálamo-hipófise);

• A concentração intratesticular de inibina é um potencial marcador para a detecção precoce de problemas de fertilidade em jovens garanhões;

Objetivo:

Avaliar a expressão de genes relacionados com a apoptose

(Bax, Bcl-2, survivin e p53) durante a maturação in vitro de

oócitos equinos e comparar a expressão gênica entre

oócitos e células do cumulus com diferentes características

morfológicas.

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

• Coleta e classificação dos COC

Materiais e Métodos:

Fig. 1. A) Oocytes classified as healthy morphological group, G1; B) Oocyte

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

Materiais e Métodos:

• Cada grupo experimental: pools de 60 oócitos e céls do cumulus correspondentes (4 X)

• Extração RNA → confecção cDNA → qRT-PCR

Gene Acession Number Sequence TM Fragment size Efficiency (%) Coorelation (R2₎ Bcl-2 Eq XM_001499714.1 F 5’ GAGACCCCCAGTGCCATCAA 3’ 57ºC 146 bp 99.9% 0.97 R 5’ GGGATGTCAGGTCGCTGAAT 3’ BaxEq XM_001489207.1 F 5’ TTTGCTTCAGGGTTTCATCC 3’ 60ºC 162 bp 100% 0.94 R 5’ ATCCTCTGCAGCTCCATGTT 3’ p53 Eq XM_001918153.1 F 5’ AAAGGATGCCCATGCTACAGAGGA 3’ 63ºC 82 bp 90.5% 0.98 R 5’ AGTAGACTGGCCCTTCTTGGTCTT 3’ SurvivinEq XM_001915400.1 F 5’ TTCATCCACTGTCCCACTGA 3’ 57ºC 98 bp 70.5% 0.98 R 5’ GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3’

GAPDH NM_001163856.1 F 5’ GCC GTA ACT TCT GTG CTG TG 3’ 61ºC 150 bp 84.0% 0.98 R 5’ AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG 3’

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

Resultados:

• Expressão de Gênica:

 Survivin: ↑ mOocG1 que mCumG1 (p <0,02)  P53: ↓ mOocG1 que mCumG1 (p = 0.007)

Objetivo:

Identificar polimorfismo da p53 equina e determinar a

frequência dos genótipos em equinos, correlacionando com

parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue Inglês (PSI).

• DNA biobank: 105 éguas PSI

Material e Métodos:

Equine p53 SNP

• Parâmetros Reprodutivos

 _{Número de montas naturais}

 _{Diagnóstico positivo de gestação}  _{Nascimento de potro}  _Aborto  _{Gestação gemelar}  _Placentite  _{Endometrite pós-cobertura}  _{Ciclo anovulatório}  _Natimortos

• A região alvo da p53 foi amplificada por PCR:

– Primers: forward 5’ TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA 3’

reverse 5’ TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 3’

– Produto de 199 bp

• Identificação do SNP por PCR-RFLP com enzima BstUI

– Sítio de restrição: CG/CG • Arg/Arg: fragmentos de 113 bp e 86 bp • Arg/Pro: fragmentos de 199bp, 113 bp e 86 bp • Pro/Pro: fragmento de 199 bp

Material e Métodos:

Equine p53 SNP

• Identificamos 3 possíveis genótipos da p53 em equinos PSI

Resultados:

Figure 1. A) Amplification of a 199 bp fragment of p53 containing codon 72; B)

Restriction fragment length polymorphism demonstrating three possible genotypes: Arg/Pro (A/P) (199, 113 and 86 bp fragments); Arg/Arg (A/A) (113 and 86 bp fragments); and Pro/Pro (P/P) (199 bp fragment).

% Genotype (n/total)/ Reproductive Parameters

Arg/Arg Arg/Pro Pro/Pro

Mating 1 16.2 (32/198) 59.1 (117/198) 24.7 (49/198) 2 or + 16.2 (11/56) 67.9 (38/56) 12.5 (7/56) Pregnancy No 10.0 (2/20) 60.0 (12/20) 30.0 (6/20) Yes 17.5 (41/234) 61.1 (143/234) 21.4 (50/234) Birth of foal No 14.3 (6/42) 69.0 (29/42) 16.7 (7/42) Yes 17.5 (37/212) 59.4 (126/212) 23.1(49/212) Abortion No 17.5 (40/228) 58.3 (133/228) _24.1(55/228)** Yes 11.5 (3/26) _{84.6 (22/26)}* _{3.8 (1/26)} Twin gestation No 16.1 (38/236) 61.9 (146/236) 22.0 (52/236) Yes 27.8 (5/18) 50.0 (9/18) 22.2 (4/18) Endometritis No 16.6 (37/223) 61.4 (137/223) 22.0 (49/223) Yes 19.4 (6/31) 58.1 (18/31) 22.6 (7/31) Stillborn No 16.5 (41/248) 60.9 (151/248) 22.6 (56/248) Yes 33.3 (2/6) 66.7 (4/6) 0 (0/6) Acyclic No 16.0 (39/243) 61.3 (149/243) 22.6 (55/243) Yes 36.4 (4/11) 54.5 (6/11) 9.1 (1/11)

Table 1. Distribution of the codon 72 SNP in p53 and association with reproductive

• Estudo da múltipla interação gênica em características complexas; Potencial na investigação, diagnóstico e tratamento de doenças; Estratégias para reduzir prevalência de doenças associadas a

alelos, preservando a diversidade genética e condicionamento físico geral;

Teste diagnóstico comercial disponível, facilitando:

– identificação de portadores;

– confirmação do diagnóstico de casos clínicos;

– gestão dos alelos no melhoramento genético da população;

Biomarcadores aplicados à Clínica de equinos

Epidermólise Bolhosa Juncional - JEB

• Doença autossômica recessiva dermatológica (humano x equino); • Inserção de Citosina no gene LAMC2 em ECA5, codificando um stop

codon;

• deleção de 6.589 pb nos exons 24-27 do gene LAMA3 no ECA 8; • O defeito molecular é uma falha na produção de laminina,

proteína da membrana basal heterotrimérica que faz a adesão entre as camadas da pele derme e epiderme;

• Características clínicas: áreas de mucosa e tegumento desprovidas de epitélio e com ulcerações graves;

Melanoma

• Acomete cavalos de pelagem tordilha;

• A pelagem tordilha é herdada em um padrão autossômico dominante, com homozigotos mostrando mais rápido e completo branqueamento e

maior incidência de melanoma;

• Duplicação do intron 6 do gene syntaxin-17 no ECA 25;

• Metástases: gânglios linfáticos, fígado, pulmão, baço e músculo; • Programa de melhoramento genético minimizando a geração de

Pelagem Simples

Pelagem Composta

• Cavalos Puro Sangue Inglês (PSI) foram selecionados para o

excepcional desempenho de corrida, resultando na adaptação

dos sistemas estruturais e funcionais, contribuindo para a elite

dos fenótipos atléticos;

Capacidade atlética do PSI:

•  capacidade metabólica aeróbica e anaeróbica; • Sistemas Cardiovascular e Respiratório:

↑Volume pulmonar; [Hemoglobina]; débito

cardíaco; Densidade Mitocondrial; Glicogênio; * Genes do Fenótipo Atlético

Biomarcadores de performance:

• Força e composição muscular;

• Metabolismo muscular e tolerância ao exercicio; • Biogênese mitocondrial;

• Capacidade hemodinâmica e de metabolismo aeróbico; • Tendão e ligamento;

• Genes responsáveis ​​pela oxidação de ácidos graxos, o

aumento da sensibilidade à insulina e da força muscular:

 ACSS1 (acil-CoA sintetase membro da família de cadeia curta 1)  ACTA1 (actina, alfa 1)

 ACTN2 (actinina, alfa 2)

 ADHFE1 (álcool desidrogenase, contendo ferro, 1)  MTFR1 (regulador fissão mitocondrial 1),

 PDK4 (quinase piruvato desidrogenase, isozima 4)  TNC (tenascina C).

Peroxisome proliferator-activated receptor-c coactivator 1a (PGC-1a): fator

crítico na adaptação do músculo esquelético ao exercício, agindo através do controle da transcrição de genes de angiogênese, oxidação de ácidos graxos, fosforilação oxidativa, biogênese mitocondrial e tipo de fibra

muscular;

Miostatina,

codificada pelo gene MSTN, é um membro da superfamília

de TGF-b que regula desenvolvimento do músculo esquelético;

• creatine kinase muscle (CKM), cytochrome c oxidase subunit IV isoform 1 (COX4I1), cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 (COX4I2) and

pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 (PDK4)

 diferentes protocolos de exercícios provocam respostas

transcricionais variáveis em genes exercício;

• Vinte novos SNPs foram detectados em 3 genes - ACTN3, CKM e COX4I2;

• No entanto 3 SNPs em CKM e COX4I2 foram significativamente

diferentes entre cavalos alta performance e controle (nunca ganhou uma corrida).

Aplicação de Diagnóstico Molecular em Equinos

• Biomarcadores: Performance em Cavalos Atletas; Características Reprodutivas; Cor da Pelagem; Doenças Hereditárias;

• ccffDNA

– Identificado em mulheres (Lo et al. 1997)

– Alternativa de diagnóstico pré-natal não-invasivo (Finning & Chitty

2008)

– 10% do DNA é fetal na plasma de mulheres gestantes (Lun et al. 2008)

Introdução:

Equine ccffDNA

Objetivos:

 Detecção da presença do ccffDNA no plasma de éguas

prenhas através da determinação por amplificação do SRY;

 Realizar um estudo de validação pré-desenvolvimento de

• População em estudo:

– 20 éguas prenhas – 2 éguas vazias – 2 éguas virgens

– DNA genômico de 10 fêmeas – DNA genômico de 10 machos

• Coleta e preparação da amostra:

– Sangue venoso é coletado e processado (centrifugações) dentro de 15

mim

• Extração do ccffDNA

– 1mL de plasma

– QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) (Akolekar et al., 2010)

Material e Métodos:

• Sexagem Molecular:

– Padronizada com DNA genômico de macho e fêmea – Sequenciamento

– Detecção do SRY (182 bp)

– Controle com GAPDH (150 bp)

– 10µL como template da reação de PCR

• Controles:

– NTC (no-template control )

– Controle negativo (DNA genômico de fêmea)

– Controle positivo (2% de DNA genômico de macho)

* Confirmação do sexo fetal no nascimento

Material e Métodos:

Resultados:

Equine ccffDNA

Figure 1. Molecular sexing test using equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) for SRY

amplification: A) Polymerase chain reaction (PCR); B) Second round Polymerase chain reaction (2nd_-PCR);

C) Quantitative Real Time Polymerase chain reaction (qPCR). M: ccffDNA of male pregnant mare; F: ccffDNA of female pregnant mare; +TC: positive control; -TC: negative control; NTC: non-template control;

Resultados:

Equine ccffDNA

Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine

circulating cell-free fetal DNA (ccffDDNA).

Samples SRY PCR % (n/total) GAPDH PCR % (n/total) SRY 2nd_{-PCR* %} (n/total) GAPDH 2nd_{-PCR %} (n/total) SRY qPCR % (n/total) GAPDH qPCR % (n/total) ccffDNA Male pregnancy 72.7 (8/11) 100 (11/11) 90.9 (10/11) 100 (11/11) 90.9 (10/11) 100 (11/11) Female pregmancy 0 (0/9) 100 (9/9) 0 (0/9) 100 (9/9) 0 (0/9) 100 (9/9)

Control Genomic DNA

Male 100 (10/10) 100 (10/10) 100 (10/10) 100 (10/10) 100 (10/10) 100 (10/10) Female 0 (0/10) 100 (10/10) 0 (0/10) 100 (10/10) 0 (0/10) 100 (10/10) Control mares ccffDNA non-pregnant 0 (0/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 100 (2/2) ccffDNA virgin 0 (0/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 100 (2/2)  SRY/PCR: Acurácia 85% (17/20)  SRY/2nd_{-PCR e qPCR : Acurácia 95% (19/20)}

Equine ccffDNA

Conclusões:

• Este é o primeiro estudo demonstrando a presença do

ccffDNA no plasma de éguas prenhas;

• Os resultados deste estudo demonstram que é possível a

determinação do sexo fetal em éguas utilizando ccffDNA

para amplificação do SRY.