Prova cruzada virtual

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Prova cruzada virtual

Por que e como usamos

Jorge Neumann Laboratório de Imunologia de Transplantes Santa Casa de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil

1. Introdução

Entre os diversos problemas hoje encontrados na rotina dos transplantes renais com doador falecido, dois chamam a atenção de quem participa deste processo na linha de frente ou na retaguarda do laboratório: o tempo de isquemia fria a que o órgão é submetido e a proporção de pacientes que apresentam grande reatividade aos antígenos HLA (Human Leukocyte Antigens - Antígenos de histocompatibilidade humano).

O tempo de isquemia fria deve ser sempre o menor possível. Idealmente, doador e receptor deveriam estar no mesmo bloco cirúrgico, mas isto muito raramente é alcançado. Com o aumento das doações à distância, isto é, onde doador e receptor estão em diferentes regiões de um país ou continente, a tendência é de prolongamento destes tempos.

A respeito do grau de sensibilização, cerca de 25% dos pacientes em lista de espera para transplante renal nos três estados da região sul do Brasil apresentam anticorpos anti-HLA circulantes contra um leque de antígenos HLA considerado alto. A presença destes anticorpos frequentemente impede a realização do transplante renal por resultar em prova cruzada pré-transplante positiva, e como consequência eles acabam ficando em lista por períodos muito longos e bastante acima da média dos pacientes nos quais tais anticorpos não são detectados. As ferramentas diagnósticas atualmente disponíveis nos laboratórios de histocompatibilidade permitem não apenas identificar quais anticorpos estão presentes nestes receptores como também fornecem uma semiquantificação destes anticorpos. Isto fez com que fosse possível prever o resultado da prova cruzada com um alto grau de acerto.

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Este exercício teórico, se corretamente feito, pode abreviar o tempo gasto pelo laboratório na execução das provas cruzadas, diminuindo com isto o tempo necessário para a liberação do resultado e assim contribuindo para a redução dos tempos de isquemia. Além disto, é possível evitar que seja desperdiçado o soro de um paciente em uma prova cruzada presumidamente positiva, com isto economizando além do tempo, dinheiro e, acima de tudo, o próprio soro deste receptor, indispensável no estudo contra um doador potencialmente com maiores chances de resultar em prova cruzada negativa.

Esta prática de prever o resultado de uma prova cruzada, também chamada de prova cruzada virtual, já está em uso corrente no Laboratório de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Porto Alegre desde 2010. Outros centros já haviam anteriormente mostrado que esta abordagem poderia ser benéfica, embora com critérios distintos dos aqui adotados.1

Antes de iniciarmos seu emprego, analisamos por um ano os resultados de todas as provas cruzadas realizadas no laboratório e comparamos estes resultados com a prova cruzada virtual realizada em paralelo. Para que isto ocorresse foi necessário que todos os parâmetros envolvidos na avaliação virtual estivessem padronizados e validados internamente. Os dois principais parâmetros foram o limiar de positividade na prova cruzada por citometria de fluxo e o limite de detecção de anticorpos clinicamente relevantes nos testes de fase sólida para avaliação de reatividade contra o painel, para assim definir da forma mais objetiva possível o que chamamos de paciente hipersensibilizado.

2. Métodos

2.1 Prova cruzada por citometria de fluxo

Entre todas as variáveis envolvidas no procedimento técnico da prova cruzada por citometria de fluxo, talvez a mais importante seja a definição do limiar de positividade.

Proporção volume de soro × número de células alvo, titulação de conjugados, titulação dos controles positivos e tempos e temperaturas de incubação são parâmetros que devem ser ajustados em citometria de fluxo. Na prova cruzada, além disto, devemos também arbitrar a partir de que ponto passamos a considerar o resultado do teste como positivo e em qual escala os testes serão lidos e interpretados, se linear (1-10.000) ou logarítmica (104

). A opção mais simples é a de adotar um limiar sugerido por alguma publicação ou entidade. Isto pode ser adequado para quem

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faz estes testes de forma esporádica, mas não é o melhor procedimento para quem emprega esta ferramenta de forma rotineira.

Uma alternativa é medir o grau de reatividade que atingem soros oriundos de indivíduos considerados normais e que não apresentem em sua história eventos relacionados à imunização anti-HLA. Desta forma, uma seleção de 15 a 30 voluntários do sexo masculino, nunca transfundidos e nunca transplantados, é testada contra 15 a 30 doadores de órgãos selecionados aleatoriamente. A média desta reatividade, acrescida de três desvios padrão, é considerada como limite de negatividade e valores superiores a este limite são considerados positivos.

A melhor opção, no entanto, é usar os próprios receptores de órgãos como parâmetro. Isto é feito avaliando-se a média de reatividade dos receptores que não apresentam anticorpos anti-doador segundo a avaliação de um teste de fase sólida baseado em single antigens beads. Deste modo, obtemos uma avaliação mais realista, uma vez que não há seleção de soros e pode-se assim usar um número muito maior de testes, fazendo com que a estatística seja, portanto, mais confiável e potente.

No Laboratório de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Porto Alegre, os resultados de limiar (cutoff) obtidos contra linfócitos T e contra linfócitos B em um equipamento FacsCalibur (BD) estão demonstrados abaixo. Foram incluídos 540 soros de receptores sem anticorpos anti-doador (sem anti-HLA A, B, C, DR, DQ e DP) testados contra 302 anti-doadores de órgãos sólidos. Em escala linear 1-10.000:

• Linfócitos T: média: 22.30; SD: 18.5; média + 3 SD: 77.8

• Linfócitos B: média: 65.0; SD: 64.6; média + 3 SD: 258.8

Baseado nestes números, passamos a usar valores superiores a 80 como positivos em linfócitos T e superiores a 260 em linfócitos B em escala linear.

2.2 Avaliação de reatividade contra o painel

Poucas áreas na imunologia de transplantes evoluíram tanto nos últimos 15 anos como a da avaliação de reatividade contra o painel. Originalmente desenhada para representar o grau de positividade que um determinado soro apresentava em provas cruzadas reais, ela evolui para testes não mais com células vivas, evitando com isto o grau de complexidade que a célula exige em sua manipulação e diminuindo os fatores de confusão inerentes a um ensaio biológico.

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A primeira evolução foi a de aderir moléculas HLA em placas de Elisa. Isto evitava o uso de células inteiras e viáveis e permitia a criação de kits comerciais para a avaliação de painel. Estas facilidades eram acompanhadas, por outro lado, de baixa sensibilidade, o que era demonstrado por um número de provas cruzadas reais positivas em indivíduos aparentemente sem anticorpos anti-HLA circulantes. Em nosso laboratório constatamos até 11% de falsos negativos em testes baseados em Elisa.2

A mais recente geração de reagentes para avaliação de reatividade contra o painel faz uso de princípios comuns à citometria de fluxo, com o emprego de esferas plásticas às quais foram aderidas moléculas HLA purificadas. O equipamento usado, conhecido como Luminex, é capaz de identificar dezenas de diferentes esferas, permitindo assim o teste simultâneo de dezenas de antígenos HLA. Pode-se com esta tecnologia, de uma forma muito rápida, saber se o receptor é portador de anticorpos anti-HLA, contra quais antígenos HLA, e de forma semiquantitativa avaliar a dimensão desta imunização.

Esta nova geração de testes de fase sólida, também conhecida como single antigen beads, trouxe por um lado informações que de outra maneira são muito difíceis de obter, mas por outro trouxe também alguns novos desafios. Talvez o mais importante seja o de definir qual o padrão de reatividade mínimo que deve ser considerado como clinicamente relevante. Além disto, no processo de fabricação, algumas moléculas HLA podem sofrer processo de desnaturação total ou parcial. Isto por sua vez pode levar a resultados falso-positivos, uma vez que não encontraremos na natureza moléculas HLA desnaturadas na membrana das células de um doador.

Levando em conta estas dificuldades, o laboratório deve determinar qual o nível de reatividade a partir do qual o anticorpo será considerado positivo, e estar alerta para possíveis reações falso-positivas.

Em nosso laboratório, onde usamos os kits One Lambda Single Antigens Beads, baseado em testes realizados com o soro de 24 homens não transfundidos e não transplantados (Fig. 1 e Fig. 2), adotamos 1.000 unidades de fluorescência (mfi) como valor de cutoff, a partir do qual consideramos um anticorpo como presente.

2.3 Correlação entre os resultados Luminex Single Antigen Beads e a prova

cruzada por citometria de fluxo

Entre 1º de janeiro e 31 de dezembro de 2010 realizamos em paralelo 1.316 provas cruzadas por citometria de fluxo entre 161 doadores falecidos e 620 receptores na lista de espera para rim no

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Rio Grande do Sul (média de 2,1 testes por receptor). Os resultados das provas cruzadas por citometria foram comparados aos níveis de anticorpos anti-HLA presentes no doador pelo teste Single Antigen Beads.

Os soros foram classificados em três grupos:

• sem anticorpos anti-doador (DSA),

• com anticorpos em baixos níveis (1.000 a 5.000),

• com anticorpos em níveis altos, superiores a 5.000.

Na faixa de fluorescência baixa, entre 1.000 e 5.000 de mfi, observamos 60,9% de provas cruzadas por citometria positivas (com 39,1% negativas). Na presença de anticorpos anti-doador (anti-HLA A, B ou DR) em níveis superiores a 5.000 de mfi, observamos 97,6% de provas cruzadas por citometria de fluxo positivas, (ou 2,4% negativas).

Além disto, caso o receptor não apresentasse nenhum anticorpo em níveis superiores a 5.000 isoladamente, mas que tivesse dois ou mais anticorpos cuja soma fosse superior a 5.000, a positividade observada foi de 94,6%.

A partir destes dados, e em comum acordo com os grupos de transplante que utilizam os serviços do laboratório e da Central de Transplantes do Rio Grande do Sul, sul do Brasil, passamos a eliminar da lista de candidatos ao rim todos os potenciais receptores que apresentem anticorpos anti-doador em nível suficientemente alto a ponto de configurar probabilidade superior a 97% de apresentar prova cruzada positiva. Isto resultou na esperada economia de tempo, traduzida por menos isquemia fria, de dinheiro e na poupança do soro do receptor hipersensibilizado.

Em paralelo, com o aumento das remessas de rins originários de outras regiões do Brasil, passamos com certa frequência a ter que lidar com situações onde recebíamos um rim apto para ser transplantado, mas que vinha sem nenhum material biológico viável, por ausência ou má qualidade, que nos permitisse realizar as necessárias provas cruzadas pré-transplante. O dilema residia em ou desperdiçar um órgão ou transplantá-lo sem a realização do teste.

A experiência anteriormente adquirida com a prova cruzada virtual nos permitiu passar a selecionar um receptor da lista originada pela compatibilidade HLA que não apresentasse anticorpos anti-HLA presentes no doador, portanto com prova cruzada virtual negativa. Desde 2010 realizamos 12 transplantes renais nesta situação. Em cinco destes, foi por ausência de material (gânglio, baço ou mesmo sangue) que permitisse a realização de qualquer teste físico. Em sete situações o rim chegou ao nosso hospital com longos tempos de isquemia, superior a 24

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horas (média de 28,5 horas). Nestes doze casos, a avaliação da prova cruzada foi feita de forma virtual, considerada negativa pela ausência de anticorpos anti-doador (anti-HLA A, B, C, DR e DQ) e o transplante realizado. Nos 7 casos de longa isquemia onde havia material para a prova cruzada, o transplante foi levado a efeito baseado apenas na prova cruzada virtual, com a prova cruzada real sendo realizada retrospectivamente. Nestes 7 casos, a prova cruzada real confirmou a negatividade apontada pela prova cruzada virtual. Todos os 12 receptores permanecem com enxerto funcionante, com um seguimento entre 5 e 38 meses.

3. Discussão

Desde a introdução das provas cruzadas pré-transplante no final dos anos 60, viu-se a necessidade de melhorar sua especificidade e sensibilidade. A introdução da antiglobulina humana (AGH) e, posteriormente, das provas cruzadas por citometria de fluxo em muito melhoraram estas duas carências, entretanto permanecem sendo testes muito laboriosos e que demandam diversas horas para a sua execução.

A evolução inexorável da tecnologia fez com que surgissem modernamente ferramentas capazes de informar com grande precisão se um determinado receptor apresenta ou não anticorpos pré-formados contra alvos HLA presentes no doador. Se realizados em um laboratório com domínio das técnicas de fase sólida, Single Antigen Beads, e com os cuidados necessários na determinação de relevância do anticorpo encontrado – nível de fluorescência (mfi) –, as informações obtidas podem permitir tanto a exclusão de um receptor por apresentar alto risco de prova cruzada positiva como também a realização do transplante sem uma prova cruzada física. Hoje diversos centros em diferentes regiões do mundo usam a prova cruzada virtual em suas rotinas.3-8

O protocolo para prova cruzada virtual em uso na Santa Casa de Porto Alegre permite que o transplante seja realizado antes de uma prova cruzada física, sempre que não sejam demonstrados anticorpos anti-HLA presentes no doador, isto é, não se evidenciam reações no teste de fase sólida com fluorescência superior a 1.000 mfi.

Nos casos onde encontramos anticorpos anti-doador na faixa de fluorescência entre 1.000 e 4.999, a prova cruzada por citometria de fluxo é mandatória no pré-transplante, uma vez que em cerca de 60% dos casos a prova cruzada real será positiva.

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Por fim, nos casos onde encontramos anticorpos anti-doador com níveis superiores a 5.000 mfi, a prova cruzada real nem sequer é realizada, uma vez que a probabilidade desta ser positiva é superior a 97%. Entretanto, nos casos em que o paciente apresenta algum tipo de urgência, seja falta de acesso adequado para diálise ou outro motivo médico, este permanecerá sendo levado à prova cruzada real mesmo considerando que a chance desta ser negativa é inferior a 3%. É relevante ainda a informação de que desde 2013 adotamos um protocolo rápido e otimizado para prova cruzada por citometria de fluxo, denominado Protocolo Halifax9

, que permitiu a redução do tempo necessário para sua conclusão a cerca de duas horas, agregando assim rapidez ao processo, mesmo nos casos em que a prova cruzada pré-transplante seja necessária.

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Figura 1

Perfil de reatividade de 24 soros de doadores masculinos saudáveis em teste Luminex Single Antigen Beads One Lambda classe I. A linha azul representa a reatividade média + 1 desvio padrão e a linha vermelha, média + 2 desvios. Por estes resultados, nosso laboratório adotou 1.000 unidades de fluorescência (mfi) como mínimo a partir do qual o anticorpo passa a ser considerado positivo. Anticorpos contra os antígenos A29, 31, 34, 66, 80 e Cw17 apresentam resultados superiores e devem ser olhados com muita cautela provavelmente pela presença de moléculas desnaturadas nas esferas do kit.

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Figura 2

Perfil de reatividade de 24 soros de doadores masculinos saudáveis em teste Luminex Single Antigen Beads One Lambda classe II. A linha azul representa a reatividade média + 1 desvio padrão e a linha vermelha, média + 2 desvios. Por estes resultados, nosso laboratório adotou 1.000 unidades de fluorescência (mfi) como mínimo a partir do qual o anticorpo passa a ser considerado positivo. Anticorpos contra os antígenos DP2 e DR52 que apresentam resultados superiores devem ser olhados com muita cautela provavelmente pela presença de moléculas desnaturadas nas esferas do kit.

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Tabela 1. Resumo de resultados

DSA Prova cruzada positiva Prova cruzada negativa

Grupo 1 (DSA entre 1.000 e 4.999 mfi)

60,9% 39,1%

Grupo 2 (DSA >5.000 mfi) 97,6% 2,4%

Nos casos onde encontramos anticorpos anti-doador com níveis inferiores a 5.000 mfi (Grupo 1), a prova cruzada pré-transplante é considerada obrigatória. Nos pacientes do Grupo 2, com

anticorpos anti-doador acima de 5.000 mfi, a prova é considerada positiva e os pacientes são excluídos da lista, embora aqui haja exceções. Pacientes sem anticorpos anti-doador detectados por testes de fase sólida Single Antigen Beads podem ser levados ao transplante sem prova cruzada real prospectiva.

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Referências

1. Bingamann, A., Murphey, C., Palma-Vargas, J. and Wright, F.: A virtual crossmatch protocol significantly increases access of highly sensitized patients to deceased donor kidney transplantation. Transplantation, Vol 86, Nº 12, 1864-1868, 2008.).

2. S. Fernandes, J. Neumann e D. Saitovich: O papel da citometria de fluxo na detecção de aloanticorpos anti-HLA no pre transplante renal Atualidades em Nefrologia 9.9 ed. São Paulo: Sarvier, 2006, v.9, p.375-380.

3. Bohming, G., Fidler, S., Christiansen, F., et al: Transnational validation of the Australian algorithm for virtual crossmatch allocation in kidney paired donation. Hum Immunol, 74(5), 500-505, 2013.

4. Worsley, C., Mayne, E., Suchard, M.: Luminex-based virtual crossmatching for renal transplantation in South Africa. S Afr Med J, 102(1), 40-43, 2011.

5. Sun, Y., Song, Y., Wan, L., et al: Virtual crossmatch versus final crossmatch – review of 2000 crossmatches performed in the past three years. Human Immunol 74, 1-49, 15OR,2013.

6. Locke, A., Moua, K., Cabarong, M., et al. A comparison of mfi with flow cytometric crossmatches aoutomes as a means to correlate antibody testing with virtual crossmatch prediction. Human Immunol 74, 1-49, 19 OR, 2013.

7. Norin, A., Hochman, D., Das, B.: DSA scoring method for enhanced virtual crossmatch predictability: case studies. Hum Immunolo 74, 1-49, 23 OR, 2013.

8. Wedermyer, G., Roark, C., Freed, B.: Validation of virtual crossmatch using donor specific antibody. Hum Immunol, 74, 1-49, 48P, 2013.

9. Liwski, R., Adams, G., Peladeu, G., Eckels, D., Bray, R., Gebel, H.: An optimized flow cytometric crossmatch assay expedites pre-transplant immunologic risk assessment. Hum Immunol 72; 73. DOI: 10.1016/j.humimm.2011.07.107.