A AÇÃO CARDIOVASCULAR DOS PEPTÍDEOS RICOS EM
PROLINA DA
Bothrops jararaca
NÃO ESTÁ RELACIONADA
COM A INIBIÇÃO DA ENZIMA CONVERSORA DE
ANGIOTENSINA I E POTENCIAÇÃO DA BRADICININA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências
Orientador:
Prof. Dr. Antonio Carlos Martins de Camargo
Co-orientador:
Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos
Ficha catalográfica
Ianzer, Danielle Alves
A ação cardiovascular dos peptídeos ricos em prolina da Bothrops jararaca não está relacionada com a inibição da enzima conversora de angiotensina I e Potenciação da Bradicinina/ Danielle Alves Ianzer. – São Paulo, 2006.
xiii, 124f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular
Título em inglês: The cardiovascular action of proline rich-peptides from Bothrops jararaca is not related to angiotensin I-converting enzyme inhibition and bradykinin potentiation.
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Hipertensão – ICB - UFMG e no Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada – Instituto Butantan.
Apoio Financeiro:
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Ao
Prof. Dr. Antônio Carlos Martins de Camargo
por mais uma
oportunidade que me foi concedida, por sua preciosa orientação e pela
confiança para realização de mais um projeto.
Ao
Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos
por ter aberto as
portas, concedendo a oportunidade de desenvolver este trabalho em seu
laboratório. Agradeço por sua co-orientação, pela confiança, pela dedicação e
pelos conhecimentos transmitidos durante a realização do mesmo.
Aos amigos Gisele Maia, Jerusa Almeida, José Roberto Silva, Carlos
Henrique Xavier, Luciana Maia e Marcela Ramos, pela colaboração para
realização dos experimentos e, principalmente, pela amizade, carinho e
dedicação, ajudando-me nesta jornada de uma forma muito preciosa.
Ao Prof. Dr. Anderson Ferreira pela ajuda para realização no estudo de
função renal.
A Vera Pontieri pelos estudos realizados com captopril.
Às funcionárias do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada
CAT-CEPID, Neusa Lima, Vera Lima, Vanessa Souza e Maria José da Silva pela
colaboração administrativa e convívio agradável.
A todos os professores, estudantes e técnicos do Laboratório de
Hipertensão do ICB-UFMG, especialmente Profa. Andréa Haibara, Prof.
Marco Antônio Peliky, Marcela Neves, Marisa Lemos, Cynthia, Andrey, Ana
Paula Nadu, Betinha, Leonor, Serginho, Denise, Giancarla, Gonzaga, Rodrigo
Molecular e Biomateriais – Departamento de Química da UFMG pela
amizade e carinho.
Aos amigos Diva Helena Nogueira, Rosemari, Marina Matos, Simone
Barbosa, Liliana Mora, William Marandola, José Fernando Magalhães, Gisele
Picolo, Marcelo Sodré, Márcio de Paula, Fernanda Faria, Gerusa Araújo,
Andréia Marneli e Millen Cristine pela amizade e carinho, pelo apoio nos
momentos difíceis e pela vibração nas minhas vitórias.
A Neiva Madeira Yanzer pela revisão ortográfica.
Ao Giuseppe Puorto pela foto da Bothrops jararaca.
A todos que, de alguma forma, colaboraram para realização deste
,
%
ÍNDICE
pág.
ABREVIATURAS ... ix
RESUMO ... xii
ABSTRACT ... xiii
I – INTRODUÇÃO ... 1
I.1 – Sistema Renina Angiotensina (SRA)... 4
I.2 – Sistema Calicreína Cinina (SCC) ... 7
I.3 – Vaspeptidases: ECA e NEP ... 9
I.4 – Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) - 40 anos de história dos primeiros inibidores da ECA ... 14
I.4.1 – A descoberta dos BPPs ... 14
I.4.2 – Desenvolvimento do Captopril ... 15
I.4.1 – Retorno do interesse pelos BPPs ... 18
II – OBJETIVOS ... 28
II.1 – Objetivo Geral ... 29
II.2 – Objetivos Específicos... 29
III – MATERIAIS E MÉTODOS... 30
III.1 – Animais... 31
III.2 – Peptídeos... 31
III.3 – Outras drogas e reagentes... 32
III.4 – Cânulas... 32
III.5 – Equipamentos... 32
III.7.2 – Estudo da ação potenciadora de BPPs sobre a atividade hipotensora da BK e da ação inibitória dos BPPs sobre a conversão de Ang I em Ang II
em ratos acordados ... 37
III.8 – Estudo do efeito dos BPPs sobre a função renal de ratos espontaneamente hipertensos (SHR)... 38
III.8.1 – Determinação de Na+ e K+ nas amostras de plasma e urina ... 39
III.8.2 – Determinação da osmolalidade nas amostras de plasma e urina ... 39
III.9 – Análise Estatística ... 40
IV – RESULTADOS ... 41
IV.1 – Intensidade e duração da atividade potenciadora dos BPPs sobre o efeito hipotensor da bradicinina em ratos normotensos anestesiados... 42
IV.2 – Efeitos cardiovasculares da administração intravenosa dos BPPs em ratos espontaneamente hipertensos ... 45
IV.3 – Avaliação dos efeitos cardiovasculares da administração intravenosa dos BPPs em ratos normotensos ... 62
IV.4 – Comparação dos efeitos cardiovasculares dos BPPs em ratos hipertensos e normotensos ... 69
IV.5 – Potenciação da BK durante o efeito anti-hipertensivo agudo e tardio dos BPPs em SHR acordados... 71
IV.6 – Dissociação da atividade anti-hipertensiva dos BPPs em SHR e inibição, in vivo, da conversão de Ang I em Ang II ... 73
IV.7 – Determinação do efeito dos BPPs sobre a função renal de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) ... 75
V – DISCUSSÃO ... 80
VI – CONCLUSÃO ... 97
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 100
ABREVIATURAS
µ µ µ
µM – micromolar
Ac – acetil
Ang I – angiotensina I
Ang II – angiotensina II
Ang III – angiotensina III
Ang IV – angiotensina IV
Ang-(1-7) – angiotensina (1-7)
ANP – peptídeo natriurético atrial
Bj – Bothrops jararaca
Bk – bradicinina
BNP – peptídeo natriurético cerebral
BPFs – fatores de potenciação da bradicinina
BPPs – peptídeos potenciadores de bradicinina
cDNA – ácido desoxirribonucleico complementar
CNP – peptídeo natriurético tipo C
C-terminal – carboxi-terminal
Da – dalton
DCV – doenças cardiovasculares
ECA2 – enzima conversora de angiotensina II
EDHF – fator hiperpolarizante derivado de endotélio
FC – freqüência cardíaca
mg – miligrama
min – minutos
mL – mililitro
MM – massa molar
mM – milimolar
NEP – neprilisina
ng – nanograma nM – nanomolar
NO – óxido nítrico
N-terminal – amino-terminal
PA – pressão arterial
PAM – pressão arterial média
PAP – pressão arterial pulsátil
PCP – prolil carboxipeptidase
PE – polietileno
PEP – prolil endopeptidase
RAAS – sistema renina-angiotensina-aldosterona
rpm – rotações por minuto
SCC – sistema calicreína cinina
SRA – sistema renina angiotensina
t-PA – ativador do plasminogênio de tipo tecidual
Código dos aminoácidos
1 letra 3 letras
aminoácido .
A
Ala
Alanina
C
Cys
Cisteína
D
Asp
Ácido Aspartico
E
Glu
Ácido Glutâmico
<E
Pyr
Ácido Piroglutâmico
F
Phe
Fenilalanina
G
Gly
Glicina
H
His
Histidina
I
Ile
Isoleucina
K
Lys
Lisina
L
Leu
Leucina
M
Met
Metionina
N
Asn
Asparagina
P
Pro
Prolina
Q
Gln
Glutamina
R
Arg
Arginina
S
Ser
Serina
T
Thr
Treonina
V
Val
Valina
RESUMO
No presente trabalho foram avaliados os efeitos cardiovasculares de quatro
peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs) em ratos espontaneamente hipertensos
(SHR). Os peptídeos foram selecionados de uma família de 19 oligopeptídeos encontrados
no veneno e no precursor do peptídeo natriurético do tipo C do cérebro da serpente
Bothrops jararaca. Estes peptídeos foram escolhidos por suas características distintas; relativos a inibição in vitro da enzima conversora de angiotensina I (ECA) e a potenciação
ex vivo da bradicinina (BK). Os experimentos foram realizados em ratos hipertensos (SHR) e normotensos (WT) acordados, com implantação de cateteres de polietileno em artéria
femoral para medida da pressão arterial média (PAM) e da freqüência cardíaca (FC) e veia
femoral para administração da droga. A PAM e a FC foram monitorados durante 6 horas
após a injeção intravenosa dos BPPs. Os quatro BPPs mostraram efeitos cardiovasculares
potentes entre as doses de 0,47 nmol/Kg e 710 nmol/Kg. O efeito anti-hipertensivo dos
BPPs foi bifásico, apresentando uma redução inicial da PAM nos primeiros 20 minutos
após a injeção do peptídeo (período agudo), seguida por outra queda que iniciou em
60-80 minutos após o BPP e se manteve por até de 6 horas. A alteração da PAM máxima foi
observada com o BPP-10c na dose de 71 nmol/Kg (-53 ± 6 mmHg). O BPP-7a é um fraco
inibidor in vitro da ECA somática [Ki(app) ≅ 50 µM] e mostrou-se incapaz de potenciar a BK, até mesmo, em concentrações 100 vezes maior que concentrações usadas para os
outros peptídeos. Contudo, o BPP-7a na dose de 14,2 nmol/Kg provocou queda máxima
da PAM de -45 ± 6 mmHg em SHR. Em contraste, foi mostrado que durante a ação
anti-hipertensiva dos quatro BPPs em SHR não houve alteração das respostas hipotensora da
BK e pressora da Ang I, tanto durante o período agudo como durante o período tardio.
Esses resultados indicam a participação de mecanismos ainda não esclarecidos nos efeitos
cardiovasculares desses peptídeos, não podendo ser descartada a ação mediada por
receptor órfão. Essas características abrem novas perspectivas para utilização dos BPPs
ABSTRACT
In the present study, were evaluated the cardiovascular effects of four Bradykinin
Potentiating Peptides (BPPs) in spontaneously hypertensive rats (SHR). The peptides
were selected from a family of 19 proline-rich oligopeptides found either in the venom of
Bothrops jararaca or derived from the C-type natriuretic peptide precursor of the B. jararaca
brain. These peptides were chosen for their distinct features concerning the in vitro and in vivo inhibition of the somatic angiotensin converting enzyme (ACE), and the ex-vivo and
in vivo potentiation of bradykinin (BK). The experiments were performed in conscious adult male hypertensive rats (SHR) and normotensive rats (WT), with polyethylene
catheters implanted into the femoral artery for the mean arterial pressure (MAP) and
heart rate (HR) measurements, and into the femoral vein for drug administration. The
MAP and HR were monitored for 6 hours after the intravenous injection of BPPs. All four
BPPs showed potent cardiovascular effects in the range between 0.47 nmol/Kg and 710
nmol/Kg. The anti-hypertensive effect of BPPs was biphasic, presenting an initial
reduction of MAP in the first 20 minutes after the peptide injection (acute period),
folowing by other fall in 60-80 minutes after BPP and maintained for even of 6 hours (late
period). The maximal change on MAP was observed using the BPP-10c at a dose of 71
nmol/Kg (-53 ± 6 mmHg). Differently from the other three BPPs, the BPP-7a presented a
weak in vitro inhibition of the somatic ACE [Ki(app) ≅ 50 µM], and was unable to potentiate the BK, even at concentrations 100-fold higher than the concentrations used for the other
peptides. However, the BPP-7a at a dose of 14.2 nmol/Kg caused the maximum MAP fall
of the -45 ± 6 mmHg in SHR. In contrast, was showed that during the BPP
anti-hypertensive effect in SHR there were not alteration of the BK hypotensive and the Ang I
pressure responses, during both acute and late periods. These results indicate the
I – INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial (HA) é considerada um fator de risco altamente
prevalente para as doenças cardiovasculares como: acidentes vasculares cerebrais,
insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio, insuficiência renal e doenças
vasculares periféricas (Collins e cols., 1990; Burnett Jr JC, 1999).
A Organização Mundial de Saúde estima que a hipertensão arterial seja
responsável por 4,5 % das causas de doenças associadas (64 milhões) e por 7,1
milhões de mortes prematuras (World Health Organization, 2003).
No Brasil, a hipertensão é um dos principais responsáveis por graves
problemas de saúde no país. Pesquisas revelaram que 28,5 % dos brasileiros
apresentam pressão arterial acima de 140 x 90 mmHg (Sociedade Brasileira de
Cardiologia, 2005). As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de
mortes no Brasil. Dados do levantamento realizado entre o período de 1979 e 1997,
revelam que as mortes por DCV alcançam 32,3% do total que corresponde a 300
estresse (Sudakov e cols., 1982) e fatores genéticos, demonstrados principalmente
pela história familiar do paciente ou identificados por exames altamente
específicos (Marques e cols., 2003; Naaby-Hansen e cols., 2004).
A regulação da pressão arterial (PA) é uma das funções fisiológicas mais
complexas, que depende da integração das atividades dos sistemas
cardiovascular, renal, neural e endócrino. Os principais mecanismos de controle
da PA se dividem em controle neural, humoral e local que agem de forma
integrada em diferentes situações comportamentais, para melhor redistribuir os
fluxos sangüíneos regionais através de alterações na resistência total e local e no
débito cardíaco e dessa forma manter a PA em níveis adequados (Hasser e cols.,
2000; Campagnole-Santos e Haibara, 2001).
Os mecanismos neurais controlam a pressão arterial através do sistema
nervoso central (SNC) e sistema nervoso autônomo. Os mecanismos humorais são
aqueles que atuam em nível sistêmico, principalmente através de substâncias
circulantes lançadas no sangue. Os mecanismos locais ocorrem através de
substâncias que atuam pontualmente em órgãos ou pequenas regiões com campo
de ação restrito (ação parácrina).
Os fatores locais como prostaglandinas, endotelina e óxido nítrico são
também de grande importância no controle vascular, por serem capazes de
sobre a resistência vascular periférica, função cardíaca e a volemia (Schiffrin EL,
2001).
O sistema renina-angiotensina (SRA) e o sistema calicreína-cinina (SCC)
desempenham funções fundamentais para regulação dos sistemas cardiovascular
e renal (Mullins e cols., 1990; Madeddu e cols., 1999; Campbell DJ, 2001).
I.1 – Sistema Renina Angiotensina (SRA)
Descoberto há mais de cem anos (Tigerstedt e Bergman, 1898), o SRA é um
sistema hormonal envolvido na regulação da PA e no balanço hidroeletrolítico
(Brunner e cols., 1972; Haber E, 1983), apresentando um papel importante na
regulação hemodinâmica e homeostática através de mecanismos vasculares e
renais, tanto em condições fisiológicas quanto fisiopatológicas (Cody RJ, 1997;
Santos e cols., 2000; Unger T, 2002).
Alterações no equilíbrio dos SRAs tecidual (cérebro, rim, vasos, coração,
adrenal), circulante, central e periférico parecem estar envolvidas no surgimento e
manutenção das várias formas de hipertensão, tais como: hipertensão essencial,
hipertensão renal, hipertensão neurogênica e hipertensão por mineralocorticóides
(funções intrácrina e autócrina), sobre células adjacentes (função parácrina) ou em
locais distantes da região de produção (função endócrina) (Unger T, 2002).
O SRA é um sistema altamente complexo dependente da ativação em
cascata de diversas enzimas/substratos, que produzem peptídeos biologicamente
ativos (Santos e cols., 2005).
A pró-renina é uma enzima liberada na circulação pelas células
justaglomerulares dos rins e estocada nessas células em grânulos imaturos para
ser processada na forma ativa, renina (Kurtz e Wagner, 1999).
A liberação da renina é controlada por diversos fatores. A atividade do
nervo renal representa um sinal estimulador para secreção de renina que é
mediada via adrenoreceptores β1 (Hackenthal e cols., 1990). Outras substâncias
como dopamina (Kurtz e cols., 1988), adrenomedulina (Jensen e cols., 1997)
também estimulam a secreção de renina. A função da renina, uma
aspartil-peptidase, é clivar especificamente a ligação peptídica Leu10-Val11 do
angiotensinogênio plasmático, produzido pelo fígado. A síntese de
angiotensinogênio é estimulada por glicocorticóides, hormônio tireodiano e pela
angiotensina II (Ang II) (Ben-Ari e Garrison, 1988). A clivagem libera o
decapeptídeo angiotensina I (Ang I), que em seguida é clivado pela enzima
conversora de angiotensina I (ECA) originando o potente octapeptídeo
O SRA não possui apenas a Ang II como produto ativo. Outros peptídeos
biologicamente ativos, como a angiotensina III (Ang III), angiotensina IV (Ang IV)
e angiotensina (1-7) [Ang-(1-7)] são gerados a partir da Ang I e/ou Ang II. Estudo
com a Ang-(1-7) mostraram que esse peptídeo apresenta em geral ações opostas a
Ang II (Ferrario e cols., 1997; Santos e cols., 2000).
A Ang II tem suas ações mediadas pelos receptores AT1 e AT2. A ligação da
Ang II em receptor AT1 desencadeia processos celulares produzindo vários efeitos,
dentre eles, vasoconstrição, síntese protéica, crescimento celular, regulação da
função renal e do equilíbrio hidroeletrolítico (Ardaillou R, 1999; De Gasparo e
cols., 2000). A Ang II também atua como neurotransmissor e neurorregulador
modulando o controle central da pressão arterial, a atividade simpática, o apetite
pelo sal e a sede (Lima e cols., 1999; De Gasparo e cols., 2000).
Os receptores AT2 estão largamente presentes em tecidos fetais e
apresentam redução na sua expressão logo após o nascimento (Nahmias e
Strosberg, 1995; Gallinat e cols., 2000). Porém, parecem desempenhar papel
importante em adultos. Em algumas situações a ligação da Ang II em AT2 provoca
vasodilatação, um dos efeitos opostos aos mediados pelo receptor AT1 (Gallinat e
(PEP) ou por hidrólise da Ang I pela neprilisina (NEP) e prolil endopeptidase
(Ferrario e cols., 1997; Santos e cols., 2000). Esse peptídeo exerce diversas funções
no SRA, dentre elas, a inibição da ECA, e também, via seu receptor Mas, que
contrapõe muita das ações mediadas pelo receptor AT1, causando modulação ou
antagonismo das ações da Ang II, como vasoconstrição e proliferação celular
(Ferrario e cols., 1997; Santos e cols., 2003).
Nos últimos anos, numerosas observações obtidas a partir de estudos
clínicos e em modelos experimentais de diabetes, hipertensão, insuficiência
cardíaca, entre outros, têm sugerido que além das disfunções do sistema
renina-angiotensina, a redução dos componentes do sistema calicreína-cinina pode causar
aumento da PA, conseqüentemente induzindo o aparecimento de doenças
cardiovasculares relacionadas (Sharma JN, 1984; Sharma e cols., 1996; Sharma e
Sharma, 2002).
I.2 – Sistema Calicreína Cinina (SCC)
A descoberta do sistema calicreína-cinina se iniciou há quase um século
atrás, quando Abelous e Bardier mostraram o efeito hipotensor da urina humana
(Abelous e Bardier, 1909).
O SCC representa uma cascata metabólica onde as calicreínas teciduais e
plasmática liberam cininas vasoativas a partir do cininogênio de alto e de baixo
no SCC, a bradicinina (BK) é a principal. A BK, um nonapeptídeo
(Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) identificada por Rocha e Silva e colaboradores (1949), é
gerada a partir da clivagem do cinogênio de alto peso molecular pela calicreína
plasmática (Suzuki e cols., 1966).
As cininas estão envolvidas em vários processos fisiológicos e patológicos.
Devido a sua capacidade de ativar células endoteliais, as cininas podem causar
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, liberação do ativador do
plasminogênio de tipo tecidual (t-PA), produção de óxido nítrico (NO) e
mobilização de ácido araquidônico. Sendo assim, participa fisiologicamente da
regulação de pressão sanguínea, funções renal e cardíaca e em processos
patológicos como inflamação (Moreau e cols., 2005).
As diversas atividades farmacológicas das cininas são mediadas através de
ligações com dois tipos de receptores específicos (receptores B1 e B2), antes de
serem metabolizadas por diversas peptidases (Marceau e cols., 1998;
Leeb-Lundberg e cols., 2005). As ações como vasodilatação e hipotensão são mediadas
pelo receptor B2, pela liberação de NO, prostaciclinas e fator hiperpolarizante
derivado de endotélio (EDHF) (Couture e Girolami, 2004). Enquanto as ações
responsáveis pela degradação da BK, entre elas, a ECA, a NEP, a aminopeptidase
P e as carboxipeptidases M e N (Margolius HS, 1995).
O SRA e o SCC são dois sistemas que interagem em diferentes níveis e estão
envolvidos em várias funções fisiológicas e fisiopatológicas. Após a liberação da
Ang I e BK, ocorre a formação da Ang II e da inativação da BK pela ECA. Na
mesma situação, se insere a NEP que metaboliza Ang I e BK (Figura 1) (Tschöpe e
cols., 2002; Campbell DC, 2003).
I.3 – Vasopeptidases: ECA e NEP
Inicialmente, apenas a enzima conversora de angiotensina I era considerada
a enzima vascular envolvida na regulação da pressão arterial. Atualmente, sabe-se
que além da ECA, outras enzimas como a NEP também estão envolvidas na
regulação dos sistemas cardiovascular e renal. Desta maneira, o termo
“vasopeptidases” tem sido utilizado para as enzimas que participam do controle
das disfunções cardiovasculares e da pressão arterial (Weber MA, 2001).
A ECA, uma zinco metalopeptidase, é a responsável principal pela
formação do peptídeo vasopressor Ang II, através da clivagem do dipeptídeo
C-terminal da Ang I (Skeggs e cols., 1956). Além disso, a ECA inativa a BK pela
remoção do dipeptídeo C-terminal (Turner e Hooper, 2002).
Existem três isorformas da ECA: a forma somática e duas formas pequenas.
homólogos, denominados C e N-terminais, e cada um deles contém um sítio ativo.
(Wei e cols., 1991a; Wei e cols., 1991b). A forma pequena de 90 - 110 KDa é
expressa apenas nas células germinativas masculinas e contém um sítio ativo
correspondente ao domínio C-terminal da forma somática (Coates D, 2003). A
outra forma pequena de 68 KDa foi identificada no fluido ileal e na urina humana
que apresenta apenas um sítio ativo correspondente ao domínio N-terminal
(Deddish e cols., 1994; Casarini e cols., 1995).
Desde a descoberta dos dois domínios catalíticos ativos da ECA por Wei e
colaboradores em 1991 (Wei e cols., 1991b), têm sido feitas especulações sobre a
funcionalidade dos dois sítios. Embora, in vitro os sítios C- e N-terminais
apresentem a mesma habilidade para clivar tanto a Ang I quanto a BK, existem
algumas características bioquímicas que diferenciam os dois sítios ativos (Wei e
cols., 1992; Jaspard e cols., 1993; Deddish e cols., 1996; Michaud e cols., 1997;
Deddish e cols., 1998).
In vivo, a Ang I é predominantemente hidrolisada pelo o sítio C-terminal, a
BK é hidrolisada por ambos os domínios (Acharya e cols., 2003). A função do
domínio N-terminal pode estar menos relacionada com o sistema
tetrapeptídeo (Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-OH) envolvido na regulação negativa da
hematopoiese (Rieger e cols., 1993; Rousseau e cols., 1994; Azizi e cols., 1996).
Além disso, outro substrato específico para sítio N-terminal é a Ang-(1-7), que ao
mesmo tempo inibe a hidrólise da Ang I feita pelo domínio C-terminal (Deddish e
cols., 1998).
Os avanços científicos têm possibilitado elucidar o papel funcional dos dois
domínios da ECA, o que aumenta a busca pelo desenvolvimento de uma nova
geração de inibidores domínio-seletivos com perfis farmacológicos distintos
(Redelinghuys e cols., 2005).
A NEP, uma enzima encontrada abundantemente nos rins, está envolvida
no metabolismo de vários peptídeos reguladores dos sistemas nervoso,
cardiovascular, inflamatório e imune. Os principais substratos in vivo da NEP são
os hormônios natriuréticos, peptídeo natriurético atrial (ANP), peptídeo
natriurético cerebral (BNP) e peptídeo natriurético do tipo C (CNP), as
endotelinas, a Ang I convertida em Ang (1-7) e a BK (Campbell DC, 2003).
Estudos iniciados na década de 90 comprovaram que a inibição combinada
da ECA e da NEP é mais eficaz que a inibição da ECA, para redução da pressão
sanguínea, tanto em animais hipertensos como em pacientes. A inibição
simultânea das vasopeptidases, ECA e NEP, reduz a atividade do sistema
renina-angiotensina pelo bloqueio da conversão da Ang I em Ang II e, paralelamente,
peptídeos natriuréticos (Anastasopoulos e cols., 1998; Burnett Jr JC, 1999; Bralet e
Schwartz, 2001).
Os inibidores das vasopeptidases passaram a representar uma nova opção
para o tratamento da hipertensão e poderiam também diminuir a morbidade e
mortalidade associadas às disfunções cardiovasculares, como o infarto
(Anastasopoulos e cols., 1998; Burnett Jr JC, 1999; Bralet e Schwartz, 2001).
A primeira droga desenvolvida para inibir as vasopeptidases foi o
Omapatrilato (Burnett Jr JC, 1999; Trippodo e cols., 1999). Ensaios in vitro
monstraram que essa droga é altamente potente para inibir a ECA, contudo inibe
igualmente os dois sítios catalíticos (Azizi e cols., 2000). Estudos clínicos
realizados com o Omapatrilato apresentaram índice considerável de casos de
angioedema e tosse seca em pacientes tratados (Messerli e Nussberger, 2000;
Kostis e cols., 2004). Esse efeito colateral foi atribuído à forte inibição das duas
enzimas (Zanchi e cols., 2003), limitando sua utilização clínica.
A Figura 1 apresenta a ação das vasopeptidases, ECA e NEP sobre o sistema
Figura 1 - Ação da ECA e da NEP sobre os SRA, SCC e peptídeos natriuréticos.
1) Conversão da Ang I em Ang II; 2) Conversão da Ang I em Ang-(1-7); 3 e 4) Degradação
da BK; 5) Degradação da Ang-(1-7) e 6) Degradação dos peptídeos natriuréticos. Efeitos
fisiológicos no SRA mediados pelos receptores AT1 incluem vasoconstrição, retenção de
água e sódio, liberação de aldosterona, aumento da atividade nervosa simpática entre
outros; mediados pelos receptores AT2 incluem diferenciação celular, vasodilatação entre
outros; mediados pelos receptores Mas e ATn incluem vasodilatação (liberação de NO e
potenciação da BK), aumento do fluxo renal, modulação da excreção renal de sódio,
modulação da atividade do sistema nervoso simpático entre outros. Os efeitos no SCC
mediados pelos receptores B2 incluem vasodilatação e hipotensão através da liberação de
NO, prostaciclinas e do EDHF. Efeitos fisiológicos dos peptídeos natriuréticos incluem
vasodilatação, excreção de sódio, diminuição dos níveis de aldosterona, inibição do
RAAS, inibição da atividade nervosa simpática, diminuição do crescimento do músculo
liso vascular.
(Adaptado de Burnett Jr JC, 1999; Couture e Girolami, 2004; Santos e cols., 2005). Angiotensinogênio Angiotensina I Ang II ECA Bradicinina Metabólitos inativos B2 3 Renina Cininogênio Calicreína Efeitos fisiológicos NEP Metabólitos inativos ANP BNP CNP Efeitos fisiológicos 4 6 1 2
AT2 AT1 Mas ATn
5
Efeitos fisiológicos
I.4 – Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) – 40 anos de
história dos primeiros inibidores da ECA
I.4.1 – A descoberta dos BPPs
No início da década de 60, durante experimentos para verificar se o BAL
(2,3-dimercaptopropanol), em associação ao veneno da serpente Bothrops jararaca
(Bj) (Figura 2), era capaz de potenciar a contração no íleo isolado de cobaia, os
pesquisadores Ferreira e Rocha e Silva observaram que o próprio veneno possuía
forte atividade potenciadora sobre a BK (Ferreira e Rocha e Silva, 1963). Esses
potenciadores da atividade da bradicinina foram inicialmente chamados de fatores
de potenciação da bradicinina (Bradykinin potentiating factors - BPFs), por não
Os BPFs potenciaram a ação farmacológica da bradicinina ex vivo em muitas
preparações do músculo liso, dentre os quais o intestino de cobaia foi mais
sensível para ação dos BPFs (Ferreira SH, 1965). O extrato de BPF potenciou
especificamente a ação da BK em todos esses sistemas sem alterar os efeitos da
acetilcolina e da histamina (Graeff e cols., 1965; Ferreira SH, 1965). No entanto,
apresentou baixo efeito sobre a ação da angiotensina II e ocitocina nas preparações
de músculo liso de íleo de cobaia e útero de rata, respectivamente (Ferreira SH,
1965).
I.4.2 – Desenvolvimento do Captopril
Sérgio Ferreira testou o efeito do extrato de BPF sobre a ECA. O extrato
apresentou-se como um potente inibidor dessa enzima. Esse resultado fez com que
o grupo de Vane, que na época estava engajado na investigação da causa da
hipertensão, tivesse um forte interesse pelos BPFs como uma ferramenta
importante no tratamento da hipertensão (Smith e Vane, 2003).
Utilizando métodos bioquímicos, Ferreira e colaboradores (1970)
fracionaram o veneno da B.jararaca para isolamento dos BPFs, que após a
identificação passaram a ser chamados de peptídeos potenciadores de bradicinina
ou BPPs. Neste trabalho foram isolados nove peptídeos e determinada a seqüência
de aminoácidos de um deles, o BPP-5a. Com a mesma metodologia, Ondetti e cols.
Após a identificação dos BPPs, Vane apresentou para a indústria
farmacêutica Squibb o conceito da inibição da ECA pelos BPPs. Dessa forma,
houve um grande interesse pelos BPPs por parte da indústria farmacêutica (Smith
e Vane, 2003).
Sabendo que a ECA possuía um papel importante no controle da pressão
arterial (Ng e Vane, 1970), vários pesquisadores se empenharam em desenvolver
uma droga anti-hipertensiva com grande potência inibitória sobre a ECA e,
principalmente, que apresentasse atividade por administração oral (Ondetti e
cols., 1977; Cushman e cols., 1977; Ondetti e Cushman, 1981).
Na época, dentre os BPPs que haviam sido descritos, o BPP-9a sob o nome
genérico de teprotide, devido aos quatro resíduos de prolinas na sua estrutura,
apresentou uma potente inibição da ECA, como também uma satisfatória
potenciação da BK (Ferreira e cols., 1970). Contudo, estudos clínicos constataram
que a utilidade terapêutica do BPP-9a ou teprotide era limitada pela ausência de
atividade por administração oral, tanto em modelos animais como em humanos
(Krieger e cols., 1971; Gavras e cols., 1974; Gavras e cols., 1975). Assim, tornou-se
essencial para aplicação farmacêutica o desenvolvimento de um inibidor não
Extensos estudos da ligação com o Zn2+, centro catalítico do sítio ativo, conduziu à
síntese de compostos não-peptídicos estáveis que combinaram a prolina com um
grupo sulfidril, aumentando a potência inibitória. Destes compostos, o Captopril
(D-3mercapto-2-metilpropionil-L-prolina) foi o primeiro inibidor sintético
delineado para a ECA (Figura 3), que apresentou grande potência inibitória sobre
a enzima e atividade por via oral (Ondetti e Cushman, 1981).
Figura 3 – Estrutura química do captopril.
O desenvolvimento do captopril apresentou características, como baixo
custo de produção, absorção oral, estabilidade e, ao mesmo tempo, reproduziu as
mesmas atividades farmacológicas e enzimáticas dos BPPs (Case e cols., 1978;
Gavras e cols., 1978; Antonaccio e cols., 1979; Niarchos e cols.,1979; Cushman e
cols., 1982). Como conseqüência, os BPPs deixaram de interessar à Indústria
Farmacêutica.
Estudos recentes mostraram que o captopril atua sobre a ECA bloqueando
para o sítio N-terminal (Michaud e cols., 1997). Acredita-se que esse fato explique
parte de seus efeitos colaterais indesejáveis, como a anemia, causada
provavelmente pela inibição do domínio N-terminal (Bailey e Sizeland, 1989;
Lefant e cols.,1989; Dive e cols., 1999).
I.4.3 – Retorno do interesse pelos BPPs
Durante análises da biblioteca de cDNA da glândula de veneno da Bj, foi
isolado o cDNA que codifica a proteína precursora dos BPPs e do peptídeo
natriurético tipo C no veneno da serpente. O clone codifica uma proteína
constituída por 256 aminoácidos, contendo 7 BPPs e o CNP (Figura 4). Dos sete
peptídeos encontrados, havia duas seqüências inéditas (Murayama e cols., 1997).
As duas novas seqüências encontradas nesse precursor, sugeriram a
aa bp
TCTGGCCAAGCAGACAAGCGCG 22 GCTTGACGAGACGCTCTTGCGGCAAAGCGCCCGGCTCGACTCGGCTCCCTTCGGCTCAGCGGTCCGCGCCGTCGA 97 GGATTCTCACTCTTGCTCGCTCGCTCGCTCGCTCGCTCTCGCCCACCCTCTCTGCCGGCGCCTGCGCAGCCCGGG 172 ATGGTCCTCTCCCGCCTGGCGGCCAGCGGGCTGCTGCTCCTGGCCCTGCTGGCGCTCTCGGTCGACGGGAAGCCG 247
M V L S R L A A S G L L L L A L L A L S V D G K P 25
GTGCAGCAGTGGGCGCAGAGTTGGCCCGGTCCTAATATTCCGCCGCTGAAG 298 *BPPIV-1-A V Q Q W A Q S W P G P N I P P L K 42
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGGGGGCTGGCCGCGCCCCGGTCCTGAGATTCCGCCGCTGACG 358 BPPIII-1-A V Q Q W A Q G G W P R P G P E I P P L T 62
GTGCAGCAGTGGGCGCAAAACTGGCCGCATCCTCAGATTCCGCCGCTGACG 409 BPPIV-1-Bb V Q Q W A Q N W P H P Q I P P L T 79
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGGGCGGGCGCCGGGTCCTCCGATTCCGCCGCTGACG 463 BPP-c V Q Q W A Q G R A P G P P I P P L T 97
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGGGCGGGCGCCGCATCCTCCGATACCGCCGGCGCCG 517 BPP-d V Q Q W A Q G R A P H P P I P P A P 115
CTGCAGAAGTGGGCGCCGCTGCAGAAGTGGGCGCCGCTGCTGCAGCCCCACGAGAGTCCGGCGAGCGGCACG 589 BPPVa L Q K W A P L Q K W A P L L Q P H E S P A S G T 139
ACGGCCTTGCGGGAGGAGCTGAGCCTGGGGCCAGAAGCGGCGTCGGGCGTCCCGTCTGCTGGAGCAGAGGTC 661
T A L R E E L S L G P E A A G G V P S A G A E V 163
GGGCGCAGCGGCTCGAAGGCGCCCGCTGCACCCCATCGGCTGTCGAAGAGCAAAGGGGCGGCGGCGACGCGG 733
G R S G S K A P A A P H R L S K S K G A A A T R 187
CCGATGCGGGACTTGCGCCCCGACGGCAAGCAGGCACGGCAAAACTGGGGCCGGATGGCGCACCACGACCAC 805
P M R D L R P D G K Q A R Q N W G R M A H H D H 211
CACGCGGCAGCAGGAGGCGGCGGCGGAGGCGGAGGAGGAGCGCGTCGTCTGAAGGGGCTGGCC 868
H A A A G G G G G G G G G A R R L K G L A 232
AAGAAAGGGGCGGCCAAGGGCTGCTTTGGCCTGAAGCTCGACCGCATCGGCACCATGAGCGGCCTGGGCTGC 940
Bj-CNP K K G A A K G C F G L K L D R I G T M S G L G C 256
TGAAGCCGTCGAGGGCGGCGCGAAGGCGACACCTGGCGGCGGTCTTTGAACTGAGACCCCACCCCATCCGCG 1012 GACATTTCTGGACATCCCCTGCAATTCATCCAGGGATCCCAGGCCCACACAGCCTGTCTCCTGTTGGTACGA 1084 GCACTTGAAGAAGCCATTTTTCAGTGGGAGGGTTCTGGGTAGGGTTGGACTGAGTTTTGCGCCCCCAAATCT 1156 TCCTATCTTACCTAATATATACCTAGATGCCATATATATATCGATAGATACAAGTACACCCAACACAAAAAA 1228 CACGCCCGCCCACAACTTCTTCCCCGCGACAAAGGACGGTGTCGGGAGACGGAGAGAACCAGCTGCGTATGC 1300 CATCGAGATTGCTGTTTGTACATTCGTGTCACGCATAAATGTATTTAAGTTGTAAAAGCTATTTATATATTG 1372 TTTATAAAGAGATATTTATAAAAAAAAATTTTATTTATGTAAACTAAACGAAAAGGGGTCGAGCATTGTAAA 1444 CTTTTTTTTTCCCCTTTCTCATCCTGAATAGTCGGAAGGAAAGAAAAAAAAAATCATGGACGATTTGATAAC 1516 CTGTCTTGCATTTTAATCGGATGCAGTCTTTCTTTCCGAAATGGGTGGTTTGAACAAGGCTTTTAGATACCA 1588 CGGATAAGAGTAAAAAATGCATTTGTAAAGAAATCGCACGCTATCTACCAAAGGTGTAAAAGAACCCGACGC 1660 GCCGTTTTTGACGTTTTTAGCAGAAATAAAAAAAACCACTTTTCAAAGAGGTCCTCAGAATTAAAAAAAAAAA 1733
Figura 4 -Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da molécula protéica precursora
dos BPPs e do CNP isolada da glândula de veneno da Bothrops jararaca. O clone NM
96, presente no veneno da Bothrops jararaca, codifica para uma proteína constituída por 256 aminoácidos, contendo 7 BPPs (vermelho) e o peptídeo natriurético tipo C (CNP)
(azul). O lado esquerdo de cada seqüência repetida apresenta cinco resíduos de
Esse achado conduziu à realização de estudos da fração de baixo peso
molecular do veneno bruto da B.jararaca. Utilizando a combinação de técnicas
convencionais de cromatografia líquida e espectrometria de massa, foram isolados
e identificados 16 BPPs, sendo que 5 deles eram inéditos (Ianzer e cols., 2004)
(Tabela 1).
Ao mesmo tempo, utilizando as mesmas técnicas, foram realizados estudos
para isolamento de possíveis BPPs de outros tecidos da B.jararaca. Dessa forma, foi
isolado e identificado o BPP-5a no cérebro e no pâncreas, peptídeo previamente
descrito para o veneno da serpente (Hayashi e cols., 2003).
O cDNA que codifica o precursor de BPPs no cérebro foi clonado e foi
possível observar que este precursor neuronal também apresenta 7 seqüências de
BPPs e uma seqüência de CNP (Figura 5). Neste precursor havia duas novas
seqüências de BPPs, contendo 11 e 12 resíduos de aminoácidos, 11c e
BPP-12b. (Hayashi e cols., 2003) (Tabela 1).
Estudos de hibridização in situ revelaram a expressão do precursor dos
BPPs nas regiões do cérebro da serpente conhecidos por estarem envolvidos no
controle do fluido neuroendócrino e na regulação cardiovascular, como descrito
aa bp
CGGCACGAGGAAAGCGATGCCGACGCTGCGAGCGAATCTA 40 GGCCAAGCAGACAAGCGCGGCTTGACGAGACGCTCTTGCGGCAAAGCGCCCGGCTCGACT 100
CGGCTCCCTTCGGCTCAGCGGTCCGCGCCGTCGAGGATTCTCACTCTTGCTCGCTCGCTC 160 GCTCGCTCTCGCCCACCCTCTCTGCCGGCGCCTGCGCAGCCCGGGATGGTCCTCTCCCGC 220
M V L S R 5
CTGGCGGCCAGCGGGCTGCTGCTCCTGGCCCTGCTGGCGCTCTCGGTCGACGGGAAGCCG 280
L A A S G L L L L A L L A L S V D G K P 25
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGGGGGCTGGCCGCGCCCCGGTCCTGAGATTCCGCCGCTGAAG 340 EVASIN-13a V Q Q W A Q G G W P R P G P E I P P L K 45
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGGGGGCTGGCCGCGCCCCGGTCCTGAGATTCCGCCGCTGACA 400 EVASIN-13a V Q Q W A Q G G W P R P G P E I P P L T 65
GTGCAGCAGTGGGCGCAAAACTGGCCGCATCCTCAGATTCCGCCGCTGACG 451 EVASIN-10c V Q Q W A Q N W P H P Q I P P L T 82
GTGCAGCAGTGGGCGCAATGGGGGCGGCCGCCGGGTCCTCCGATTCCGCCGCTGACG 508 EVASIN-12b V Q Q W A Q W G R P P G P P I P P L T 101
GTGCAGCAGTGGGCGCAAGCGCGGCCGCCGCATCCTCCGATACCGCCGGCGCCGCTG 565 EVASIN-11e V Q Q W A Q A R P P H P P I P P A P L 120 CAGAAGTGGGCGCCGGTGCAGAAGTGGGCGCCGCTGCTGCAGCCCCACGAGAGTCCGGCG 625 EVASIN-5a . .Q K W A P V Q K W A P L L Q P H E S P A 140
AGCGGCACGACGGCCTTGCGGGAGGAGCTGAGCCTGGGGCCAGAAGCGGCGTCGGGCGTC 685
..S G T T A L R E E L S L G P E A A S G V 160
CCGTCTGCTGGAGCAGAGGTCGGGCGCAGCGGCTCGAAGGCGCCCGCTGCACCCCATAGG 745
.P S A G A E V G R S G S K A P A A P H R 180
CTGTCGAAGAGCAAAGGGGCGGCGGCGACCTCGGCGGCGTCGCGGCCGATGCGGGACTTG 805
. .L S K S K G A A A T S A A S R P M R D L 200
CGCCCCGACGGCAAGCAGGCGCGGCAAAACTGGGGCCGGATGGTGCACCACGACCACCAC 865
..R P D G K Q A R Q N W G R M V H H D H H 220
GCAGCAGTAGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGAGGAGGAGCGCGTCGTCTGAAGGGGCTG 925
. .A A V G G G G G G G G G G A R R L K G L 240
GCCAAGAAAGGGGCGGCCAAGGGCTGCTTCGGCCTGAAGGTCGACCGCATCGGCACCATG 985 CNP . .A K K G A A K G C F G L K V D R I G T M 260
AGTGGCCTGGGCTGCTGAAGCCGTCGAGGGCGGCGCGAAGGCGACACCTGGCGGCGGTCT 1045
S G L G C 265
TTGAACTGAGACCCCACCCCATCCGCGGACATTTCTGGACATCCCCTGCAATTCATCCAG 1105 GGATCCCAGGCCCACACAGCCTGTCTCCTGTTGGTACGAGCAACTTGAAGAAGCCATTTT 1165 TCAGTGGGAGGGTTCTGGGTAGGGTTGGACTGAGTTTTGCGCCCCCAAATCTTCCTATCT 1225 TACCTAATATATACCTAGAGTCCATATATATATCGATAGATACAAGTACACCCAACACAA 1285 AAAACACGCCCGCCCACAACTTCTTCCCCGCGACAAAGGACGGTGTCGGGAGACGGAGAG 1345 AACCAGCTGCGTATGCCATCGAGATTGCTGTTTGTACATTCGTGTCACGCATAAATGTAT 1405 TTAAGTTGTAAAAGCTATTTATATATTGTTTATAAAGAGATATTTATAAAAAAAAATTTT 1465 ATTTATGTAAACTAAACGAAAAGGGGTCGAGCATTGTAAACTTTTTTTTTTTCCCCCTTT 1525 CTCATCCTGAATAGTCGGAAGGAAAGAAAAAAAAAATCATGGACGATTTGATAACCTGTC 1585 TTGCATTTTAATCGGATGCAGTCTTTCTTTCCGAAATGGGTGGTTTGAACAAGGCTTTTA 1645 GATACCACGGATAAGAGTAAAAAATGCATTTGTAAAGAAATCGCACGCTATCTACCAAAG 1705 GTGGTAAAAGAACCTGACGC 1724
Figura 5 -Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da molécula protéica precursora
dos BPPs e do CNP isolada do cérebro da Bothrops jararaca. O clone codifica uma
proteína contendo 7 BPPs (vermelho) e o peptídeo natriurético tipo C (CNP) (azul). O lado
esquerdo de cada seqüência repetida apresenta cinco resíduos de aminoácidos
É interessante notar que o CNP, um neuropeptídeo envolvido na regulação
da PA e na concentração de eletrólitos do sangue (Nascimento-Gomes e cols.,
1995), mais uma vez foi codificado no precursor dos BPPs no cérebro. Isso, sugere
um papel fisiológico importante dos BPPs que podem também ter uma ação como
neuropeptídeos (Hayashi cols., 2003; Hayashi e Camargo, 2005).
Os BPPs descritos para a Bothrops jararaca são peptídeos contendo de 5 a 14
resíduos de aminoácidos por molécula e apresentam características estruturais
comuns, como a presença de um resíduo de ácido piroglutâmico na posição
N-terminal e uma prolina na posição C-terminal. Além disso, a maioria dos BPPs
apresenta resíduos de ácido glutâmico, arginina e triptofano. Peptídeos contendo
mais de sete resíduos de aminoácidos terminam com o tripeptídeo Ile-Pro-Pro e
possuem vários resíduos de prolina nas suas partes internas (Ferreira e cols., 1970;
Freer e Stewart, 1971; Ianzer e cols., 2004) (Tabela 1), o que confere certa resistência
a hidrólise por aminopeptidases, carboxipeptidases e endopeptidases (Cheung e
Tabela 1 – Peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs) isolados do veneno bruto da
Bothrops jararaca. <E, ácido piroglutâmico; + potenciação da bradicinina; ND, não
determinado; negrito, novas seqüências (Ianzer e cols., 2004).
Sequência de aminoácidos
Nomenclatura MW (Da)
Potenciação da BK
<EKWAP BPP-5aa,c,d,e 611,7 +++
<EWPRP BPP-5be 665,8 +
<ESWPGP BPP-6aa,e 653,7 +
<EDGPIPP BPP-7ae 705,8 +
<EWPRPQIPP BPP-9aa,b,e 1101,3 +++
<ESWPGPNIPP BPP-10aa,b,c,e 1075,2 ++
<ENWPRPQIPP BPP-10bb,e 1215,4 ND
<ENWPHPQIPP BPP-10ca,b,c,d,e 1196,3 +++
<EWPRPTPQIPP BPP-11ab,e 1299,5 ND
<EGRAPGPPIPP BPP-11bc,e 1069,2 ++
<EGRAPHPPIPP BPP-11cd 1149,3 ++
<EGRPPGPPIPP BPP-11de 1095,3 ND
<EARPPHPPIPP BPP-11ed 1189,4 ++
<EGWAWPRPQIPP BPP-12a a,e 1415,6 +++
<EWGRPPGPPIPP BPP-12bd 1281,5 +++
<EWAQWPRPQIPP BPP 12ce 1485,8 ND
<EGGWPRPGPEIPP BPP-13ad,e 1370,5 +++
<EGGLPRPGPEIPP BPP-13ba,b,c,d,e 1297,5 +++
<EWAQWPRPTPQIPP BPP-14ae 1683,85 ND
Além da Bothrops jararaca, vários BPPs foram descritos para venenos de
outras espécies de serpentes como Agkistrodon halys blomhoffi (Kato e Suzuki, 1970;
Kato e Suzuki, 1971; Higuchi e cols., 1999); Agkistrodon halys pallas (Cheung-Wu e
cols., 1982); Crotalux atrox (Politi e cols., 1985); Bothrops insularis (Cintra e cols.,
1990); Bothrops jararacussu (Ferreira e cols., 1992a; Ferreira e cols., 1992b);
Agkistrodon piscivorus piscivorus (Ferreira e cols., 1995); Bothrops neuwiedi (Ferreira e
cols., 1998); Trimeresurus gramineus e Trimeresurus flavoviridis (Higuchi e cols.,
1999), Trimeresurus mucrosquamatus (Jia e cols., 2003), Lachesis muta (Soares e cols.,
2005), utilizando tanto técnicas de bioquímica como de biologia molecular. Vários
BPPs também foram isolados a partir de venenos de outros animais peçonhentos
como: escorpiões (Ferreira e cols., 1993; Meki e cols., 1995; Zeng e cols., 2000; Braga
TV, 2005) e aranhas (Sosnina e cols., 1990; Akchunov e cols., 1992; Ferreira e cols.,
1996).
Contudo, apenas para a B.jararaca foi descrita essa variedade de peptídeos
(Tabela 1). Essa diversidade pode ser explicada por mutações aceleradas dentro do
domínio dos BPPs durante a evolução da serpente (Hayashi e Camargo, 2005).
Esse tipo de processo já foi observado para as fosfolipases A2 (Nakashima e cols.,
para inibição do sítio C-terminal da ECA somática. Enquanto que alguns
peptídeos mostraram-se inespecíficos, como os BPPs 11d, 12a e 13a; outros
apresentaram especificidade pelo sítio amino-terminal, BPP-5a e BPP-12b.
Somente os BPPs 7a e 11d apresentaram fraca atividade inibitória, na ordem de
µM (Tabela 2) (Ianzer DA, 2001; Cotton e cols., 2002; Hayashi e cols., 2003).
Através de técnicas de modelagem molecular foi demonstrada a interação
específica do BPP-9a com o sítio C-terminal da ECA. Enquanto, para o complexo
N-terminal da enzima-peptídeo (N-sECA-BPP9a) ocorre repulsão entre os
resíduos Arg 412 da enzima e a Arg da posição P4 do peptídeo (Fernandez e cols.,
2004).
A Tabela 2 apresenta os resultados in vitro para inibição dos sítios da ECA e
para inibição da NEP e os resultados ex vivo para ponteciação da BK, obtidos com
Tabela 2 - Atividade de potenciação sobre o efeito contrátil da bradicinina em íleo
isolado de cobaia (UP), constante de inibição (Ki) para a NEP e constantes de inibição
aparente (Ki app) para sítio C-terminal e N-terminal da ECA dos peptídeos potenciadores
de bradicinina (BPPs). nd – não determinado. (Ianzer DA, 2001; Cotton e cols., 2002;
Hayashi e cols., 2003).
BPP Seqüências MM (Da) UP
(nmol)
Ki NEP
(µµµµM)
Ki app da ECA
(nM) Sítio C Sítio N
BPP-5a <EKWAP 611,7 0,36 554,7 1280 400
BPP-5b <EWPRP 665,8 8,58 531,3 nd nd
BPP-7a <EDGPIPP 705,8 10,77 492,0 40000 70000
BPP-9a <EWPRPQIPP 1101,3 0,22 86,1 1 100
BPP-10a <ESWPGPNIPP 1075,2 1,68 458,9 33 130
BPP-10c <ENWPHPQIPP 1196,3 0,48 253,9 0,5 200
BPP-11a <EWPRPTPQIPP 1299,5 nd 237,8 nd nd
BPP-11b <EGRAPGPPIPP 1069,2 2,67 475,7 57 3000
BPP-11c <EGRAPHPPIPP 1149,3 2,68 589,2 40 2000
BPP-11d <EGRPPGPPIPP 1113,3 nd 1177,6 1000 1000
BPP-11e <EARPPHPPIPP 1189,4 29,77 112,7 300 100
BPP-12a <EGWAWPRPQIPP 1433,6 0,34 106,2 25 25
BPP-12b <EWGRPPGPPIPP 1281,5 0,83 220,2 150 5
BPP-13a <EGGWPRPGPEIPP 1388,5 1,26 473,4 50 50
BPP-13b <EGGLPRPGPEIPP 1297,5 0,45 693,6 nd nd
--- CAPTOPRIL 217,3 0,14 1097,6 1,14* 0,08*
fracos inibidores dessa enzima, descartando a possibilidade de serem utilizados
como inibidores combinados das duas enzimas (ECA e NEP) (Tabela 2) (Ianzer
DA, 2001).
A diversidade de BPPs descritos para a B.jararaca, bem como, as diferenças
apresentadas para potenciação da BK e inibição da ECA in vitro, implicam na
necessidade de avaliação e caracterização da(s) atividades e mecanismo(s) de ação
para cada peptídeo.
Para realização do presente trabalho, foram selecionados quatro peptídeos
entre as 19 seqüências de BPPs descritas para a B.jararaca. Os BPPs 5a, 7a, 9a e 10c
foram selecionados de acordo com as propriedades totalmente distintas relativas à
inibição dos dois sítios catalíticos ECA e potenciação da BK (em azul, Tabela 2).
A utilização desses peptídeos permitiu reavaliar o conceito vigente que
atribui os efeitos cardiovasculares dos inibidores de ECA a sua eficácia como
II – OBJETIVOS
II.1 – Objetivo Geral
Estudar os efeitos cardiovasculares de diferentes BPPs em ratos hipertensos
(SHR) e ratos normotensos (WT) e verificar se esses efeitos estão associados ou não
a sua afinidade domínio-seletiva pela ECA e sua atividade potenciadora de BK.
II.2 – Objetivos Específicos
Avaliar a atividade de potenciação dos BPPs sobre o efeito hipotensor da
bradicinina em ratos anestesiados (determinação da UP);
Avaliar o efeito da administração i.v. dos BPPs sobre parâmetros
cardiovasculares de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e ratos Wistar
normotensos;
Comparar os efeitos cardiovasculares observados em ratos hipertensos com
aqueles observados em ratos normotensos;
Relacionar a atividade de potenciação da BK com os efeitos cardiovasculares
dos BPPs em SHR acordados;
Relacionar a atividade inibitória sobre a ECA com os efeitos cardiovasculares
dos BPPs em SHR acordados;
III – MATERIAIS E MÉTODOS
III.1 – Animais
Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus) machos, adultos de peso corporal
entre 200 a 350 g. As linhagens utilizadas foram: ratos normotensos (WT) e ratos
espontaneamente hipertensos (SHR).
Os ratos normotensos e SHR foram fornecidos pelo Centro de Bioterismo
(CEBIO) do ICB - UFMG. Os animais foram mantidos com acesso livre à
alimentação e água e foram submetidos a um ciclo luz-escuro (12 horas cada) no
Biotério do Laboratório de Hipertensão antes de serem preparados para os
experimentos. Procedimentos que envolvem animais e seus cuidados foram
conduzidos conforme Giles AR, 1987 e aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da UNIFESP.
III.2 – Peptídeos
Os peptídeos potenciadores de bradicinina, BPP-5a (lote 0564109), BPP-7a
(lote B03260), BPP-9a (lote 0564111) e BPP-10c (lote B03264), foram fornecidos pela
III.3 – Outras drogas e reagentes
Bradicinina e captopril foram adquiridos da Sigma Co., EUA; heparina
sódica (Liquemine, 5000U.I/mL) da Roche Laboratories, Brasil; salina isotônica
estéril (NaCl 0,9%) da Asterflex, Brasil; Uretana da Sigma Aldrich Co, Alemanha;
tribromoetanol da Sigma Aldrich Co., Alemanha; padrão do osmômetro (500, 290
e 100 mOsm/Kg H2O) da Precision System Inc, EUA; padrão de sódio 140 mEq/L
de Na+ e potássio 5mEq/L de K+ da Laborlab, Brasil. Todos os demais reagentes
utilizados foram de melhor qualidade analítica disponível.
III.4 – Cânulas
As cânulas utilizadas foram confeccionadas a partir de tubos de polietileno
PE-10 (4cm para artéria e 2cm para a veia) soldados em outros tubos de polietileno
PE-50 (15cm) e obstruídas na extremidade livre do PE-50 com pino de metal.
Antes de serem implantadas nos ratos, as cânulas arteriais foram preenchidas com
solução contendo heparina (25.000 U.I. diluída 5 vezes em solução salina 0,9%) e
as cânulas da veia foram preenchidas com salina estéril (NaCl 0,9%).
♦ Ultrasom – ultrasonic cleaner by Branson – Branson A Smithkline Beckman
Company Parrott Dr. Shelton OT, EUA;
♦ Balança analítica modelo BL 120S, Denver, EUA;
♦ Pipetas – Eppendorf, Alemanha;
♦ Gaiolas metabólicas para ratos entre 150 – 300g, Nalgene, EUA;
♦ Centrífuga modelo 5417R, Eppendorf, Alemanha;
♦ Fotômetro de chama FC-180, CELM, Brasil;
♦ Osmômetro, µOsmette, Precision System, EUA.
III.6 – Registro de parâmetros cardiovasculares em ratos
anestesiados
Para o registro dos parâmetros cardiovasculares (pressão arterial pulsátil -
PAP, pressão arterial média - PAM e freqüência cardíaca - FC), os animais foram
submetidos a procedimento cirúrgico para isolamento e canulação dos vasos. Os
ratos foram anestesiados com uretana 12% (1,0 mL/100g de peso corporal) por via
intraperitoneal e colocados em decúbito dorsal em uma prancha cirúrgica. Foi
realizada uma pequena incisão na pele, separando a musculatura para localização
do feixe vásculo-nervoso femural. Na artéria femural foi introduzida uma cânula
para registro da pressão arterial. Na veia femural foi introduzido uma cânula para
as infusões das drogas. A cânula arterial foi conectada ao transdutor e feito o
animal foi mantida em 36 - 37° C (temperatura retal) através de uma manta
elétrica de aquecimento.
O registro foi realizado com a conexão da cânula arterial a um transdutor
de pressão (strain-Gauge –DT-XX Viggo-spectramed) e as oscilações de pressão
captadas foram amplificadas e convertidas em sinais digitais através do conversor
analógico/digital (A/D) MP100 (BIOPAC systems, Inc.). O software utilizado foi
AcqKowledge 5.0 (BIOPAC Systems, Inc.). Após a prévia calibragem do
equipamento, as três variáveis PAP, PAM e FC foram monitoradas continuamente.
A PAM e a FC foram calculadas via software a partir dos valores da PAP.
III.6.1 – Determinação da unidade de potenciação (UP) da BK pelos BPPs
na pressão arterial de ratos anestesiados
Para determinação da UP na pressão arterial de rato foram utilizados 21
ratos normotensos, de peso corporal de 200 a 280 g. A UP é a quantidade do
peptídeo capaz de transformar o efeito de uma dose simples de BK ao
correspondente ao efeito produzido por uma dose dupla (Ferreira SH, 1965; Paula
e cols., 1995).
30, 40, 50, 60, 75 e 90 minutos, após a injeção do peptídeo, foram injetadas doses
padrão de 0,5 µg de BK para verificar a potenciação do efeito hipotensor da
mesma, como também a duração deste efeito.
Neste ensaio foram testadas várias doses do peptídeo (uma dose por rato) a
fim de determinar a dose correspondente a UP. O n variou de 4 a 7 animais para
cada BPP.
III.7 – Registro de parâmetros cardiovasculares em ratos
acordados
Um dia antes do experimento, os animais foram submetidos à cirurgia para
introdução de cânulas na artéria e na veia femural. Os ratos foram anestesiados
com tribromoetanol 2,5% (1,0 mL/100 g de peso corporal) por via intraperitoneal e
colocados em decúbito dorsal em uma prancha cirúrgica. Foi realizada uma
pequena incisão na pele, separando a musculatura para localização do feixe
vásculo-nervoso femural. As cânulas foram introduzidas na veia cava inferior
através da veia femural, para administração da droga e na aorta abdominal
através da artéria femural, para registro dos parâmetros cardiovasculares. As
cânulas foram amarradas junto ao feixe com fio cirúrgico e dirigidas
subcutaneamente com auxílio de um trocater para a região escapular, onde foram
O experimento foi iniciado 18 - 20 horas após o procedimento cirúrgico e
realizado com o animal não-anestesiado e com livre movimentação. O registro foi
realizado com a conexão da cânula arterial a um transdutor de pressão (BIOPAC
systems, Inc.), conforme detalhadamente descrito no item III.6.
III.7.1 – Efeitos cardiovasculares da administração aguda de BPPs em ratos
acordados
Neste estudo foram utilizados ratos hipertensos - SHR (65 animais) e ratos
normotensos - WT (23 animais),de peso corporal entre 250 a 350g.
Antes da administração da droga foram monitorados os parâmetros
cardiovasculares dos ratos durante 60 minutos, como controle basal foram
utilizados os 20 minutos que antecederam a administração do peptídeo. Após esse
período, foi feita a injeção i.v. in bolus do BPP num volume total de 0,5 mL
(solução de NaCl 0,9%) ou veículo (NaCl 0,9%) e monitorados os parâmetros
cardiovasculares durante 6 horas. Durante o período do registro, foram anotados
os valores de PAM e FC a cada 2 minutos. Este estudo foi realizado com as doses
de 0,47; 2,37; 14,2; 71 e 710 nmol/Kg de peso corporal para cada BPP em SHR (O n
de BPP ou veículo. No segundo dia de experimento, os animais apresentaram
níveis basais de PAM e FC similares aos observados no primeiro dia.
III.7.2 – Estudo da ação potenciadora de BPPs sobre a atividade
hipotensora da BK e da ação inibitória dos BPPs sobre a conversão de Ang
I em Ang II em ratos acordados
Neste estudo foram utilizados SHR (34 animais), de peso corporal entre 250
a 350 g. Antes da administração da droga, foram monitorados os parâmetros
cardiovasculares do rato durante 30 minutos. Após esse período, foram feitas
injeções i.v. in bolus da bradicinina (0,5 µg e 1,0 µg) e da angiotensina I (20 ng e 40
ng) num volume total de 0,1 mL para verificar a resposta padrão desses peptídeos
(controle). O intervalo de cada administração foi de no mínimo 3 minutos. Foram
feitas injeções de salina (veículo) após a administração das drogas. Após 60
minutos do início do registro, foi feita a administração i.v. de BPP (2,37 nmol/Kg)
num volume total de 0,5 mL (solução de NaCl 0,9 %). Nos tempos de 10 e 210
minutos após a administração de BPP foram feitas injeções de BK (0,5 µg) e nos
tempos 20 e 220 minutos após BPP foram feitas injeções de Ang I (40 ng) (O n
III.8 – Estudo do efeito de BPPs sobre a função renal de ratos
espontaneamente hipertensos (SHR)
Neste estudo foram utilizados 29 ratos hipertensos de peso corporal entre
280 a 350g para avaliação aguda da função renal após administração i.v. de BPPs.
Para adaptação, os ratos foram mantidos em gaiolas metabólicas durante
um período de 48 horas antes da administração com acesso livre a água e ração. O
BPP (710 nmol/Kg) no volume final de 0,15 mL (solução de NaCl 0,9%) foi injetado
na veia caudal dos ratos. Os animais controle (injeção i.v. de salina, 0,15 mL) e os
tratados foram mantidos por 24 horas, após a administração, em gaiolas
metabólicas mantendo livre acesso à água e ração.
Após o período de 24 horas, foram coletados a urina e o sangue dos ratos
para determinação de vários parâmetros (sódio plasmático, excreção urinária de
sódio e potássio, osmolalidade sérica, osmolalidade urinária, clearance osmolar,
clearance de água livre).
As amostras de sangue (0,5 – 1,0 mL) foram coletadas através da veia
caudal e acondicionados em tubos (tipo Eppendorf), contendo 30 µL de heparina e
mantidos em banho de gelo até a centrifugação. As amostras de urina e sangue
III.8.1 – Determinação de Na+ e K+ nas amostras de plasma e urina
As determinações de Na+ nas amostras de plasma e de Na+ e K+ nas
amostras de urina foram realizadas por fotometria de chama no fotômetro de
chama utilizando padrão contendo 140 mEq/L de Na+ e 5mEq/L de K+ preparado
em água deionizada.
Para determinação do sódio plasmático e urinário, as amostras de plasma e
de urina foram diluídas em 3000 e 200 vezes em água deionizada,
respectivamente. Os valores lidos a partir das amostras foram multiplicados pelo
fator de diluição. A dosagem de cada amostra foi feita em duplicata.
A partir das concentrações sérica e urinária de sódio e urinária de potássio,
pode ser calculada a quantidade excretada desses íons.
Quantidade excretada = concentração do íon (mEq/L) X fluxo urinário
(mL/min/100g peso).
Quantidade excretada = µEq/min/100g de peso
III.8.2 – Determinação da osmolalidade nas amostras de plasma e urina
A determinação das osmolalidades sérica e urinária foi realizada por
osmometria de congelamento. Para leitura, o osmômetro foi previamente
calibrado utilizando duas soluções padrão, 100 mOsm/Kg H2O e 500 mOsm/Kg
H2O. A faixa de leitura usada foi de 0 a 2000 mOsm/L. Foram utilizadas 50 µL de
diluídas 1:2 em água deionizada. Os valores lidos a partir das amostras foram
multiplicados pelo fator de diluição. A dosagem de cada amostra foi feita em
duplicata.
O clearance osmolar (Closm) foi obtido a partir do seguinte cálculo: Closm Osmolalidade urinária (mOsm/L) x volume (mL)
Osmolalidade sérica (mOsm/L) x Tempo de coleta de urina (min)
III.9 – Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± EPM. Os resultados da
potenciação da BK em ratos anestesiados e acordados, os resultados do efeito
pressor da Ang I em ratos acordados e os resultados dos parâmetros renais foram
analisados utilizando One-Way ANOVA seguida do teste de Dunnett. Os dados
dos efeitos cardiovasculares foram analisados utilizando teste t pareado para
comparar o efeito agudo com o tardio de cada BPP. Para comparações do efeito
agudo e do efeito tardio separadamente dos grupos tratados com BPPs e com
veículo foi utilizado One-Way ANOVA seguido do teste de Dunnett ou do teste
de Newman Keuls quando apropriado. Para comparação dos efeitos
cardiovasculares nos dois modelos animais foi utilizado teste t não pareado
IV – RESULTADOS
IV.1 – Intensidade e duração da atividade potenciadora dos
BPPs sobre o efeito hipotensor da bradicinina em ratos
normotensos anestesiados
A avaliação e comparação da intensidade de potenciação dos BPPs para
promover a amplificação do efeito hipotensor causado pela administração
intravenosa de bradicinina foi possível graças a determinação da unidade de
potenciação (UP).
A Figura 6 apresenta as respostas hipotensora da BK antes e após a
