GIOVANA CAMILA DE MACEDO
PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA DA OREXINA NA SENSIBILIZAÇÃO
COMPORTAMENTAL AO EFEITO ESTIMULANTE DO ETANOL EM
CAMUNDONGOS MACHOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Macedo, Giovana Camila de
Participação do sistema da orexina na sensibilização
comportamental ao efeito estimulante do etanol em camundongos machos/ Giovana Camila de Macedo -- São Paulo, 2011.
xxii,58p.
Tese de Mestrado – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
Título em Inglês: Role of orexin system in ethanol-induced behavioral sensitization in male mice
1. Orexina. 2. Sensibilização comportamental. 3. Dependência. 4. Etanol. 5. Imunohistoquímica. 6. Área tegmentar ventral. 7.
camundongos. 8. SB 334867.
GIOVANA CAMILA DE MACEDO
PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA DA OREXINA NA SENSIBILIZAÇÃO
COMPORTAMENTAL AO EFEITO ESTIMULANTE DO ETANOL EM
CAMUNDONGOS MACHOS
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências pelo Programa de
Pós-Graduação em Psicobiologia.
Orientadora: Prof
a.
Dr
a. Deborah Suchecki
São Paulo
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento de Psicobiologia
Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Prof. Dr. Marco Túlio de Mello
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Banca examinadora
Dr. Fábio Cardoso Cruz
Profa. Dra.Isabel Marian Hartmann Quadros Profa. Dra. Rosana Camarini
Suplente
Prof. Dr. Mario Pedrazzoli
APROVADO EM 25/05/2011
Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia da
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à
Psicofarmacologia (AFIP) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), com bolsa de Mestrado do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
“... somos águias. Por isso, companheiros e companheiras, abramos as asas e voemos. Voemos como as águias. Jamais nos contentemos com os grãos que nos jogarem aos pés para ciscar.”
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“Liguei mais um pedacinho da minha ponte. Quero sentar e sentir o brilho passar”.
Giovana Camila de Macedo
DEDICATÓRIA
Com imenso amor e gratidão dedico esta tese aos meus
pais João Bosco Maria de Macedo e Cristina Ferreira de
Macedo pelo exemplo de vida e de ser humano, pelos valores
morais e pela educação que me proporcionaram.
Aos meus queridos irmãos Juliana e Samuel pelo
companheirismo, amor e amizade. Um presente que a vida
me deu.
Agradecimento especial
À minha orientadora Profa. Dra. Deborah Suchecki, pelos ensinamentos, dedicação, apoio e entendimentos.
Aos animais de laboratório que contribuíram para que este trabalho fosse realizado. Sem vocês nada disso ocorreria.
Agradecimentos
À vida por essa oportunidade!
À UNIFESP e a todos os profissionais desta instituição.
Ao Departamento de Psicobiologia, que fez parte da minha vida por alguns anos.
Á Profa. Rita de Cássia Sinigaglia Coimbra, pela colaboração e dedicação.
À Andrea Borges pela imensa ajuda na realização dos experimentos e dedicação.
Ao companheiro de imunohistoquímica Danilo. Obrigada por tudo!
À Suzi Emiko Kawakami pela ajuda na construção e realização deste projeto.
Obrigada por tudo!
Ao Thiago Vignoli por me ajudar na perfusão.
Aos colegas do grupo do estresse que me instigaram com os pensamentos,
discussões e idéias!
Às meninas do grupo da Malu, pela amizade, colaboração e ajuda nos
experimentos.
À Andrezza Kim por toda ajuda e pelos bons momentos que tivemos! Valeu!
À Shirley Takahashi pela amizade e carinho! Adoro você.
À Ana Paula (Aninha) por toda colaboração e carinho.
Aos colegas da sala 20 (Feba, Angélica, Aline, André, Juliane, Luzinha, Danilo,
Murilo) pela companhia, conversas, risadas e apoio!
Aos pós-graduandos do departamento pelos ideais compartilhados e construídos.
Aos professores da graduação que contribuíram para que eu chegasse até aqui.
Fabíola, Ralpho e Rita. Obrigada pela luz e estímulo que me conduziram até aqui.
A todos os professores e pesquisadores do Departamento de Psicobiologia, pelas
aulas, pelo conhecimento compartilhado e construído, pelo ambiente de trabalho e
pelo apoio oferecido.
Ao Gilberto de Carvalho (Gilbertinho) pelo apoio técnico e ajuda em parte dos
experimentos e pelo convívio agradável.
Ao técnico Valdegar pela ajuda nos experimentos.
À Cris, pela convivência, dedicação e competência em seu trabalho na biblioteca.
Tenho um carinho grande por você!
Ao pessoal da secretaria, pela colaboração e auxílio em questões burocráticas da
pós-graduação. Nereide Lourdes Garcia, Júlio Nascimento, Mara Vianna e Érika.
À Socorro, por sempre contribuir com a limpeza da sala 20. Obrigada pela
companhia e conversas!
À Simo e Tati Lui por estarem cada uma a sua maneira sempre comigo,
acompanhando minha vida!Um presente que ganhei!
À Ana Luísa, amiga de Itapetininga que está sempre comigo em qualquer lugar.
À loja YES! que fez parte da minha vida. À todos os funcionários e clientes que
participaram dessa etapa.
À s crianças do orfanato Nosso Lar por todo carinho e amor! Vocês dão mais cor à
minha vida.
À toda minha família, em especial as minhas tias Guida, Bel, Ana, Chica, Marta,
Ana Paula, Renata, Sônia, Ilma, e tios Fernando, Pedrinho, Geraldo, Luís (in memoriam) pelo amor e apoio incondicional.
Aos meus avôs João que mansamente acompanhou minha trajetória e sempre
sorriu quando soube das minhas conquistas e Pedro (in memoriam) que me
ensinou a me relacionar com as pessoas na feira e a vender ainda criança.
Sempre teve uma palavra de otimismo para me dar! Seu “cheiro’” foi a forma de
carinho!
Às minhas avós Ilba (in memoriam) pelo afeto e proteção espiritual; obrigada pela
luz. E Izabel pelo exemplo de luta, perseverança e fé. Obrigada por existir em
minha vida!
À Ana Luiza que me ajudou a enxergar as outras múltiplas faces da vida que até
então não conseguia sentir! Obrigada por participar da minha vida!
À Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP), ao Conselho de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
Ao meu País, Brasil, grande pátria por me proporcionar viver dignamente como
cidadã e construir minha história!
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de
terminar...
Portanto, devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
Fernando Sabino
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO
1. Descoberta das orexinas... 1
2. Uso, abuso e dependência de substâncias psicoativas... 2
3. Sensibilização comportamental e etanol... 5
4. Sensibilização comportamental e orexinas... 9
II.JUSTIFICATIVA
... 13III. OBJETIVOS
... 14IV. MATERIAL E MÉTODOS
1. Animais... 152. Soluções administradas aos animais...15
3. Anticorpos utilizados na técnica de imunohistoquímica...15
4. Aparelhos...16
5. Experimentos Experimento 1...17
Experimento 2...26
V. RESULTADOS
Experimento 1...30
Experimento 2...34
VI. DISCUSSÃO
...38VII. CONCLUSÕES
... 42VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
...43IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
...54X. ANEXO
...57Lista de figuras
Figura 1: Representação esquemática das duas fases da sensibilização comportamental: a fase de indução (ou desenvolvimento) e a fase de expressão.
Figura 2: Representação esquemática da via dopaminérgica mesocorticolímbica.
Figura 3: Caixa de atividade locomotora.
Figura 4: Esquema representativo do delineamento experimental do experimento 1.
Figura 5: Esquema representativo do delineamento experimental do experimento 2.
Figura 6: Ambulação na caixa de atividade locomotora.
Figura 7: Número de células c-Fos–IR (A) e ORX+c-Fos–IR (B) contadas no Hipotálamo Lateral.
Figura 8: Fotomicrografias da dupla marcação de orexina e c-Fos no Hipotálamo Lateral.
Figura 9: Atividade locomotora ao longo de 60 min, após tratamento com diferentes doses de SB 334867 (10, 20 e 40 mg/kg, i.p).
Efeito ao longo do tempo de diferentes doses de SB 334867 (10, 20 e 40 mg/kg,
i.p) sobre a atividade locomotora dos animais.
Figura 10: Desenvolvimento da sensibilização comportamental, medida pela atividade locomotora de animais tratados com salina ou etanol.
Figura 11: Atividade locomotora no dia do desafio salina.
Figura 12: Efeito do SB 334867, administrado i.p., 30 min antes do desafio com etanol.
Lista de Abreviaturas
ANOVA Análise de variância
ATV Área Tegmentar Ventral
BSA Albumina sérica bovina
c-Fos-IR Imunoreatividade para c-Fos
CPF Córtex Pré-frontal
DAB 3,3 Diaminobenzina
DSM-IV-TR Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais
E.P.M. Erro padrão da média
EtOH Etanol
HL Hipotálamo Lateral
i.c.v. intracerebroventricular
i.p. intraperitoneal
LTP “long-term potenciation”- Potenciação a longo prazo
NAcc Núcleo accumbens
NMDA N-metil-D-Aspartato
ORX orexina-A
ORX+ c-Fos-IR Imunoreatividade de duplas marcações para orexina e c-Fos
Ox1r receptor orexinérgico do tipo-1
Ox2r receptor orexinérgico do tipo-2
PFA “perifornical area”- Área perifornicial
PSEC “post-synaptic excitatory current”- corrente pós-sináptica excitatória
RNAm RNA mensageiro
SAL salina
SB 334867 N-(2-Metil-6-benzoxazolil)- N’-1,5- naftiridina-4-uréia)- antagonista seletivo do receptor de orexina tipo-1
SB10 antagonista do receptor de orexina tipo-1 na dose de 10mg/Kg
SB20 antagonista do receptor de orexina tipo-1 na dose de
20mg/Kg
SB40 antagonista do receptor de orexina tipo-1 na dose de
40mg/Kg
_______________________________________
RESUMO
______________
As orexinas são dois neuropeptídeos, orexina-A e orexina-B, derivados do mesmo gene precursor (pré-pro-orexina), produzidos em alguns milhares de neurônios localizados na área perifornicial do Hipotálamo lateral. Apesar de ter uma produção restrita ao hipotálamo, os neurônios orexinérgicos projetam-se amplamente para todo o cérebro regulando uma série de funções endócrinas e homeostáticas. Evidências recentes, no entanto, mostram o envolvimento do sistema da orexina no circuito de recompensa. Neste estudo avaliamos o envolvimento do sistema da orexina na sensibilização comportamental induzida por etanol. No experimento 1 foi utilizado o modelo de sensibilização comportamental e os animais do grupo salina, agudo (uma administração de EtOH) e crônico (7 administrações de EtOH) foram tratados durante 14 dias para verificar o desenvolvimento de sensibilização comportamental; após o término do tratamento os animais foram perfundidos e a imunorreatividade de duplas marcações para orexina e c-Fos foi avaliada pela técnica de imunohistoquímica. No experimento 2 foi utilizado o modelo de sensibilização comportamental para verificar se o antagonista de receptor do tipo 1 da orexina, SB 334867, bloqueia esse fenômeno. No primeiro experimento não houve diferença estatística entre os grupos salina, agudo e crônico quanto à ORX+c-Fos-IR; porém os animais tratados cronicamente com EtOH apresentaram uma tendência de aumento da dupla marcação de neurônios orexinérgicos indicando que o desenvolvimento da sensibilização comportamental produz ativação desses neurônios; além disso, os animais tratados cronicamente com etanol desenvolveram a sensibilização comportamental. No segundo experimento, o SB 334867 bloqueou a expressão deste fenômeno, indicando que o sistema orexinérgico parece influenciar de maneira importante o processo de sensibilização comportamental, já que a administração sistêmica do SB334867 bloqueou a expressão da sensibilização comportamental aos efeitos estimulantes do etanol em camundongos machos.
_____________________________________
ABSTRACT
______________
Orexins are two neuropeptides, orexin-A and orexin-B, derived from the same precursor gene (pre-pro-orexin) produced by a few thousand neurons located in the perifornical area of the lateral hypothalamus. Despite having a restricted production, orexinergic neurons project widely to brain structures that regulate a number of endocrine and homeostatic functions. Recent evidence suggests the involvement of the orexin system in the reward circuit. We evaluated the role of this system in ethanol-induced behavioral sensitization. In Experiment 1 was used the behavioral sensitization model (development), in which animals were chronically treated for 14 days with saline, acute ethanol after saline treatment or with ethanol (seven administration) to induce behavioral sensitization; at the end of the treatment animals were perfused and immunohistochemistry technique was used to determine double staining for orexin and c-Fos (ORX+c-Fos-IR). In Experiment 2 behavioral sensitization was induced and SB 334867, an orexin-1 receptor antagonist, was used to examine whether it could block the expression of this phenomenon. The results of Experiment 1 showed no statistical difference among the groups (saline, acute and chronic) as to ORX+c-Fos-IR, although animals chronically treated with EtOH exhibited an trend to more double staining of orexin neurons indicating that this treatment regimen activates this neuropeptide system. In the second experiment, SB 334867 blocked the expression of this phenomenon. The orexin system seems to influence the process of behavioral sensitization, since systemic administration of SB 334867 blocked the expression of this phenomenon induced by a stimulant dose of ethanol in male mice.
___________________________________________
Introdução
____________1. Descoberta das orexinas
As orexinas (também conhecidas como hipocretinas) são dois
neuropeptídeos, Orexina-A A)/Hipocretina-1 e Orexina-B
(ORX-B)/Hipocretina-2, derivados do mesmo gene precursor
(pré-pro-orexina/hipocretina) produzidos em alguns milhares de neurônios localizados na
área perifornicial (PFA) do Hipotálamo lateral (HL) (Lecea et al, 1998; Sakurai et
al; 1998).
Estes neuropeptídeos foram caracterizados em um estudo colaborativo,
com o objetivo de identificar ligantes endógenos para receptores acoplados à
proteína G. Um grupo, formado por Gautvik e colaboradores, utilizaram a técnica
de hibridização in situ para identificar as espécies de RNA mensageiro (RNAm)
restritas aos diferentes núcleos do hipotálamo de ratos, entre os quais havia uma
espécie cuja expressão era restrita a alguns milhares de neurônios, distribuídos
bilateralmente no hipotálamo dorsolateral; este grupo denominou os peptídeos
como hipocretinas. Simultaneamente, Sakurai e colaboradores demonstraram, em
1998, que a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de ORX-A ou de ORX-B
aumentava o consumo de alimentos em ratos. Além disso, os ratos em jejum por
48 h apresentavam aumento da concentração de RNAm e do peptídeo
hipocretina. Com base nessas observações, este outro grupo propôs o nome
alternativo para as hipocretinas já que havia estimulado o consumo alimentar
agudo quando administrado em ratos. Assim, esses peptídeos foram denominados
orexinas. Em 6 de março de 1998 foi publicado um comunicado na
__________________________________________
Introdução
_____________revista Cell indicando que tanto as hipocretinas quanto as orexinas eram os
mesmos peptídeos . 1
Apesar desses neuropeptídeos terem uma produção restrita ao hipotálamo,
os neurônios orexinérgicos projetam-se amplamente para todo o encéfalo (Peyron
et al, 1998) regulando uma série de funções endócrinas e homeostáticas (Harris &
Aston-Jones, 2006; Sakurai, 2006) como ingestão alimentar (Sakurai et al, 1998) e
regulação do ciclo sono/vigília (Saper et al, 2005), uma vez que camundongos
knockout para o receptor de orexina exibem um fenótipo muito semelhante ao de
pacientes com narcolepsia humana (Chemelli et al, 1999). As orexinas agem pro
meio da ligação com dois receptores diferentes acoplados à proteína G: o receptor
de orexina do tipo 1 (Ox1r) e de orexina do tipo 2 (Ox2r); enquanto o Ox1r
encontra-se densamente distribuído na área tegmentar ventral (ATV) (de Lecea et
al, 2006) e em menor proporção no núcleo accumbens (NAcc) (Marcus et al, 2001)
regiões conhecidas por regular os processos de dependência, o Ox2r
apresenta-se mais densamente localizado no NAcc e em estruturas meapresenta-sencefálicas,
incluindo os núcleos monoaminérgicos, como o dorsal da rafe e locus coeruleus
(Marcus et al, 2001).
2. Uso, abuso e dependência de substâncias psicoativas
Registros históricos indicam que o uso de substâncias psicoativas capazes
de alterar o comportamento, a consciência e o humor dos seres humanos já fazia
parte do cotidiano de povos muito antigos nas mais variadas culturas e contextos,
1- Neste texto será utilizado o termo orexinas
________________________________________
Introdução
_______________principalmente social, cultural, religioso e ritualístico (Crocq, 2007). A partir de um
processo de fermentação natural ocorrido há aproximadamente 10.000 anos o ser
humano passou a consumir e atribuir diferentes significados ao uso do álcool. Mas
foi somente em 1952, que o consumo excessivo de álcool passou a ser
considerado como doença na primeira edição do DSM (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disoders).
Segundo o manual, a característica essencial do abuso de substâncias é
um padrão mal-adaptativo de uso, manifestado por consequências adversas
recorrentes e significativas relacionadas ao uso repetido. Os critérios para abuso
de substância não incluem tolerância, abstinência ou um padrão de uso
compulsivo, incluindo, ao invés disso, apenas as consequências prejudiciais do
uso repetido. O indivíduo pode apresentar intoxicação repetidamente ou outros
sintomas relacionados à substância, quando deveria cumprir obrigações
importantes relativas a seu desempenho no trabalho, na escola ou em casa,
incluindo ausências repetidas, relacionados a "ressacas" recorrentes. Embora um
diagnóstico de abuso de substância seja mais provável em indivíduos que apenas
recentemente começaram a consumi-la, alguns indivíduos continuam sofrendo as
consequências sociais adversas relacionadas à substância por um longo período
de tempo, sem apresentarem evidências de dependência.
A característica essencial da dependência de substância é a presença de
um agrupamento de sintomas cognitivos, comportamentais e fisiológicos indicando
que o indivíduo continua usar uma substância apesar de problemas significativos
__________________________________________
Introdução
_____________relacionados a ela. Existe um padrão de auto-administração repetido que,
geralmente, resulta em tolerância, abstinência e comportamento compulsivo de
consumo da droga. Os sintomas de dependência são similares entre as várias
categorias de substâncias, mas, para certas classes, alguns sintomas são menos
salientes e, em uns poucos casos, nem todos os sintomas se manifestam. Embora
não seja especificamente relacionada como um critério, a fissura (forte impulso
para usar a substância) tende a ser observada na maioria dos indivíduos com
dependência de substâncias (DSM-IV-TR, 2002).
De acordo com o II Levantamento Domiciliar Sobre o Uso de Drogas
Psicotrópicas, realizado pelo Centro Brasileiro de Informações Sobre Drogas
Psicotrópicas (CEBRID) (Carlini et al., 2005), aproximadamente 75% da população
entrevistada fizeram uso de bebidas alcoólicas na vida e 12,3% são dependentes
de álcool. Esse alto índice de uso e dependência de álcool explica a importância
dos estudos com enfoque nesse tema.
A questão central em estudos sobre o uso, abuso e dependência é saber como se
dá a transição entre o uso controlado da substância para o uso descontrolado e
entender como o alcoolismo se relaciona com outros problemas psiquiátricos e
sociais ou ainda, como o álcool age sobre o organismo, especialmente sobre o
sistema nervoso central, com o intuito de desenvolver novas políticas para o
controle do consumo e comercialização, novas abordagens psicoterapêuticas de
tratamento e, sobretudo, novos tratamentos farmacológicos para o abuso e
dependência do álcool.
__________________________________________
Introdução
___________________3. Sensibilização comportamental e etanol
Sensibilização é o ato, efeito ou processo de sensibilizar e “sensibilizar” é
tornar um organismo sensível a um agente exterior ou droga medicamentosa
(Dicionário Michaelis - Weiszflog, 1998). Dessa forma, a sensibilização é o
processo pelo qual ocorre aumento da sensibilidade de um organismo a estímulos
ou a um conjunto de estímulos. No entanto, há dificuldades para se avaliar
objetivamente a sensibilidade ou o grau de percepção do estímulo pelo organismo.
A sensibilização será abordada no contexto de drogas de abuso, onde é
considerada, em animais de laboratório, como uma potencialização ou aumento
progressivo de alguns efeitos comportamentais, como aumento da atividade
locomotora, estereotipia ou da atividade rotacional induzida após administrações
repetidas da mesma dose de psicoestimulantes, opiáceos ou etanol (Phillips et al,
1997; Pierce & Kalivas, 1997; Vanderschuren e Kalivas, 2000).
O termo sensibilização foi utilizado por estudiosos de memória e
aprendizagem referindo-se a uma forma de aprendizagem não-associativa, como
um processo oposto ao processo de habituação, uma vez que a sensibilização
facilita, enquanto que a habituação reduz, a resposta de um organismo à
apresentação repetida de um estímulo. Esses processos relativamente simples de
aprendizagem e seus mecanismos neuronais subjacentes foram e são
extensivamente estudados em invertebrados como a Aplysia californica, um
molusco marinho.
__________________________________________
Introdução
_____________A Aplysia apresenta um reflexo conhecido como reflexo de retirada das
guelras (órgão respiratório do animal), que tanto pode passar por um processo de
sensibilização, como por uma habituação dependendo das circunstâncias. O
reflexo de retirada das guelras ocorre quando um estímulo tátil fraco é aplicado ao
sifão do animal. Com a estimulação repetida, essas retiradas reflexas diminuem
de freqüência, indicando a ocorrência de habituação. Por outro lado, quando um
estímulo nocivo é aplicado na cauda do molusco, há aumento dessa resposta
reflexa, indicando sensibilização. Dependendo do número de repetições deste tipo
de estimulação, pode-se induzir a sensibilização de curto prazo, durando apenas
alguns minutos, ou de longo prazo, com duração de dias a semanas (Kandel,
2000).
No contexto das drogas de abuso, Wise & Bozarth (1987) propõem que a
capacidade das drogas de induzir dependência está relacionada aos seus efeitos
reforçadores e estimulantes, desencadeada pelo uso repetido e abusivo das
drogas. Nesse sentido, a teoria de Robinson & Berridge (1993) propõe que a
administração repetida de drogas de abuso induz neuroadaptações, alterando de
maneira duradoura o funcionamento dos sistemas neurais de reforço e
recompensa. Essas neuroadaptações tornariam os sistemas de recompensa
“sensibilizados” à droga e aos estímulos a ela associados, promovendo
comportamentos compulsivos de busca e consumo da droga (Robinson &Berridge,
2001).
________________________________________
Introdução
_______________Um dos modelos animais utilizados para avaliar as neuroadaptações é a
sensibilização comportamental, também conhecida como "tolerância reversa"
(Koob e Nestler, 1997; Kalivas, 2000; Stewart & Badiani, 1993). Uma das
primeiras descrições da sensibilização ao efeito estimulante do etanol em
camundongos foi feita por Masur e Boerngen (1980). Essas autoras observaram
que o efeito estimulante locomotor inicial de animais tratados com etanol
aumentava pronunciadamente após a exposição crônica à droga.
A sensibilização comportamental pode ser dividida em duas fases: fase de
indução ou desenvolvimento, que ocorre durante o tratamento repetido com a
droga e a fase de expressão, em que os animais recebem um desafio com a droga
após um período de abstinência (Vanderschuren & Kalivas, 2000). Além de serem
temporalmente distintas, há relatos de que estas fases envolvem substratos
neurobiológicos diferentes (Cador et al., 1995). A ATV está mais envolvida com a
fase de indução e o NAcc, com a expressão da sensibilização comportamental
(Vanderschuren & Kalivas, 2000). Abaixo segue uma representação das fases de
indução e expressão da sensibilização comportamental.
________________________________________
Introdução
_____________________Figura 1: Representação esquemática das duas fases da sensibilização comportamental: a fase de indução (ou desenvolvimento) e a de expressão. Durante a fase de indução são realizadas as administrações repetidas da droga (representada na figura por traços horizontais finos). A comprovação de que se desenvolveu sensibilização pode ser feita por testes de atividade, nos quais os níveis de atividade ao longo do tratamento são comparados com aqueles observados no primeiro dia de administração da droga (teste agudo). Após o fim do tratamento, segue-se um período de abstinência (//) que, geralmente, pode variar de um dia a semanas. Em seguida, inicia-se a fainicia-se de expressão da inicia-sensibilização, em que os animais recebem administração de droga, na mesma dose utilizada no desenvolvimento (desafio, representada por traços verticais mais grossos) e são testados para quantificação de atividade locomotora. Alguns autores consideram que quando o desafio com a droga ocorre logo após o término do tratamento se observam a expressão de curto prazo da sensibilização, e se o desafio for realizado após semanas do fim do tratamento, observa-se a expressão de longo prazo da sensibilização comportamental (Vanderschuren et al, 2000).
Embora seja pouco estudada em humanos, há relatos de sensibilização
comportamental aos efeitos de drogas como anfetamina, cocaína e etanol. Em um
estudo clínico sobre sensibilização ao etanol em humanos, demonstrou-se que
filhos de alcoolistas apresentam sensibilização a alguns efeitos fisiológicos do
etanol, como o aumento da amplitude do pulso dos dedos (medida através de
Fotopletismografia), fenômeno não observado em filhos de não-alcoolistas (Newlin
& Thomson, 1991). Apesar das propriedades reforçadoras das drogas
contribuírem para o potencial de abuso e dependência, estudar os efeitos
psicomotores das drogas de abuso auxilia o entendimento da dependência já que
há forte relação entre o poder reforçador das drogas e sua capacidade de induzir
estimulação psicomotora (Robinson e Berridge, 2000).
Além disso, a estimulação psicomotora auxilia na compreensão do
funcionamento das vias de reforço e recompensa já que é fundamental para o
entendimento do desenvolvimento da dependência (Wise et al, 1987). Essas vias
envolvem neurônios dopaminérgicos que se projetam da ATV para o NAcc e
__________________________________________
Introdução
_____________córtex pré-frontal (CPF)envolvendo também várias outras estruturas do sistema
límbico, formando a via dopaminérgica mesocorticolímbica (Hyman e Malenka,
2001). Na Figura 1 estão representadas as vias envolvidas nestes processos.
Figura 2: Representação esquemática da via dopaminérgica mesocorticolímbica. Vários sistemas de neurotransmissão participam da regulação do circuito mesocorticolímbico modulando o disparo dos neurônios dopaminérgicos e consequentemente afetando o desenvolvimento da sensibilização. Neste circuito participam os sistemas dopaminérgico, glutamatérgico e GABAérgico, e a modulação por peptídeos opióides. Disponível em: http://www.virtual.epm.br/material/depquim/4flash.htm
4. Sensibilização comportamental e orexinas
Evidências recentes mostram o envolvimento do sistema da orexina no
circuito de recompensa. Os neurônios orexinérgicos inervam densamente tanto a
ATV, rica em dopamina, quanto o NAcc. Baseado na distribuição anatômica das
projeções orexinérgicas, estudos demonstram que esses neurônios podem
________________________________________
Introdução
_______________estimular a atividade neuronal do sistema mesolímbico. Assim, dois trabalhos que
impulsionaram os estudos da função das orexinas no circuito de recompensa
demonstram claramente sua importância. O primeiro estudo mostrou que
neurônios do HL, que contêm orexina, são intensamente ativados em ratos que
apresentam preferência ao lugar após o condicionamento com morfina, cocaína,
ou alimentos. Além disso, a ativação de células orexinérgicas no HL restabelece
uma preferência de lugar extinta por opiáceos que pode ser prevenida com o
pré-tratamento com o antagonista do receptor de orexina-A (SB 334867) (Harris et al.,
2005). O segundo estudo mostra que a administração i.c.v. de orexina-A
restabelece a busca por cocaína ou alimento em condicionamento operante
(Boutrel et al., 2005). Mais recentemente, mostrou-se que a orexina-A, quando
administrada diretamente na ATV, participa da recuperação do comportamento de
busca por cocaína (Wang et al., 2009). Por outro lado, a administração de SB
334867 produz redução na sinalização induzida pelo estresse e no
comportamento de busca por cocaína, álcool ou sacarose (Lawrence et al., 2006;
Koob, 2008; Nair et al., 2008; Richards et al., 2008; Smith et al., 2009). À luz
destas evidências, os neurônios de orexina no HL, os neurônios dopaminérgicos
da ATV e os neurônios no Nacc e no CPF formariam um circuito que parece ser
importante nos processos de recompensa.
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Introdução
_______________Para avaliar o envolvimento da orexina na dependência de drogas, a
manipulação do sistema das orexinas com a administração de SB 334867 parece
ser uma estratégia útil. O SB 334867 é um antagonista 50 vezes mais seletivo
para Ox1r do que para Ox2r (Duxon et al., 2001). Borgland e colaboradores (2006)
caracterizaram o envolvimento do sistema das orexinas na indução da
sensibilização comportamental à cocaína. Neste estudo, há evidências
convincentes de que a aplicação in vitro de orexina-A na ATV induz a
potencialização da corrente pós-sináptica excitatória (PSEC) do receptor NMDA;
em outras palavras, a orexina-A aumenta o disparo dos neurônios dopaminérgicos
na ATV. Esta observação eletrofisiológica realizada em fatias de cérebro de rato
foi expandida para estudos in vivo, demonstrando que a sinalização de orexina na
ATV é necessária para a indução de sensibilização comportamental à cocaína,
pois a administração de SB 334867 (10 mg/kg, i.p ou 6 µg intra-ATV) realizada
diariamente por 5 dias, 15 min antes das injeções de cocaína (15 mg/kg, i.p)
bloqueia o desenvolvimento da sensibilização comportamental em ratos. Quando
administrado apenas no último dia, o SB 334867 não reduz a atividade
locomotora, indicando que, apesar da sinalizaçãoorexinérgica ser necessária para
o desenvolvimento da sensibilização à cocaína, não é necessária para a sua
expressão (Sharf et al., 2010; Borgland et al., 2006). Outro trabalho mostra que a
orexina-A parece estar envolvida na expressão da resposta locomotora induzida
por administração crônica com anfetamina e que esta expressão da sensibilização
________________________________________
Introdução
_______________comportamental à anfetamina é reduzida pela administração aguda de SB 334867
(Quarta et al., 2010). Paralelamente a esses achados, Jupp e colaboradores
(2011) mostraram o envolvimento do sistema orexinérgico na auto-administração
de etanol. Neste trabalho, o SB 334867 reduziu significativamente a resposta por
busca ao etanol sugerindo um papel da orexina nos aspectos motivacionais de
auto-administrar etanol.
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Justificativa
_______________Estudos sobre a função do etanol na interação entre os sistemas
dopaminérgico e orexinérgico parecem ser fundamentais para o entendimento dos
comportamentos de dependência. A partir desta constatação e dada a complexa
interação de sistemas de neurotransmissores e neuromoduladores no circuito de
recompensa cerebral, a elucidação da função do sistema das orexinas na
sensibilização comportamental ao efeito estimulante do etanol poderia contribuir
para o desenvolvimento de novas intervenções farmacológicas a serem utilizadas
no tratamento da dependência ao etanol.
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Objetivos
_________________Objetivo geral:
Avaliar a influência do sistema da orexina na sensibilização comportamental aos
efeitos estimulantes do etanol em camundongos machos.
Objetivos específicos:
• Determinar se os neurônios orexinérgicos são estimulados durante o
desenvolvimento da sensibilização comportamental induzida pelo
tratamento repetido com etanol.
• Avaliar se o antagonista de Oxr1 (SB 334867) bloqueia a expressão da
sensibilização comportamental aos efeitos estimulantes do etanol em
camundongos machos.
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Material e Métodos
_____________1. Animais
Foram utilizados camundongos suíços machos provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), com 90 dias de idade e peso corporal entre 25-50 g.
Todos os animais foram mantidos em biotério no Departamento de Psicobiologia em grupos de 10 a 18 em gaiolas plásticas, sob temperatura controlada (23 ± 2°C) e um sistema de iluminação artificial, que consiste em lâmpadas fluorescentes, com ciclo constante de 12 h de claro e 12 h escuro (7h00 - 19h00) e livre acesso a ração e água. Os animais foram transportados para a sala de experimento uma hora antes do tratamento ou do teste, realizados entre 11h00 – 17h00.
2. Soluções
administradas aos animais
• Etanol (Synth®, Diadema, Brasil) foi preparado em solução salina
(15% p/v em 0,9% NaCl).
• Salina (NaCl 0,9% p/v)
• SB 334867 (Biociências Tocris®, catálogo n° 1960) nas doses de 10,
20 e 40 mg/Kg.
• HPBCD 10% (Hidroxipropil-beta-ciclodextrina) e DMSO 2%
(Dimetilsulfóxido) foram utilizados para diluir o SB 334867.
3.
Anticorpos utilizados na técnica de imunohistoquímica
Anticorpos primários:____________________________________
Material e Métodos
___________________•
anti-orexina-A: anticorpo policlonal de cabra, (Santa CruzBiotecnologia® , catálogo n° sc-8070); diluição 1:1000
• anti-c-Fos: anticorpo policlonal de coelho (Santa Cruz Biotecnologia®, catálogo n° sc-52); diluição 1: 2500
Anticorpos secundários:
• anti IgG – cabra: originado do burro (Santa Cruz Biotecnologia®,
catálogo n° 3854); diluição 1:500
• anti- IgG – coelho: originado do burro (Santa Cruz Biotecnologia®,
catálogo n° 3840); diluição 1:500
4. Aparelhos
• Os testes de atividade locomotora foram realizados em caixas de
atividade Opto-Varimex [modelo Opto-M3, caixas de acrílico, Columbus Instruments, Columbus, OH], medindo 47,5 cm de comprimento x 25,7 cm de largura x 20,5 cm de altura, que detectam a locomoção através de 16 pares de células fotoelétricas conectados a um contador digital que é acionado quando há interrupção do feixe fotoelétrico, contabilizando 1 atividade locomotora.
• Micrótomo de vibração (Leica VT1000S, Alemanha).
• Sistema de análise ImageJ, disponível em: http://rsbweb.nih.gov/ij/
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Material e Métodos
_____________Figura 3: Caixa de atividade locomotora Opto-Varimex (Columbus Inst.)
5. Experimentos
realizados
EXPERIMENTO 1: Análise da imunorreatividade de Orexina e c-Fos
(ORX+c-Fos–IR) no HL de camundongos submetidos à sensibilização comportamental induzida pelo etanol
Objetivo específico: Determinar se os neurônios orexinérgicos foram estimulados durante o desenvolvimento da sensibilização comportamental induzida pelo tratamento repetido com etanol. Para isso, foi medida a marcação dupla de orexina e c-Fos, um marcador de atividade neuronal que é ativado rapidamente quando há estimulação celular e cuja expressão não pode ser prevenida por inibidores de síntese protéica (Sheng e Greenberg, 1990).
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Material e Métodos
_____________Procedimento: Inicialmente os animais foram habituados à caixa de atividade locomotora por 15 min, sem qualquer tratamento (habituação). Quarenta e oito horas após a habituação, com base nos níveis de atividade locomotora no teste inicial, os animais foram distribuídos de forma balanceada em três grupos: Salina (SAL, n= 9), Agudo (n=11) e Crônico (n=12). O tratamento consistiu de sete administrações espaçadas por 48 h. Todas as administrações foram realizadas por via i.p. e os animais foram testados nas caixas de atividade locomotora, por 15 min, a cada 96 h.
A SAL foi preparada e administrada no volume de 0,15 ml/10 g de peso do animal e o EtOH foi administrado na dose de 2,2 g/kg, no mesmo volume. No último dia de tratamento, metade dos animais do grupo SAL recebeu etanol (grupo Agudo) e a outra metade continuou recebendo salina (grupo SAL); os animais tratados com EtOH receberam a mesma solução no último dia (grupo Crônico). Noventa minutos depois da última administração, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca.
Segue abaixo, o procedimento experimental:
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Material e Métodos
_____________Figura 4: Esquema representativo do delineamento experimental do experimento 1. A barra cinza claro representa o período em que os animais foram habituados à caixa de atividade locomotora. As barras cinza escuro representam o período em que os animais foram tratados i.p. com solução salina (SAL) ou etanol (EtOH) a cada 48h. As barras pretas representam o momento em que os animais foram testados nas caixas de atividade locomotora, por 15 min, a cada 96h. A barra vermelha representa o momento que os animais foram perfundidos.
Na perfusão, os animais foram anestesiados com xilazina (0,004 ml/g) e ketamina (0,01 ml/g); após confirmação da ausência de reflexos dolorosos, foi realizada a abertura do tórax e 0,03 ml de heparina sódica diluída em soro fisiológico a 0,9% (concentração de 1:10) foi infundida no ventrículo esquerdo. Inicialmente solução salina 0,9% foi bombeada, sob pressão devidamente regulada, por 30 segundos (tempo suficiente para lavar o cérebro do animal). Posteriormente, foram introduzidos 40 mL de solução fixadora (paraformaldeído tamponado a 4%). Todas as soluções utilizadas na perfusão encontravam-se à temperatura ambiente (20-25°C).
Os animais foram decapitados e toda a cabeça ficou submersa em solução fixadora de paraformaldeído 4% por 18-24 h à temperatura ambiente para
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Material e Métodos
_____________completar o processo de fixação. Terminado esse período, os encéfalos foram retirados do crânio e mantidos em solução fixadora de paraformaldeído 1% a 4°C até o processamento do material.
Após a perfusão, iniciou-se o processamento do material. Os encéfalos mantidos em solução de paraformaldeído a 1% foram cortados no plano coronal numa forma metálica fenestrada própria para camundongos (ASI Instruments, Estados Unidos), de forma a obter-se uma peça de aproximadamente 0,3 cm de espessura contendo o hipotálamo do animal. Essa peça foi então emblocada em ágar a 7% (Merck, Alemanha) e fixada no suporte de amostra do micrótomo de vibração (Leica VT1000S, Alemanha) com éster de cianoacrilato (Loctite, Brasil). A velocidade de corte no micrótomo de vibração foi mantida entre 0,2 e 0,3 mm.seg-1 e a frequência em 90Hz. A região de interesse foi isolada em peças de corte coronal (entre -0,34 e -2,80 mm do bregma, segundo Paxinos & Franklin, 2004) e processadas em cortes de 40 μm, em série de 1 a cada 6 fatias e armazenados à -20°C em placas de cultura de 12 cavidades preenchidas com solução crioprotetora (Hoffman e Wei, 2004). No dia do processamento, os grupos de fatias foram selecionados aleatoriamente com o auxílio de um dado e o grupo de fatias selecionado foi transferido para placas de cultura com 24 cavidades sob agitação (Agitador Barnstead Thermolyne, Estados Unidos) para a realização da técnica de imunohistoquímica por free-floating. Esta técnica consiste na utilização de cortes não montados em lâminas, e colocados em solução em poços, facilitando a penetração dos anticorpos no tecido de forma mais uniforme.
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Material e Métodos
_____________O protocolo descrito abaixo foi realizado em placas de cultura de 24 cavidades sob agitação constante, favorecendo a imuno-marcação nas duas faces das fatias. Todo o protocolo foi testado e padronizado de acordo com a sensibilidade do método e titulação do anticorpo primário a fim de se obter a concentração ótima em nossas condições de trabalho.
1. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, EUA) 0,1M; pH 7,6... 5 x 5 min
Objetivo: Retirada da solução crioprotetora e de impurezas dos cortes
2. Peróxido de Hidrogênio 1% (Merck, Alemanha)...30 min
Objetivo: Bloquear a atividade enzimática endógena (peroxidase ou fosfatase alcalina) evitando-se marcações inespecíficas. Para tanto, adiciona-se substrato em excesso (peróxido de hidrogênio ou levamisole) para saturar a enzima.
3. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6... 5 min
Objetivo: Retirar o peróxido de hidrogênio em excesso, ou seja, aquelas moléculas que não se ligaram à peroxidase endógena.
4. Tris + Triton 0,1%...15 min
Objetivo: Permeabilização das células para facilitar a entrada do anticorpo primário.
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Material e Métodos
___________________5. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o Triton em excesso
6. Incubação com soro albumina bovina (BSA) 1% ...1 h
Objetivo: Bloquear as ligações inespecíficas do anticorpo primário
7. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o BSA em excesso
8. Incubação com o primeiro anticorpo primário (diluído em Tris + 0,1% BSA): anti-orexina-A durante a noite a 4°C.
Objetivo: Ligação do anticorpo com o seu antígeno
9. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o excesso de anticorpo primário que não reagiu com o antígeno.
10. Incubação com anticorpo secundário 1:500 (diluído em Tris + 0,1% BSA): donkey anti-goat (Santa Cruz biotecnologia)...2 h
Objetivo: Ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário.
11. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o excesso de anticorpo secundário que não reagiu com o antígeno.
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Material e Métodos
_____________12. Incubação com sistema de visualização de estreptavidina-peroxidase (DAKO) por 10 min
Objetivo: A streptavidina, que possui quatro sítios de ligação para a biotina, se liga ao anticorpo primário biotinilado. A streptavidina é conjugada com peroxidase de rábano (horseradish peroxidase -HRP).
13. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o excesso do complexo streptavidina – peroxidase que não reagiu com o anticorpo primário.
14. Revelação com (DAB) marrom: 3,3-diamino benzina líquido (Dako, Dinamarca)...30-90 s
Objetivo: Oxidação do DAB pela enzima peroxidase. O composto 3,3-diamino benzina (DAB) é um doador de elétrons que quando oxidado se converte em um produto final estável e de cor marrom, permitindo assim a visualização da reação antígeno-anticorpo. O tempo de revelação com o DAB foi estabelecido visualmente e mantido constante para reações com o mesmo anticorpo primário.
15. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 x 5 min
Objetivo: Parar a reação do DAB com a peroxidase.
16. Peróxido de Hidrogênio 1% (Merck, Alemanha)...15 min
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Material e Métodos
_____________Objetivo: Bloquear a atividade enzimática endógena (peroxidase ou fosfatase alcalina) evitando-se marcações inespecíficas. Para tanto, oferece-se muito substrato (peróxido de hidrogênio ou levamisole) para saturar a enzima.
17. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o excesso de peróxido de hidrogênio.
18. Tris + Triton 0,1% ...15 min
Objetivo: Permeabilização das células para facilitar a entrada do segundo anticorpo primário.
19. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o Triton em excesso
20. Incubação com BSA 1% (Sigma-Aldrich, EUA) ...1h
Objetivo: Bloquear as ligações inespecíficas do anticorpo primário.
21. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min
Objetivo: Retirar o excesso do BSA
22. Incubação com o segundo anticorpo primário (diluído em Tris + 0,1% BSA) anti-c-Fos durante a noite a 4°C
Objetivo: Ligação do anticorpo primário com o seu antígeno
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Material e Métodos
_____________23. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min 24. Incubação com anticorpo secundário 1:500 (diluído em Tris + 0,1% BSA) donkey anti-rabbit...2 h 25. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 min 26. Incubação com sistema de visualização de estreptavidina-peroxidase.
Peroxidase conjugada com streptavidina do kit universal LSAB® (Dako, Dinamarca) ... 10 min 27. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH7,6...5 min 28. Revelação com 3,3-diamino benzina (DAB blue) líquido (Dako, Dinamarca) ...30-90 s 29. Tampão Tris (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) 0,1M; pH 7,6...5 x 5 min 30. Água destilada
Objetivo: Retirar o excesso do Tampão Tris
31. Montagem das fatias em lâminas silanizadas (Dako, Dinamarca)
32. Desidratação em etanol 90% (Merck, Alemanha)...5 min 33. Desidratação em etanol absoluto (Merck, Alemanha)...5 min 32. Clarificação em xileno (Merck, Alemanha)...5 min 33. Montagem da lamínula (Glass Técnica, Brasil) utilizando o Entellan (Merck, Alemanha).
Em cada experimento, uma cavidade da placa de cultura foi sempre destinada ao controle negativo na qual não foram adicionados os anticorpos
____________________________________
Material e Métodos
_____________primários. As lâminas obtidas foram analisadas e fotografadas no microscópio Eclipse E600 (Nikon Instruments Inc., Estados Unidos).
A c-Fos–IR foi quantificada pela contagem de núcleos marcados com c-Fos e a ORX+Fos–IR foi quantificada pela contagem do número de células duplamente marcadas, em que o núcleo é marcado para c-Fos e o citoplasma, para ORX. A região de interesse foi analisada em ambos os hemisférios cerebrais para a contagem total de células positivas, determinando a média como valor representativo em cada grupo.
EXPERIMENTO 2: Efeito do SB 334867 na expressão da sensibilização
comportamental aos efeitos estimulantes do etanol em camundongos machos Objetivo específico: Avaliar se a administração i.p. de SB 334867 bloqueia a expressão da sensibilização comportamental ao efeito estimulante do etanol. Procedimento: A primeira etapa desse experimento consistiu da realização de uma curva dose-efeito para avaliar o efeito per se do SB 334867. Para tanto, os animais (n=40) foram testados nas caixas de atividade locomotora por 1 h sem administração de droga (habituação). Quarenta e oito horas depois, receberam uma injeção de veículo (n=10) ou SB 334867 nas doses 10 (n=10), 20 (n=10) ou 40 mg/kg (n=10), 30 min antes da administração de SAL. Imediatamente após a administração de salina, os animais foram colocados nas caixas de atividade locomotora e esta foi avaliada por 1 h.
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Material e Métodos
_____________Após a determinação da melhor dose de SB 334867, novos grupos de camundongos foram inicialmente habituados à caixa de atividade locomotora por 15 min, sem qualquer tratamento. Quarenta e oito horas após a habituação, com base nos níveis de atividade locomotora no teste inicial, os animais foram distribuídos em dois grupos: SAL (n= 36) e EtOH (n=35). O tratamento consistiu de sete administrações, i.p., espaçadas por 48 h. A cada 96 h, os animais foram testados nas caixas de atividade locomotora, por 15 min.
Cinco dias após o término do tratamento, iniciaram-se os desafios. No primeiro desafio todos os animais receberam SAL para verificar se houve condicionamento à droga ou ao ambiente. Quarenta e oito horas após este desafio foi realizado o desafio droga/ EtOH. Neste desafio os animais foram subdivididos em 3 grupos: veículo-EtOH (n = 12), SB 10 EtOH (n = 12) e SB 20 mg/kg-EtOH (n = 12).
Abaixo segue o protocolo experimental para melhor compreensão.
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Material e Métodos
_____________Figura 5: Esquema representativo do delineamento experimental do experimento 2. A barra cinza claro representa o período em que os animais foram habituados à caixa de atividade locomotora. As barras cinza escuro representam o período em que os animais foram tratados com solução salina ou etanol a cada 48 h. As barras pretas representam o período em que os animais tratados foram testados nas caixas de atividade locomotora, por 15 min, a cada 96h. A barra azul escuro representa o momento em que todos os animais foram desafiados com salina e testados nas caixas de atividade locomotora por 15 min. A barra azul claro representa o período que os animais foram desafiados com o SB 334867 nas doses de 10 ou 20 mg/kg, 30 min antes da administração de etanol, e imediatamente colocados nas caixas da atividade locomotora por 15 min.
Análise estatística
Os resultados da habituação às caixas de atividade foram analisados pelo teste t de Student ou por Análise de Variância (ANOVA) de uma via. Para a análise dos resultados do desenvolvimento da sensibilização comportamental foi utilizada a ANOVA de duas vias para medidas repetidas, cujos fatores foram: grupo (SAL, EtOH Agudo, EtOH Crônico) e teste (T1, T2, T3, T4 – medida repetida).
__________________________________
Material e Métodos
_______________Os resultados de c-Fos–IR e Orx+c-Fos–IR foram analisados pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis.
Para a análise da curva dose-efeito foi empregada a ANOVA de duas vias para medidas repetidas, com os fatores dose (veículo, SB10, SB20 e SB40) e tempo (15, 30 e 60 min – medida repetida). A análise dos resultados obtidos no desafio SAL foi feita pelo Teste t de Student e na expressão da sensibilização comportamental, pela ANOVA de 2 vias com os fatores: grupo (SAL ou EtOH) e desafio (veículo, SB10 e SB20).
Quando necessária, a análise a posteriori, foi realizada pelo teste de Newman- Keuls, e em todos os casos o nível de significância foi estabelecido em p ≤ 0,05.
_________________________________
Resultados
______________________Experimento 1
Habituação: A ANOVA não detectou nenhuma diferença estatisticamente
significativa entre os grupos. A contagem inicial de atividade locomotora por grupo
foi: Salina = 1029,8 ± 420,4; Agudo = 1225,0 ± 500,0 e Crônico = 1071,9 ± 405,1.
Desenvolvimento da sensibilização comportamental (Figura 1): A ANOVA para
medidas repetidas mostrou interação entre os fatores grupo e teste [F(6,48) =
7,97; p < 0,005]. A análise da interação mostrou que os animais tratados
cronicamente com EtOH apresentaram maior atividade locomotora nos testes 2, 3
e 4, em comparação com o teste 1 (p <0,0005) e com o grupo SAL no teste 4 (p <
0,03).
_________________________________________
Resultados
______________Figura 6: Atividade locomotora (média ± EPM) de animais tratados com solução salina, com solução salina e etanol no último dia (agudo) ou tratados com EtOH (crônico) nos quatro testes de , espaçadas por 96 horas. * Diferente do grupo salina nos testes 2, 3 e 4; † Diferente do próprio Teste 1.
Quantificação de c-Fos–IR e ORX-c-Fos–IR:
As Figuras 8A, 8B, 8C apresentam as fotomicrografias de reações de
imuno-histoquímica para ORX+c-Fos–IR de animais representativos dos grupos Salina,
Agudo e Crônico, respectivamente. A análise da contagem de células c-Fos–IR
mostrou diferença estatisticamente significativa [F(2,11) =4,56; p < 0,04], em que o
grupo Agudo apresentou maior número de células marcadas para c-Fos (p <
0,05). A análise das células ORX+c-Fos–IR [F(2,11) = 433, 61; p > 0,05] não
detectou diferença entre os grupos.
_________________________________________
Resultados
______________A
B
_________________________________________
Resultados
______________Figura 7: Número de células c-Fos–IR (A) e ORX+c-Fos–IR (B) no Hipotálamo Lateral de animais dos grupos Salina (N=5), Agudo (N=4) e Crônico (N=5). Os valores são apresentados como média ± EPM. * Diferente do grupo Crônico.
A
B
C
_________________________________________
Resultados
______________Figura 8: Fotomicrografias do Hipotálamo Lateral mostrando ORX+c-Fos–IR (citoplasma marrom e núcleo azul, respectivamente) representativas de um animal do grupo Salina (A), de um animal do grupo Agudo (B) e de um animal do grupo Crônico (C). As setas indicam as duplas
marcações. A barra de escala é de 100 μm.
Experimento 2
Curva dose-efeito
Habituação: A ANOVA não detectou nenhuma diferença estatisticamente
significativa entre os grupos. As atividades locomotoras (média ± d.p.) da primeira
exposição às caixas de atividade locomotora foram: veículo/salina = 1904,5 ±
675,22; SB10/salina = 2131,90 ± 893,62; SB20/salina = 2093,50 ± 1058,92;
SB40/salina = 2178,67 ± 633,83.
Tratamento (Tabela 1): A ANOVA para medidas repetidas detectou interação entre
os fatores grupo e tempo [F(6,70) = 6,07; p < 0,01]. O teste a posteriori mostrou
que os animais tratados com o SB na dose de 20 mg/kg diferiram do veiculo no
tempo 60 minutos (p < 0,05). O grupo de animais tratado com 40 mg/kg de SB
apresentou uma tendência a redução da atividade locomotora, quando
comparados ao grupo tratado com veículo (p = 0,057).
_________________________________________
Resultados
______________Tabela 1: Atividade locomotora ao longo de 60 min, após tratamento com diferentes doses de SB 334867 (10, 20 e 40 mg/kg, i.p.)
Os valores apresentados são cumulativos:
SB 334867
Veículo 10 mg/kg 20 mg/kg 40 mg/kg
15 min 535,6 ± 113,3 213,9 ± 39,5 238,5 ± 76,3 256,9 ± 63,6 30 min 849,0 ± 171,8 296,9 ± 63,0 347,5 ± 101,4 323,3 ± 89,3 60 min 1274,4 ± 299,0 459,7 ± 107,6 434,2 ± 109,2* 395,4 ± 123,2
*
Diferente do veículo no tempo 60 minutosBloqueio da expressão da sensibilização pelo SB 334867
Habituação: O teste t de Student não detectou nenhuma diferença
estatisticamente significativa entre os grupos. Os níveis de atividade locomotora
basal dos grupos SAL e EtOH foram, respectivamente 1452,914 ± 421,98 e
1432,89 ± 478,178.
Desenvolvimento da sensibilização comportamental (Figura 9): A ANOVA para
medidas repetidas mostrou interação entre os fatores grupo e teste [F(3,207) =
21,46, p < 0,0001], sendo que para os animais tratados com salina, houve redução
da atividade locomotora nos testes 3 e 4, enquanto que para os animais tratados
cronicamente com EtOH houve aumento da atividade nos testes 2, 3 e 4, em
relação ao teste 1 (p < 0,01). Os animais do grupo EtOH diferiram daqueles do
grupo SAL em todos os testes (p < 0,05).
_________________________________________
Resultados
______________Figura 9: Desenvolvimento da sensibilização comportamental, medida pela atividade locomotora de animais tratados com salina ou etanol. † Diferente do grupo salina nos testes 1, 2, 3 e 4 # Diferente do mesmo grupo no teste 1.
Expressão da sensibilização comportamental:
Desafio salina: O teste t de Student mostrou diferença estaticamente significativa
entre os grupos SAL e Etanol (salina= 785,38 ± 466,92, etanol= 1001,81 ±488,23;
t = -2,24; gl = 69; p < 0,03).
Desafio Veículo/SB-Etanol (Figura 10):A ANOVA de 2 vias indicou interação entre
grupo e desafio [F(2,65) = 3,53; p < 0,04]. A análise da interação mostrou que os
animais pré-tratados com etanol e desafiados com veículo/EtOH apresentaram
maior atividade locomotora do que aqueles pré-tratados com SAL após o mesmo
desafio (p < 0,02). Entretanto, a administração de SB na dose de 20 mg/kg reduziu
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Resultados
______________ a atividade locomotora dos animais pré-tratados com EtOH em comparação comaqueles que receberam veículo (p < 0,02).
Figura 10: Efeito do SB 334867, administrado i.p., 30 min antes do desafio com etanol. Os valores são expressos em média ± EPM. * Diferente do respectivo grupo desafiado com vei/EtOH; † Diferente do respectivo grupo salina;
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Discussão
___________________Os resultados do presente estudo mostraram que a dose de 2,2 g/kg de
EtOH administrada a cada 48 h produziu sensibilização comportamental em
camundongos, em concordância com estudos prévios que mostram que baixas
doses de etanol promovem aumento progressivo da resposta comportamental aos
efeitos estimulantes da droga em camundongos (Fish et al. 2002; Masur and
Boerngen 1980; Phillips et al. 1997), em um fenômeno conhecido como
sensibilização comportamental ou “tolerância reversa” (Robinson e Berridge 1993).
O estudo do envolvimento do sistema orexinérgico na dependência a drogas
é recente e diversas linhas de evidências sugerem que a orexina esteja envolvida
na dependência associada a comportamentos já que a ativação desses neurônios
está relacionada a estímulos associados com drogas e recompensa de alimentos
(Bonci & Borgland, 2009) e baseia-se na existência de projeções orexinérgicas
para regiões encefálicas envolvidas com comportamentos motivados e de
recompensa (Carr and Kalivas 2006; Harris et al. 2005; Scammell and Saper
2005), como por exemplo a ATV (Borgland et al. 2006) e o NAcc (Narita et al.
2006). Essas áreas contêm ambos os receptores para orexina, embora com
distribuição diferenciada. Enquanto há um predomínio de Orxr1 na ATV, estrutura
que está relacionada ao desenvolvimento da sensibilização, no NAcc, que está
envolvido com a expressão da sensibilização comportamental, há predomínio de
Orxr2 (Sharf et al. 2010).
Os resultados do Experimento 1 mostraram que mais neurônios
orexinérgicos estavam ativados no grupo de animais tratados cronicamente,
______________________________________
Discussão
__________________ porém este aumento não foi estatisticamente significativo. Isso pode ter sidodevido ao pequeno número de encéfalos avaliados e/ou à grande variabilidade
exibida pelos grupos. Apesar disto, o aumento do número de neurônios
orexinérgicos no HL após administração crônica com EtOH parece indicar um
possível envolvimento destes neurônios no desenvolvimento de sensibilização
comportamental. Visto que a técnica de imunohistoquímica fornece resultados
semi-quantitativos, seria necessário avaliar a expressão protéica da orexina no HL
para obtermos dados que refletissem melhor a produção do neuropeptídeo após o
desenvolvimento da sensibilização comportamental. É importante ressaltar que
estudos prévios mostram que o tratamento agudo (Leriche et al. 2008; Morales et
al. 1998) ou a retirada após tratamento crônico com EtOH (Morgan et al. 1992)
resulta em aumento de c-FOS–IR, à semelhança do que foi observado no
presente estudo.
Em relação à função da orexina na expressão da sensibilização
comportamental, o antagonista do receptor Oxr1 bloqueou essa fase do
fenômeno, sugerindo que o recrutamento do sistema orexinérgico é importante
para a expressão do fenômeno da sensibilização. De acordo com os resultados da
curva dose-resposta à administração de SB (10-40mg/Kg), todas as doses
produziram redução da atividade locomotora em comparação com o veículo. Esse
resultado era esperado, visto que a administração i.c.v de orexina-A promove
hiperlocomoção (Nakamura et al. 2000) e que a atividade orexinérgica é maior
durante a vigília associada à atividade locomotora (Torterolo et al. 2003), sendo
