JULIANA DO NASCIMENTO ALVAREZ
CARACTERIZAÇÃO EXPERIMENTAL DO FENÔMENO DE
SENSIBILIZAÇÃO COMPOR
TAMENTAL “IMEDIATA”
APÓS ADMINISTRAÇÃO ÚNICA DE DIFERENTES
DROGAS DE ABUSO EM CAMUNDONGOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina – para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
São Paulo
CARACTERIZAÇÃO EXPERIMENTAL DO FENÔMENO DE
SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL “IMEDIATA”
APÓS ADMINISTRAÇÃO ÚNICA DE DIFERENTES
DROGAS DE ABUSO EM CAMUNDONGOS
Tese preparada durante o Curso de Pós-Graduação em Farmacologia – Área de Concentração: Neurotransmissores – Departamento de Farmacologia e apresentada à Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina,
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
Orientador: Dr. Roberto Frussa Filho
Número do Comitê de Ética em Pesquisa: 0984/06
São Paulo
FICHA CATALOGRÁFICA
Alvarez, Juliana do Nascimento
“Caracterização experimental do fenômeno de sensibilização comportamental „imediata‟ após administração única de diferentes drogas
de abuso em camundongos”
Juliana do Nascimento Alvarez- São Paulo, 2009 - n° de pág: 224
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
Agradeço meu orientador, Prof. Dr. Roberto
Frussa-Filho;
A doutoranda Daniela Fukue Fukushiro;
A Profª. Drª. Beatriz Monteiro Longo;
A Ana Claudia Naldinho;
Aos colegas do laboratório;
Aos técnicos: Téo e Cleo;
E a todos que de uma forma ou de outra colaboraram
com meu desenvolvimento profissional.
“E aqueles que foram vistos dançando foram julgados insanos por
aqueles que não podiam escutar a música.”
A sensibilização comportamental caracteriza-se pelo aumento progressivo
e duradouro do efeito estimulante locomotor eliciado por drogas de abuso após o
tratamento repetido em roedores. A base neurobiológica desse fenômeno parece
intersectar com aquela da dependência química em humanos (sistema
dopaminérgico mesolímbico). Assim, a sensibilização comportamental tem sido
proposta por diferentes pesquisadores como um modelo fisiopatológico
dependência química. Recentemente verificamos que a sensibilização
comportamental pode se desenvolver de uma forma imediata. Nesse sentido,
demonstramos que uma injeção indutora de anfetamina é capaz de potencializar
o efeito estimulante locomotor produzido por uma injeção desafio da droga,
administrada algumas horas após.
Os objetivos gerais da presente Tese foram: 1-) caracterizar
comportamental e neuroquimicamente o fenômeno de sensibilização imediata à
anfetamina em camundongos, 2-) verificar se o fenômeno de sensibilização
imediata também ocorre para outras drogas de abuso (cocaína, morfina e etanol)
e 3-) verificar o possível desenvolvimento de sensibilização comportamental
imediata cruzada entre anfetamina e cocaína, morfina ou etanol.
Para tanto, utilizamos como paradigma experimental a atividade
locomotora de camundongos em campo aberto.
Verificamos o desenvolvimento de sensibilização imediata à anfetamina em
vários parâmetros comportamentais analisados em campo aberto (locomoção,
levantar e imobilidade), administrando 2 injeções desse psicoestimulante na dose
injeção de anfetamina (injeção indutora) ou de níveis residuais de droga. Além
disso, uma maior ativação neuronal no núcleo accumbens foi observada em
animais sensibilizados, na ausência de alterações neuroquímicas pré-sinápticas
no estriado-accumbens, sugerindo o envolvimento de modificações pós-sinápticas
no fenômeno de sensibilização imediata.
A sensibilização comportamental imediata também se desenvolveu para a
cocaína e a morfina, mas não para o etanol. Finalmente, a sensibilização imediata
ocorreu também de forma cruzada entre anfetamina e as demais drogas de
abuso, apresentando um caráter bidirecional, com exceção do etanol, cujo
cruzamento ocorreu apenas quando a anfetamina foi administrada na indução do
fenômeno, e o etanol na sua expressão.
Esses resultados podem ter relevância para uma maior compreensão dos
The behavioral sensitization phenomenon is characterized by a progressive
and enduring enhancement of the locomotor stimulant effect of drugs of abuse
following repeated treatment in rodents. This behavioral phenomenon seems to
share the same neurobiological basis of drug dependence in humans and has
been proposed as a pathophysiological animal model of drug dependence.
Recently, we demonstrated an early-onset type of behavioral sensitization. Indeed,
an “induction” injection of amphetamine potentiated the locomotor stimulant effect of a challenge injection of the drug, given some hours later.
The aims of this Thesis were threefold: 1-) to behaviorally and
neurochemically characterize the rapid-onset type of behavioral sensitization to
amphetamine in mice, 2-) to verify if the rapid-onset type of behavioral
sensitization would also occur to other drugs of abuse (cocaine, morphine and
ethanol) and 3-) to investigate the possible development of rapid-onset
cross-sensitization between amphetamine and cocaine, morphine or ethanol.
Mice´s open-field locomotor activity was used as the experimental
paradigm.
We verified the development of the rapid-onset type of behavioral
sensitization to amphetamine in the several behavioral parameters analyzed in the
open-field (locomotion, rearing and immobility), by administering 2 injections of 2,5
mg/kg amphetamine, separated by a 4h interval. We demonstrated that this
phenomenon was not a consequence of the stress induced by the priming
injection of amphetamine and was not due to residual levels of the drug. Moreover,
accumbens, suggesting that postsynaptic adaptations may be involved.
The rapid-onset behavioral sensitization also developed to cocaine and
morphine, but not to ethanol. Finally, rapid-onset cross-sensitization occurred
between amphetamine and the other drugs of abuse in a bidirectional way, except
for ethanol. Within this aspect, cross-sensitization between amphetamine and
ethanol only developed when amphetamine was administered during the induction
of this phenomenon and ethanol in its expression.
The present results may contribute to the comprehension of the mechanism
ANF – Anfetamina COC – Cocaína DA – Dopamina
DOPAC – Ácido 3,4-dihidrofenilacético ETN – Etanol
HVA – Ácido homovanílico
IEGs – Genes de expressão imediata IP – Intraperitoneal
MET – Metirapona MOR – Morfina SAL – Salina
1.Introdução
1. 1. Sensibilização comportamental e dependência qu“mica...14
1.2. Fenômeno de sensibilização imediata aos efeitos comportamentais da anfetamina ...21
1.3. Sensibilização comportamental cruzada...25
1.4. Dependência qu“mica e genes de expressão imediata...27
2. Objetivos 2.1. Proposição geral...31
2.2. Objetivos espec“ficos...31
2.2.1. Relacionados à caracterização experimental do fenômeno de sensibilização imediata induzida por diferentes drogas de abuso...31
2.2.2.Relacionados ao fenômeno de sensibilização comportamental imediata cruzada entre diferentes drogas de abuso...32
3. Materiais e métodos 3.1. Sujeitos experimentais ...33
3.2. Drogas e reagentes...33
3.3. Testes comportamentais...34
3.3.1 Atividade geral em campo aberto...35
accumbens de camundongos...36
3.4.1.1 Dissecação da estrutura ...36
3.4.1.2. Processamento das amostras...36
3.4.1.3. Separação e quantificação de dopamina seu metabólito DOPAC...37
3.4.2. Avaliação da expressão de c-fos...37
3.4.2.1. Perfusão e fixação do encéfalo de camundongos...37
3.4.2.2. Imuno-histoquímica para c-fos...38
3.5. Análise estat“stica...39
4. Delineamento experimental e resultados 4.1 Experimento 1 - Curva tempo-resposta do efeito estimulante locomotor induzido pela dose de 2,5 mg/kg de anfetamina em camundongos ...40
4.2 Experimento 2 - Conteúdo de dopamina e de DOPAC no estriado-accumbens após administração aguda de anfetamina...46
4.3. Experimento 3 – Caracterização comportamental do fenômeno de sensibilização imediata ao efeito estimulante locomotor induzido pela dose de 2,5 mg/kg de anfetamina ... 52
comportamental imediata à anfetamina... 63
4.6. Experimento 6 –Investigação da participação da corticosterona na expressão do fenômeno de sensibilização comportamental imediata à anfetamina ... 67
4.7. Experimento 7 – Poss“vel desenvolvimento de sensibilização imediata cruzada a diferentes doses de coca“na após injeção indutora de anfetamina ... 73
4.8. Experimento 8 – Investigação da influência de poss“veis n“veis residuais de anfetamina sobre a sensibilização imediata cruzada entre anfetamina e coca“na...79 4.9. Experimento 9 – Poss“vel desenvolvimento de sensibilização imediata cruzada a diferentes doses de morfina após injeção indutora de anfetamina ... 85
4.10. Experimento 10 – Poss“vel desenvolvimento de sensibilização imediata cruzada a diferentes doses de etanol após injeção indutora de anfetamina ... 91
4.11. Experimento 11 – Curva tempo-resposta do efeito estimulante locomotor induzido pela dose de 20 mg/kg de coca“na em camundongos ... 97
4.12. Experimento 12 – Caracterização comportamental do fenômeno de sensibilização imediata ao efeito estimulante motor induzido pela dose de 20 mg/kg de coca“na ... 103
induzido pela dose de 20 mg/kg de morfina em camundongos ... 117
4.15. Experimento 15 – Caracterização comportamental do fenômeno de sensibilização imediata ao efeito estimulante motor induzido pela morfina ... 124
4.16. Experimento 16 - Poss“vel desenvolvimento de sensibilização imediata cruzada a diferentes doses de anfetamina após injeção indutora de morfina...131
4.17. – Experimento 17 – Curva tempo-resposta do efeito estimulante locomotor induzido pela dose de 1.8 g/kg de etanol em camundongos ... 138
4.18. Experimento 18 – Caracterização comportamental do fenômeno de sensibilização imediata ao efeito estimulante motor induzido pelo etanol ... 144
4.19. Experimento 19 – Poss“vel desenvolvimento de sensibilização imediata cruzada a diferentes doses de anfetamina após injeção indutora de etanol...150
5. Discussão ... 156
6. Conclusão ... 199
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. Sensibilização comportamental e dependência química
Algumas respostas comportamentais exibidas por animais de laboratório
a estimulantes dopaminérgicos indiretos (como a anfetamina e a cocaína) e
diretos (como a apomorfina e a bromocriptina) intensificam-se após a sua
administração repetida (Robinson e Becker, 1986; Hoffman e Wise, 1992).
Diversos termos têm sido utilizados para a denominação desse fenômeno,
como por exemplo, tolerância reversa, facilitação comportamental e
sensibilização comportamental, sendo esse último mais freqüentemente
utilizado (Szechtman et al., 1994a,b; Everitt e Wolf, 2002). Dentre as respostas
sensibilizadas por agonistas dopaminérgicos diretos e indiretos incluem-se o
comportamento rotacional, o comportamento de beber, a responsividade a
estímulos acústicos, o comportamento de escalar e a performance em labirinto
em Y (Robinson e Becker, 1986). Indubitavelmente, entretanto, a hiperatividade
locomotora e os comportamentos estereotipados promovidos por esses
agonistas são as respostas comportamentais mais dramaticamente afetadas
pela administração repetida de drogas capazes de aumentar a função
dopaminérgica; constituem, portanto, os parâmetros comportamentais
quantificados na grande maioria dos estudos relacionados ao fenômeno de
sensibilização comportamental (Robinson e Becker, 1986; Wise et al, 1996,
Alvarez e Fukushiro et al 2006). Nesse aspecto, a sensibilização à
hiperatividade locomotora induzida pela anfetamina, em particular, tem atraído
15
dos mecanismos relacionados ao fenômeno de dependência a
psicoestimulantes.
Conforme revisado por Phillips e colaboradores (1997a,b), a maioria das
substâncias com potencial de abuso é capaz de estimular a atividade
locomotora em roedores. Esse fato tem levado à investigação detalhada da
estimulação psicomotora induzida por drogas. Assim, tem sido postulado que
modelos animais de estimulação locomotora induzida por drogas poderiam
corresponder à ação euforizante dessas drogas em humanos, sendo que o
estudo da locomoção traria importantes subsídios aos mecanismos
neuroquímicos relacionados aos efeitos euforizantes e reforçadores das drogas
de abuso. Nesse contexto, assim como descrito para a anfetamina, o
tratamento crônico intermitente com diversas outras drogas de abuso é capaz
de promover sensibilização ao seu efeito estimulante motor (Robinson e
Becker, 1986; Kalivas e Stewart, 1991, Araújo et al 2006).
De fato, além de agonistas dopaminérgicos, outras classes de drogas
capazes de apresentar, em determinadas doses, efeitos psicoestimulantes,
também promovem o desenvolvimento do fenômeno de sensibilização ao efeito
estimulante locomotor, quando administradas repetidamente. Assim, a
administração repetida de morfina e outros opiáceos com ação agonista em
receptores opióides do tipo parecem promover um aumento de seu efeito
estimulante motor caracterizado pela intensificação da ambulação de
camundongos (Iizuka e Hirabayashi, 1983; Kuribara e Tadokoro, 1989,
Kuribara, 1995; Zarrindast et al., 2003; De Rover et al., 2005; Kotlinska et al.,
16
Esse aumento da atividade locomotora em camundongos promovida por
agonistas opióides parece refletir um aumento da neurotransmissão
dopaminérgica conseqüente a uma estimulação de receptores opióides do tipo
(Rethy et al., 1971; Buxbaum et al., 1973; Kuschinsky e Hornykiewicz, 1974;
Reggiani et al., 1980; Swerdlow et al., 1985).
Da mesma forma, enquanto a administração aguda de uma dose baixa
de etanol resulta em um aumento da atividade locomotora, a administração
repetida de baixas doses pode produzir o aparecimento de sensibilização
comportamental, caracterizada por um aumento progressivo da atividade
locomotora de camundongos (Masur et al, 1986; Cunningham e Noble, 1992;
Hunt e Lands, 1992; Broadbent et al., 1995; Phillips et al., 1995; Roberts et
al.,1995; Kurtz et al., 1996; Lessov et al., 2001; Araújo et al., 2005, 2006).
Nesse sentido, a administração sistêmica de doses baixas (0,5 a 2,0 g/kg i.p.)
de etanol promove um aumento dos níveis de dopamina e de seus metabólitos,
ácido homovanílico (HVA) e ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) no núcleo
accumbens de ratos (Imperato e Di Chiara, 1986). Além disso, a administração
de etanol é capaz de aumentar de forma dependente de dose, tanto in vivo como in vitro, a taxa de disparos dos neurônios dopaminérgicos localizados na
área ventral do tegmento mesencefálico (Gessa et al., 1985; Brodie et al.,
1990)
Nesse contexto, diferentes observações experimentais indicam que o
sistema dopaminérgico mesolímbico vem a ser o principal substrato neuronal
subjacente tanto ao fenômeno de sensibilização à hiperatividade locomotora
como também às propriedades reforçadoras de drogas psicoestimulantes.
17
capazes de bloquear tanto a auto-administração de psicoestimulantes em ratos
(Le Moal e Simon, 1991) como o desenvolvimento da sensibilização
comportamental à anfetamina (Segal et al., 1979). Ainda nesse sentido,
Paulson e Robinson (1990) verificaram que após a administração sistêmica
repetida de anfetamina, uma injeção desafio dessa droga no núcleo
accumbens promoveu um aumento da locomoção significativamente maior do
que aquele observado em animais pré-tratados com salina. Paralelamente,
injeções repetidas de anfetamina na área ventral do tegmento mesencefálico,
mas não no núcleo accumbens, produzem sensibilização à resposta
locomotora induzida por uma injeção periférica subseqüente de anfetamina
(injeção desafio) (Kalivas e Weber, 1988).
Esses resultados sugerem que enquanto a indução da sensibilização
comportamental à resposta locomotora promovida pela anfetamina depende da
ação dessa droga na área ventral do tegmento mesencefálico, a expressão do
fenômeno está relacionada às suas ações nas terminações dopaminérgicas
localizadas no núcleo accumbens. Independentemente dessa diferenciação, os
experimentos acima descritos mostram o estreito vínculo do fenômeno de
sensibilização comportamental ao sistema dopaminérgico mesolímbico, à
semelhança do que ocorre com o processo de auto-administração de
psicoestimulantes (Maldonado et. al., 1993).
Ainda nesse contexto, drogas bloqueadoras de receptores
dopaminérgicos centrais têm se mostrado efetivas em antagonizar tanto a
sensibilização comportamental (Kuczenski e Leith, 1981; Mattingly e Rowlett,
1989; Ujike et al., 1989; Mattingly et al., 1994) como a auto-administração
18
1989; Britton et al., 1991; Hubner e Moreton, 1991; Richardson et al., 1993).
Curiosamente, algumas das substâncias não-dopaminérgicas (como
antagonistas de aminoácidos excitatórios e antagonistas opióides) que são
efetivas em inibir a sensibilização comportamental (Karler et al., 1989; Kuribara,
1995) também têm se mostrado capazes de antagonizar as propriedades
reforçadoras de psicofármacos (Mello et al., 1989; Schenk et al., 1993).
Uma evidência experimental adicional das semelhanças entre os
mecanismos inerentes à sensibilização comportamental e o processo de
dependência de psicoestimulantes provém dos experimentos relatados por
Piazza e colaboradores (1989). Esses autores verificaram que os ratos mais
predispostos a desenvolver hiperatividade locomotora induzida pela anfetamina
também eram aqueles a apresentar maior predisposição à auto-administração
dessa droga. Dados semelhantes têm sido obtidos para o etanol. Camarini e
colaboradores (2004) verificaram uma correlação positiva entre a sensibilização
à hiperatividade locomotora induzida pelo etanol e o consumo dessa
substância em duas linhagens de camundongos (C57BL/6J e DBA/2J).
Grahame e colaboradores (2000) demonstraram que camundongos
geneticamente selecionados para alta preferência ao etanol desenvolveram
sensibilização ao efeito estimulante locomotor da droga, ao passo que tal
sensibilização não ocorreu para camundongos geneticamente selecionados
para baixa preferência ao etanol. Esses resultados sugerem uma associação
genética positiva entre o fenômeno de sensibilização comportamental e as
propriedades reforçadoras do etanol. Nesse sentido, Lessov e colaboradores
(2001) verificaram, que uma linhagem de camundongos com alta preferência
19
pelo etanol e apresentou associado a um posterior aumento do consumo
voluntário da droga. Paralelamente, esses autores verificaram que o consumo
voluntário prévio de etanol foi capaz de promover um aumento (sensibilização)
do efeito estimulante induzido por uma injeção intraperitoneal da droga.
A administração repetida de agonistas dopaminérgicos indiretos como a
anfetamina e a cocaína aumenta a disponibilidade sináptica de dopamina na
área ventral do tegmento mesencefálico levando a uma subsensibilidade de
auto-receptores dopaminérgicos D2 (Wolf et al., 1993). Localizados nos corpos
celulares dos neurônios dopaminérgicos, com conseqüente aumento na
atividade basal desses neurônios (Henry et al., 1989) e potencialização do
aumento dos níveis extracelulares de dopamina no núcleo accumbens induzido
por esses psicoestimulantes (Wolf et al., 1993). Essas alterações pré-sinápticas
têm sido propostas como parte dos processos eliciadores do fenômeno de
sensibilização comportamental (ver Henry et al., 1998). Todavia, esses efeitos
são transientes, permanecendo por poucos dias após o término da
administração repetida. Por outro lado, a administração repetida desses
psicoestimulantes torna os neurônios supersensíveis aos efeitos
eletrofisiológicos inibitórios da dopamina no núcleo accumbens (Henry et al.,
1989) e de agonistas seletivos D1 (Henry e White, 1991). Nesse sentido, é
importante ressaltar que essa supersensibilidade funcional de
dopaminoceptores D1 conseqüente da administração repetida de
psicoestimulantes não está associada a alterações no binding de SCH 23390,
fato sugestivo que o fenômeno decorra de alterações pós-receptor (Groppetti et
20
Nesse cenário, estudos eletrofisiológicos realizados por Henry e
colaboradores (1998) trouxeram importante contribuição para a elucidação das
adaptações de dopaminoceptores D1 e D2 no sistema dopaminérgico
mesoaccumbens em conseqüência de sua estimulação repetida, bem como da
relação dessas adaptações com a resposta comportamental associada ao
fenômeno de sensibilização. Assim, esses autores verificaram que a
administração sistêmica repetida do agonista de dopaminoceptores D2
quimpirole produziu uma subsensibilidade de auto-receptores D2 na área
ventral do tegmento mesencefálico (isto é, atenuou efeitos inibitórios da
apomorfina na taxa de disparos dos neurônios dessa região), enquanto o
tratamento sistêmico repetido com o agonista D1 SKF 38393 promoveu uma
supersensibilidade de dopaminoceptores D1 no núcleo accumbens (isto é,
potencializou os efeitos inibitórios da aplicação iontoforética do SKF 38393
nesses neurônios). Ambos os fenômenos duraram apenas 1 semana, sendo
que somente nesse período verificou-se um aumento aos efeitos estimulantes
locomotores da cocaína (sensibilização cruzada). Quando os agonistas D1 e D2
foram combinados, observou-se subsensibilidade de auto-receptores D2 na
área ventral do tegmento mesencefálico, semelhante àquela produzida pelo
agonista D2 isoladamente. Todavia, tal combinação aumentou e prolongou a
supersensibilidade D1 no núcleo accumbens, prolongando também a
sensibilização cruzada à cocaína. Os autores interpretaram esses últimos
resultados como sugestivos de que a indução de subsensibilidade de
auto-receptores D2 na área ventral do tegmento mesencefálico é condição
necessária para alterações persistentes tanto da supersensibilidade D1 no
21
Mais especificamente, Henry e colaboradores (1998) preconizam que a
subsensibilidade de auto-receptores D2 (induzida pela administração repetida
do agonista D2) com o conseqüente aumento da atividade dos neurônios da
área ventral do tegmento mesencefálico, mantém aumentado o nível de
estimulação dos dopaminoceptores pós-sinápticos. Quando a administração do
agonista D2 é combinada com a do agonista D1, a estimulação adicional dos
dopaminoceptores D1 (pós-sinápticos) promoveria as adaptações necessárias
para o aumento persistente da função receptora D1.
1.2. Fenômeno de sensibilização “imediata” aos efeitos comportamentais da anfetamina
Assim como relatado para comportamentos relacionados ao sistema
mesoaccumbens, processos adaptativos que ocorrem imediatamente após a
manifestação comportamental resultante da injeção de psicoestimulantes
parecem também ser fundamentais para a sensibilização de comportamentos
associados à transmissão dopaminérgica nigroestriatal. Com efeito, em dois
trabalhos pioneiros, Kuczenski e Segal (1999a,b) demonstraram o
desenvolvimento de sensibilização imediata ao comportamento estereotipado
induzido por anfetamina em ratos. Mais especificamente, os autores verificaram
que 3 horas após a injeção aguda de 4 mg/kg de anfetamina (período no qual a
estereotipia já havia desaparecido e os níveis extracelulares de dopamina já
haviam voltado ao normal) uma nova injeção de 0,5 mg/kg de anfetamina (dose
incapaz de promover estereotipia em animais pré-tratados com salina)
promovia intensa estereotipia, sem alterar os níveis extracelulares de dopamina
pré-22
tratados com salina. Em um de seus trabalhos, Kuczenski e Segal (1999a),
verificaram que tal fenômeno era inibido tanto pela injeção do antagonista
preferencialmente D2, haloperidol, como do antagonista seletivo D1, SCH
23390, previamente à primeira injeção de anfetamina. Em um segundo
trabalho, esses mesmos autores, demonstraram que a injeção prévia de 4
mg/kg de anfetamina era capaz de, 3 horas depois, também potencializar os
efeitos de doses sub-efetivas dos agonistas D1 SKF 82958 ou D2 quimpirole
sobre o comportamento estereotipado. Além disso, verificaram que a
administração prévia desses agonistas em doses maiores foi capaz de
potencializar a estereotipia induzida por doses sub-efetivas de anfetamina
(Kuczenski e Segal 1999b).
A expressão da sensibilização comportamental se baseia em mudanças
neuroplásticas dependentes de tempo nos circuitos cerebrais que envolvem o
comportamento motivacional. Dentre essas alterações neuroadaptativas, uma
hiper-reatividade da via dopaminérgica mesolímbica de longa duração tem sido
mais evidente (ver item 1.1). A magnitude da sensibilização é altamente
influenciada pelo perfil de pré-tratamento. Nesse sentido, a administração
repetida intermitente de doses moderadas de drogas é muito mais efetiva em
induzir sensibilização do que uma exposição contínua a doses altas ou
crescentes dessas drogas (Robinson e Becker, 1986; Stewart e Badiani, 1993;
Vanderschuren et al., 1997). Nesse aspecto, a exposição única à anfetamina,
cocaína ou mesmo morfina tem se mostrado capaz de induzir sensibilização
comportamental e neuroquímica (Robinson, 1984; Peris e Zahniser, 1987;
23
desafio foi sempre aplicada em um intervalo de vários dias após a injeção
indutora da droga.
Conforme já abordado anteriormente, Kuczenski e Segal (1999 a,b)
demonstraram o desenvolvimento de sensibilização imediata ao
comportamento estereotipado induzido por anfetamina em ratos. Esse achado,
embora publicado em periódico de grande impacto na área farmacológica, não
teve continuidade investigativa condizente com sua potencial importância
básica e clínica. Com efeito, sob o ponto de vista básico/mecanicístico ele
sugere a possibilidade de que os eventos neuroplásticos (ou pelo menos parte
deles) que medeiam o fenômeno de sensibilização comportamental ocorram de
maneira praticamente imediata. Paralelamente, conforme sugerido por esses
mesmos autores, uma vez que essas alterações comportamentais são
aparentes logo após o término da resposta à anfetamina, elas podem ter
importantes implicações para as alterações comportamentais resultantes das
administrações de psicoestimulantes em um padrão “binge” de abuso em humanos. Não obstante, Kuczenski e Segal (1997a,b) sugeriram que o
fenômeno de sensibilização imediata à estereotipia induzida por anfetamina em
ratos não se estenderia ao efeito estimulante locomotor da droga, o qual está
relacionado ao sistema mesoaccumbens, e reflete de maneira mais específica
os processos mecanicísticos subjacentes à dependência química. Por outro
lado, a ausência de sensibilização ao efeito estimulante locomotor poderia
decorrer de uma competição comportamental entre os comportamentos
estereotipado e locomotor, uma vez que ambos os comportamentos foram
avaliados em um mesmo aparelho de observação. Com efeito, ao validarmos
24
camundongos (Chinen et al., 2006), utilizamos aparelhos de observação
específicos para avaliar a estereotipia ou a atividade locomotora e
demonstramos o desenvolvimento do fenômeno para ambos os parâmetros
comportamentais (com um intervalo de 4 horas entre as injeções indutoras e
desafio).
Nesse trabalho Chinen et al (2006), analisando conjuntamente os dados
obtidos para o comportamento estereotipado e para a estimulação locomotora
induzidos pela anfetamina, no contexto do fenômeno de sensibilização
imediata, verificaram um perfil de respostas bastante semelhante. Em ambos
os parâmetros comportamentais, a sensibilização imediata ocorreu na ausência
de pareamento ambiental, mas este foi capaz de potencializá-la de maneira
vigorosa. Em ambos os casos, o efeito potencializador do processo de
pareamento ambiental pareceu se dever ao desenvolvimento de um
condicionamento Pavloviano entre o comportamento em questão e o ambiente
a ele associado, conforme sugerido pelos experimentos envolvendo desafio
com salina. Sob o ponto de vista clínico, a demonstração do fenômeno de
sensibilização imediata à ação estimulante locomotora da anfetamina, bem
como sua potencialização pelo processo de condicionamento ambiental sugere
que o desenvolvimento de dependência de drogas pode se estabelecer (pelo
menos em alguns de seus aspectos biológicos) de forma imediata. Além disso,
sugere também que o condicionamento ambiental poderia exercer um papel
importante no abuso de psicoestimulantes em um padrão “binge”. Sob o enfoque básico/mecanicístico, nossos dados sugerem que uma única injeção
25
conseqüências funcionais imediatas nos sistemas dopaminérgicos
mesoestriatal e mesoaccumbens.
1.3. Sensibilização Comportamental Cruzada
No que concerne ao fenômeno da sensibilização comportamental, vários
estudos têm abordado a sensibilização cruzada entre drogas, na qual os efeitos
de uma droga de abuso podem ser potencializados pelo tratamento prolongado
prévio com outra droga de abuso, possivelmente pelo fato de essas duas
drogas compartilharem um mecanismo comum de sensibilização
comportamental. Nos estudos realizados para verificar a ocorrência de
sensibilização cruzada entre drogas, os animais geralmente são tratados
repetidamente com uma droga A (para indução da sensibilização), e
posteriormente desafiados com uma droga B, para se verificar a expressão da
sensibilização. Há relatos de sensibilização cruzada entre drogas como
cocaína, anfetamina e morfina (Vezina e Stewart, 1990; Wise e Leeb, 1993;
Cador et al., 1995; Cunningham et. al., 1997; Vanderschuren et. al., 1997).
Assim, Vezina e Stewart (1990) verificaram que ratos tratados com injeções de
anfetamina na área ventral do tegmento mesencefálico, mas não no núcleo
accumbens, apresentaram uma sensibilização ao efeito estimulante locomotor
de uma injeção sistêmica de morfina. De forma semelhante, Cador e
colaboradores (1995) observaram, que em ratos o tratamento com injeções de
anfetamina na área ventral do tegmento mesencefálico induziu a sensibilização
ao efeito estimulante locomotor de uma injeção de cocaína no núcleo
accumbens e de uma injeção sistêmica de morfina, administradas após um
26
entre drogas, assim como na sensibilização comportamental clássica, a área
ventral do tegmento mesencefálico parece ser a região crítica responsável pela
indução da sensibilização, enquanto o núcleo accumbens parece estar mais
relacionado com a expressão desse fenômeno.
O fenômeno de sensibilização cruzada entre drogas parece ser um
processo bidirecional. Dessa forma, assim como o tratamento com anfetamina
pode induzir a sensibilização aos efeitos de outras drogas como a morfina, o
tratamento prévio com morfina também é capaz de induzir a sensibilização aos
efeitos de uma injeção subseqüente de anfetamina. Nesse contexto,
Vanderschuren e colaboradores (1997) demonstraram que o tratamento com
injeções de morfina, de forma chamada “intermitente” (14 injeções diárias), induziu sensibilização cruzada ao efeito estimulante locomotor de uma injeção
de anfetamina, administrada 3 semanas após o término desse tratamento.
Cunningham e colaboradores (1997) também relataram essa sensibilização
cruzada entre o tratamento com morfina (na dose de 10 mg/kg durante 5 dias)
e, uma injeção desafio de anfetamina (na dose de 1,5 mg/kg), quando as
injeções foram dadas sistemicamente. Nesse mesmo trabalho, foi observada
sensibilização cruzada entre o mesmo tratamento com morfina e injeções
intraaccumbens de anfetamina na dose de 2,5 µg/0,5 µl ou cocaína na dose de
7 µg/0,5 µl, em ratos.
Em relação ao etanol, há dados controversos no que concerne ao
fenômeno de sensibilização comportamental cruzada. Manley e Little (1997)
relataram que ratos que consumiram etanol na dieta por 3 semanas
apresentaram maior efeito estimulante e maior sensibilização locomotora
27
Netsby e colaboradores (1997) observaram que após 3 semanas de
tratamento, ratos pré-tratados com etanol apresentaram sensibilização
comportamental (e neuroquímica) a um desafio com morfina, mas não à
anfetamina. Outro estudo com camundongos mostrou que animais pré-tratados
com etanol apresentaram sensibilização cruzada à cocaína (Itzhak e Martin,
1999), embora Fish et al. (2002) não tenham observado sensibilização cruzada
entre etanol e morfina e anfetamina.
Apesar de existirem inúmeros estudos demonstrando o fenômeno de
sensibilização cruzada entre drogas para o modelo de sensibilização
comportamental clássica, não se sabe se esse fenômeno também ocorreria
para a sensibilização comportamental imediata.
1.4 Dependência química e genes de expressão imediata
A estimulação neuronal ativa mecanismos distintos para processar e
transmitir a informação. Essa ativação pode se dar por alterações da atividade
eletrofisiológica neuronal ou por alterações na cascata de segundos
mensageiros que evocam a produção de fatores de transcrição os quais
induzem ou inibem a transcrição de genes (Herdegen e Leah, 1998). Os genes
ativados por fatores de transcrição podem produzir proteínas como as que
constituem receptores, canais iônicos e as requeridas para síntese de
neurotransmissores. Entre os fatores de transcrição conhecidos, um dos mais
estudados é o c-fos, o qual é induzido rapidamente após a ativação sináptica,
atingindo o pico entre 90 e 120 minutos após a estimulação (Grzanna e Brown,
28
Mais especificamente, c-fos é um proto-oncogene pertencente à família
dos genes de expressão imediata, immediate early genes – IEG. Esses genes são fatores de transcrição, ativados rápida e transientemente na cascata inicial
da expressão gênica, responsável por iniciar o processo de mudanças
adaptativas induzidas por estímulos extracelulares e atividade sináptica
excitatória (Davis et al., 2003). A proteína c-Fos, produto do gene c-fos, é uma
proteína regulatória que, em conjunto com outros membros das famílias FOS e
JUN, formam um complexo heterodimérico AP1, que por sua vez, se liga ao
DNA para controlar a expressão gênica.
Na maioria das células, os níveis de expressão basal de c-fos são relativamente baixos. Todavia, o seu RNAm e os níveis protéicos aumentam
rapidamente após a aplicação de uma variedade de estímulos, como por
exemplo estresse (Del Bel et al, 1993; Titze-de-Almeida et al, 1994), epilepsia
(Herrera e Robertson, 1996), estímulos nociceptivos (Hunt et al, 1987; Harris et
al, 1996) e dependência química (Aston-Jones e Harris, 2004; Nestler, 2004).
Essa baixa de expressão basal seguida de um aumento de expressão de c-fos
contribuem para a sensibilidade da técnica, onde a presença da proteína c-Fos
pode ser usada como um marcador de ativação celular gerada por um
estímulo. No sistema nervoso central, esse aumento pode ser detectado
rapidamente (15-30 minutos para a ativação de RNAm e 30-60 minutos para a
ativação da proteína c-Fos) pela técnica de imuno-histoquímica (Grzanna e
Brown, 1993). O uso extensivo dessa técnica tem sido facilitado pela
disponibilidade de anticorpos que reconhecem e se ligam às regiões
específicas da proteína. A incubação do tecido em solução contendo o
29
células c-Fos positivas. Os resultados desse procedimento podem ser
facilmente observados e quantificados por microscopia. A extensão da área e
intensidade da expressão de c-Fos determinam as áreas cerebrais ativadas em
uma determinada situação experimental (Grzanna e Brown, 1993).
Dada a sua simplicidade, sensibilidade, resolução celular e utilidade com
respeito a diversos estímulos, a imuno-histoquímica para c-Fos tem sido
aplicada para mapear a ativação de células no sistema nervoso em resposta às
drogas, tais como opiáceos (Chang et al. 1988; Chang & Harlan 1990; Hayward
et al. 1990), cocaína (Graybiel et al. 1990; Young et al. 1991; Hope, 1998), e
anfetamina (Graybiel et al. 1990). A marcação imunocitoquímica de c-Fos pode
também ser feita em combinação com a marcação de outros antígenos ou
traçadores neurais, tornando possível a identificação das características dos
neurônios que expressam c-fos em resposta ao estímulo.
Outros fatores de transcrição relacionados com Fos são as proteínas
FosB, FRA1 e FRA2, que se acumulam com a estimulação repetida,
necessitando de um tempo maior para serem detectados (Nestler et al., 2001).
De importância para esta Tese, a sensibilização comportamental clássica
induzida pelo tratamento repetido com psicoestimulantes, é acompanhada por
um aumento da expressão de fatores de transcrição como c-fos e fosB no striatum, núcleo accumbens e córtex pré-frontal (Badiani et al., 1998; Self e Nestler, 1998; Crombag et al., 2002).
Até o momento, o fenômeno de sensibilização comportamental imediata
aos efeitos estimulantes locomotores de drogas de abuso foi demonstrado
apenas para a anfetamina e apenas por meio de técnicas comportamentais.
30
que tange a outros parâmetros comportamentais que não a atividade
locomotora.
De importância, o fenômeno foi demonstrado somente após uma dose
indutora alta de anfetamina (5mg/kg), a qual poderia, hipoteticamente, levar a
níveis residuais da droga, os quais poderiam potencializar os efeitos da injeção
desafio. A investigação desse fenômeno produzido por uma dose indutora
menor de anfetamina, bem como sob uma perspectiva comportamental mais
abrangente, acompanhada de evidencias neuroquimicas e moleculares se faz,
portanto, necessária. Também de relevância vem a ser a demonstração de
abrangência do fenômeno de sensibilização imediata para outras drogas de
abuso e do possível desenvolvimento de sensibilização mediata cruzada entre
31
2.
OBJETIVOS
2.1 Proposição Geral
Esta tese teve os seguintes objetivos gerais: 1-) Caracterizar
comportamental e neuroquimicamente o fenômeno de sensibilização imediata à
anfetamina; 2-) Verificar se o fenômeno de sensibilização imediata ao efeito
estimulante locomotor demonstrado para a anfetamina (Chinen et al., 2006)
também ocorre para outras drogas de abuso (cocaína, morfina e etanol) e 3-)
Verificar o possível desenvolvimento de sensibilização comportamental
imediata cruzada entre anfetamina e cocaína, morfina ou etanol.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Relacionados à caracterização experimental do fenômeno de sensibilização imediata induzido por diferentes drogas de abuso Caracterizar comportamental e neuroquimicamente o fenômeno
de sensibilização imediata ao efeito estimulante locomotor induzido por
anfetamina
Verificar o possível desenvolvimento de sensibilização imediata
ao efeito estimulante locomotor induzido pela cocaína.
Verificar o possível desenvolvimento de sensibilização imediata
ao efeito estimulante locomotor induzido pela morfina.
Verificar o possível desenvolvimento de sensibilização imediata
32
2.2.2 Relacionados ao fenômeno de sensibilização imediata cruzada entre diferentes drogas de abuso
Verificar a possível sensibilização imediata do efeito estimulante
locomotor entre:
Cocaína, induzida por uma injeção de anfetamina;
Anfetamina, induzida por uma injeção de cocaína;
Morfina, induzida por uma injeção de anfetamina;
Anfetamina, induzida por uma injeção de morfina;
Etanol, induzida por uma injeção de anfetamina;
33
3.
MATERIAL E MÉTODO
3.1 Sujeitos Experimentais
Foram utilizados camundongos EPM M1 machos, com idade variando
entre 2 a 3 meses. Os animais chegaram ao laboratório experimental pelo
menos 10 dias antes do início dos experimentos e foram mantidos sob
temperatura constante (22±1°C) e sob um ciclo claro/escuro de 12:12 horas,
sendo as luzes acesas às 7:00h. Água e comida foram fornecidas ad-libitum.
3.2. Drogas e Reagentes
Ácido Cítrico (C6H8O7.H2O) - Merck
Ácido Heptano 1-sulfônico (C7H15NaO3S) - Mallinckrodt Baker
Ácido Perclórico - Merck
Anfetamina - Sigma
Anticorpo policlonal feito em coelho anti-c-Fos - Chemicon 1:2500
Anticorpo anti-coelho feito em cabra - Chemicon 1:200
Avidina-biotina - Vectastain
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) - Synth Brasil
Cloreto de Cálcio (CaCl2.2H2O) - Merck
Cloreto de Magnésio (MgCl2.6H2O) - Merck
Cloreto de Potássio (KCl) - Sigma
Cloreto de Sódio
Cocaína - Sigma
D(+) Glicose Anidra (C6H12O6) - Merck
34
Diaminobenzidina (DAB) - Sigma
EDTA – Etilanodinitrilo (C10H14O8N2Na2.2H2O) - Mallinckrodt Baker
Etanol - Merck
Fosfato de Sódio Monobásico (NaH2PO4.H2O) - Merck
Metabissulfito de Sódio (Na2O5S2) - Merck
Metanol (CH3OH) - Mallinckrodt Chemicals USA
Metirapona - Merck
Morfina - Sigma
Sacarose (C12H22O11) - Merck
Sulfato de Magnésio (MgSO4) - Merck
As drogas de abuso (anfetamina, cocaína, etanol e morfina) foram
dissolvidas em solução salina. As soluções foram injetadas sempre por via
intraperitoneal em volume de 0,1 ml/10 g de peso corporal. As doses propostas
em todos os experimentos foram escolhidas com base em dados obtidos em
experimentos-piloto realizados em nossos laboratórios ou em dados
específicos da literatura.
As soluções estoques dos padrões de HPLC foram diluídas em HCL
0,1M com 0,02% de EDTA e 0,02% de metabisulfito de sódio. Todos reagentes
utilizados em HPLC foram diluídos em água ultra pura (MiliQ), filtrados em filtro
de porosidade de 0,022µm e de aerados com gás Hélio.
35
3.3.1 Atividade Geral em Campo Aberto
O campo aberto utilizado consiste em uma arena de polietileno branco
fosco com formato cilíndrico. O corpo do cilindro tem 40 cm de altura e sua
base é um cilindro de madeira do mesmo diâmetro e com 2 cm de altura.
Desse modo, o corpo do cilindro (paredes da arena), apresenta um encaixe
justo à base (chão da arena) podendo ser separado para a efetuação da
limpeza. O chão da arena é subdividido em 19 quadrantes aproximadamente
iguais demarcados por 3 circunferências concêntricas de raios diferentes (8, 14
e 20 cm), intersectadas por segmentos de retas radiais. Cada animal foi
observado individualmente no campo aberto por 5 minutos, durante os quais
foram quantificados, por meio de observação direta, os seguintes parâmetros
comportamentais: freqüência de locomoção, freqüência de levantar e duração
de imobilidade. Cada unidade de locomoção corresponde ao ato de o animal
penetrar com as 4 patas um dos quadrantes do campo aberto; cada unidade de
levantar corresponde à postura de o animal permanecer apoiado somente nas
patas posteriores, com o tronco perpendicular ao chão, tendo a cabeça dirigida
para cima e tocando ou não com as patas anteriores as paredes do campo
aberto; o comportamento de imobilidade foi considerado como período de
tempo (em segundos) durante os qual o animal não apresenta atividade
motora, permanecendo estático no que diz respeito à cabeça, tronco e
membros. Além desses parâmetros comportamentais, a freqüência de
defecação (número de bolos fecais) exibida pelos camundongos durante a
36
3.4 Testes Neuroquímicos
3.4.1 Quantificação de dopamina e seu metabólito DOPAC no estriado-accumbens de camundongos
3.4.1.1 Dissecação da estrutura
Os animais foram eutanásiados por decapitação, o encéfalo retirado
rapidamente e lavado com a Solução de Dissecação resfriada pela presença
de gelo e gelo seco com a seguinte composição (mmol/L): NaH2PO4.H2O
(1,25), MgSO4 (2,00), MgCl2.6H2O (2,00), CaCl2.2H2O (2,00), KCl (3,50),
Glicose (10,00), Sacarose (220,00) e NaHCO3 (21,00) sendo que o NaHCO3 e
a Sacarose foram acrescentados à solução apenas no momento do
experimento. O encéfalo foi então colocado em uma placa de Petri (forrada
com papel de filtro molhado pela mesma solução) rodeada por gelo e gelo seco
para a manutenção da temperatura. O cérebro foi dissecado abrindo os
hemisférios direito e esquerdo para localização e retirada dos
estriado-accumbens que foram separados do resto do tecido.
3.4.1.2 Processamento das amostras
Após a pesagem, as estruturas foram processadas em aparelho de
ultra-som e colocadas no congelador por 12 horas para que ocorresse a precipitação
das proteínas. Passadas às 12 horas foram centrifugadas em ultra centrífuga
(JOAN) por 45 minutos a 4ºC e 14000 rpm.
Para a quantificação das aminas as amostras foram filtradas em filtro de
seringa de 0,22m e armazenadas em freezer -80ºC até serem injetadas no
37
3.4.1.3 Separação e quantificação de dopamina e seu metabólito DOPAC
As amostras foram separadas e quantificadas por meio de um sistema
de cromatografia líquida de alta eficiência, (HPLC, Shimadzu), utilizando-se
uma coluna Chromolith RP-18e (Merck), sendo detectadas por um detector
eletroquímico (1049 A, Hewlett Packard). O sistema de HPLC foi controlado por
um computador acoplado ao sistema, por meio de um programa específico
(Software Class VP, versão 2.0) que realizou o registro e a análise dos dados.
A fase utilizada foi composta por (gramas/litro) Na2HPO4.H2O (13,4), EDTA
(0,372), ácido 1-heptanossulfônico (0,320), ácido cítrico (10,5), metanol (12%),
pH 3,5.
Concentrações conhecidas de dopamina e DOPAC foram tratadas da
mesma forma que as amostras e injetadas em diferentes concentrações no
HPLC. Para cada substância, foram calculadas as médias das áreas dos picos
de cada concentração utilizada, sendo construída uma curva da concentração
dos padrões em função da área obtida em cada concentração. A regressão
linear dessa curva serviu para calcular as concentrações de dopamina e
DOPAC nas amostras.
3.4.2. Avaliação da expressão de c-fos
3.4.2.1 Perfusão e fixação do encéfalo de camundongos
Os animais foram eutanasiados com tionembutal (50 mg/kg, i.p.) e seus
38
perfusão consistiu na abertura das cavidades abdominal e torácica dos animais
anestesiados que, com a freqüência de batimento cardíaco ainda acima de
100/minuto, foram perfundidos através do ventrículo esquerdo, com 100 mL de
solução salina (0,9% NaCl) passando em seguida em 200 mL de
paraformaldeido (4%) por aproximadamente 15 minutos. Os encéfalos então
foram removidos do interior do crânio, imersos em paraformaldeido por 1 hora
e a seguir em solução hipertônica de sacarose (30%) para crio-proteção. Fatias
consecutivas coronais do encéfalo (30 micras) foram obtidas em criostato e
armazenadas em temperatura de -20 ºC em solução anti-congelante (500 mL
PBS, 500mL H2O, 1,59g NaH2PO4, 5,47g Na2HPO4, 300g sacarose, 300 mL
etilenoglicol) até o processamento para imuno-histoquímica.
3.4.2.2 Imuno-histoquímica para c-Fos
Os cortes foram lavados com PBS para retirar a solução anti-congelante,
e incubados por 30 minutos em solução de bloqueio “blocking buffer” (BB) (90
mL de PBS 0,1M, 250L de Triton X-100, 450L de soro normal de cabra) em
temperatura ambiente. Após esse tempo, foram incubados “over night” com anticorpo policlonal feito em coelho anti-c-Fos (1:2000) diluído em BB. A seguir
os cortes foram incubados em anticorpo secundário anti-coelho feito em cabra
(1:200) por 1 hora, novamente lavados com PBS, processado com
avidina-biotina e o produto intensificado com diaminobenzidina (DAB). As lâminas
foram montadas e fechadas. Para a análise das lâminas, a extensão da área,
intensidade e quantificação das células marcadas, foram mensurados com a
39
mesencenfálico (VTA) continha 250µm², sendo que o atlas Paxinos e Franklin
(2001), serviu como referência para localização das áreas quantificadas.
3.5. Análise Estatística
Para a análise de cada parâmetro comportamental foi utilizada a análise
de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida do teste de Duncan, com
exceção dos experimentos envolvendo curva tempo-resposta, no qual se
utilizou o teste T para amostras independentes, teste T para amostras
pareadas, e MANOVA. A probabilidade de p<0,05 foi considerada suficiente para revelar diferenças estatisticamente significantes entre os vários grupos
40
4.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS
4.1. Experimento 1. Curva tempo-resposta do efeito estimulante locomotor induzido pela dose de 2,5 mg/kg de anfetamina em camundongos.
Vinte camundongos foram habituados em campo aberto por 10 minutos
durante 3 dias, sendo sua atividade geral quantificada no 3º dia. Com base em
seu nível basal de atividade geral, os animais foram distribuídos em 2 grupos com
10 animais cada e atividade geral semelhante: ANF e SAL. No 4º dia, os animais
do grupo controle (SAL) receberam uma injeção intraperitoneal (ip) de solução
salina, enquanto os animais do grupo experimental (ANF) receberam uma injeção
ip de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg. Imediatamente após as respectivas
injeções, os animais foram colocados no campo aberto e lá permaneceram por
240 minutos. Após 15 minutos da introdução no campo aberto, sua atividade geral
foi quantificada durante 5 minutos a cada 30 minutos, conforme descrito no item
3.3.1.
Resultados:
Com relação ao parâmetro locomoção (figura 1), a ANOVA de duas vias
revelou efeitos significativos do fator tempo (minutos de observação) [F(10,180) =
15,77; p<0,05] e do fator grupos (SAL X ANF) [F(1,18) = 24,85; p<0,05], bem
como interação entre os fatores tempo e grupos F(10,180) = 10,05; p<0,05].
O teste T para amostras pareadas mostrou que para o grupo SAL houve
41
analisados, com exceção do minuto 75, em relação ao minuto 15 [T (9) = 3,50;
4,03; 4,37; 4,43; 5,43; 5,11 e 5,52; p<0,05 para os minutos 45, 105, 135, 165, 195,
225 e 255 em relação ao minuto 15, respectivamente]. O grupo ANF apresentou
diminuição significativa na locomoção a partir do minuto 135 até o minuto 255, em
relação ao minuto 15 [T(9) = 2,75; 2,79; 3,11; 3,19; e 2,88; p<0,05 para os minutos
135, 165, 195, 225 e 255 respectivamente].
O teste T de Student revelou que a freqüência de locomoção apresentada
pelos animais do grupo ANF foi significativamente maior que aquela apresentada
pelo grupo SAL até 135 minutos após a administração da anfetamina [T(18) =2,4;
4,6; 5,0; 3,3 e 2,7; p<0,05 para os minutos 15, 45, 75, 105 e 135,
respectivamente]. Do minuto 165 ao minuto 255, a freqüência da atividade
locomotora apresentada pelos camundongos do grupo ANF não apresentou
diferenças significativas em relação àquela dos animas do grupo SAL.
No que se refere ao parâmetro freqüência de levantar (Figura 2), a
MANOVA revelou efeito significativo do fator tempo [F(10,180) = 6,90; p<0,05], do
fator grupos [F (1,18) =5,76; p<0,05] e interação tempo x grupos [F(10,180) = 5,41;
p<0,05]. O teste T para amostras pareadas mostrou que enquanto o grupo SAL
apresentou diminuição significativa da freqüência de levantar a partir do minuto 45
até o minuto 255 em relação ao minuto 15 [T(9) = 4,12; 3,85; 4,76; 5,06; 4,78;
4,82; 5,41 e 5,55; p<0,05 para os minutos 45, 75, 105, 135, 165, 195, 225 e 255
respectivamente], o grupo ANF apresentou aumento da freqüência de levantar nos
minutos 75 e 105 em relação ao minuto 15 [T(9) = 2,64; 3,28; p<0,05 para os
42
independentes revelou que os animais do grupo ANF apresentaram uma
diminuição significativa da freqüência desse comportamento em relação aos
animais do grupo SAL no primeiro período de tempo avaliado (minuto 15)
[T(18) = -2,9;p<0,05]. Do minuto 75 ao minuto 135, os animais do grupo ANF
apresentaram freqüência de levantar significativamente aumentada em relação ao
grupo SAL [T(18) =2,7; 3,1 e 2,9; p<0,05 para os minutos 75, 105 e 135,
respectivamente]. Do minuto 165 ao minuto 255, a freqüência de levantar do grupo
que recebeu anfetamina não apresentou diferenças significativas em relação
àquela do grupo que recebeu salina.
No parâmetro imobilidade (Figura 3), a ANOVA de duas vias detectou efeito
significativo do fator tempo [F(10,180) = 14,62; p<0,05], do fator grupos [F(1,18)
=7,68; p<0,05] e interação tempo x grupos [F(10,180) = 3,62; p<0,05]. O teste T
para amostras pareadas demonstrou que enquanto para o grupo SAL houve uma
aumento significativo da imobilidade em quase todos os minutos analisados em
relação ao minuto 15 [T(9) = 2,56, 3,44, 4,73, 4,16, 5,99; 6,82; 5,64 e 6,60; p<0,05
para os minutos 45, 75, 105, 135, 165, 195, 225 e 255 respectivamente], para o
grupo ANF houve um aumento significativo da duração da imobilidade do minuto
195 ao minuto 255 em relação ao minuto 15 [T(9) = 4,71, 4,20 e 3,60; p<0,05 para
os minutos 195, 225 e 255, respectivamente].
De acordo com o Teste T para amostras independentes, os animais do
grupo ANF apresentaram uma diminuição significativa na imobilidade em relação
aos camundongos do grupo SAL do minuto 75 ao minuto 135 [T(18) = 3,2; 3,3 e
43
Figura 1: Freqüência de locomoção de camundongos que receberam uma injeção
intraperitoneal de solução salina (SAL) ou de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg (ANF). Imediatamente após as respectivas injeções, os animais foram colocados no campo aberto e sua atividade locomotora foi quantificada durante 5 minutos, a partir do 15o
minuto, a cada 30 minutos, por um período de 240 minutos. A figura representa as médias + erro padrão.
Teste T de Student para amostras independentes p<0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
A ANOVA de duas vias revelou efeitos significativos do fator tempo, do fator grupos e interação tempo x grupos
Teste T para amostras pareadas (em relação ao minuto 15):
Grupo SAL – diminuição da locomoção no minuto 45 e do minuto 105 ao minuto 255.
Grupo ANF – diminuição da locomoção do minuto 135 ao minuto 255. Diferenças não representada nos gráficos
Locomoção
0 100 200 300 400
15 45 75 105 135 165 195 225 255
F
re
qu
ên
ci
a
ANF SAL
44
Figura 2: Freqüência de levantar de camundongos que receberam uma injeção
intraperitoneal de solução salina (SAL) ou de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg (ANF). Imediatamente após as respectivas injeções, os animais foram colocados no campo aberto e o seu comportamento de levantar foi quantificado durante 5 minutos, a partir do 15o minuto, a cada 30 minutos, por um período de 240 minutos.
A figura representa as médias + erro padrão. Teste T de Student para amostras independentes p<0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
A ANOVA de duas vias revelou efeitos significativos do fator tempo, do fator grupos e interação tempo x grupos
Teste T para amostras pareadas (em relação ao minuto 15): Grupo SAL – diminuição do levantar do minuto 45 ao minuto 255. Grupo ANF – aumento do levantar no minuto 75 e no minuto 105. Diferenças não representada nos gráficos
Levantar
0 10 20 30 40
15 45 75 105 135 165 195 225 255
F
re
q
u
ê
n
ci
a
ANF SAL
45
Figura 3: Duração da imobilidade de camundongos que receberam uma injeção
intraperitoneal de solução salina (SAL) ou de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg (ANF). Imediatamente após as respectivas injeções, os animais foram colocados no campo aberto e a sua imobilidade foi quantificada durante 5 minutos, a partir do 15o minuto, a
cada 30 minutos, por um período de 240 minutos. A figura representa as médias + erro padrão. Teste T de Student para amostras independentes. p<0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
A ANOVA de duas vias revelou efeitos significativos do fator tempo, do fator grupos e interação tempo x grupos.
Teste T para amostras pareadas (em relação ao minuto 15): Grupo SAL - aumento da imobilidade do minuto 45 ao minuto 255. Grupo ANF – aumento da imobilidade do minuto 195 ao minuto255. Diferenças não representada nos gráficos
Imobilidade
0 100 200 300 400
15 45 75 105 135 165 195 225 255
D
ura
çã
o
ANF SAL
46
4.2. Experimento 2. Conteúdo de dopamina e de DOPAC no estriado-accumbens após administração aguda de anfetamina.
Noventa e seis camundongos receberam injeção ip de salina (SAL) ou
anfetamina (ANF) na dose de 2,5 mg/kg. Após, 15, 30, 60, 120, 180 ou 240
minutos das injeções de ANF ou SAL, os animais foram submetidos à eutanásia
para a retirada dos dois estriado-accumbens de cada animal. Após processamento
do tecido, as amostras foram injetadas em HPLC acoplado a um detector
eletroquímico para a separação e análise do conteúdo de dopamina (DA) e seu
metabólito DOPAC. Foi utilizada uma amostra de 8 animais para cada tempo
indicado acima. Com base nessas quantificações foi calculado o TURNOVER da
dopamina através da relação DOPAC/DA.
Resultados:
Com relação ao conteúdo de DA (Figura 4), a ANOVA de duas vias não
revelou efeito do fator tempo, grupo, nem interação entre esses fatores.
No que se refere ao conteúdo de DOPAC (Figura 5), a ANOVA de duas vias
revelou efeitos significativos do fator tempo (minutos de observação) [F(5,84) =
3,67; p<0,05], do fator grupo [F(1,84) =6,7; p<0,057] e interação entre os fatores
tempo e grupo F(5,84) = 5,03; p<0,05].
O teste T para amostras mostrou que para o grupo SAL não houve
diferença significativa do conteúdo de DOPAC em todos os períodos analisados.
47
ao minuto 240, em relação ao minuto 15 [T(7) = 2,59; 3,84 e 4,09; p<0,05 para os
minutos 120, 180 1 240 respectivamente].
O teste T para amostras independentes revelou que o conteúdo de DOPAC
no estriado-accumbens apresentado pelos animais do grupo ANF foi
significativamente menor que aquele apresentado pelo grupo SAL até 60 minutos
após a administração da anfetamina [T(14) = 4,34; 4,06; 3,07; p<0,05 para os
minutos 15, 30 e 60, respectivamente]. Do minuto 120 ao minuto 240, os níveis de
DOPAC apresentados pelos camundongos do grupo ANF não apresentaram
diferenças significativas em relação àqueles dos animas do grupo SAL.
No que se refere à relação DOPAC/DA (Figura 6), a ANOVA de duas vias
revelou efeitos significativos do fator tempo (minutos de observação) [F(5,84) =
10,58; p<0,05], do fator grupo [F(1,84) = 8,66; p<0,05] e interação entre os fatores
tempo e grupos [F(5,84) = 14,23; p<0,05].
O teste T para amostras pareadas mostrou que para o grupo SAL não
houve diferença significativa na relação DOPAC/DA em todos os períodos
analisados. O grupo ANF apresentou diminuição na relação DOPAC/DA no minuto
30 [T(7) = 2,77; p<0,05] e a partir do minuto 120 ao minuto 240, houve um
aumento da relação DOPAC/DA em relação ao minuto 15 [T(7) = 4,38; 13,35 e
6,18; p<0,05 para os minutos 120, 180 e 240, respectivamente].
O teste T para amostras independentes revelou que a relação DOPAC/DA
apresentada pelos animais do grupo ANF foi significativamente menor que aquela
apresentada pelo grupo SAL até 60 minutos após a administração da anfetamina
48
Do minuto 120 ao minuto 240, a relação DOPAC/DA apresentada pelos
camundongos do grupo ANF não apresentou diferenças significativas em relação
49
Figura 4. Conteúdo de dopamina no estriado-accumbens de camundongos que
receberam uma injeção intraperitoneal de solução salina (SAL) ou de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg (ANF) e, 15, 30, 60, 120, 180 ou 240 minutos antes da eutanásia
A figura representa as médias + erro padrão.
A análise de variância de duas vias não revelou diferenças significativas para os fatores grupo, tempo ou interação entre os fatores grupo e tempo.
DA
0 20 40 60 80 100
15 30 60 90 120 150 180 210 240
p
m
o
l/m
g
t
e
c
id
o
SAL ANF
50
Figura 5: Conteúdo de DOPAC no estriado-accumbens de camundongos que
receberam uma injeção intraperitoneal de solução salina (SAL) ou de anfetamina na dose de 2,5 mg/kg (ANF) e, 15, 30, 60, 120, 180 ou 240 antes da eutanásia.
A figura representa as médias + erro padrão. Teste T de Student para amostras independentes p<0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
A ANOVA de duas vias revelou efeitos significativos do fator tempo e interação tempo x grupo
Teste T para amostras pareadas (em relação ao minuto 15): Grupo SAL – não apresentou diferenças significativas.
Grupo ANF – aumento de DOPAC do minuto 120 ao minuto 240. Diferenças não representadas nos gráficos
DOPAC
0 1 2 3 4 5
15 30 60 90 120 150 180 210 240
p
m
o
l/m
g
t
e
c
id
o
SAL ANF
