Interações agudas do chá de ayahuasca com agentes usados em anestesia (propofol e morfina), observadas em modelos animais

(1)

Júlia Movilla Pires

“INTERAÇÕES AGUDAS DO CHÁ DE AYAHUASCA COM

AGENTES USADOS EM ANESTESIA (PROPOFOL E MORFINA),

OBSERVADAS EM MODELOS ANIMAIS”

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências

(2)

Júlia Movilla Pires

“INTERAÇÕES AGUDAS DO CHÁ DE AYAHUASCA COM

AGENTES USADOS EM ANESTESIA (PROPOFOL E MORFINA),

OBSERVADAS EM MODELOS ANIMAIS”

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências

(3)

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Pires, Júlia Movilla

Interações agudas do chá de ayahuasca com agentes usados em anestesia (propofol e morfina), observadas em modelos animais/ Júlia Movilla Pires. – São Paulo, 2009.

xxiii, 87f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências.

Título em inglês: Acute interactions obtained from ayahuasca tea when in association with drugs used in anesthetic procedures (propofol and morphine), observed in animal models.

1. Ayahuasca. 2. Interações farmacológicas. 3. Morfina. 4. Propofol 5.

(4)

(5)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRURGIA/DISCIPLINA DE ANESTESIOLOGIA, DOR E MEDICINA INTENSIVA

Chefe do Departamento: Lydia Massako Ferreira

(6)

(7)

(8)

(9)

“A visão completa de Deus é a do intelecto unido ao sentimento, isto é, a do cientista que também sabe orar, e a do místico que também sabe pensar.”

(10)

AGRADECIMENTOS

Ao padrinho Prof. Eurípedes, apóstolo da bondade, pelos grandes amparos recebidos e fidelidade na amizade. Pelo grande exemplo de generosidade em vida, ensinando e auxiliando ao próximo incondicionalmente sem jamais desejar o engrandecimento de si mesmo.

Aos animais que mais uma vez serviram ao homem com seu sangue e suor, para que desfrutássemos de melhorias. Que Deus os abençoe!

A FAPESP pela bolsa ao aluno e financiamento do projeto. A AFIP pelo apoio financeiro.

Ao Laboratório Cristália pela doação das amostras de morfina e propofol.

Ao Prof Dr. Maurício Yonamine da Universidade Federal de São Paulo, pelo doseamento dos constituintes do chá de ayahuasca.

Ao Dr. Wilson Gonzaga que gentilmente cedeu a amostra de chá.

Ao Depto de Biofísica (INFAR) por permitir utilizar o laboratório para liofilização da amostra de chá.

Aos Professores e membros da banca: Prof. Dr. Reinaldo Takahashi, Prof. Dr. José Roberto Leite, Profa. Dra. Flávia Machado Ribeiro e suplente Prof. Dr. Luis Carlos Marques, pela participação e sugestões.

Aos colegas de grupo pelo convívio diário alegre e amistoso, especialmente à Juliana e Bruno que muito contribuíram no auxílio à experimentos. Também desejo agradecer aos colegas: Andréia, Melina, Eliane Baziloni e Perla Romanus pelos grandes auxílios em experimentos pesarosos.

Aos Professores e alunos do departamento: Dra Gina Negri, Dr. José Carlos Galduróz, Dra Eliana Rodrigues, Dr. Ricardo Tabach, Dra Solange Nappo, Dr. Joaquim Maurício Duarte-Almeida, Tharcila, Marna, Daniel, Graziella e Lyvia pela amizade, amparo e auxílio sempre prestados com muita boa vontade.

(11)

Aos funcionários do CEBRID: Hebert, Patrícia, Mara, Jane, Aline, Marlene, Elena e Clara, por resolverem todas as questões burocráticas, por serem prestativos e pelos sorrisos.

A secretária do Depto de Cirurgia, Solange Montosa da Silva, pelas gentilezas, pela simpatia e pela rapidez com que me prestou auxílio nos serviços burocráticos.

A todos os técnicos e bioteristas, em especial ao Cristiano Rezende e Tomé, pela bondade, dedicação, fidelidade e disciplina com que auxiliam, e ao Gilbertinho da Bioquímica que sempre sanou minhas dúvidas com prontidão.

Ao grupo de pessoas responsáveis pela limpeza e cozinha. Obrigada por cuidarem tão bem de nós!

A todos os funcionários da secretaria de pós-graduação, pelo bom humor e presteza no auxílio.

Ao Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida e Dra Mônica Levy Andersen, pela presteza, receptividade e simpatia.

A Cristina Jorge, “nossa” bibliotecária diligente.

(12)

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Ao amigo e professor Elisaldo Luiz de Araújo Carlini, pela oportunidade oferecida, por me tutelar e amparar. Muito obrigada por compartilhar comigo seus preciosos e ricos conhecimentos amealhados ao longo dos anos. Muito obrigada por se preocupar em ensinar aos jovens. Obrigada por ensinar o Brasil. O que é o NOBEL, senão o esforço extremo de nossas almas na busca do melhor em benefício do próximo. Tenha a certeza de que NOBEL verdadeiro, aquele que somente é oferecido por Deus, você já o conquistou.

Ao Prof. Dr. Fúlvio Rieli Mendes, pelo auxílio e ensinamentos prestados ao longo dos anos, traduzidos em imensos esforços, experimentos assistidos e aturadas correções...

(13)

Lista de abreviações:

 AYA – chá de ayahuasca

 DMT – dimetiltriptamina

 FDA – food and drug administration

 GABA – ácido gama amino butírico

 IMAO – inibidor ou inibidores da MAO

 ip – intraperitoneal

 MAO - monoaminoxidase

 ISRS – inibidores seletivos da recaptação de serotonina

 MAO – monoaminoxidase

 UDV – União do vegetal

 UTI – unidade de terapia intensiva

Unidades de medidas utilizadas:

 µL – microlitro

 g – grama ou gramas

 h – hora ou horas

 kg – kilograma

 mg – miligramas

 min – minutos

 mL – mililitro

 rpm – rotações por minuto

(14)

Lista de figuras:

Figura 1: cozimento do chá de ayahuasca...3

Figura 2: plantas componentes do chá de ayahuasca...4

Figura 3: estruturas químicas dos principais alcalóides encontrados no chá de ayahuasca...7

Figura 4: caixa de arame utilizada para observação dos sinais apresentados pelos animais no teste do “screening” farmacológico...20

Figura 5: aparelho de rota-rod...21

Figura 6: caixa utilizada para registro da atividade locomotora...22

Figura 7: posição de decúbito dorsal...23

Figura 8: aparelho da placa quente...27

Figura 9: contorção abdominal...28

Figura 10: efeito do propofol no teste do rota-rod...37

Figura 11: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol no teste do rota-rod...38

(15)

Figura 13: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina

no teste da atividade motora...41

Figura 14: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol

no teste do tempo de sono...44

Figura 15: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol

no teste do tempo de “grooming”...45

no teste da placa quente...47

Figura 17: efeito do propofol no teste da placa quente...48

Figura 18: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste de

indução de “writhes” após 30 min de tratamento com o chá...49

indução de “writhes” após 90 min de tratamento com o chá...50

indução de “writhes” com novas doses de chá e morfina...51

Figura 21: efeito do chá de ayahuasca no teste da formalina...52

no teste da formalina...53

(16)

Lista de tabelas:

Tabela 1: sumário de grupos utilizados e testes realizados...15

Tabela 2: resultados do doseamento do chá de ayahuasca realizado

pelo Departamento de Análises Toxicológicas da USP...33

Tabela 3: sumário de observações do “screening” farmacológico

do chá de ayahuasca...35

Tabela 4: medida do tempo de latência e do tempo de sono de camundongos

pré-tratados com chá de ayahuasca, induzidos por hexabarbital...42

(17)

RESUMO

(18)

(19)

SUMÁRIO

Dedicatória...vii

Agradecimentos...x

Lista de abreviações...xiii

Lista de figuras...xiv

Lista de tabelas...xvi

Resumo...xvii

1. INTRODUÇÃO...1

1.1 O uso da bebida ayahuasca no Brasil...1

1.2 Farmacologia da ayahuasca...5

1.3 Interações dos IMAO com outras substâncias...8

2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO...11

3. OBJETIVOS...13

4. MATERIAIS...14

4.1 Animais...14

4.2 Drogas e reagentes...14

4.3 Esquema de testes realizados...15

5. MÉTODOS...16

5.1 Preparo do liofilizado do chá de ayahuasca...16

5.2 Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca...16

5.2.1 Preparação das soluções padrão...16

5.2.2 Extração dos alcalóides da ayahuasca...16

(20)

5.3 Rendimento do chá de ayahuasca e definição das doses...18

5.4 Caracterização do liofilizado do chá...19

5.5 Teste do “screening” farmacológico do chá de ayahuasca...19

5.6 Teste do rota-rod...21

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente...21

Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente...21

Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol...21

5.7 Medida da atividade motora...22

Experimento 1: avaliação do efeito do chá isoladamente...22

Experimento 2: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina...22

5.8 Indução de sono por hexabarbital...23

Experimento 1: avaliação do tempo de sono após a associação do chá com hexabarbital...24

Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital 24h após administração do chá de ayahuasca...24

5.9 Avaliação do tempo de sono induzido pelo propofol...25

Experimento 1: indução de sono pelo propofol isoladamente...25

Experimento 2: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de sono induzido pelo propofol...25

(21)

5.11 Teste da placa quente...27

Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente...27

5.12 Indução de “writhes” por ácido acético...28

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente e associado com morfina...28

Experimento 2: avaliação do efeito da associação entre o chá de ayahuasca com morfina em doses subefetivas...29

Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina após 90 min de tratamento...29

5.13 Teste da formalina... 30

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente...30

5.14 Teste do trânsito intestinal...31

6. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS...30

7. RESULTADOS...33

7.1 Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca...33

7.2 Caracterização do liofilizado do chá...33

7.3 “Screening” farmacológico...34

Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...34

Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina...35

(22)

7.4 Teste do rota-rod...37 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...37 Experimento 2: efeito do propofol isoladamente...37 Experimento 3: efeito da associação do chá de ayahuasca

com propofol...38

7.5 Medida da atividade motora...39 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...39 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca com

morfina...40

7.6 Medida do tempo de sono induzido por hexabarbital... 42 Experimento 1: medida do tempo de sono após a associação

do chá de ayahuasca com hexabarbital...42 Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital

24h após administração do chá de ayahuasca...43

7.7 Medida do tempo de sono induzido pelo propofol...44 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo

de sono induzido pelo propofol...44

7.8 Teste do tempo de “grooming”...45 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de

“grooming” induzido pelo propofol...45

7.9 Teste da placa quente...46 Experimento 1: efeito da associação do chá de

(23)

7.10 Teste de contorções abdominais...49 Experimento 1: efeito da associação do chá de ayahuasca 1X e 10X

com morfina 1 mg/kg após 30 min de tratamento

com o chá de ayahuasca...49 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca 0,5X

com morfina 0,25 mg/kg após 30 min de tratamento

com o chá de ayahuasca...50 Experimento 3: efeito da associação do chá de ayahuasca 1X e 10X

com morfina 1 mg/kg após 90 min de tratamento

com o chá de ayahuasca...51

7.11 Teste da formalina...52 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...52 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca

com morfina...53

7.12 Teste do trânsito intestinal...54 Experimento1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente

e associado com morfina...54

8. DISCUSSÃO...55

9. CONCLUSÃO...69

10. ANEXO...70

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...72

(24)

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1 O uso da bebida ayahuasca no Brasil

A ayahuasca é um termo de origem Quechua1, utilizado para designar uma bebida com propriedades psicoativas, preparada através do cozimento de duas plantas (Figura 1), o cipó Banisteriopsis caapi (Spruce ex Griseb.) C.V. Morton (Malpighiaceae) e as folhas de Psychotria viridis (Ruiz & Pav.) (Rubiaceae) (Figura 2). No Brasil a B. caapi é conhecida popularmente por “mariri” e a P. viridis por “chacrona”, ou rainha. Quanto aos termos “Aya”, este quer dizer “pessoa morta, alma, espírito” e “waska” significa “corda, liana, cipó ou vinho”, portanto, traduzindo poderíamos dizer que significa “vinho da alma”, “vinho dos mortos”, ou “corda dos mortos” (Rivier & Lindgren, 1972). Esta bebida, segundo seus usuários, “libera a alma de seu confinamento corporal” (Schultes & Hofmann, 1993). É preparada na forma de chá, e também é conhecida popularmente como Caapi, Daime ou Hoasca (Brasil), Dapa, Kahi, Miki, Yage (Colômbia), Oasca, Vegetal, Natem (Equador) (Schultes & Hofmann, 1993; McKenna et al., 1984a; Riba et al., 2001). O preparo e o uso da ayahuasca são originários do conhecimento e das práticas ritualísticas de populações indígenas das bacias do rio Orinoco (Colômbia e Venezuela) e Amazonas (Bolívia, Brasil, Equador, e Peru). Para essa cultura, os efeitos psicoativos da bebida propiciavam aos seus usuários uma forma de comunicação com o mundo espiritual, auxiliando no diagnóstico e no tratamento de enfermidades, ou seja, uma beberagem utilizada com fins cerimoniais e medicinais (Rivier & Lindgren, 1972; Schultes & Hofmann, 1993; Riba et al., 2006).

(25)

Introdução

segundo grupo religioso, a União do Vegetal (UDV), que também passou a fazer uso da ayahuasca. Esses dois movimentos foram agregando um número cada vez maior de seguidores, e se disseminando por outros estados do Brasil. Esses movimentos passaram a ser chamados de religiões “ayahuasqueiras”, e também estão presentes nos Estados Unidos e Europa. O uso ritualizado da ayahuasca é legalmente aceito no Brasil, legitimado juridicamente desde 1987, segundo pareceres do Conselho Federal de Entorpecentes (CONFEN), (Mourão, 1995), sendo que atualmente existem mais de 10.000 filiados ao Centro União do Vegetal.

No Brasil desenvolveram-se religiões não indígenas que fazem uso da ayahuasca, e que estão se expandindo para Europa e América. Estas religiões reelaboraram as antigas tradições com influências do cristianismo, espiritismo Kardecista e religião afro-brasileira (Labate & Araújo, 2002). Cerca de uma vez por semana, ou uma vez a cada duas semanas os participantes se reúnem para a realização de um culto sagrado e ingerem cerca de um copo da bebida momentos antes do início. O ritual acontece em um ambiente rico em estímulos visuais e auditivos (musical) que, somados aos efeitos psicoativos do chá, propiciam uma “viagem espiritual” dirigida (Mac Rae, 1992).

(26)

Introdução

recaída do uso pelas mesmas, ou dependência pelo chá. Aqui podemos visualizar claramente a existência de um suporte religioso e social, além dos efeitos farmacológicos produzidos. Segundo trabalho de Doering-Silveira et al. (2005a), em estudo clínico conduzido com 84 adolescentes brasileiros, usuários e não usuários do chá, os adolescentes usuários ingeriram menos álcool (46,3%) do que em relação aos não-usuários (74,4%), em um período de um ano.

(27)

Introdução

Figura 2: plantas componentes do chá de ayahuasca: (A) Banisteriopsis caapi (cipó) e (B) Psychotria viridis (rainha). Fonte: Google.

(A)

(28)

Introdução

1.2 Farmacologia da ayahuasca

A principal espécie de cipó utilizado para preparar a bebida ayahuasca é a Banisteriopsis caapi, embora dependendo do local, outras espécies sejam adicionadas a essa bebida, como algumas da família das Solanáceas, tais como Nicotiana sp., Brugmansia sp., e Brunfelsia sp. A “rainha” normalmente é representada pela Psychotria viridis, ou por alguma planta do gênero Psychotria, mas também, dependendo do local, pode ser adicionada a

Diplopterys cabrerana (Malpighiaceae) que possui dimetiltriptamina (DMT)

como principal alcalóide (Riba, 2003).

Os principais componentes ativos do chá de ayahuasca (Figura 3) são: DMT (dimetiltriptamina) e os alcalóides da harmala: harmina, harmalina, tetrahidro-harmina, e em quantidades traços harmol e harmalol (Rivier & Lindgren, 1972; McKenna et al., 1984b; Callaway et al., 1999). No entanto, os principais efeitos da bebida são atribuídos ao sinergismo que ocorre entre os princípios ativos presentes nas duas plantas (Callaway et al., 1999; Ott, 1999).

A DMT presente nas folhas da P. viridis, é o principal componente alucinógeno do chá, sendo uma potente substância alucinógena quando fumada ou injetada. Quando ingerida por via oral é rapidamente inativada pela monoaminoxidase A (MAO-A) presente nos intestinos e fígado (McKenna et al., 1984b), o que é evitado com a associação das ß-carbolinas inibidoras da MAO (IMAO). O pico da concentração de DMT ocorre entre uma hora a duas horas após a ingestão do chá, gerando os efeitos visionários mais intensos (Callaway et al., 1999), enquanto que a experiência total do chá dura em média 4h (Grob et al., 2002). Os efeitos psicoativos da DMT são atribuídos a sua ação no sistema serotonérgico (Callaway et al., 1994; Strassman, 1996). De acordo com Smith et al. (1998) e Riba et al. (2001), sugere-se que a DMT funciona como um agonista para receptores 5-HT2A e 5-HT2C, semelhante à serotonina. O pico plasmático da DMT está associado com imagens coloridas e confusas, processos complexos de pensamento e estado geral de consciência aguçado (Simões et al., 2007).

(29)

Introdução

como agonistas serotonérgicos, pois segundo Grella et al. (2003), foi evidenciada a afinidade das β-carbolinas pelos receptores 5-HT2A e 5-HT2C.

A tetrahidro-harmina, embora inibindo fracamente a MAO de maneira não significante, pode contribuir com os efeitos psicoativos, impedindo a recaptação de serotonina nas plaquetas e em neurônios pré-sinápticos (Callaway et al., 1999).

As β-carbolinas, além de aumentarem os níveis de serotonina no

cérebro, aumentam também os níveis de dopamina (Cazenave, 2000; Costa et al., 2005). Por outro lado, quando administrados juntos (alcalóides da harmala e a DMT), ocorre o sinergismo. A harmina e a harmalina, ao inibirem a MAO-A intestinal, diminui a desaminação/oxidação (degradação) da DMT, aumentando assim a sua biodisponibilidade e, portanto, seus efeitos psicoativos.

Além dos efeitos psicoativos, a ayahuasca provoca efeitos purgativos (vômito e diarréia) que são considerados tônicos pelos usuários. Náuseas, vertigens, nervosismo, transpiração excessiva e tremor brando também podem ocorrer (Schultes & Hoffmann 1993; Callaway et al., 1999).

(30)

Introdução

Figura 3: estruturas químicas dos principais alcalóides encontrados no chá de ayahuasca: (A) dimetiltriptamina, (B) harmina, (C) harmalina e (D) tetrahidro-harmina.

(A)

(B)

(C)

(31)

Introdução

1.3 Interações dos IMAO com outras substâncias

Apesar do crescente uso da ayahuasca, ainda existem poucos estudos a respeito das possíveis interações de seus princípios ativos com outras substâncias (Callaway & Grob, 1998).

Alguns autores acreditam que ocorrem interações entre a ayahuasca e alimentos ou bebidas ricos em tiramina (queijos maduros e produtos com fermento concentrado). Isso representaria um fator de risco para os usuários da bebida, devido ao fato de que a tiramina é normalmente inativada pela MAO intestinal e hepática. Quando a MAO se encontra inibida, grandes quantidades de tiramina passam para a circulação sistêmica, alcançando as terminações nervosas simpáticas e promovendo a liberação de noradrenalina das fendas sinápticas, que já se encontra em quantidades maiores que o normal devido a inibição da MAO intraneural, gerando hipertensão e outros efeitos (Stahl, 2002). Contudo, MacKenna (2004) destaca que não há relatos descritos desta interação.

É importante ressaltar que pelo fato dos alcalóides da harmala (harmina e harmalina) serem IMAO-A, estes podem causar sérios riscos quando do uso simultâneo com determinados medicamentos, tais como a meperidina (Stockley, 2007), e com inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), cuja interação gera elevação da concentração de serotonina na fenda sináptica podendo promover a síndrome serotonérgica, que pode atingir gravidade considerável (Callaway & Grob, 1998). A síndrome serotonérgica caracteriza-se por apresentar inicialmente sintomas tais como euforia, náusea, confusão seguida de tremores, vômitos, convulsões, perda da consciência e possivelmente levar a morte, em casos extremos (Teixeira-Silva et al., 2006)

(32)

Introdução

Segundo Strassman & Qualls (1994) a DMT provoca aumento da pressão sanguínea, da frequência cardíaca, da temperatura; e midríase em humanos. Já em um estudo realizado com voluntários da UDV que fazem uso do chá de ayahuasca durante rituais, não foi registrada nenhuma evidência de toxicidade aguda ou após o uso repetido durante o contexto religioso (Grob et al., 2002).

O presente trabalho verificou se o tratamento prévio e agudo com o chá de ayahuasca interfere com os efeitos da morfina ou do propofol, agentes utilizados em processos cirúrgicos. Coller et al. (2009) apontam o envolvimento da isoenzima CYP2D6 no metabolismo da morfina. Entretanto, segundo Armstrong & Cozza (2003), a morfina é metabolizada e eliminada do organismo principalmente através de reações de conjugação com o ácido glicurônico, sem que haja uma grande participação do sistema P450.

Entre os medicamentos utilizados em anestesia, com comprovada interação com os IMAO, destaca-se a morfina, que tem seus efeitos depressores intensificados e grau de analgesia aumentado (Jenkins & Graves, 1965; Graig & Stitzel, 1994; Stockley, 2007). A administração de IMAO deve ser interrompida pelo menos 15 dias antes da administração de morfina (Graig & Stitzel, 1994).

Estudos da literatura relatam que existe risco de interações medicamentosas entre ISRS e IMAO, mas interações entre drogas serotonérgicas e alcalóides da harmala não tem sido relatadas (Callaway & Grob, 1998).

(33)

Introdução

(34)

Justificativa

2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

A interação entre drogas é bastante comum, podendo ocorrer devido a modificações da biodisponibilidade de uma droga na presença de uma segunda, ou por combinação do efeito das duas. É conhecido ainda o fato de alguns alimentos modificarem a absorção ou metabolismo de certos fármacos, como já foi relatado para o suco de “grape fruit” (Citrus paradisi), pomelo (Citrus grandis) (Kantola et al., 1998; Nowak, 2008), suco de maçã, laranja e romã (Kamath et al., 2005; Farkas et al., 2008; Saruwatari et al., 2008). Um dos parâmetros ainda pouco investigado é o risco de interação entre o chá de ayahuasca com outras drogas, como já foi descrito para alguns fitoterápicos, como o Hypericum perforatum (Roby et al., 2000), Ginkgo biloba (Fugh-Berman, 2000) que em geral interferem com o sistema enzimático P450.

As -carbolinas presentes no chá de ayahuasca, devido a sua ação inibidora sobre a MAO, interferem com a absorção e metabolização de substratos da MAO, como é o caso da DMT, também presente no chá. Não se conhece, entretanto, qual o efeito do chá sobre outras enzimas metabolizadoras, em especial as enzimas do sistema P450, as quais metabolizam um grande número de fármacos e também as β-carbolinas. Diante do crescente número de usuários do chá de ayahuasca, conhecer as possíveis interações entre o chá e fármacos empregados na clínica passa a ser cada vez mais importante.

(35)

Justificativa

A interação entre drogas com pequena margem de segurança, ou que são usadas em circunstâncias onde existe risco de vida para o paciente são especialmente críticas. Neste sentido, existe a necessidade de serem estabelecidos os parâmetros de segurança para o paciente que irá se submeter a uma cirurgia, que será tratado com analgésicos ou anestésicos, principalmente quando fez uso prévio deste chá. Uma vez que já se conhece o efeito inibidor dos alcalóides ß-carbolínicos do chá sobre a MAO; e visto a possibilidade de interação dos IMAO com a morfina, torna-se importante, portanto, verificar se o uso prévio do chá de ayahuasca poderá interferir com a morfina, e também com o propofol, anestésico muito utilizado em cirurgias.

(36)

Objetivos

3. OBJETIVOS

(37)

Materiais

4. MATERIAIS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos albinos da linhagem Suíça, adultos (3-4 meses), pesando entre 35-50 g. Os animais foram provenientes do biotério do Departamento de Psicobiologia, UNIFESP e mantidos em salas com controle de temperatura (23 ± 2°C) e ciclo claro/escuro de 12h com água e comida “ad libitum”. Ao término dos experimentos os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. No teste do trânsito intestinal os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de ética da UNIFESP (protocolo no 1494/06) seguindo as normas recomendadas pelo “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” de Geneva, 1985.

4.2 Drogas e reagentes

Ácido acético, bicarbonato de sódio, carvão vegetal, formaldeído, goma arábica (Labsynth), hexabarbital sódico (Sigma-Aldrich), propofol (Propovan®, ampolas doadas pelo Laboratório Cristália) e sulfato de morfina (Dimorf®, ampolas doadas pelo Laboratório Cristália). O hexabarbital foi dissolvido em solução de bicarbonato de sódio (pH 9) através de agitação (magnética), sonicação, aquecimento e resfriamento. Sempre que a solução precipitava, ela era novamente aquecida e esfriada para administrar aos animais.

O chá de ayahuasca foi gentilmente cedido pelo Dr. Wilson Gonzaga da Costa, médico psiquiatra presidente da Associação Beneficente Luz de Salomão e ex-integrante do Santo Daime, segundo o qual o chá foi produzido em Manaus. A concentração de DMT e -carbolinas no chá foi previamente quantificada (ver item 5.2).

(38)

Materiais

4.3 Esquema de testes realizados

O protocolo experimental consistiu inicialmente em avaliar o efeito do chá de ayahuasca isoladamente em diversos modelos experimentais e em seguida comparar os efeitos da morfina e propofol isoladamente e associados com o chá. Os testes onde foram investigados os efeitos da associação do chá com cada droga foram determinados em função dos efeitos esperados ou observados para cada uma das drogas isoladamente.

A Tabela 1 traz um sumário dos testes empregados e associações realizadas em cada um.

Tabela 1: sumário de grupos utilizados e testes realizados.

Teste Chá AYA + morfina AYA + propofol

“Screening” farmacológico X X X

Rota-rod X X

Atividade motora X X

Tempo de sono X X

“Grooming” X X

Placa quente X X

Indução de “writhes” X X

(39)

Metodologia

5. MÉTODOS

5.1 Preparo do liofilizado do chá de ayahuasca

O chá de ayahuasca foi concentrado com o auxílio de um rota-evaporador modelo FISATON, até o chá atingir um volume de cerca de 10% do volume inicial. Em seguida o concentrado foi colocado em frasco apropriado e congelado a –40ºC em banho de gelo seco e acetona, e colocado em um liofilizador, a -4 ATM de pressão por cerca de 48h para a obtenção do resíduo seco (liofilizado).

O liofilizado obtido foi armazenado em frasco âmbar, dentro de um dessecador em geladeira. Quantidades apropriadas foram pesadas e diluídas em água destilada, no momento dos testes.

5.2 Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca

As concentrações de DMT e alcalóides β-carbolinas (harmina, harmalina e tetrahidro-harmina) foram dosadas em colaboração com o Prof. Dr. Maurício Yonamine da Universidade de São Paulo (USP), conforme metodologia descrita abaixo (Pires et al. 2009a).

5.2.1 Preparação das soluções padrão

Soluções padrão (10 mg/mL) de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina, foram preparadas com metanol em um balão volumétrico. As concentrações injetadas no cromatógrafo gasoso foram de 1 mg/mL, as quais foram obtidas através da diluição da solução estoque.

5.2.2 Extração dos alcalóides da ayahuasca

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Metodologia

com metanol (2,0 mL). Foi injetado no cromatógrafo gasoso 1,0 µL desta solução. Os alcalóides extraídos foram identificados através da comparação de seus respectivos tempos de retenção com aqueles obtidos com os padrões analisados nas mesmas condições cromatográficas. A quantificação foi baseada sobre a integração da área do pico obtida com o padrão interno.

5.2.3 Análise usando cromatografia gasosa acoplada com a espectrometria de massas

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Metodologia

5.3 Rendimento do chá de ayahuasca e definição das doses

As doses do chá de ayahuasca utilizadas neste trabalho foram estabelecidas em função das doses consumidas pelo homem durante um ritual. De acordo com o Dr. Wilson, que forneceu o chá de ayahuasca, o volume ingerido nas sessões ritualísticas varia em função da concentração do chá. Além disso, cada seita ou cada pessoa ingere uma quantidade diferente de chá dependendo dos efeitos que pretende obter. Todo esse procedimento ocorre com a autorização do “mestre”, que é a pessoa que acompanha os rituais para orientação dos participantes.

Assim, utilizou-se para o cálculo da “dose unitária” o volume médio consumido durante um ritual, de aproximadamente 70 mL, de acordo com o volume apontado pelo Dr. Wilson (medido em um copinho plástico). Uma vez que a liofilização de 100 mL do chá de ayahuasca produziu um rendimento de 12g, verificou-se que o chá encontra-se na concentração de 0,12g/mL. Calcula-se, portanto, que em um copo de 70 mL há 8,4g de sólido, o que significa que um homem de 70 kg (peso médio) estará recebendo o equivalente a 120 mg/kg (8,4g/70 kg). Esta dose foi escolhida como a dose unitária do trabalho.

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Metodologia

5.4 Caracterização do liofilizado do chá

Foram analisados os seguintes parâmetros do chá liofilizado: cor, odor, sabor e pH. O pH foi determinado em pHmetro CORNIG 125, previamente calibrado com soluções tampão de fosfato pH 7 e biftalato pH 4, utilizando soluções do chá, nas concentrações de 0,12 g/mL e 1,2 g/mL.

5.5 Teste do “screening” farmacológico do chá de ayahuasca

Os camundongos foram distribuídos em grupos de cinco para cada uma das seguintes doses do extrato: 0,1X (12 mg/kg), 1X (120 mg/kg), 10X (1200 mg/kg) e 20X (2400 mg/kg) administradas por via oral (gavagem), além de um grupo controle que recebeu água. Para testar a administração por via intraperitoneal (ip), os animais foram distribuídos em grupos de três camundongos para cada uma das seguintes doses: 0,1X, 1X, 10X.

Numa segunda etapa, o mesmo experimento foi realizado avaliando os efeitos do propofol, ou morfina isolados ou em associação com o chá. O chá de ayahuasca 1X foi administrado 30 min antes do propofol 50 e 140 mg/kg (ip), ou morfina 10 e 20 mg/kg (ip) ou salina (ip).

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Metodologia

Este experimento serviu para estipular doses para os demais testes e traçar um perfil inicial da atividade da droga testada. Os sinais apresentados não foram quantificados numericamente, ou seja, foi realizada uma observação qualitativa e anotado o número de camundongos que apresentou o sinal observado.

Figura 4: gaiola de arame utilizada

para observação dos sinais

apresentados pelos animais no teste do “screening” farmacológico.

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Metodologia

5.6 Teste do rota-rod

Este teste consiste em avaliar a coordenação motora dos camundongos que são colocados sobre uma barra giratória a 12 rpm (rotações por min) aos tempos 0 (basal), 30, 60 e 120 min após a administração das drogas (Carlini & Burgos, 1979; Mendes et al., 2002)(Figura 5).

Realizou-se uma pré-seleção de camundongos nesse aparelho 24h antes do teste, separando para o estudo somente aqueles que conseguiram permanecer na barra por 60 seg em até 3 tentativas.

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente

Grupos de 10 animais receberam por via oral água (controle) ou chá de ayahuasca (1X e 10X) e foram avaliados conforme descrito anteriormente.

Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente

Grupos de 5 animais receberam por via ip propofol nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, e em seguida avaliados no aparelho de rota-rod.

Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol

O chá de ayahuasca (10X) foi administrado 30 min antes do propofol (50 e 100 mg/kg) ou salina (ambos via ip), e avaliados no aparelho de rota-rod, pelos mesmos tempos descritos em 5.6.

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Metodologia

5.7 Medida da atividade motora

O teste consiste em colocar os animais em caixas acrílicas individuais dotadas de células fotoelétricas (Figura 6). O número de interrupções dos feixes de luz foi registrado aos 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min, conforme descrito por Carlini (1972) e Mendes (2000), porém sendo a contagem não-cumulativa.

Experimento 1: avaliação do efeito do chá isoladamente

Grupos de 11-12 camundongos receberam por via oral água (grupo controle) ou o chá de ayahuasca 10X. Em seguida foram imediatamente colocados nas caixas de atividade motora e avaliados conforme descrito acima.

Experimento 2: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina

Grupos de 8 camundongos receberam por via oral água (grupo controle) ou o chá de ayahuasca (1X). Após 30 min receberam morfina (5 mg/kg) ou salina (ambas via ip), sendo imediatamente colocados nas caixas para avaliação.

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Metodologia

5.8 Indução de sono por hexabarbital

Este teste mede o efeito de drogas sobre o sono induzido pelo hexabarbital. Foi registrado o tempo entre a administração do barbitúrico e a perda do reflexo de endireitamento (início do estado hipnótico, ou latência de sono) e o tempo que o animal levava para recuperar o reflexo de endireitamento (tempo de sono). A perda do reflexo de endireitamento (Figura 7) é a incapacidade do animal voltar à posição normal quando colocado em decúbito dorsal. O critério para a recuperação deste reflexo foi fixado quando o animal por três vezes consecutivas saía da posição de decúbito dorsal imposta ao mesmo (Carlini et al., 1986; Mendes et al., 2002).

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Metodologia

Experimento 1: avaliação do tempo de sono após a associação do chá com hexabarbital

Grupos de 6 camundongos foram tratados por via oral com água (grupo controle) ou com o chá de ayahuasca (1 e 10X, oral). Trinta minutos após foram tratados com hexabarbital sódico 80 mg/kg (ip) e colocados novamente na caixa-moradia. Assim que iniciavam o sono os animais eram colocados em decúbito dorsal sob a bancada e o tempo total de sono registrado, conforme descrito anteriormente.

Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital 24h após administração do chá de ayahuasca

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Metodologia

5.9 Avaliação do tempo de sono induzido pelo propofol

Neste experimento, o propofol foi empregado como droga indutora de sono, usando o mesmo protocolo descrito para o hexabarbital (item 5.8).

Experimento 1: indução de sono pelo propofol isoladamente

Inicialmente foi realizado um experimento para escolha da dose de propofol. Foram testadas as seguintes doses (n=5): 100, 140, 175 e 200 mg/kg (ip), baseado em doses já descritas na literatura (Irifune et al., 2003; Anwar & Abdel-Rahman, 1998). As doses de 100 mg/kg e 200 mg/kg foram descartadas. A primeira porque dos 5 animais testados 3 não dormiram e a segunda porque provocou a morte de um animal (dados não mostrados). Portanto as doses escolhidas para teste foram de 140 e 175 mg/Kg.

Experimento 2: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de sono induzido pelo propofol

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Metodologia

5.10 Teste do tempo de “grooming”

Este teste foi realizado com a finalidade de verificar se o chá ou o anestésico em questão altera o tempo de “grooming”, uma vez que a administração do chá de ayahuasca diminuiu este comportamento no “screening” inicial com o chá. O “grooming” (auto-limpeza) é um comportamento normal do animal, caracterizado por movimentos de se lamber e revolver os pêlos do corpo e da cabeça com as patas.

Grupos de 5-6 camundongos cada receberam as drogas em questão, conforme descrito a seguir. A primeira administração foi realizada por via oral, e os animais receberam água ou AYA 10X. Em seguida foram colocados em cubas de acrílico e o tempo que o animal apresentou o comportamento de “grooming” foi registrado dos 0-60 min. Posteriormente o mesmo animal foi tratado por via ip com salina ou propofol 50 mg/kg e recolocado na cuba de acrílico para nova contagem do tempo de “grooming”, dos 61-120 min.

Houve, portanto quatro grupos experimentais. Cada grupo recebeu a 1ª administração (oral) ao 0 min e a 2ª (ip) aos 61 min. Abaixo estão descritos os grupos, e as respectivas drogas da 1ª administração e 2ª administração, respectivamente:

- grupo controle: água + salina - grupo chá: AYA 10X + salina

- grupo propofol: água + propofol 50 mg/kg

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Metodologia

5.11 Teste da placa quente

O possível efeito antinociceptivo central das drogas foi medido utilizando-se o procedimento da placa quente (Figura 8), colocando o camundongo sobre uma placa aquecida a uma temperatura constante de 55oC e verificando o tempo decorrido para que o animal apresentasse resposta característica ao estímulo doloroso que consiste em sapatear, lamber as patas (anteriores ou posteriores) ou dar pulos (Oliveira et al., 1970; Pires et al., 2009b). Os animais foram avaliados aos 0 (basal), 15, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min. Foi estabelecido um teto máximo de 30 seg de permanência na placa quente para evitar que danos ocorressem nas patas dos animais.

Os animais foram distribuídos em grupos de 7-10 camundongos cada e tratados por via oral com água (controle) ou ayahuasca (1 e 10X). Após 30 min foram tratados com morfina (10 mg/kg) ou salina (ip), em associação ou isoladamente e avaliados nos tempos descritos acima.

Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente

Os animais foram distribuídos em grupos de 5 camundongos cada e tratados por via ip com propofol isoladamente (12,5; 25 e 50 mg/kg), sendo em seguida avaliados conforme já descrito.

(51)

Metodologia

5.12 Indução de “writhes” por ácido acético

Este teste serve para medir um possível efeito antinociceptivo. Após administração das drogas, foi injetado ácido acético na concentração de 0,8% e o número de contorções abdominais (Figura 9) (contração do abdômen com distensão das patas anteriores ou posteriores) foi contado durante um período de 20 min (Contar & Carlini, 1987; Pires et al., 2009b).

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente e associado com morfina

Os animais foram distribuídos em grupos de 10 camundongos e tratados por via oral com água (controle) ou ayahuasca (1 e 10X). Após 30 min foi administrado morfina 1mg/kg ou salina (ambas via ip). Após um novo intervalo de 30 min, ácido acético 0,8% foi injetado por via ip e o número de contorções registrado imediatamente, conforme descrito anteriormente.

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Metodologia

Experimento 2: avaliação do efeito da associação entre chá de ayahuasca com morfina em doses subefetivas

Este teste foi realizado com a finalidade de verificar a ocorrência de uma possível interação em doses inativas isoladamente, uma vez que tanto o chá, na dose de 10 mg/kg, como o grupo morfina (1mg/kg) apresentaram uma diminuição considerável do número de contorções.

Os animais foram distribuídos em grupos de 10-11 camundongos e tratados por via oral com água (controle) ou chá de ayahuasca 0,5X. Após 30 min foi administrado morfina 0,25 mg/kg ou salina (ambas via ip). Após um novo intervalo de 30 min ácido acético 0,8% foi injetado por via ip e o número de contorções registrado imediatamente, conforme descrito em 5.12.

Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina após 90 min de tratamento

Ainda com a finalidade de verificar a ocorrência de uma possível resposta comportamental referente a esta interação, foi repetido um terceiro experimento, modificando o tempo de avaliação. Este experimento foi planejado uma vez que testes anteriores indicaram que o chá teria um efeito bifásico, observado no teste da atividade motora, no qual os animais tratados com o chá + morfina (item 5.7) apresentaram efeito da interação após 90 min do tratamento com morfina. Portanto, pretendia-se verificar se a interação do chá com a morfina no teste de contorções abdominais dependeria do tempo de administração das drogas.

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Metodologia

5.13 Teste da formalina

Este teste serve para avaliar tanto a dor neurogênica, como a resposta inflamatória.

O teste consistiu em injetar os animais já previamente tratados com as respectivas drogas com 20 µL de formalina a 2,5% na pata direita traseira (subplantar). Em seguida os animais foram observados durante 30 min e foi medido o tempo gasto lambendo a pata, que foi dividido em duas fases. A primeira fase constava da medida dos 0-5 min que representa a resposta neurogênica, e a segunda dos 15-30 min após a injeção de formalina, que mede a resposta inflamatória (Beirith et al., 1999; Pires et al., 2009b).

Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente

Este primeiro experimento foi realizado com a finalidade de verificar a ação do chá de ayahuasca em diferentes doses no teste da formalina, e para tanto foi utilizada uma dose efetiva de morfina como referência.

Foram utilizados grupos de 5-7 camundongos, tratados por via oral com água (controle), chá (0,1X, 1 e 10X), ou por via ip com morfina (1mg/kg). Após 30 min os animais foram injetados com formalina (subplantar) e logo em seguida avaliados, conforme descrito anteriormente.

Com a finalidade de continuar as investigações, para o teste seguinte foi escolhida uma dose subefetiva de morfina (1mg/kg), que não apresentasse diferença estatisticamente significante em nenhuma das fases observadas, mas que apresentasse uma tendência em diminuir o tempo de lambidas na pata (dose escolhida baseada em ensaios anteriores).

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Metodologia

5.14 Teste do trânsito intestinal

A propriedade de reduzir o trânsito intestinal de roedores é típica de drogas opiáceas, e deve-se a ativação de receptores da musculatura intestinal.

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Análise estatística

6. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS

Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, levando-se em consideração o número de grupos experimentais e o tipo de medida (intervalar, nominal ou ordinal).