PATOLOGIA EM LARVAS DE Ascia monuste monuste INFECTADAS POR Bacillus thuringiensis VAR. kurstaki. I. SINTOMATOLOGIA EXTERNA Ε INTERNA.
RonchiTeles, B. (*) Habib, Μ. Ε. M. (**)
RESUMO
pfizò zntz iytabatho ^ofum zòtudadoò os btntomab zxtzn.noò ζ tntzinoi pfiz-moKtaJj> zm taaantaj, dz AòcÂa monaòtz monu&tz infizctadaó com um produto {VÁjpoJL) a ba&ζ dz íteuUZ-luò thu/UnQÍ.znÂÍÁ VOA. kuAAtaki. (Soiotipo Η 3 a : 3 b ) . TaJj, òintomaò ião impontantzò nctò auaLiaçõzò dcu> doznçcu, dz tnòztoò no campo.
Pcuia oò ZAtudoò áa kcòtopatologta ^oiam anaLíbadoA ai, altzAacõzò oconxLdcLh no te-cido ζ cztixtaò do zpttztio tntZÁtinaí a nZvzí dz mi.ch.00copia, ótica ζ zZ.ztM.5ni.ca. Ίαΐλ at tznxiçõzò izòultam na moht.z daò tagaJttaò infizctadoA.
INTRODUΗΓO
Ascia monuste monuste (Linnaeus, I 76A) ι uma das pragas mais freq٧entes em planta ηγo de crucνferas, sendo de ampla distribuiηγo inclusive na regiγo de Manaus, AM. Conhe cida como curuquerκ da couve, esta'lagarta continua sendo combatida atravιs do uso de in seticidas quνmicos, provocando na maioria das vezes efeitos colateraisdesvantajosos. A contaminaηγo de alimentos, eliminaηγo de inimigos naturais das pragas alιm de problemas ecolσgicos, sγo conseq٧κncias freq٧entes devido ao uso inadequado de tais defensivos. Com isso tornarse necessαria a busca de alternativa de controle que sejam mais seguras e eficientes.
Esse pierνdeo mostrouse susceptνvel ao Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Ron_ chi, 1 9 8 5 ) .
Aspecto de sintomatologia externa e interna da bacterνose causada por esse bacilo em algumas espιcies de insetos, foram revelados por alguns autores como Heimpel & Angus ( I 9 5 9 ) em lagartas de Bombyx mori e Anagasta kuhniella, Steinhaus ( 1 9 6 3 ) em alguns 1epJ_
dopteros inclusive B. mori, Habib ( 1 9 6 8 ) em A. kuhniella, Habib S Fαvaro 0 9 8 1 ) em A. argillacea, Amaral ε Habib ( 1 9 8 1 ) em Anticarsia gemmatalis, Habib ( 1 9 8 2 ) em Alabama ar gillacea, BrassolΊs sophorae, Spodoptera latifascia, Plodia interpunctelIa, Culex decla rator. Simu li um goeldii e S. rorotaense, Amaral (1982) em A. gemmatalis Bert i F° & Gallo
(*) Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia · INPA, Manaus (AM). (**) Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Campinas (SP).
()977) em Bras so)is astyra.
No presente trabalho, pretendese avaliar a sintomatologia externa, histopatologi^ e citopatologia em lagartas de A. monuste monuste infectadas por B. thuringiensis. Esta investigaηγo serα seguida por outra visando a determinaηγo da susceptibi1 idade deste piŁ rνdeo ao bacilo.
MATERIAL Ε MΙTODOS
A descriηγo da sintomatologia externa foi baseada em critιrios adaptados a partir de Steinhaus (1963), Habib (1968 e 1982) e Ronchi (1985).
Para a anαlise da ultraestrutura das cιlulas do epitιlio intestinal de lagartas infectadas com Bacillus thuringiensis, o seguinte procedimento foi realizado: lagartas com 16 horas de infecηγo, foram dissecadas sob 1upa (estereoscσpica, em soluηγo fisiolσ
gica, removido o intestino mιdio e imediatamente foi prιfixado numa soluηγo de glutaral deνdo 2,5Ύ em tampγo cacodilato de sσdio 0,1 Μ (7,2) por 2 horas γ 4°C. Apσs esse perνo do, o intestino foi lavado em tampγo gelado de cacodilato com 7,5¾ de sacaroseeapσs fi xado numa soluηγo de tetrσxido de σsmio 1Ύ, em tampγo cacodt lato com 2% de sacarose por 2 horas. Apσs nova lavagem, foi desidratado em acetona γ 30¾ e 50Ύ, durante 15 min em cada, e depois colocado em acetona 70Ύ, por um perνodo de aproximadamente 1216 horas. Apσs esse perνodo, o material foi trabalhado γ temperatura ambiente, sendo imerso em ace
tona 90¾ e 95¾ durante 15 min em cada banho e por ٥ltimo, foi em acetona 100Ύ por 3 ve zes, com duraηγo de 20 min cada.
Logo apσs a desidrataηγo, o intestino mιdio foi embebido na resina de inclusγo. Fl nalmente, o intestino jα incluνdo no molde foi para a estufa γ 60°C para polimerizaηγo, durante 7 2 horas.
Os cortes ultrafinos foram feitos em um ultramicrσtomo Reichert OM U3 com nava lha de vidro. Os cortes foram distendidos com clorofσrmio e colocados em telinhas de co bre e contrastadas por 30 min no escuro, em acetato de uranila e lavados em trκs frascos com αgua destilada. Em seguida foram contrastados em citrato de chumbo, durante 5 min e 1 avados novamente em 3 frascos com αgua destilada. Os cortes foram examinadose fotogra
fados no microscópio eletrônico de transmissγo ZEJSS modelo EM 10A.
Apenas os cortes semifinos foram montados em lβminas de vidro corados γ quente com azul de toluidina, examinados e fotografados em um fotomicroscσpio ZEISS, modelo Axνomat NDC.
RESULTADOS Ε DISCUSSΓO
Sintomatologia Externa
No presente trabalho, o primeiro sintoma tadas por ٧. thuringiensis var. kurstaki., apσs
geno, foi a perda do apetite. As lagartas param de se alimentar, indicando alguma dis funηγo no aparelho digestivo ocasionada pela aηγo da δ endotoxina produzida pelo bac_^ lo, que age direto nas cιlulas epiteliais do intestino.
Algumas horas apσs o tratamento, as lagartas entram numa fase de regurgitaηio e diarrιia. Com 12 horas de infecηγo o tegumento da lagarta comeηa a ficar opaco e a co
loraηγo adquire um aspecto escuro. Com 2k horas de tratamento as lagartas diminuνram bastante a movimentaηγo, apenas reagem com movimentos lentos da cabeηa em resposta a eŁ tνmulos de toque. Como as lagartas dessa espιcie nγo sofrem paralisia geral, elas podem ser colocadas no tipo II na classificaηγo de Heimpel & Angus (1959), em que as lagartas alιm de nγo sofrerem parilisia geral, a morte ι por septicemia ocasionada pela germina ηγo e multiplicaηγo da bactιria na cavidade do corpo. Neste tipo II, encontramse tam bιm outras espιcies como Brassolis sophorae (Habib et ai . , 1 9 8 6 ) , Alabama argil lacea (Ha_ bib, 1982) e Anticars ia gemmatalis (Amaral & Habib, 1 9 8 1 ; Amaral, 1 9 8 2 ) .
Com a paralizaηao do funcionamento do intestino, ocasionado pela aηγo da α endo toxina, a lagarta entra numa fase mortal, que ocorre entre 24 e 72 horas.
Apσs a morte, o corpo da lagarta, que estava semiflγcido, comeηa a secar, fican do com aparκncia de mumificado e o tegumento termina de escurecer, adquirindo a colora ηγo preta.
0 desenvolvimento dos diferentes sintomas variou no tempo, de acordo com a dosagem aplicada e a idade da lagarta.
A seq٧κncia desses sintomas coincide com descriηυes de outros pesquisadores como, Steinhaus, 1951; Tanada, 1953 e Habib, 1 9 8 2 , para outros lepidσpteros.
Histopatologia
A anαlise histopatolσgica do intestino mιdio de lagartas de 59 estαdio de A. mo-nuste 16 horas apσs a infecηγo por B. thuringiensis, foi realizada com uma dosagem equ_i_ valente a 266 Ul/g. As alteraηυes observadas atravιs de microscσpias σtica e eletrôni ca, mostraram ter alguma relaηγo com os sintomas patolσgicos externos, no quedizrespei to aos dist٥rbios que ocasionam a parada alimentar, tal parada, por exemplo, foi compro vada pela presenηa do tecido vegetal mal digerido misturado com a bactιria na luz intej^ tinal (Figura 1).
Fig. 1. Presenηa de tecido vegetal mal digerido, misturado com bactιrias, na luz do in testino mιdio de lagarta de A. monuste monuste, infectada por Bacillus thurin giensis. ( 1 1 2 0 x ) .
Fig. 2. Degeneraηγo das microvilosidades do intestino mιdio de A. monuste monuste com 16 horas de infecηγo com Bacillus thuringiensis var. kurstaki em cortes ultra finos. (2940 x ) .
As alteraηυes citolυgicas observadas no perνodo em que ocorrea infecηγo incluνram a degeneraηγo das microvilosidades n.as cιlulas epiteliais (Figura 2 ) . As membranas celu_ rares se apresentam formando espaηos vazios dando a impressγo de estarem sofrendo desi drataηγo. Em cιlulas sadias, isto ι, em lagartas nγo infectadas pelo bacilo, as micro vilosidades apresentamse intactas.
Esses dados coincidem com as observaηυes de Ebersold et al. (1977), quando citam a formaηγo dos espaηos intercelu1 ares e as alteraηυes ocorridas nas microvilosidades, em lagartas de Pieris brassicae.
As mitocυndrias na presenηa da toxina do bacilo, sofrem alteraηυes no tamanho, i_n cluindo hipertrofia, dissociaηγo e desintegraηγo das cristas, isto ι, o conte٥do ι dis solvido.
Traverls et al. (1976) mostraram que o efeito da endotoxina nas mitocôndrias, alιm de inibir a produηγo de ATP, tambιm estimula a obtenηγo e consumo de oxigκnio. A aηγo dessa toxina nas mitocυndrias resulta no aumento da taxa de respiraηγo celular ocasio nando maior absorηγo de glicose pelas cιlulas epiteliais do intestino mιdio.
Ebersold et al. ( 1 9 7 7 ) citam o desenvolvimento de vac٥olos no retνculo endoplasmα tico, que resulta da ruptura dos sνtios de conecηao da membrana, este fato nγo foi obser vado. Entretanto, maior vacuolizaηγo foi observada no prσprio citoplasma de epitιlio. Enquanto isso, as mitocυndrias Ho epitιlio intestinal nγo infectado apresentam as cris tas intactas.
Os n٥cleos das cιlulas ep teliais foram os ٥nicos que aparentemente nao se altera ram de uma forma drαstica sob a aηγo da endotoxina; somente uma exposiηγo prolongada em contato com a toxina induziria alguma contraηγo no material nuclear (Ebersold et al. , 1 9 7 7 ) . Entretanto, Habib (1968 e 1982) observou condensaηγo de cromatina em n٥cleos de
cιlulas epiteliais de Anagasta kuhniella e Alabama argillacea infectadas poe esta bactι^ ria.
resultando em contato direto entre o alimento e as cιlulas epiteliais (Figura 3 ) .
Essas observaηυes coincidem com as de Habib ( 1 9 8 2 ) , em larvas de A. argillacea in fectadas pelo mesmo sorotipo.
Fig. 3. Degeneraηγo da membrana peritσfica e vacuolizaηγo das cιlulas epiteliais do in testino mιdio de lagartas de A. monuste monuste com 16 horas de infecηγo por Bacillus thuringiensis var. kurstaki, Em microscσpio σtico. (800 x)
SUMMARY
ExX.iin.nal and inttn.nat ςijmptomt, weAe dutzctid In thz ptioAont htudy, among laAvae. oi
K&CAJCL monu&te. monu&te. in^zctud by BacitνuA thuhlng-ÍWÁÀA va/i. ku&òtahí (H: 3a-36).
It AJ> important to be ^amiLLofi with the. o.xtin.nat òymptomò o& t\ÚÁ bactextaZ d-Lòzaòz in oHÁtn. to nvatiatz. thz tfáicitncy o^ pioductò bahid on tkii pathogm.
AZteAationò dzte.cte.d among thz mid-gut epithelial coltí, wete oJUo doAcJúhoA.
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