UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio de Mesquita Filho”
Instituto de Geociências e Ciências Exatas
Câmpus de Rio Claro
MAKENLY TAFURT CARDONA
DETERMINAÇÃO IN SITU DE METILMERCÚRIO E MERCÚRIO (II)
EM SISTEMAS AQUÁTICOS NAS PROXIMIDADES DE REFINARIAS
DE PETRÓLEO, UTILIZANDO A TÉCNICA DIFUSÃO EM FILMES
FINOS POR GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO (DGT).
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Instituto de Geociências e Ciências
Exatas do Câmpus de Rio Claro, da
Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Geociência e Meio Ambiente.
Orientador: Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário
Rio Claro - SP
sistemas aquáticos nas proximidades de refinarias de petróleo, utilizando a técnica difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT) / Makenly Tafurt Cardona. - Rio Claro, 2015
77 f. : il., figs., gráfs., tabs., mapas
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Geociências e Ciências Exatas
Orientador: Amauri Antonio Menegário
1. Abastecimento de água. 2. Recurso hídrico. 3. S.cerevisiae. I. Título.
MAKENLY TAFURT CARDONA
DETERMINAÇÃO IN SITU DE METILMERCÚRIO E MERCÚRIO (II)
EM SISTEMAS AQUÁTICOS NAS PROXIMIDADES DE REFINARIAS
DE PETRÓLEO, UTILIZANDO A TÉCNICA DIFUSÃO EM FILMES
FINOS POR GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO (DGT).
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Instituto de Geociências e Ciências
Exatas do Câmpus de Rio Claro, da
Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Geociência e Meio Ambiente.
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário Orientador – CEA/UNESP - Rio Claro/SP
Prof. Dr. Carlos Alfredo Suarez CEA/UNESP - Rio Claro/SP
Prof. Dr. Marco Tadeu Grassi UFPR-Curitiba/PR
Conceito: Aprovada
Dedico este trabalho аоs meus amados pais, Meus irmãos е meus três preciosos sobrinhos, por serem sempre meu melhor presente e motivo de orgulho.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Ao Prof. Amauri pelo conhecimento compartilhado, todo tempo e paciência dispendidos a este trabalho, bem como a estrutura disponibilizada;
Ao Prof. Alfredo pelo acompanhamento no trabalho e dedicada atenção em todo o processo de construção do conhecimento aqui obtido.
Ao Prof. Marco Tadeu Grassi e ao Prof. Marcelo de Oliveira pelo aceite do convite para participação na banca e pelas sugestões que muito contribuíram para melhorar este trabalho.
Ao Grupo GEMB pela amizade, suporte e troca de ideias que me foi permitida ao longo desses anos.
Aos funcionários do CEA pelo apoio administrativo essencial para cumprimento em cada etapa deste processo.
A minha família, em especial minha irmã Yali, por ter tornado possível hoje eu estar aqui. Ao Welinton pela compreensão, apoio e carinho.
Aos meus amigos hoje aqui presentes e aos que não puderam estar por tornar esses dois anos muito mais prazerosos e confortáveis.
DETERMINAÇÃO IN SITU DE METILMERCÚRIO E MERCÚRIO (II) EM SISTEMAS AQUÁTICOS NAS PROXIMIDADES DE REFINARIAS DE PETRÓLEO, UTILIZANDO A TÉCNICA DE DIFUSÃO EM FILMES FINOS POR GRADIENTE DE
CONCENTRAÇÃO (DGT)
Resumo
Neste trabalho foi desenvolvido um método para determinação seletiva e in situ do metilmercúrio (MeHg) com o uso técnica da técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT- diffusive gradients in thin films) e, também usando a DGT, avaliou-se um método já desenvolvido (baseado no uso da membrana P81) para a determinação de mercúrio (II). Para amostragem da espécie MeHg foi usado um disco ligante baseado no uso da Saccharomyces cerevisiae (levedura) - 20% (m/v) - imobilizada em agarose 3%, o gel de poliacrilamida como meio difusivo (S + P) e o acetato de celulose como membrana filtrante. A membrana de troca catiônica P81 e o gel difusivo de agarose (P81 + A) foram usados na determinação de mercúrio (II).
Os dispositivos DGT montados com as três camadas foram imersos em soluções preparadas no laboratório com concentrações conhecidas de MeHg (e/ou Hg(II)).Determinou-se o coeficiente de difusão médio do MeHg (7,03 ± 0,77 x 10-6 cm2 s-1 a 23 ºC) na poliacrilamida. Posteriormente foram avaliados os principais parâmetros que afetam o desempenho da técnica: na faixa de pH 3,5 e 8,5 e força iônica (I), entre, 0,0005 mol L-1 a 0,1 mol L-1 NaCl. As recuperações obtidas de (84 - 98 %) e (84 - 105 %) do analito, no intervalo de pH e I estudadas, indicaram que o método pode ser utilizado em sistemas aquáticos que satisfaçam estas condições. Foram avaliadas também interferências devido à presença de alguns íons concomitantes. Os íons Mn, Cu, Zn, Fe(II) não afetaram a retenção do MeHg pelo ligante, com recuperações de (70 - 87 %). A retenção do ligante S. cerevisiae foi menos tolerável à presença de Pb e Cd com recuperações de (62 ± 5 %) e (54 ± 6 %). O método desenvolvido foi aplicado in situ no Rio Negro (Manaus-AM) no entorno da refinaria de petróleo Isaac Sabbá (Reman). Determinou-se as concentrações medias de MeHg e Hg (II) no local pela técnica DGT. Os resultados obtidos com a DGT foram (< 0,025 µgL-1) e (< 0,085 µgL-1), respectivamente.
Abstract
An in situ method for selective determination of methylmercury (MeHg) was developed in this work by using the diffusive gradients in thin films (DGT) technique. This method was used together with an already evaluated DGT method, based on the use of P81 cationic membrane as binder for determination of mercury (II). To determine MeHg species, it was used a binder disk of Saccharomyces cerevisiae (yeast) - 20% (w / v) - immobilized on agarose 3%, polyacrylamide diffusive layers (S + P) and acetate of cellulose as a filter membrane. The P81 cationic membrane and the diffusion agarose gel (P81 + A) were used for the determination of mercury (II).
The DGT devices assembled with the previously described layers were deployed in solutions prepared in laboratory, with known concentrations of MeHg (and / or Hg2+).The average MeHg diffusion coefficient obtained for polyacrylamide equals to 7.03 ± 0.77 x 10-6 cm2 s-1 at 23 °C. It was evaluated the main parameters that affect the technical performance: pH (3.5 - 8, 5) and ionic strength (I) (0.0005 mol L-1 to 0.1 mol L-1 NaCl). The analyte recoveries obtained for the pH range studied (84 - 98%) and I (84 - 105%) indicated that the method can be used in aquatic systems which meet these conditions. The effect of interference due to simultaneous presence of ions was also evaluated. Mn, Cu, Zn, Fe (II) did not affect the retention of MeHg by the binder (70 - 87% recoveries). However, the binder layer was less tolerable to presence of Pb and Cd, noticiable by lower recoveries of 62 ± 5% and 54 ± 6%, respectively.
The developed method was applied in situ in Rio Negro (Manaus-AM), nearby the oil refinery Isaac Sabbá (Reman). The average concentrations of MeHg and Hg (II) were determined and the results obtained by DGT on site were (< 0,025 µgL-1) and (< 0,085 µgL-1), respectively.
Lista de Figuras
Figura 01. Ciclo biogeoquímico de mercúrio. ... 19
Figura 02. Principais reações químicas do ciclo do Hg. ... 20
Figura 03. Fundamento teórico. ... 25
Figura 04. Esquema de um dispositivo DGT ... 27
Figura 05. Diagrama esquemático do sistema AFS para analise de mercúrio. ... 33
Figura 06. Mapa de localização do Rio Negro na Bacia do Rio Amazonas. ... 34
Figura 07. Preparo do agente ligante S.Cerevisiae ... 41
Figura 08. Disposição dos discos utilizados na montagem do DGT ... 42
Figura 09. a) solução em estabilização; b) Dispositivos DGTs a serem utilizados para imersão; ... 44
Figura 10. Soluções sintéticas de Hg(II)e MeHg para a analise de especiação. ... 47
Figura 11. Pontos de coleta ... 48
Figura 12. Ilustra os pontos de amostragem no Rio Negro ... 48
Figura 13. a) Montagem dos dispositivos DGT; b) Dispositivos DGT mais pesos; c) Imersão no Rio Negro-AM. ... 49
Figura 14. Procedimento adotado para coleta de amostras - a) Teor dissolvido; b) Teor total. ... 50
Figura 15. Procedimento de coleta ... 50
Figura 16. Massa acumulada em relação à concentração da solução de imersão versus o tempo. Soluções contendo 100 mg L - 1 MeHg em 0,05 mol L - 1 NaCl (pH 5-6 ). Temperatura 23 ° C. Imersões até 48 horas... 55
Figura 17. Massa acumulada em relação a concentração da solução de imersão versus o tempo. Soluções contendo 100 mg L - 1 MeHg em 0,05 mol L - 1 NaCl (pH 5-6 ). Temperatura 23 ° C. Imersões até 6 horas... 55
Figura 18. Efeito das diferentes forças iônicas testadas na capacidade de ligação da S. cerevisiae ... 58
Figura 19. Efeito dos diferentes pH testados na capacidade de ligação da S. cerevisiae. ... 59
Lista de Tabelas
Tabela 01. Propriedades físico- químicas do mercúrio. ... 14 Tabela 02. Classificação de compostos mercuriais. ... 15 Tabela 03. Compostos de mercúrio encontrados nos hidrocarbonetos e carvão
energético ... 18 Tabela 04. Parâmetros instrumentais para determinação de Hg. ... 51 Tabela 05. Resultados do teste de extração em fase sólida com o emprego da
membrana P81 na retenção do MeHg. ... 53 Tabela 06. Resultados do teste de extração em fase sólida com o emprego dos
discos de S. cerevisiae imobilizada em agarose na retenção do MeHg ... 54 Tabela 07. Coeficientes de Difusão (D) determinados nos diferentes experimentos
realizados no laboratório. ... 57 Tabela 08 Recuperação (µg L-1) dos analitos a partir de amostras sintéticas obtidos
com o método proposto. S + P = Agente ligante S. cerevisiae + gel difusivo poliacrilamida; S + A = Agente ligante S. cerevisiae + gel difusivo agarose. ... 62 Tabela 09. Resultado de análise de especiação de Hg (II) e MeHg em solução com
concentrações conhecidas. ... 63 Tabela 10. Parâmetros monitorados nos pontos de coleta e imersão dos dispotivos
DGT. ... 64 Tabela 11. Concentração In situ (µg L-1) de MeHg e Hg (II) (determinação por
técnica DGT), e concentração de mercúrio total y dissolvida em amostras
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 OBJETIVOS ... 13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13
3.1 Mercúrio ... 13
3.1.1 Fontes ... 16
3.1.2 Ciclo biogeoquímico do mercúrio ... 18
3.1.3 Metilmercúrio ... 21
3.1.4 Bioacumulação e Biomagnificação ... 22
3.1.5 Toxicidade do Metilmercúrio ... 23
3.2 Técnica de difusão em filmes finos por gradientes de concentração (DGT). 24 3.2.1 Especiação de mercúrio (II) e metilmercúrio pela DGT ... 27
3.3 Espectrometria de fluorescência atômica com geração de vapor frio (CV-AFS).. ... 31
3.4 Caracterização da área de estudo ... 34
3.4.1 Rio Negro-Bacia do Rio Negro, AM. ... 34
4 MATERIAL E MÉTODOS EMPREGADOS ... 36
4.1 Material ... 36
4.1.1 Soluções ... 37
4.2 Métodos ... 38
4.2.1 Princípios da Técnica DGT ... 38
4.2.2 Membrana filtrante ... 39
4.2.3 Géis difusivos ... 39
4.2.4 Agentes ligantes ... 40
4.2.6 Retenção de MeHgpela S.Cerevisiae. ... 42
4.2.7 Processo de eluição ... 43
4.2.8 Coeficiente de difusão ... 44
4.2.9 Efeito da força iônica na retenção de MeHg ... 45
4.2.10 Efeito do pH na retenção de MeHg ... 45
4.2.11 Interferência de metais na determinação de MeHg ... 45
4.2.12 Seletividade do ligante S. cerevisiae para MeHg e Hg(II) ... 46
4.2.13 Analise de especiação de MeHg e Hg(II) ... 46
4.3.1 Locais de Coleta ... 47
4.3.2 Imersão ... 48
4.4 Preparo das soluções e amostras para determinação por CV- AFS ... 50
4.5 Determinação de mercúrio e metilmercúrio empregando espectrometria de florescência atômica com geração de vapor frio (CV-AFS). ... 51
4.5.1 Condições de operação do CV-AFS ... 51
5 RESULTADOS E DICUSSÃO ... 52
5.1 Retenção MeHg – testes preliminares ... 52
5.2 Curvas de imersão e Coeficiente de difusão ... 54
5.3 Efeito da força iônica na retenção de MeHg ... 57
5.4 Efeito do pH na retenção na retenção de MeHg ... 58
5.5 Efeito da interferência de metais ... 59
5.6 Seletividade do ligante S. cerevisiae para MeHg e Hg(II). ... 60
5.7 Análise de especiação de MeHg e Hg (II) em amostras sintéticas. ... 62
5.8 Imersão in situ Rio Negro, sub-bacia do Rio Negro , AM. ... 63
6 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 66
1 INTRODUÇÃO
O Hg é um dos metais presentes no solo e na água, como um componente natural dos mesmos ou como resultado das atividades humanas, que podem causar graves impactos ambientais (GUTIERREZ; BUSCIO 2010). Assim, traços e ultra traços deste elemento podem ser encontrados em águas residuais provenientes de refinarias de petróleo, sendo também susceptíveis de serem fiscalizadas pelos órgãos reguladores para as emissões de mercúrio na atmosfera e em resíduos sólidos ou líquidos, como é feito com as usinas a carvão (WILHEM M., 2000). Outra fonte associada à produção comercial de mercúrio está intimamente ligada à indústria da mineração, que é a fonte primária de obtenção deste metal e representa cerca de 60 % do fornecimento (IGME, 2003).
A toxicidade do mercúrio depende de suas diferentes espécies químicas, como o metilmercúrio (a forma orgânica) que é extremamente tóxico, quando comparada com o Hg2+ (forma inorgânica mais comum no ambiente). Devido ao radical orgânico, o metilmercúrio (MeHg) pode entrar rapidamente na corrente sanguínea, causando danos irreparáveis ao sistema nervoso central. Se for acumulado no corpo humano, pode não só afetar o sistema nervoso, como também o sistema cardiovascular, trato digestivo e renal, especialmente em crianças (MORRISON, 2007). Além disso, estudos anteriores indicam a existência de mercúrio bioacumulado (especialmente na sua forma MeHg) nos organismos vivos e os efeitos adversos na trajetória do elemento na cadeia alimentar, chegando ao ser humano através da flora e fauna aquáticas, causando problemas na saúde das pessoas que vivem na região exposta (WEINBERG, 2010).
A análise de especiação de mercúrio em um ecossistema aquático torna-se um problema, devido aos níveis muito baixos, o que requer o uso de técnicas altamente sensíveis. Além disso, a determinação é dificultada por aspectos como a preservação e estabilidade das várias espécies durante a amostragem, armazenamento e análise (YU L. P. et al., 2003). Neste sentido, são necessárias
problemas de preservação e estabilidade das suas várias espécies (DAHLQVIST et al., 2010; GILLAN et al., 2012; WEIJIA et al., 2007).
A técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (Diffusive Gradients in thin Films - DGT) desenvolvida recentemente, em comparação com outras técnicas analíticas, apresenta uma série de vantagens, como: sua simplicidade; capacidade de amostragem in situ; pré-concentração das espécies de interesse; amostragem multielementar; e sua capacidade de fornecer concentrações médias no tempo, quando utilizado por longos períodos (dias e semanas) em amostras de concentração variável, além da independência das medidas realizadas com as variações do fluxo hídrico do sistema estudado, o qual permite seu emprego em qualquer sistema aquático, seja em rios, mares ou lagoas sem a necessidade de medidas adicionais (ZHANG, H. & DAVISON W., 1995; Manual Técnico de Informações DGT Research).
O petróleo bruto ou natural tem uma ampla matriz de compostos, entre eles hidrocarbonetos saturados e aromáticos. A concentração total de metais em óleos raramente excede 0,02-0,03% em peso. Cerca de 60 microelementos podem ser encontrados nesta matriz, dentre eles o mercúrio (Hg) (SOIN et al., 2010). O mercúrio e os compostos de mercúrio são componentes comuns do petróleo e produtos dele derivados. As concentrações de Hg no petróleo cru e gás natural variam entre 0,01 ng g-1 e 10 µg g-1, as quais são altamente dependentes da localização geológica (WILHEM M., 2000). Deste modo, as águas residuais de refinarias de petróleo podem conter uma vasta gama de poluentes orgânicos e metálicos, tais como óleo, graxas, fenóis, sulfetos, amoníaco, sólidos em suspensão, compostos de nitrogênio, metais pesados e os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (BROWN; DONELLY, 1984).
Neste projeto visou-se o desenvolvimento de um método empregando a técnica DGT para medida in situ das espécies de mercúrio (Hg2+ inorgânico e MeHg orgânico). Para aplicação do método, foram selecionados três pontos nas proximidades da refinaria de petróleo Isaac Sabbá (Reman) no percurso do Rio Negro na cidade de Manaus, no Estado do Amazonas.
2 OBJETIVOS
O presente trabalho teve como principal objetivo desenvolver um método para determinar in situ seletivamente as espécies de mercúrio orgânico (MeHg) e inorgânico (Hg (II)) em sistemas aquáticos usando a técnica DGT. Avaliar o desempenho do sistema DGT contendo o agente ligante S. cerevisiae e poliacrilamida (como agente difusivo) para retenção de MeHg. Também, avaliar o desempenho do método desenvolvido para especiação de mercúrio no entorno de refinarias de petróleo.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Mercúrio
concentrações inferiores a 0,5 mg L -1 (OMS,1993). Na Tabela 01 são apresentadas algumas de suas propriedades físicas e químicas.
Tabela 01. Propriedades físico- químicas do mercúrio. Propriedade
Cor/ forma Branca prata; líquido a temperatura ambiente e a 0°C
Odor Inodoro
Densidade 13 579 g/cm3 (25°C) Ponto de fusão -38,87 °C (234 K) Ponto de ebulição 356,72 °C(630 K)
Pressão de vapor
(25°C) 2x10-3 mmHg
Solubilidade em água
Insolúvel em água e em HCl diluído., HBr, HI, H2SO4 diluído.,
solúvel em HNO3 Solubilidade em
solventes orgânicos Solúvel em H2SO4 ; lipídicos.
Fonte: Agency (1999); Fabre e Truhaut (1971); Galvao e Corey (1987); Halbach (1987); Stokinger (1965), apud Azevedo (2003).
carbono (C). Desta forma, constitui o precursor ambiental das espécies de mercúrio que apresenta maior toxidade: as organometálicas (JACKSON, 1998; AZEVEDO, 2003).
Fatores como o pH, força iônica, potencial redox, concentrações de matéria orgânica dissolvida, oxigênio dissolvido, sulfatos e sólidos suspensos, são importantes que controlam a especiação do mercúrio em solução e contribuem para diferenciar ou tipificar o mercúrio no ambiente (GABRIEL e WILLIAMSON, 2004).
Em 2000, a União Internacional de Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemestry- IUPAC), recomendou a seguinte definição: “Especiação é o termo geralmente utilizado para representar a distribuição de um elemento entre as espécies químicas definidas num sistema” (TEMPLETON et al., 2000). As diferentes formas de um elemento químico e suas combinações são conhecidas como "espécies". As principais espécies de mercúrio são o mercúrio elementar (Hg0), e as formas inorgânicas (Hg2+) e orgânicas (MeHg) (AZEVEDO, 2003).
A Tabela 02 apresenta uma classificação dos compostos mercuriais, proposta por Lindqvist e colaboradores (1984).
Tabela 02. Classificação de compostos mercuriais.
Classificação Composto
Voláteis (Hg°); (CH3)2Hg
Espécies reativas particuladas solúveis
em água
Hg2+, HgX3-, HgX42- (em que X=OH-, Cl-, Br-), HgO em partículas aerossóis
e complexos de Hg2+ com ácidos orgânicos
Espécies não reativas
MeHg, CH3HgCl, CH3HgOH e outros organomercuriais, Hg(CN)2, HS e Hg2+
ligado ao enxofre em fragmentos de matéria húmica.
3.1.1 Fontes
O mercúrio é gerado no ambiente por processos naturais e antrópicos. As emissões naturais na atualidade são menores em comparação com as emissões antrópicas; em todo o mundo estima-se que durante o último século as emissões antrópicas triplicaram as concentrações de Hg na atmosfera e na superfície do oceano (MANSON et al.,1994).
As fontes naturais incluem atividade geotérmica, a evaporação das superfícies de terra e água, degradação de minerais, intemperismo natural de rochas, erupções vulcânicas e incêndios florestais, sendo responsáveis por cerca de 10 % da estimativa de 5.500-8.900 toneladas de mercúrio atualmente a ser emitidos e re-emitidos para a atmosfera a partir de todas as fontes. (UNEP, 2013).
O mercúrio pode ser encontrado em concentrações variáveis, em quase todos os ambientes geológicos. É encontrado em vários tipos de rochas, com mais frequência em calcário, arenito, serpentina, andesita, basalto, riolita, feldspato alcalino e quartzo e principalmente associado ao cinábrio como sulfeto de mercúrio. As regiões de alta concentração de mercúrio nas rochas superficiais são caracterizadas pela emissão de grandes quantidades de mercúrio para a atmosfera. Devido às elevadas temperaturas do manto da Terra, o mercúrio, em especial o elementar, é extremamente móvel e continuamente se difunde para a superfície por sua volatilidade. Em zonas de fratura geológicas profundas, estes processos são mais intensos. Existem os chamados cinturões geoquímicos de mercúrio, os quais na sua capa superior as concentrações de mercúrio excedem significativamente os valores médios. Em algumas partes dos cinturões, a acumulação de grandes quantidades de mercúrio levou à formação de depósitos exploráveis (Jonasson e Boyle, 1971; Bailey et al., 1973; Clayton, 1982 apud UNEP, 2002).
estimadas em cerca de 50% das emissões atmosféricas. Calcula-se também que o total de Hg emitido para o meio ambiente atinja cerca de 100 toneladas anuais, tendo diminuído significativamente nas últimas duas décadas (MMA, 2011).
As principais fontes de emissão ocorrem a través da queima de carvão, mineração, fundição e produção de ferro e metais não ferrosos, produção de cimento, mineração artesanal de pequena escala de ouro, resíduos de produtos de consumo em geral (baterias, tintas, interruptores elétricos e dispositivos eletrônicos, termômetros, medidores de pressão arterial, lâmpadas fluorescentes, pesticidas, fungicidas, medicamentos, cosméticos, amálgama dentária), na indústria do cloro e álcalis, onde a tecnologia de células de mercúrio pode ser utilizada na produção de cloro e de soda cáustica, também é usado como um catalisador na produção de cloreto de vinil monômero (VCM) a partir de acetileno, sobretudo na China. Novas fontes não incluídas nos inventários passados são as emissões provenientes da produção e emissão de alumínio primário, queima de gás natural e refino de petróleo (UNEP, 2013).
A concentração de Hg no petróleo é extremamente variável dependendo da origem, arcabouço geológico do depósito, idade do depósito, entre outros fatores. Várias espécies de mercúrio já foram identificadas no petróleo. A Tabela 03 apresenta a predominância relativa entre as espécies de mercúrio encontradas em combustíveis fósseis comparando os valores registrados para carvão energético, petróleo e gás natural. A espécie dominante de Hg no petróleo é mercúrio elementar, consequentemente, será concentrado nas frações mais leves, como a nafta. Essa informação é importante para prever a distribuição do mercúrio nas diversas etapas da cadeia de produção de combustíveis (MMA, 2013).
Tabela 03. Compostos de mercúrio encontrados nos hidrocarbonetos e carvão energético
Espécies Carvão Petróleo Gás natural Hg° Traços >90 % do total >90% do total
(CH3)2Hg Traços Traços Traços
HgCl2 10-50 % do total Traços Traços HgS >50 % do total Raro Em suspensão
HgO Traços Raro Raro
CH3HgCl - Raro Raro
Fonte: EPA (1998); Wilhelm (2000); Bloom (2002) apud MMA (2011).
3.1.2 Ciclo biogeoquímico do mercúrio
O ciclo biogeoquímico de mercúrio é caraterizado pelas várias rotas que este composto pode seguir no ambiente. De modo geral destaca-se sua liberação do solo e da água para atmosfera, seu transporte está seguido da deposição atmosférica na água e no solo. Quando em contato com o solo ou sedimento, pode ocorrer sorção do mercúrio na forma insolúvel seguida de metilação/desmetilação, reiteração deste na atmosfera ou bioacumulação na cadeia alimentar aquática (BISINOTI et al.,2004).
Figura 01. Ciclo biogeoquímico de mercúrio. Fonte: Modificado a partir de Souza (2000).
na forma insolúvel sulfeto de mercúrio (HgS), o que dificulta o processo de metilação com períodos de retenção mais longos (UNEP, 2005). Desta forma a liberação gradual do mercúrio pode-se estender por períodos mais longos com possíveis lançamentos para a superfície das águas.
Dependendo das condições ambientais como pH e salinidade, (aumentando a solubilidade, mobilidade e disponibilidade do mercúrio) e a presença do complexo íon mercúrio (II)- ácido húmico (Hg2+-AH) no solo, aumenta ou diminui a metilação do mercúrio (WASSERMAN., 2002 apud BISINOTI et al., 2004). Por outro lado, o mercúrio oxidado (Hg2+) pode complexar também com outros íons presentes, como o cloreto, e formar cloreto de mercúrio (II) (HgCl2), que depositará na água e no solo, podendo formar MeHg, ou se volatilizará e retornará para a atmosfera, na forma de mercúrio metálico, MeHg ou dimetilmercurio. Mais do que 85% do estoque total de mercúrio na biota de águas doces está na forma de MeHg, no entanto, nas águas este valor raramente ultrapassa 10% e, em sedimentos, varia de 0,1 a 1,5% do estoque total, (BISINOTI et al, 2004). Devido à sua baixa concentração no ambiente, o estudo deste composto é de grande importância pelos efeitos adversos que causa à saúde do homem. A Figura 02 ilustra as principais reações que podem ocorrer no ciclo do Hg no sedimento, água e atmosfera, com grande influência da ação de bactérias e da luz solar.
3.1.3 Metilmercúrio
O mercúrio inorgânico pode ser metilado, principalmente, por dois mecanismos:
Biótico, por microrganismos e fungos em condições aeróbias ou anaeróbias.
Químico ou abiótico.
Nos dois mecanismos, tem relevância, parâmetros como pH, potencial redox, temperatura, concentração de matéria orgânica, substância húmica e presença de íons (cloreto, nitrato, nitrito, sulfato, sulfeto) (AZEVEDO, 2003;. BISINOTI, 2004).
A formação do MeHg em condições bióticas ocorre por ação da coenzima metilcobalamina (conhecida como vitamina B12) sobre o Hg (II). Produzida por bactérias metanogênicas, tanto aeróbias quanto anaeróbias, em ambientes moderadamente redutores, sendo capaz de transferir o grupo metila para o íon Hg2+ como um íon carbânio e um radical metila para produzir MeHg estável em condições neutras e ácidas e o dimetilmercúrio ((CH3)2Hg) em condições básicas, (Balde, 1997; D´itri, 1990; Manahan, 1975 apud Azevedo, 2003). (Equações 1 e 2).
CH3 – B12 + Hg2+ + H2O → MeHg + H2O – B12 (1)
CH3 – B12 + MeHg → (CH3)2Hg + H2O – B12 (2)
A taxa de síntese biológica do MeHg é determinada, principalmente pela concentração e forma química do Hg disponível no sistema aquático, ocorrendo especialmente na coluna de água nos oceanos, a pouca profundidade e em locais associados com partículas e sedimentos como lagoas, estuários, pântanos e brejos (FITZGERALD et al., 2014). Normalmente mediada por bactérias em ambientes parcialmente ácidos, com baixos valores de potencial redox e com alta concentração de material orgânico dissolvido (COD), predominando a metilação abiótica.
A metilação abiótica do mercúrio pode ser realizada de várias maneiras: por aumento de temperatura e presença de ácidos húmicos e fúlvicos doadores do grupo metila para o Hg (II), e, portanto, são uma fonte adicional na formação de MeHg. Por reação com a metilcobalamina não enzimática, em extratos livres de célula de bactéria anaeróbia, foi observada transferência não enzimática dos grupos metila da metilcobalamina para o Hg(II) e por reações de transmetilação por meio da radiação ultravioleta, envolvendo derivados metílicos de estanho, chumbo e compostos etílicos ((CH3)4 Pb) lançados no mesmo corpo de água. Em geral mecanismos abióticos em sedimentos formam uma quantidade menor de MeHg comparada com a metilação bioquímica sob condições similares (Queiroz, 1995 apud Azevedo, 2004).
3.1.4 Bioacumulação e Biomagnificação
Uma vez metilado, o Hg orgânico é rapidamente incorporado pela biota. Por apresentar um longo tempo de residência em organismos, aumenta sua concentração ao longo do tempo de exposição (bioacumulação) e, consequentemente, se incorpora na cadeia trófica. Cerca de 90 % do Hg presente nos organismos de nível trófico elevado encontra-se sob forma de MeHg.
por longos períodos antes de ser removidos por processos naturais, tornando-se um risco à saúde dos seres vivos (UNEP, 2013).
Aparentemente, quase o 100% do mercúrio é bioacumulado em peixes predadores na forma de MeHg, a maior parte deste se encontra nos tecidos dos peixes formando ligações covalentes com os grupos sulfidrilos das proteínas, resultando em uma vida media de eliminação longa (cerca de dois anos) (Wiener and Spry, 1996; apud Unep, 2005). Desta maneira, se gera um enriquecimento seletivo de MeHg, quando se passa de um nível trófico inferior a um superior.
Segundo Almeida et al., (2009) com base em dados da literatura sobre a distribuição de Hg em solos, águas, sedimentos, biota e os seres humanos que vivem na Bacia Amazônica, mostrou evidências de que a exposição humana à contaminação por mercúrio não está diretamente relacionada com a emissão de Hg para uma área específica, mas sim com os processos biogeoquímicos complexos ao nível do ecossistema controlando a mobilidade Hg e biodisponibilidade.
3.1.5 Toxicidade do Metilmercúrio
Verificou-se que certas regiões do cérebro são particularmente sensíveis aos efeitos tóxicos do MeHg, a saber, o córtex cerebral (especialmente o córtex visual) e a camada granulosa do cerebelo, causando mais danos ao desenvolvimento de embriões, os quais são cinco a dez vezes mais sensíveis que os adultos. (Goodman, L 1991; EPA,1997 apud Bisinotti, 2004).
Quando assimilado, 95% da dose oral é absorvido pelo intestino para a corrente sanguínea, necessitando cerca de 70 dias para que 50% da dose ingerida seja excretada. Desta forma, ocorre uma acumulação de MeHg, no organismo ao longo do tempo, mesmo com frequências relativamente baixas de exposição (MMA., 2012).
O Código Internacional de Doenças (CID) reconhece a ação tóxica do mercúrio. No Brasil, a Portaria do Ministério da Saúde (MS) n°1399/GM, de 18 de novembro de 1999, reconhece que o metal é prejudicial à saúde dos trabalhadores. O limite de tolerância, no Brasil, para exposição ocupacional (exceto as formas orgânicas) foi estabelecido no Anexo 11 da Norma Regulamentadora 15 (NR 15) da Portaria 3214, de 1978 de Ministério do Trabalho e Emprego (MTE): LT = 0,04 mg m -3 para jornadas de 48 horas semanais.
Segundo o Conselho Nacional de Meio Ambiente – CONAMA resolução 357 de 2004 dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências, nível máximo de mercúrio total 2 µg L-1 para rios pertencentes a classe 3 (Decreto Estadual n° 10755/77), porém, ainda não existe uma regulamentação para os compostos organomercuriais devido a dificuldade na sua determinação.
3.2 Técnica de difusão em filmes finos por gradientes de concentração (DGT).
da amostra se difunde através do gel de agarose ou poliacrilamida em direção ao material ligante, formando um gradiente de concentração. Na Figura 03 se ilustra graficamente a difusão molecular do analito.
Figura 03. Fundamento teórico. Fonte: Adaptado de ZHANG; DAVISON, 1995
O fluxo de íons metálicos (F) através do gel pode ser determinado de acordo com a equação 1.
g C C D
F ( b ')/ (Equação 1)
Sendo:
D = coeficiente de difusão do íon no interior do gel difusivo Cb = concentração da solução
C’ = concentração do analito livre na interface com o material ligante Δg = espessura do gel por onde há difusão do íon.
Se considerarmos que o equilíbrio entre os íons da solução/amostra e o material ligante é alcançado rapidamente e, se a ligação entre eles for intensa não ocorrendo saturação da fase ligante, a concentração C’ tenderá a zero e a Equação 1 poderá ser escrita da seguinte forma:
g DC
O fluxo dos analitos pode ser calculado também por equação de fluxo F=M(At)-1, onde M é a massa do analito, A é a área da janela do dispositivo e t o
tempo de imersão dos dispositivos, podemos combinar esta fórmula com a (Equação 2, expressando-se assim a massa M do analito em estudo como,
g tA DC
M b /
(Equação 3)
A determinação da massa M é possível depois do processo de eluição, seguido do analise para determinar a concentração Ce do íon na solução eluída. Considerando o volumem do ácido usado na eluição Ve, o volumem do disco Vr e o fator de eluição fe. A massa M do analito retida no dispositivo DGT é obtida conforme expressão 4 (ZHANG; DAVISON, 1995):
M= Ce.(Ve+Vr).fe-1 (Equação (Equação 4) 4)
Determinada a massa M num tempo de imersão determinado (t), podemos calcular a concentração Cb do analito na solução/amostra através da Equação 5.
DtA g M
Cb / (Equação 5)
Figura 04. Esquema de um dispositivo DGT. Fonte: Adaptado de ZHANG; DAVISON, 1995
3.2.1 Especiação de mercúrio (II) e metilmercúrio pela DGT
(0,0116 ± 0,0009 µg L−1) em comparação a Chelex-100 (0,0042 ± 0,0005 µg L−1). Os resultados obtidos por duas resinas ficaram muito abaixo dos valores medidos diretamente no rio (0,088 ± 0,012 µg L−1). Essa diferença indica a seletividade dos dispositivos utilizados para íons inorgânicos e espécies lábeis, não sendo capaz de amostrar espécies orgânicas inertes e coloides (DOCEKALOVÁ E DIVIS, 2005). Resultados similares foram obtidos por Cattani e colaboradores (2008) na caracterização das espécies de mercúrio em solos através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (HPLC-ICP-MS), utilizando agarose como gel difusivo e testando as resinas Chelex-100 e Spheron-Thiol como possíveis ligantes. Os estudos demonstraram recuperações melhores para a Spheron-Thiol (83-97%) em relação a Chelex-100 (50-58%). A utilização da técnica de HPLC-ICP-MS demonstrou boa separação e sensibilidade para as espécies investigadas (Hg2+, CH3Hg+ e CH3CH2Hg+).
Estudos posteriores mostraram o emprego da técnica DGT para quantificação simultânea de MeHg e Hg (II) utilizando também agarose como camada difusiva e a resina 3-mercapto-propil-sílica gel como agente ligante (3MFSG, Sigma Aldrich). As espécies de Hg foram extraídas com solução ácida de tioureia para formar complexos estáveis de Hg, posteriormente separados e detectados por cromatografia iônica e espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (IC-ICP-MS), respectivamente (HONG, Y. S. et al., 2011).
Hg (II) com o gel ligante (3-mercapto-propil-sílica gel), já que não foi observada competição da poliacrilamida com a acumulação de Hg(II) pela resina, uma vez que a massa de Hg(II) medida depois de uma implantação de 32 horas foi de 0,07 ng correspondendo a 540 ng L-1 no disco, inferior à concentração presente na solução. Assim, confirmou-se que o gel difusivo de poliacrilamida, além de não ter afinidade por MeHg demostrado por Clarisse et al.,(2006), não tem afinidade específica por Hg inorgânico. Por conseguinte, este gel é considerado adequado para ser usado como uma camada difusiva na técnica DGT para medir ambas as espécies de Hg orgânicos e inorgânicos.
Para avaliar a labilidade de MeHg em presença e ausência de matéria orgânica dissolvida (MOD), foram utilizados os dispositivos DGT com o agente ligante (3-mercapto-propil-sílica gel) , gel de agarose (A-DGT, 0,5 mm de espessura) e de poliacrilamida (P-DGT, 0,4 mm de espessura) como géis difusivos. Os resultados mostraram que a poliacrilamida em águas com e sem MOD, foi mais apropriada para a medida de MeHg, já que o complexo MeHg-MOD torna-se mais lábil sendo dissociado com maior facilidade em águas eutrofizadas, ao monitorar concentrações muito baixas (FERNANDEZ-GOMEZ et al., 2014).
Pelcova et al. (2014) testaram as resinas de troca iônica Ambersep GT74 e Duolite GT73, como agentes ligantes junto ao gel difusivo agarose para a determinação de quatro espécies de mercúrio (Hg2+, MeHg, C2H5Hg+, C6H5Hg+). A acumulação das espécies de mercúrio era independente na faixa de pH 4-8 para ambos géis. Em condições fortemente ácidas, foi observado maior capacidade de acumulação para a resina Ambersep; em condições fortemente alcalinas, a resina Duolite tinha maior capacidade de retenção. No entanto, agentes com grupos tiol, como Spheron-tiol e Duolite GT73, capazes de amostrar mercúrio total dissolvido, já não se encontram disponíveis comercialmente (PELCOVA P. et al., 2014).
2009; CLARISSE, O. et al. 2011; CLARISSE, O. et al. 2012) . No primeiro estudo, a técnica DGT foi usada com sucesso para monitorar o MeHg na fase dissolvida do lago 658 boreal estratificado, na Área experimental de lagos (ELA) em Ontário, Canadá. Os resultados mostraram que no epilímnio, o MeHg foi quase totalmente ligado a DOM. Na parte superior do hipolímnio foi identificada uma fracção lábil, e na parte inferior do lago uma fracção significativa de MeHg foi potencialmente associada ao material coloidal (CLARISSE, O et al 2009). Outro estudo foi realizado para medir a fração lábil de MeHg dissolvida na água intersticial em sedimentos na Baía de São Francisco. Os resultados foram positivos mostrando que a metilação de mercúrio, um processo biogeoquímico, afetou fortemente a quantidade de MeHg acumulado pelo dispositivo DGT no sedimento o que sugere que, as medições feitas por DGT têm o potencial para prever as taxas de metilação nestes sedimentos (CLARISSE, O. et al 2011). Também foram realizados estudos para testar o potencial do DGT na substituição do mexilhão Macoma balthica como bioindicador da bioacumulação de MeHg em ambientes marinhos. Usando isótopos enriquecidos MeHg como traçadores, a biodisponibilidade foi determinada pela comparação da taxa de absorção de MeHg por os dispositivos DGT e os organismo sentinelas ao longo do tempo. Os resultados demonstraram bons resultados demonstrando que o DGT é capaz de prever razoavelmente a absorção de MeHg pelo molusco, evidenciando a possibilidade da utilização do dispositivo como substituto para organismos sentinela (CLARISSE, O. et al 2012).
A maior parte dos trabalhos de análise de especiação de mercúrio é feita no laboratório após a amostragem in situ, usando outras técnicas analíticas como cromatografia liquida ou gasosa acoplada à espectrometria de fluorescência atômica (AFS). A cromatografia líquida possui limites de detecção mais altos se comparada com a gasosa, necessitando de métodos de pré-concentração para atingir baixos limites de detecção, por exemplo, extração em ponto nuvem (YU, L, 2005; LI, Y, 2005; LENG. G, 2012; STOICHEV, T, 2004). Ainda, os métodos propostos apresentem bons limites de detecção (na faixa de ng L-1), é importante o emprego da técnica DGT para fazer amostragem in situ.
celulose tratada com fosfato, potencialmente útil por ser um bom trocador catiônico (OLIVEIRA, W. et al.,2005; Li W. et al., 2002). Esta membrana, já foi utilizada com sucesso como agente ligante para a técnica DGT para determinação de Cu, Cd, Mn, Co, Ni, Zn e Pb (LARNER, B. L. et al., 2005). A P81 também foi empregada como agente ligante na técnica DGT para análise dos elementos nela retidos, por fluorescência de raios X (EDXRF) após uma simples secagem (ALMEIDA, E. et al., 2012). Esta membrana junto ao gel de agarose 1,5 % (m/v) foram usados com sucesso por Colaço e colaboradores (2014) na determinação de Hg (II) lábil em águas de rio, obtendo resultados positivos na recuperação do analito pela membrana com (97 %) de retenção, em comparação à tradicional resina Chelex 100 com (80 %) de retenção.
A levedura (S. cerevisiae) é um material de baixo custo, encontrado facilmente e em grandes quantidades na sua forma desidratada (MENEGÁRIO, A. et al., 2010). Seu uso já foi testado com sucesso anteriormente para a determinação seletiva de espécies de MeHg na presença Hg(II) (MADRID, Y. et al., 1995), assim como para separação e pré-concentração de vários metais (MAQUIEIRA, A. et al.,1994; BAG, H. et al., 2000; BISCARO, P. A. et al.,2007; MENEGÁRIO, A. et al., 2010). Estudos preliminares realizados nos laboratórios do Centro de Estudos Ambientais da UNESP - Rio Claro/SP utilizando S. cerevisiae imobilizada em agarose mostraram a potencialidade de sua utilização como agente ligante na técnica DGT para a determinação de Cd(II) e Pb(II) (MENEGÁRIO, A. et al., 2010; PESCIM, G. F. et al.,2012). Considerando a capacidade da S. cerevisiae para reter as espécies químicas descritas acima, pode-se considerar que o uso da S. cerevisiae imobilizada em agarose pode ser estendido para a determinação de outros metais, particularmente, para especiação do MeHg.
3.3 Espectrometria de fluorescência atômica com geração de vapor frio (CV-AFS).
ampla faixa de calibração linear (de µg L-1 a mg L-1), é considerado um dos detectores mais sensíveis para a determinação de mercúrio no ambiente, comparável à detecção com o ICP-MS, (BLOOM N.,1989; SANCHEZ R., 2010).
Para garantir que o mercúrio esteja em seu estado elementar é empregada a técnica analítica de geração química de vapor (ANDRADE, R., 2010), que consiste na transformação por meio de uma reação química da espécie de interesse em um composto volátil sem necessidade de uma chama, para seu posterior transporte para a célula de atomização (TAKASE, I. et al., 2002).
Figura 05. Diagrama esquemático do sistema AFS para analise de mercúrio. (Fonte: Adaptado SANCHEZ R., 2010).
A técnica de fluorescência atômica oferece grandes vantagens em termos de linearidade e níveis de detecção, o que tem melhorado em função da qualidade das lâmpadas empregadas como fontes da excitação (TAKASE, I. et al., 2002). A geração química de vapor, além da separação do analito da matriz, eficiência de introdução da amostra, aumento da seletividade pela redução de interferentes, obtenção de baixos limites de detecção, pode ser acoplada a diferentes técnicas, sendo elas: a espectrometria de absorção atômica (AAS), ICP OES, ICP-MS, (XP YAN.,1994).
Vários estudos de especiação de mercúrio pela AFS envolvem o acoplamento de cromatografia liquida ou gasosa (STOICHEV, T. et al., 2004 e TSENG, C. et al., 2004) sendo mais dispendioso, por precisar de métodos de pré-concentração para atingir baixos limites de detecção (YU, L, et al., 2005; LI, Y. et al., 2005; LENG, G. et al., 2012).
particularmente o mercúrio que é sensível a reações de troca, que pode causar perdas e contaminação (TORRES, D. et al., 2009).
3.4 Caracterização da área de estudo
3.4.1 Rio Negro-Bacia do Rio Negro, AM.
A Bacia do Rio Negro é constituída por diferentes tipos de rios, sendo classificados como rios de águas brancas, rios de águas claras e rios de águas pretas. A Figura 06 ilustra a localização do Rio Negro na bacia Amazônica.
Figura 06. Mapa de localização do Rio Negro na Bacia do Rio Amazonas.
minerais mais finas (argilas) juntamente com o material orgânico e formam solos arenosos (podzóis). Esse processo, chamado podzolização do solo, junto à drenagem dos solos ricos em solutos húmicos, provenientes da matéria orgânica em decomposição da floresta, favorecem a formação de águas pretas e o processo de liberação do mercúrio para os corpos hídrico. Além da cor, apresenta características físicas e químicas peculiares, entre elas, baixa condutividade (entre 6 e 12 µS cm-1), águas acidas com pH (entre 4,0 e 5,5), baixos teores de sais minerais, entre eles potássio, sódio, cálcio e magnésio, e alta concentração de matéria orgânica dissolvida (MOD) entre 600 – 900 µmol L-1 (LEENHEER e SANTOS, 1980; FADINI e JARDIM, 2001). Os solos amazônicos também têm sido sugeridos como reservatórios importantes de Hg (OLIVEIRA et al., 2001). A bacia do Rio Negro apresenta altos níveis de mercúrio no solo (170 µg kg -1) em comparação com o valor para regiões livres de anomalias 45 ± 3 µg kg -1, há indicações que a ocorrência de mercúrio nesta zona possui origem natural e têm sido creditados à mobilização do metal acumulado durante milhares de anos nos solos argilosos, antigos e profundos que predominam na região, através dos complexos orgânicos que são liberados pela lixiviação no solo. A mobilização do Hg se dá em suas diferentes formas, sendo que o processo de metilação do metal, mediado por bactérias, é amplamente favorecido nos diferentes compartimentos ambientais de floresta tropical úmida (GILMAR S. et al., 2009).
Bisinoti (2005) afirmou que a bacia do Rio Negro oferece ambientes ideais para a metilação e bioacumulação de mercúrio. Segundo a autora, as extensas áreas de solos hidromórficos na parte ocidental da bacia amazônica são habitats ricos em material orgânico, frequentemente anaeróbios e os prováveis locais de metilação.
diferentes toxicidades no ciclo biogeoquímico e os processos envolvidos de bioacumulação e biomagnificação do MeHg.
4 MATERIAL E MÉTODOS EMPREGADOS
4.1 Material
Foram utilizados os seguintes equipamentos e acessórios:
Espectrômetro de fluorescência atômica- AFS (PS Analytical modelo Millenium Merlin);
Espectrômetro de emissão óptica com fonte plasma acoplado indutivamente (ICP OES);
Vidrarias e acessórios de laboratório;
Equipamentos de uso rotineiro em laboratórios de química analítica, como medidores de pH, termômetro, agitadores e balanças analíticas.
Sistema de purificação de água Milli-Q resistividade 18,2 MΩ cm-1 (Millipore). Agitador magnético (Fisatom, modelo 752- Brasil).
Agitador orbital (Hoeter Pharmacia Biotech, modelo PR70 - Brasil). Balança analítica (Gehaka-Brasil).
Chapa de aquecimento (Tecnal, Te-018). Pipetas automáticas (Gilson-Francia).
Dispositivos DGT em polipropileno (pistão e anel), DGT (Research Lda -Lancaster, Reino Unido).
Câmara de difusão construída em acrílico, similar à proposta por Zhang e Davison (1999), construída no CEA.
Foram empregados os seguintes reagentes e produtos químicos.
Álcool metíico (Quimex - Brasil);
Bromato de potássio KBrO3 (Merck – Darmstadt, Germany); Brometo de potássio KBr (Merk - Darmstadt, Germany);
Cloridrato de Hidroxilamina NH2OH-HCl (Mallinckrodt – Paris, Kentucky); Cloreto de sódio NaCl (Synth - Brasil);
Cloreto Estanoso SnCl2 (Caledon – Georgetown, Canadá); Cloreto de Metilmercurio CH3HgCl (Aldrich);
Hidróxido de sódio NaOH (Merck - Darmstadt, Germany);
Membrana filtrante acetato de celulose (Sartorius Stedim Biotech Ltda);
Géis de agarose ( Amresco, Agarose RA -Biotechnology Grade) e, agarose poliacrilamida (DGT Research Ltd.);
Agentes e membranas trocadoras de cátions P81(Whatman, GE Lifesience); Saccharomyces cerevisiae obtida no comércio local (Brasil).
Materiais como vidrarias de laboratório, presilhas e dispositivos DGT em polipropileno (pistão e anel), previamente ao seu uso, passaram por um processo de descontaminação que consistiu em deixá-los imersos em uma solução de HNO3 20% (v/v) por um período de 4 horas. Após este tempo, os materiais foram lavados com água deionizada e logo com água purificada em sistema Mill-Q (Millipore) que confere alta resistividade, 18,2 MΩ.cm. Os ácidos empregados neste trabalho foram destilados abaixo do ponto de ebulição para maior pureza (Distillacid, Berghof).
4.1.1 Soluções
Os padrões de metilmercúrio (na faixa de 0,25 - 0,5 – 1,0 – 2,0 – 4,0 – 5,0 – 10,0 mol L-1), utilizados nas curvas analíticas foram preparados conforme procedimento descrito no manual PS Analytical (2002).
Soluções padrão certificadas: Mercúrio - Hg, manganês - Mn, cobre – Cu, Zinco-Zn, Ferro – Fe, Chumbo – Pb, Cadmio - Cd (Specsol, Brasil.
Para o preparo das soluções a serem analisadas no espectrômetro de fluorescência de atômica com geração de vapor frio CV- AFS. Adotou-se o procedimento descrito no manual do instrumento PS-Analytical (2009): HCl 33% (v/v), SnCl 2% (m/v), KBrO3 2N, KBr 2N, NH2OH-HCl 12% (m/v).
4.2 Métodos
4.2.1 Princípios da Técnica DGT
4.2.2 Membrana filtrante
Como membrana filtrante, nos dispositivos DGT, foram utilizados discos de acetato de celulose, 2,5 cm de diâmetro com uma porosidade de 0,45 µm e espessura entre 115-145 µm (Sartorius Stedim Biotech Ltda.). Estes discos foram imersos em solução ácida HNO3 1 mol L-1 por 24 horas para sua descontaminação, após este tempo foram lavados com água deionizada até atingir o pH entre 5,0-7,0. Posteriormente, foram armazenados em solução em NaCl 0,05 mol L-1, em recipiente fechado dentro da geladeira.
4.2.3 Géis difusivos
Agarose
Os géis de agarose (AMRESCO Agarose RA - Biotechology Grade -) foram preparados com composição de 1,5 % (m/v) mediante dissolução de 0,6 g de agarose em 40 mL de água ultrapura em ebulição. A agarose foi adicionada à água em ebulição em pequenas quantidades para obter uma solução mais uniforme sob agitação constante. Posteriormente, a mistura foi vertida entre duas placas de vidro pré-aquecidas com espaçador de plástico de 0,8 mm e deixada em repouso por uma 1 hora até a gelificacão completa. Após este tempo, o gel de agarose foi cortado em discos de 2,5 cm de diâmetro e, armazenados em solução com força iônica 0,05 mol L-1 NaNO3 por 24 horas antes da imersão.
Poliacrilamida
4.2.4 Agentes ligantes
Membrana P81
As membranas de troca iônica P81 comercialmente são disponíveis em forma de discos de 2,5 cm de diâmetro, espessura 0,23 mm e capacidade de troca iônica 18 µeq cm-2. Foram deixadas em imersão em solução de HNO3 1 mol L-1 por 24 horas para sua descontaminação, posteriormente lavadas para atingir pH entre 5,5 e 7,0 e preservadas em água ultrapura.
Preparação do gel ligante de S. cerevisiae imobilizada em agarose
Figura 07. Preparo do agente ligante S.Cerevisiae - a) dissolução; b) placa de vidro contendo S.Cerevisiae imobilizada em agarose; c) corte dos discos; d) preservação água Milli-Q.
4.2.5 Montagem dos dispositivos DGT
A Figura 08 mostra a sequência de montagem dos dispositivos DGT. Sobre o pistão de polipropileno foram colocados: o agente ligante (discos de agarose com a S. cerevisiae imobilizada), o gel difusivo (poliacrilamida) e a membrana filtrante (acetato de celulose), fixados com uma capa de polipropileno contendo uma janela de 20 mm de diâmetro.
Figura 08. a); c) disposição dos discos utilizados na montagem do DGT, S.Cerevisiae, Poliacrilamida, membrana filtrante.; b) materiais empregados; d) DGT montado.
4.2.6 Retenção de MeHgpela S.Cerevisiae.
4.2.7 Processo de eluição
Uma vez retirados os discos ligantes, foram dispostos em tubos de polipropileno de 15 mL, contendo 5 mL de HCl 1 mol L-1 e deixados sob agitação constante por 24 horas, ocorrendo assim a eluição dos íons retidos. Após este tempo, os discos de S. cerevisiae foram retirados da solução e os eluatos centrifugados por 10 minutos a 4000 rpm. Finalmente e posterior pre-tratamento acima descrito para determinação por CV-AFS, foi retirado 1 mL de cada tubo e transferido a tubos tipo falcon de 50 mL. Este procedimento foi também empregado para a recuperação dos íons retidos na membrana P81.
Uma vez obtidas às concentrações dos eluídos e conhecendo-se os volumes de eluente utilizados, pode-se calcular a massa eluída segundo a equação 6.
Me = (Ce). V (Equação 6)
Me= Massa dos eluídos. Ce= Concentração do eluído. V = Volume da solução de eluição.
Por outro lado, a massa de analito retida em cada um dos agentes testados pode ser calculada mediante o uso da equação 7.
Mr = (Ci-Cf). V (Equação 7)
Mr= Massa retida
Ci= Concentração inicial da solução de imersão Cf= Concentração final da solução de imersão V = Volume da solução de imersão
Segundo Zhang e Davison (1995), com os valores das massas retida (equação 7) e massa eluída (equação 6) é possível calcular o fator de eluição (fe), mediante a equação 8:
4.2.8 Coeficiente de difusão
Uma vez estudadas as capacidade de retenção de MeHg, dos ligantes P81 e
S. cerevisiae, prosseguiu-se ao teste para determinar o coeficiente de difusão do
analito. Para tal, foram preparados quatro litros de solução de 100 µg L-1 de MeHg, força Iônica 0,05 mol L-1 NaCl e pH 5,5 ajustado com HCl 2 % (v/v) e NaOH 0,1 mol L-1. Esta solução foi deixada dentro de uma incubadora a 23 ± 1 ºC por 24 h sob agitação constante, para garantir a estabilização do analito, uma vez que se observo uma perda constante nos testes contendo a solução de Hg (II), optou-se por estudar a perda o MeHg, observou-se perdas insignificativas com relação ao Hg (II).
Posteriormente, foram imersos na solução oito dispositivos DGT montados segundo item 4.2.5. e, dois dispositivos retirados após 4, 12, 24 e 48 horas respectivamente. Em sequência, os dispositivos foram desmontados e os discos de agente ligante submetidos ao processo de eluição descrito anteriormente. Do mesmo jeito, foram retiradas alíquotas da solução antes da imersão e para cada tempo de retirada dos dispositivos. Na Figura 09 apresentam-se de modo geral as etapas do processo de imersão.
4.2.9 Efeito da força iônica na retenção de MeHg
Com o objeto de analisar o efeito da força iônica na retenção da S. cerevisiae
quatro soluções de 1,5 L de MeHg 100 μg L-1 foram preparadas, cada recipiente com força iônica 0,0005 - 0,005 - 0,05 e 0,1 mol L-1 NaCl e, pH 5,0 - 6,0 ajustado com soluções de HCl 2% (v/v) e NaOH 0,1 mol L-1. Após a estabilização das soluções, foram imersos três dispositivos DGT em cada solução. Decorridas 6 horas, os dispositivos foram retirados, desmontados e os agentes ligantes submetidos ao processo de eluição, descrito no item 4.2.7.
4.2.10 Efeito do pH na retenção de MeHg
Para analisar o efeito do pH na retenção da S. cerevisiae, foram preparadas quatro soluções de 1,5 L de MeHg 100 μg L-1, pH 3,5 – 5,0 – 6,5 e 8,5, respectivamente, ajustados com soluções de HCl 2 % (v/v) e NaOH 0,1 mol L-1, força iônica 0,05 mol L-1 NaCl 2 mol L-1. Após a estabilização das soluções, foram imersos três dispositivos DGT em cada solução. Após 6 horas, os DGTs foram retirados, desmontados e os agentes ligantes submetidos ao processo de eluição.
4.2.11 Interferência de metais na determinação de MeHg
Foram avaliadas separadamente as potenciais interferências na retenção de MeHg conduzindo imersões do dispositivo desenvolvido (ligante S.cerevisiae, difusivo-poliacrilamida, e filtro-acetato de celulose) durante seis horas, em diferentes soluções preparadas no laboratório, contendo os seguintes metais: Manganês (Mn), Cobre (Cu), Zinco (Zn) e Ferro (Fe), Chumbo (Pb), e Cadmio (Cd).
ligantes continuaram o processo de eluição para posterior determinação no ICP OES. A determinação de MeHg foi feita por CV-AFS.
4.2.12 Seletividade do ligante S. cerevisiae para MeHg e Hg(II)
Foi realizado um teste para avaliar a seletividade do ligante S. cerevisiae pelo Hg(II) e MeHg , em presencia de agarose e poliacrilamida como géis difusivos, com o objetivo de observar o retenção do ligante por cada analito.
Foram preparadas três soluções de 3 L cada: Hg (II) (30 µg L-1 de Hg (II)), MeHg (30 µg L-1 de MeHg) e Mistura (30 µg L-1 de Hg(II) +30 µg L-1 de MeHg). As soluções foram mantidas em incubadora a 23 ºC. O pH (5,5) e a força Iônica (0,05 mol L-1 NaNO3). As soluções ficaram estabilizando dentro da incubadora por 24 h, após este período, foram imersos três dispositivos DGT montados com S. cerevisiae + poliacrilamida (S + P) e três com P81 + agarose (P81 + A) em cada uma das soluções. Para as duas montagens foram usados os discos de acetato de celulose como membrana filtrante. Os dispositivos ficaram imersos por um período de 6 horas. Após este período os dispositivos foram retirados, desmontados e os ligantes seguiram para o procedimento de eluição, descrito no item 4.2.7.
4.2.13 Analise de especiação de MeHg e Hg(II)
descartados o gel e membrana filtro; os agentes ligantes foram submetidos ao processo de eluição e posteriormente estas soluções foram centrifugadas, para posterior tratamento e leitura por CV-AFS. Para determinar a concentração da solução de imersão, retiraram-se alíquotas antes e depois da imersão dos dispositivos. A Figura 10 ilustra as soluções sintéticas de imersão dentro da incubadora para controle da temperatura.
Figura 10. Sluções sintéticas de Hg(II) e MeHg para a analise de especiação.
4.3 Procedimento de imersão in situ Rio Negro, sub-bacia do Rio Negro, AM. 4.3.1 Locais de Coleta
Figura 11. Pontos de coleta- a) Ponto 1-montante; b) Ponto 2-efluente; c) Ponto 3-jusante.
Figura 12. Ilustra os pontos de amostragem no Rio Negro. (Fonte: Google Earth, data da imagem 6/23/2014).
4.3.2 Imersão
período de 24h seis dispositivos DGT em cada ponto (Figura 13). Três contendo a membrana P81, gel de agarose 1,5 % e filtro, os três restantes com os discos de S. cerevisiae, agente difusivo poliacrilamida e membrana filtro de acetato de celulose. A condutividade elétrica, o pH e a temperatura foram medidos no momento da imersão e retirada dos dispositivos.
Figura 13. a) Montagem dos dispositivos DGT; b) Dispositivos DGT mais pesos; c) Imersão no Rio Negro-AM.
Em cada ponto foram coletados 50 mL de água para determinação de teor total e 50 mL para determinação do teor de sólidos dissolvidos de mercúrio. Para coletar as amostras de teor dissolvido usou-se seringa e filtros de acetato de celulose (Millipore, porosidade 0,45µm), previamente descontaminados. Cada amostra foi preservada em HCl 2 %. Na Figura 14 se ilustra o procedimento adotado para a coleta das amostras do teor dissolvido (Figura 14a), e teor total (Figura 14b). Também em cada ponto de amostragem, foi coletada água do rio usando garrafas de água mineral de politereftalato de etileno (PET) de 2 L, previamente esvaziadas e lavadas com água ultrapura no laboratório. No lugar da coleta, foram lavadas com água do rio, (Figura 15).
Figura 14. Procedimento adotado para coleta de amostras - a) Teor dissolvido; b) Teor total.
Figura 15. Procedimento de coleta
4.4 Preparo das soluções e amostras para determinação por CV- AFS
mL com água milli-Q. O objetivo deste procedimento é usar a mistura KBrO3 / KBr como pré-tratamento para transformar o MeHg em Hg(II) e na presença do redutor SnCl2 2% (m/v) a Hg0, a forma do Mercúrio determinada pela CV-AFS. As amostras coletadas em campo passaram pelo mesmo procedimento, a diferença que a diluição foi feita com a mesma amostra.
4.5 Determinação de mercúrio e metilmercúrio empregando espectrometria de florescência atômica com geração de vapor frio (CV-AFS).
4.5.1 Condições de operação do CV-AFS
As concentrações de Hg (II) foram determinadas quantitativamente usando a CV-AFS. Como gás de arrastre foi utilizado argônio. Todos os resultados obtidos foram baseados na altura de pico. Como redutor foi empregado SnCl2 2 % (m/v) e como carregador a solução branco contendo os reagentes descritos na Tabela 04. Na tabela 04 também são mostradas as condições operacionais do espectrômetro de fluorescência atômica.
Tabela 04. Parâmetros instrumentais para determinação de Hg.
Parâmetro Valor
SnCl2 2% (m/v)em HCl 33% (v/v)
Vazão do agente redutor 3,5 mL min-1
Branco: HCl 33%; KBrO3/KBr 0,1 N ;
NH2OH-HCl 12% (m/v) Vazão do branco 7,0 mL min-1 Gás de arraste-Argônio Vazão 250 mL min-1
Ganho 10
Delay time 15 s
Analysis time 30 s
Memory time 20 s
5 RESULTADOS E DICUSSÃO
A utilização da fluorescência atômica com geração de vapor frio, para detecção de Hg (II), permite a análise de baixas concentrações de Hg (II) (da ordem de ng L-1 a ng mL-1) com segurança, boa sensibilidade e baixo limite de detecção. Mediante a curva analítica no CV- AFS se obteve uma boa correlação concentrações/sinal do equipamento (R2= 0,999), com uma alta sensibilidade (9,85 uF/ng). Desta maneira, se obtiveram limites de detecção de 0,0044 ng mL-1, demonstrando alta sensibilidade da técnica.
Figura 16. Curva de calibração na CV-AFS.
5.1 Retenção MeHg – testes preliminares
(Li et al., (2002)). Diante do exposto e, considerado que o MeHg é um cátion em solução, foi realizado um teste para avaliar a retenção de MeHg pela membrana P81. Os resultados obtidos neste experimento, expostos na Tabela 05, indicaram uma baixa retenção (média de 6,75%) e baixo fator de eluição (média de 0,21) do analito, indicando que a membrana P81 não possui as características apropriadas para a retenção do MeHg.
Tabela 05. Resultados do teste de extração em fase sólida com o emprego da membrana P81 na retenção do MeHg.
Amostra Ci (ng/mL)
Cf Mr
% retido Ce Me Fe (ng/mL) (ng) (ng/mL) (ng)
1 69,91 67,01 145 4,15 2,48 49,7 0,34 2 70,98 68,78 110 3,12 1,88 37,7 0,34 3 82,86 78,04 241 5,82 1,12 22,4 0,09 4 84,85 73,02 592 13,9 1,46 29,2 0,05
Média 271,88 6,75 0,21
SD 220,16 4,92 0,16
Ci=Concentração inicial; Cf=Concentração final; Ce=Concentração do eluído; Mr=Massa retida; Me=Massa do eluído; Fe=Fator de eluição
estrutura terciária de L-glutamina: D-frutose-6- fosfato amidotransferase (GFAT) presente na S. cerevisiae, inibindo sua atividade enzimática, com o qual se explicaria a afinidade da levedura pelo MeHg e não pelo Hg(II).
Tabela 06. Resultados do teste de extração em fase sólida com o emprego dos discos de S. cerevisiae imobilizada em agarose na retenção do MeHg
Amostra Ci (ng/mL)
Cf (ng/mL)
Mr (ng)
% retido
Ce (ng/mL)
Me
(ng) Fe
1 73,98 9,004 3248,8 87,83 153,7 3842,5 1,183 2 87,84 7,265 4028,8 91,73 150,9 3772,5 0,936 3 96,09 5,578 4525,6 94,20 144,5 3612,5 0,798
Média 3934,4 91,25 0,927
SD 643,61 3,210 0,195
Ci=Concentração inicial; Cf=Concentração final; Ce=Concentração do eluído; Mr=Massa retida; Me=Massa do eluído; Fe=Fator de eluição
5.2 Curvas de imersão e Coeficiente de difusão
Figura 17. Massa acumulada em relação à concentração da solução de imersão versus o tempo. Soluções contendo 100 mg L - 1 MeHg em 0,05 mol L - 1 NaCl ( pH 5-6 ). Temperatura 23 ° C. Imersões até 48 horas.
