FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Análises Clínicas
Efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos
genes
HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1
em
indivíduos hipercolesterolêmicos
Simone Sorkin Arazi
Tese para obtenção do grau de DOUTOR Orientador:
Profa. Assoc. Rosario Dominguez Crespo Hirata
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Análises Clínicas
Efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos
genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1 em indivíduos
hipercolesterolêmicos
Simone Sorkin Arazi
Tese para obtenção do grau de DOUTOR Orientador:
Profa. Assoc. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Simone Sorkin Arazi
Efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos
genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1 em indivíduos
hipercolesterolêmicos
.
Comissão Julgadora
da
Tese para obtenção do grau de Doutor
Profa. Dra.
Rosario Dominguez Crespo Hirataorientador/presidente
____________________________
1
o. examinador
____________________________
2
o. examinador
____________________________
3
o. examinador
____________________________
4
o. examinador
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho...
A D´s
Aos meus pais, Lylian e Eduardo, pelo amor incondicional e apoio nos momentos difíceis. Obrigada pela educação, formação e motivação que me deram para sempre seguir em frente e nunca desistir dos meus objetivos. Amo muito vocês!
AGRADECIMENTOS
À Professora Rosario D.C. Hirata, minha orientadora, obrigada por todos estes anos de ensinamento, paciência e dedicação. Graças a você me tornei uma pessoa mais crítica e mais responsável. Muito obrigada!
Ao Professor Mario H. Hirata pelo apoio durante a vida acadêmica e pelos sábios conselhos nos diversos momentos em que precisei.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome de seu Diretor, Prof. Tit. Jorge Mancini Filho.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela bolsa e reserva técnica concedida (Proc. 04/11909-0) no período de dezembro de 2004 a setembro de 2008, que fizeram possível a realização deste trabalho e a participação em importantes reuniões cientificas.
Ao Departamento de Analises Clinicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome do seu Chefe, Profa. Tit. Ana Campa, pela oportunidade de concluir esta importante etapa da minha carreira acadêmica.
À Profa. Primavera Borelli, Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Farmácia- Área de Analises Clinicas, do Departamento de Analises Clinicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo
Ao Serviço de Endocrinologia e Metabologia do Hospital das Clínicas de São Paulo, em nome da Dra. Edna R. Nakandakare e Dra. Monica de Queiroz T.S. Neves pela seleção de pacientes e pelas importantes colocações na elaboração deste trabalho.
À Divisão de Clínica Médica do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, em nome do Dr. Egidio Lima Dorea e Dra. Marcia M.S. Bernik pela seleção de pacientes e dedicação durante todo o tempo de colaboração.
Ao Laboratório Clinico do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, em nome do seu chefe, Profa. Titular Marina Baquerizo Martinez pela coleta de amostras e análises bioquímicas de pacientes utilizados neste trabalho.
Ao Laboratório Alvaro, em nome de seu diretor, Dr. Alvaro Largura, pelas análises bioquímicas de pacientes utilizados neste trabalho.
Ao estatístico Fidel Beraldi, pela colaboração na análise dos dados.
À técnica do laboratório Cristina Moreno Fajardo, pelo apoio, ajuda e compreensão nos momentos difíceis.
Aos estagiários Nadia de Preto Godoy, Ângela Yoshie e Leonardo Aneas Barreto pela imensa ajuda e colaboração no projeto.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada ao Diagnostico do Departamento de Analises Clinicas e Toxicológicas da FCF-USP.
A minha querida e amada irmã, Dafna Sorkin Cohen, que mesmo longe sempre soube estar por perto e mostrar o seu apoio e amizade.
Ao querido Bernardo Bacicurinski que soube compreender os anseios nos momentos difíceis e esteve sempre ao meu lado; e a todos os familiares que estiveram por perto incentivando e admirando minha jornada.
ARAZI, S.S. Efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1 em indivíduos hipercolesterolêmicos. 2008. 154f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
RESUMO
A homeostase do colesterol é mediada por proteínas envolvidas na absorção (NPC1L1), regulação (SREBP1, SREBP2, SCAP), síntese (HMGCR) e remoção plasmática (LDLR). Os fármacos inibidores da síntese (vastatinas) e absorção (ezetimiba) do colesterol são potentes agentes hipocolesterolemiantes. Alterações em vários genes têm sido associadas a diferenças na resposta a diversos agentes terapêuticos. Com a finalidade de estudar os efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos genesHMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1, foram selecionados
25 indivíduos com hipercolesterolemia familial (HF), 72 com hipercolesterolemia não familial (HNF) e 125 indivíduos normolipidêmicos e sem doença cardiovascular (NL). Os indivíduos HF foram tratados com sinvastatina (40 mg/dia/4 sem) combinada ou não com ezetimiba (10 mg/dia/4sem) e os HNF foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4sem). Amostras de sangue foram obtidas antes e após o tratamento para a extração de DNA e RNA e analise do perfil lipídico sérico. A expressão de mRNA dos genes SREBF1a, SREBF2, SCAP, HMGCR, LDLR e NPC1L1 em células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi determinada por RT-PCR em tempo real empregando-se o gene da GAPD como controle endógeno. Os polimorfismos SREBF1a –36delG, SREBF2 G1784C e SCAP A2386G foram determinados por
PCR-RFLP. Os indivíduos HF apresentaram maior expressão de mRNA dos genes NPC1L1, HMGCR e LDLR que os grupos HNF e NL (p<0,05). O efeito da atorvastatina sobre a expressão dos genes estudados parece depender da expressão basal nos indivíduos HNF. A variação da expressão após o tratamento com atorvastatina nos pacientes do grupo HNF esteve correlacionada nos genes: SREBF1a e SREBF2; SREBF1a e SCAP; SREBF1a e LDLR; SREBF2 e SCAP; SREBF2 e LDLR; HMGCR e LDLR. O tratamento com sinvastatina e ezetimiba não modificou o padrão de expressão dos
genes estudados no grupo HF. Os polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G
parecem estar relacionados com diminuição da expressão de mRNA após o tratamento com atorvastatina.Foi observado que os portadores do genótipo GG
do polimorfismo SREBF2 G1784C apresentaram maiores concentrações séricas
de colesterol total e LDL-C após o tratamento com atorvastatina. O polimorfismo
SCAP A2386G parece estar associado com maiores concentrações de apoB em
pacientes do grupo HNF antes do tratamento com atorvastatina. Os resultados são sugestivos que os genes HMGCR, LDLR e NPC1L1 são regulados
diferentemente de acordo com o estado metabólico do indivíduo e a taxa de expressão de mRNA é influenciada pelos polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G após o tratamento com atorvastatina
ARAZI, S.S. Lipid lowering and polymorphisms effects on the expression of HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP and NPC1L1 genes in hypercholesterolemic subjects. 2008. 154p. Thesis (Ph.D. Degree) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
ABSTRACT
The regulation of cholesterol is mediated by proteins involved in the absorption (NPC1L1), regulation (SREBP1, SREBP2, SCAP), synthesis (HMGCR) and removal of plasma cholesterol (LDLR). Potent hypocholesterolemic agents inhibit cholesterol synthesis (statins) and its absortion (ezetimibe). Changes in several genes have been associated to different responses to various therapeutic agents. In order to evaluate the association between genes involved in the metabolism of cholesterol and their response to lipid lowering drugs, patients with familial (FH, n = 25) and non familial hypercholesterolemia (NHF, n = 72) were selected. Additionally, 125 normolipidemic individuals and without cardiovascular disease were selected (NL). The HF group were treated with simvastatin (40 mg/day/4 weeks) combined or not with ezetimibe (10 mg/day/4weeks). The NHF group were treated with atorvastatin (10 mg/day/4weeks). Blood samples were obtained prior to and following treatment for extraction of DNA and RNA, and serum lipid profile analysis. The mRNA expression of SREBF1a, SREBF2, SCAP, HMGCR, LDLR, and NPC1L1 genes was determined by real time RT-PCR using
the GAPD gene as endogenous control. The polymorphisms SREBF1a-36delG, SREBF2 G1784C, and SCAP A2386G were determined by PCR-RFLP. Individuals with
HF showed higher expression of mRNA of genes NPC1L1, HMGCR and LDLR when
compared with HNF and NL groups (p <0.05). The effect of atorvastatin on the gene expression seems to depend on the baseline expression in HNF subjects. The change of expression after treatment with atorvastatin in group HNF was correlated as followed:
SREBF1a and SREBF2; SREBF1a and SCAP; SREBF1a and LDLR; SREBF2 and SCAP; SREBF2 and LDLR; HMGCR and LDLR. Treatment with simvastatin and
ezetimibe did not change the gene-expression profile in HF group. The polymorphisms
SREBF2 G1784C, and SCAP A2386G appear to be related to a decreased expression
of mRNA after treatment with atorvastatin. HNF group Carriers of GG genotype of
SREBF2 G1784C polymorphism had higher serum concentrations of total cholesterol
and LDL-C after therapy. The SCAP A2386G polymorphism seems to be associated with
higher concentrations of apoB in patients from HNF group prior to treatment with atorvastatin. The results suggest that the HMGCR, LDLR and NPC1L1 genes are
regulated according to the metabolic status of the individual, and the expression rate of mRNA is influenced by SREBF2 G1784C and SCAP A2386G polymorphisms after
atorvastatin therapy.
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCB1 ATP-binding cassete B1
ACAT Acil-coenzima-A:colesterol aciltransferase AIP índice aterogênico do plasma
ALT Alanina Aminotransferase
ANOVA Analysis of variance
AST Aspartato Aminotransferase
Apo Apolipoproteína
ApoAI Apolipoproteína A1
ApoB Apolipoproteína B
ApoC Apolipoproteína C
Apo E Apolipoproteína E
bHLH-Zip zíper de leucina hélice-alça-helice básico
Bp Pares de Bases
CETP Proteína de Transferência de Colesterol Esterificado cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar
CMSP Células Mononucleares de Sangue Periférico
CK Creatina quinase
CT Colesterol Total
DAC Doença Arterial Coronariana
DEPC Dietilpirocarbonato
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DP Desvio Padrão
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
ER2 Receptor 2 da apo E
GAPD gliceraldeído desidrogenase HDL Lipoproteína de Alta Densidade HDL-c Colesterol da HDL
HF Hipercolesterolemia familial HNF Hipercolesterolemia não familial HNF4 Fator nuclear hepático 4
HMG-CoA 3-hidróxi-3metil-glutaril Coenzima A
HMGCR HMG-CoA redutase
HWE Equilíbrio de Hardy-Weinberg
IDL Lipoproteína de Densidade Intermediária INSIG Insulin induced gene
IMC Índice de Massa Corpórea
LCAT Lecitina Colesterol Acil Transferase LDL Lipoproteína de Baixa Densidade LDL-c Colesterol da LDL
LDLR Receptor da LDL
LRP Proteína relacionada ao receptor da LDL
LPL Lipoproteína lipase
LXR Liver-X-Receptor
MRFIT Multiple Risk Factor Intervention Trial NADPH nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NPC 1 Niemman Pick C1
NPC 2 Niemman Pick C2
NPC1L1 Niemman Pick C1 Like 1
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptor γ
RE Retículo endoplasmático
RFLP Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição
RNA Ácido Ribonucléico
RT-PCR Transcrição reversa seguida de PCR RXR Retinoid X receptor
mRNA RNA Mensageiro
SNP Polimorfismo de Um Único Nucleotídeo SR-B1 Receptor Scavenger do tipo 1
SRE Elementos reguladores de colesterol
SREBP1a Sterol regulatory element-binding protein 1a SREBP2 Sterol regulatory element-binding protein 2
SREBF1a Sterol regulatory element-binding factor 1 – gene da SREBP 1a SREBF2 Sterol regulatory element-binding factor 2 – gene da SREBP 2 SCAP SREBP cleavage-activating protein
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
TBE Tampão Tris Borato EDTA
TSH Hormônio tireostimulante UNG Uracil – N - glicosilase UTR região não codificadora
VLDL Lipoproteína de Muito Baixa Densidade VLDL-c Colesterol da VLDL
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -INICIADORES UTILIZADOS NOS ENSAIOS DE PCR-RFLP ... 44 TABELA 2 -CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO PELA PCR PARA OS POLIMORFISMOS
SREBF1A -36DELG,SREBF2G1784CE SCAPA2386G. ... 45 TABELA 3 -CONDIÇÕES OTIMIZADAS PARA OS ENSAIOS DE RESTRIÇÃO DOS
PRODUTOS DE PCR COM ENDONUCLEASES. ... 45 TABELA 4-DADOS DE QUANTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE RNA OBTIDAS DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO NOS INDIVÍDUOS ESTUDADOS ... 51 TABELA 5- NÚMERO DE CATÁLOGO DOS ENSAIOS UTILIZADOS (INICIADORES +
SONDA) ... 53 TABELA 6- VALORES DE INCLINAÇÃO DA CURVA E EFICIÊNCIA DOS ENSAIOS DE RT-PCR
EM TEMPO REAL. ... 55 TABELA 7-MUTAÇÕES NO GENE LDLR DETECTADAS EM INDIVÍDUOS COM HF ... 59 TABELA 8- CARACTERÍSTICAS BIODEMOGRÁFICAS E VALORES DE LIPÍDEOS SÉRICOS
BASAIS DOS INDIVÍDUOS COM HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAL (HF),
HIPERCOLESTEROLEMIA NÃO-FAMILIAL (HNF) E NORMOLIPIDEMIA (NL) ... 61 TABELA 9-VALORES DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DOS LIPÍDEOS DO PACIENTES
HIPERCOLESTEROLÊMICOS DO GRUPO HNF, ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM
ATORVASTATINA. ... 62 TABELA 10-VALORES DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DOS LIPÍDEOS DO PACIENTES
HIPERCOLESTEROLÊMICOS DO GRUPO HF, ANTES (BASAL) E APÓS O TRATAMENTO COM SINVASTATINA ISOLADA (SINVA) E EM ASSOCIAÇÃO COM EZETIMIBA
(SINVA+EZE). ... 64 TABELA 11 -EXPRESSÃO BASAL DE MRNA DOS GENES ESTUDADOS EM CMSP DE
INDIVÍDUOS DOS GRUPOS HF,HNF E NL ... 66 TABELA 12 -VARIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MRNA DOS GENES ESTUDADOS EM CMSP
DE INDIVÍDUOS HNF TRATADOS COM ATORVASTATINA ... 67 TABELA 13-VARIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MRNA DOS GENES ESTUDADOS EM CMSP
DE INDIVÍDUOS HF TRATADOS COM SINVASTATINA COMBINADA OU NÃO COM
EZETIMIBA ... 68 TABELA 14-RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MRNA DO SREBF1A EM CMSP E A
RESPOSTA A ATORVASTATINA EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 75 TABELA 15 -RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MRNA DO SREBF2 EM CMSP E A
RESPOSTA A ATORVASTATINA EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 76 TABELA 16- RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MRNA DO SCAP EM CMSP E A
RESPOSTA A ATORVASTATINA EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 77 TABELA 17- RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MRNA DO HMGCREM CMSP E A
RESPOSTA A ATORVASTATINA EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 78 TABELA 18 -RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MRNA DO LDLR EM CMSP E A
RESPOSTA A ATORVASTATINA EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 79 TABELA 19- DISTRIBUIÇÃO DE GENÓTIPOS E FREQÜÊNCIA RELATIVA DE ALELOS PARA OS
POLIMORFISMOS -36DELG DO SREBF1A,G1784C DO SREBF2 E A2386G DO
SCAP NOS GRUPOS HIPERCOLESTEROLEMIA NÃO-FAMILIAL (HNF), E
NORMOLIPIDÊMICOS (NL) ... 80 TABELA 20- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS EM INDIVÍDUOS
NL PORTADORES DE DIFERENTES GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO SREBF1A
TABELA 21- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS EM INDIVÍDUOS
NL PORTADORES DE DIFERENTES GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO SREBF2
G1784C. ... 85 TABELA 22- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS EM INDIVÍDUOS
NL PORTADORES DE DIFERENTES GENÓTIPOS DO POLIMORFISMOSCAPA2386G.
... 85 TABELA 23- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS NO PERÍODO
BASAL E APÓS TRATAMENTO COM ATORVASTATINA, EM PACIENTES HNF, COM
DIFERENTES GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO SREBF1A-36DELG. ... 87 TABELA 24- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS NO PERÍODO
BASAL E APÓS TRATAMENTO COM ATORVASTATINA, EM PACIENTES HNF, COM
DIFERENTES GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO SREBF2G1784C. ... 88 TABELA 25- CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE LIPÍDEOS E LIPOPROTEÍNAS NO PERÍODO
BASAL E APÓS TRATAMENTO COM ATORVASTATINA, EM PACIENTES HNF, COM
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -METABOLISMO ENDÓGENO E EXÓGENO DO COLESTEROL. ... 19 FIGURA 2 -CASCATA DE SÍNTESE DO COLESTEROL A PARTIR DA ACETIL COA. ... 22 FIGURA 3 -REGULAÇÃO INTRACELULAR DA EXPRESSÃO DO GENE LDLR. ... 25 FIGURA 4 - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2%, CORADO COM BROMETO DE
ETÍDEO, DOS PRODUTOS DE RESTRIÇÃO DO SNPSREBF1A-36DELG . ... 46 FIGURA 5 -ELETROFORESE EM GEL DE ACRILAMIDA 10% DOS PERFIS DE RFLP DO
POLIMORFISMO SREBF2G1784C. ... 47 FIGURA 6 -ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 10%, CORADO COM
NITRATO DE PRATA, DOS PERFIS DE RFLP DO SNPSCAPA2386G ... 48 FIGURA 7- MUTAÇÕES ENCONTRADAS NO EXON 5 DO GENE LDLR. ... 59 FIGURA 8 -CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DOS LÍPIDES DE PACIENTES
HIPERCOLESTEROLÊMICOS DO GRUPO HNF ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM
ATORVASTATINA.. ... 62 FIGURA 9 -CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DOS LÍPIDES DE PACIENTES
HIPERCOLESTEROLÊMICOS DO GRUPO HF ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM
SINVASTATINA (SINVA) E SINVASTATINA COM EZETIMIBA (SINVA +EZE).. ... 65 FIGURA 10 -EXPRESSÃO BASAL DE MRNA DOS GENES SREBF1A,SREBF2,SCAP,
HMGCR,LDLR E NPC1L1 EM CMSP DE INDIVÍDUOS COM
HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAL (HF), NÃO-FAMILIAL (HNF) E NORMOLIPIDÊMICOS (NL). ... 66 FIGURA 11-BOX PLOTS DE VALORES DE EXPRESSÃO NORMALIZADA DOS GENES
SREBF1A,SREBF2,SCAP,HMGCRELDLR EM CMSP DO GRUPO HNF, ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM ATORVASTATINA. ... 67 FIGURA 12 -BOX PLOTS DE VALORES DE EXPRESSÃO NORMALIZADA DOS GENES
SREBF1A,SREBF2,SCAP,HMGCR,LDLR E NPC1L1 EM CMSP DO GRUPO
HF, ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM SINVASTATINA E SINVASTATINA COMBINADA
COM EZETIMIBA.. ... 68 FIGURA 13 -ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE AS VARIAÇÕES DA EXPRESSÃO DE
MRNA(∆CT ATORVA-∆CTBASAL) EM CMSP APÓS O TRATAMENTO COM
ATORVASTATINA.R. ... 70 FIGURA 14 -VALORES DE EXPRESSÃO DE MRNA DESREBF1A,SREBF2,SCAP,
LDLR E HMGCR EM CMSP ANTES E APÓS O TRATAMENTO COM ATORVASTATINA.. ... 72 FIGURA 15 -PERFIL LIPÍDICO SÉRICO EM RESPOSTA A ATORVASTATINA DE ACORDO COM
O PADRÃO DE EXPRESSÃO NOS GENES SREBF1A,SREBF2,SCAP,HMGCRE
LDLR EM PACIENTES DO GRUPO HNF. ... 73 FIGURA 16 -RELAÇÃO DO POLIMORFISMO SREBF1A-36DELG E A EXPRESSÃO DE
MRNA DO SREBF1A EM CMSP EM INDIVÍDUOS NORMOLIPIDÊMICOS (A) E
HIPERCOLESTEROLÊMICOS NÃO-FAMILIAL (B), ANTES E APÓS O TRATAMENTO
COM ATORVASTATINA ... 81 FIGURA 17-RELAÇÃO DO POLIMORFISMO SREBF2G1784C E A EXPRESSÃO DE
MRNA DO SREBF2 EM CMSP EM INDIVÍDUOS NORMOLIPIDÊMICOS (A) E
HIPERCOLESTEROLÊMICOS NÃO-FAMILIAL (B), ANTES E APÓS O TRATAMENTO
COM ATORVASTATINA. ... 82 FIGURA 18 -RELAÇÃO DO POLIMORFISMO SCAPA2386G E A EXPRESSÃO DE
MRNA DO SCAP EM CMSP EM INDIVÍDUOS NORMOLIPIDÊMICOS (A) E
HIPERCOLESTEROLÊMICOS NÃO-FAMILIAL (B), ANTES E APÓS O TRATAMENTO
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1METABOLISMO DO COLESTEROL ... 17
1.1.1 Absorção ... 17
1.1.2 Transporte de lipoproteínas ... 19
1.1.3 Síntese intracelular ... 21
1.1.4 Transporte reverso do colesterol ... 23
1.2.REGULAÇÃO DA HOMEOSTASE DO COLESTEROL ... 23
1.3.HIPERCOLESTEROLEMIA E TRATAMENTO ... 27
2. OBJETIVOS ... 38
2.1.OBJETIVO GERAL ... 38
2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 38
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 39
3.1CASUÍSTICA E PROTOCOLO TERAPÊUTICO ... 39
3.2AMOSTRAS BIOLÓGICAS ... 40
3.3DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS ... 41
3.4EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO ... 43
3.5ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS ... 43
3.6TRIAGEM DE MUTAÇÕES DOS GENES LDLR E APOB ... 48
3.7SEQÜENCIAMENTO DE DNA ... 49
3.8EXTRAÇÃO E AVALIAÇÃO DO RNA TOTAL DE CÉLULAS MONONUCLEARES ... 50
3.9ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO MRNA POR RT-PCR EM TEMPO REAL ... 52
3.10CONTROLE DE QUALIDADE DAS REAÇÕES DE PCR-RFLP E RT-PCR ... 56
3.11ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ... 56
4. RESULTADOS... 58
4.1ANÁLISE MOLECULAR DOS INDIVÍDUOS COM HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAL ... 58
4.2EFEITOS DE HIPOLIPEMIANTES SOBRE O PERFIL LIPÍDICO ... 60
4.3EFEITOS DE HIPOLIPEMIANTES SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA EM CMSP ... 65
4.4RELAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS COM A EXPRESSÃO GÊNICA EM CMSP .. 80
4.5RELAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS COM O PERFIL LIPÍDICO ... 84
5. DISCUSSÃO ... 90
6. CONCLUSÕES ... 101
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 102
APÊNDICES ... 114
1. INTRODUÇÃO
1.1 Metabolismo do colesterol
1.1.1 Absorção
O colesterol no organismo é oriundo da dieta e é produzido nas células, principalmente nos hepatócitos. O colesterol da dieta é absorvido pelas células intestinais sendo incorporado aos quilomícrons que realizam seu transporte na circulação linfática e sanguínea (TULENKO; SUMMER, 2002) (Figura 1)
A absorção do colesterol das micelas no lúmen é mediada por um transportador, Niemman_Pick C1 Like 1 (NPC1L1) (ALTMANN et al 2004). O NPC1L1 faz parte da família de proteínas do tipo NPC juntamente com as NPC1 e NPC2. A proteína NPC1 facilita a liberação do colesterol captado da LDL endossomo ao reticulo endoplasmático A proteína NPC2 está localizada nos lisossomos e é requerida para a reesterificação do colesterol intracelular, mas seu mecanismo de ação exato ainda não é completamente conhecido (ORY, 2004).
Alguns estudos sugerem que o colesterol regule a expressão do NPC1L1 através da ativação da SREBP do tipo 2 (SREBP-2). A transcrição de mRNA hepático e intestinal de NPC1L1 é positivamente regulada em animais privados de colesterol (TELFORD et al., 2007, ALREFAI et al. 2007). Liu et al. (2005) demonstraram que a transcrição de mRNA intestinal é negativamente regulada em ratos alimentados com colesterol ou deficientes de acil-coenzima A:colesterol aciltransferase (ACAT2) que acumulam colesterol livre nos enterócitos.
Vários receptores nucleares também podem regular a transcrição do
NPC1L1, como os Peroxisome proliferator-activated receptor e γ (PPARγ e PPARα) (VAN DER VEEN et al. 2005, DUVAL et al., 2006; MATHUR; WATT; FIELD, 2007; VALASEK; CLARKE; REPA, 2007), Liver-X-Receptor (LXR) (KRUIT et al. 2005) e Retinoid X receptor (RXR) (LALLOYER et al., 2006). Adicionalmente, a expressão do NPC1L1 também pode ser modulada pela concentração plasmática de estrógeno (DUAN et al., 2006) e pela presença de diabetes (LALLY et al., 2006).
O colesterol é uma substância lipofílica e, portanto, deve ser solubilizado para ser absorvido. As micelas de ácidos biliares agem como carreadores e solubilizadores de colesterol, passando pela resistência do meio aquoso na borda dos enterócitos e facilitando a absorção (ROS, 2000).
Figura 1 - Metabolismo endógeno e exógeno do colesterol (LUSIS et al., 2004).
1.1.2 Transporte de lipoproteínas
Os quilomícrons são lipoproteínas ricas em triglicérides sintetizadas nas células da mucosa intestinal baseado em lípidesda dieta (triglicérides, colesterol e fosfolípides) e apolipoproteína (apo) B-48. Os quilomícrons recém sintetizados são secretados nos vasos linfáticos e atingem a circulação sanguínea através do ducto torácico. Na circulação, os quilomícrons adquirem apo C e apo E, e sofrem a ação da lipoproteína lipase (LPL), enzima que catalisa a hidrólise de triglicérides liberando ácidos graxos livres para os tecidos através da ação da proteína CD36.
Nesse processo, os quilomícrons são transformados em partículas ricas em colesterol, os remanescentes de quilomícrons, que são captados pelos hepatócitos por ligação a receptores de VLDL (VLDLR), por receptores de LDL (LDLR), e à proteína relacionada ao LDLR (LRP) que reconhecem e se ligam a apo E (YU; CHEN; COOPER, 2001). Nos hepatócitos, o colesterol oriundo dos quilomícrons remanescentes é destinado à produção da lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) ou à formação de sais biliares que é a forma de eliminação do colesterol pela via biliar (TULENKO; SUMMER, 2002).
membranas celulares ou é armazenado nas células na forma de éster de colesterol. É também empregado na produção de hormônios esteróides nos tecidos esteroidogênicos.
O LDLR faz parte de uma família de receptores ancorados à membrana celular, que incluem o receptor da VLDL (VLDLR), a proteína relacionada ao receptor da LDL (LRP), a megalina, o receptor 2 da apo E (ER2), entre outros (HUSSAIN; STRICKLAND; BAKILLAH, 1999, CHUNG; WASAN, 2004). O papel do LDLR, no metabolismo e na regulação intra e extracelular do colesterol, foi demonstrado nos estudos com pacientes com hipercolesterolemia familiar (HF), doença hereditária autossômica dominante, caracterizada por mutações no gene
LDLR (BROWN; GOLDSTEIN 1986).
O gene do LDLR está localizado na parte distal do braço curto do cromossomo 19 e possui 18 exons e 17 introns. O RNA mensageiro (mRNA) tem tamanho de 5,3 kb e codifica uma proteína de 860 aminoácidos. O exon 1 codifica os 21 aminoácidos do peptídeo de sinalização da proteína, que é clivado durante a translocação da proteína para o reticulo endoplasmático. (VARRET et
al., 2008)
1.1.3 Síntese intracelular
3-hidroxi-3-metil-glutaril-Coenzima A (HMG-CoA) em mevalonato, catalisada pela enzima HMG-CoA redutase (HMGCR) (GOLDSTEIN; BROWN, 1990).
Na figura 2, está ilustrada a rota de síntese de colesterol a partir da Acetil CoA. O gene da HMGCR está localizado no cromossomo 3, e possui 20 exons. Sua região promotora contém um domínio sensitivo aos esteróis (SRE) similar ao encontrado em outros genes também responsivos aos esteróis como o gene
LDLR e o gene NPC1L1.
1.1.4 Transporte reverso do colesterol
O colesterol celular é removido das membranas citoplasmáticas e transportado ao fígado para posterior eliminação por um mecanismo complexo denominado transporte reverso do colesterol que é mediado pelas lipoproteínas de alta densidade(HDL) (RADER, 2002).
As HDL nascentes são constituídas de apo A e fosfolípides e são secretadas pelas células da mucosa intestinal e do fígado. As HDL captam o colesterol das células periféricas, que é esterificado pela lecitina colesterol acil transferase (LCAT), enzima ativada por apo A das HDL. Estas lipoproteínas são removidas da circulação por ligação com o receptor scavenger classe B do tipo 1 (SR-B1) dos hepatócitos (TRIGATTI; RIGOTTI; KRIEGER, 2000, FREDENRICH; BAYER, 2003). Este receptor se liga a HDL com alta afinidade, é expresso primariamente pelo fígado e pelos tecidos estrogênicos e possui diferentes sítios de ligação no seu domínio extracelular. O SR-B1 modula a troca bidirecional de lipídeos na membrana plasmática participando de captação e efluxo seletivo do colesterol (ADACHI; TSUJIMOTO, 2006, RHAINDS; BRISSETTE, 2004).
1.2. Regulação da homeostase do colesterol
também excretados na bile em forma de micelas (HORTON; GOLSTEIN; BROWN,2002).
Os SREBPs pertencem à família de fatores de transcrição que contem zíper de leucina hélice-alça-helice básico (bHLH-Zip) e são sintetizados como precursores inativos ligados ao reticulo endoplasmático (RE). Cada SREBP precursor contém a região bHLH-Zip para a ligação do DNA e um domínio carboxi-terminal que é responsável pela resposta às variações na concentração de colesterol (BROWN; GOLDSTEIN, 1997). Para alcançar o núcleo e exercer sua atividade reguladora, o domínio amino-terminal do SREBP é liberado da membrana por processo proteolítico, mediado por três proteínas: a SREBP
Figura 3 - Regulação intracelular da expressão do gene LDLR. A figura ilustra como o LDLR é regulado nas células. A via das SREBPs faz um importante papel na regulação transcricional, enquanto a região 3ÚTR do mRNA do LDLR é um fator chave na regulação pós-transcricional. Alvos terapêuticos para os hipolipemiantes estão demonstrados na figura. bHLH-Zip, basic-helix– loop–helix–leucine zipper; C, colesterol; ER reticulo endoplasmático; ERK, extracellular signal-regulated kinase; HMG-CoA, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A; Insig, insulin-induced gene; LDL, lipoproteína de baixa densidade; nSREBP, SREBP nuclear; S1P, 1protease; S2P, site-2 protease; SCAP, proteína de ativação da clivagem de SREBP; SRE, elemento regulador de colesterol; SREBP, sterol regulatory element-binding protein; SSD, domínio sensor de colesterol; UTR, região não codificadora (KONG; JINGWEN; JIANG, 2006).
O colesterol aumentado na célula se liga a SCAP, mudando sua estrutura conformacional, causando a ligação dessa proteína a proteína INSIG (insulin induced gene). Isso impede a ligação do complexo Sar1/sec23/24 a SCAP e conseqüentemente a SCAP permanece no RE, impedindo assim a ação transcricional do SREBP (GOLDSTEIN; DEBOSE-BOYD; BROWN, 2006) (Figura 3).
Os SREBPS são classificados em SREBP1a, SREBP1c e SREBP2. Os SREBP1a e SREBP1c são codificadas por um único gene, SREBF1, localizado no cromossomo 17p11.2, que tem regiões promotoras alternativas para transcrição de cada proteína. Esses fatores são idênticos exceto pela região amino-terminal responsável pela ativação da transcrição de vários genes. O SREBP1a é um ativador potente de todos os genes responsivos ao SREBP (SHIMANO, 2001). O SREBP1c se liga nos promotores contidos nos E-box de genes lipogênicos requeridos para síntese de triglicérides e ácidos graxos. O SREBP2 é codificado pelo gene SREBF2 localizado no cromossomo 22q13 (HUA et al., 1995) e é ativo nos SREs presentes em regiões promotoras de genes colesterogênicos.
1.3. Hipercolesterolemia e tratamento
A doença arterial coronariana (DAC) é uma importante doença cardiovascular que tem elevado índice de mortalidade no mundo. De acordo com estimativas da World Heart Federation, a doença cardiovascular é responsável, na população mundial, por 17 milhões de óbitos por ano (http://www.worldheart.org). No Brasil, segundo dados do DATASUS (http://www.datasus.gov.br), a mortalidade proporcional por doenças do aparelho circulatório foi de 31,54% no ano de 2003.
A hipercolesterolemia se caracteriza pela elevação das concentrações séricas de LDL-C e colesterol total. Vários fatores podem influenciar as concentrações séricas de colesterol nos indivíduos tais como a idade, o gênero masculino, hormônios, tabagismo, atividade física, dieta rica em gorduras saturadas e constituição genética.
A hipercolesterolemia familial (HF) é um distúrbio hereditário autossômico dominante, causado por mutações no gene que codifica o receptor da LDL (BROWN; GOLDSTEIN, 1986). Essas mutações alteram a estrutura e função do receptor da LDL, que normalmente remove a LDL do plasma, levando a um aumento das concentrações de colesterol sanguíneo, o que conseqüentemente leva, invariavelmente, ao desenvolvimento de doença arterial coronariana (DAC) precoce.
anos, comprovou de modo claro e inequívoco a relação entre colesterolemia e freqüência de mortalidade de DAC (STAMLER; WENTWORTH; NEATON, 1986). Outros estudos importantes são: o Estudo dos Sete Países (KEYS, 1970) e o Estudo da Organização Mundial da Saúde (SIMONS, 1986).
Além dos fatores ambientais, como o aumento do consumo de colesterol e gordura saturada, fumo, e outros (Resumo das IV Diretrizes Brasileiras, 2007), os fatores metabólicos que afetam as taxas de absorção, distribuição e excreção do colesterol podem influenciar de forma significativa a homeostase do colesterol plasmático (SEHAYEK et al., 1998).
Mudanças no estilo de vida são recomendadas pelo National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III Guidelines (NCEP ATP III) - (GRUNDY et al., 2004) para reduzir a hipercolesterolemia e, conseqüentemente diminuir o risco de doenças cardiovasculares. Tais mudanças incluem: redução de ingestão de gordura saturada e de colesterol, redução de peso e prática de atividade física regular. Entretanto, essas condutas nem sempre são eficazes e há necessidade de intervenção farmacológica.
Os medicamentos hipocolesterolemiantes são classificados em: inibidores da HMGCR (vastatinas), seqüestradores de ácidos biliares (colestiramina, colestipol), ácido nicotínico e seus derivados e inibidores da absorção do colesterol (ezetimiba). Os medicamentos mais largamente utilizados são as vastatinas.
síntese de LDLR na membrana celular hepática. Essa alteração induz o aumento da captação de LDL e, conseqüentemente, a diminuição da concentração do colesterol plasmático (VAUGHAN; GOTTO, 2004).
Há diferentes tipos de vastatinas que diferem pela absorção, ligação com proteínas plasmáticas, excreção e solubilidade. A atorvastatina é administrada via oral como sal cálcico da forma ativa hidroxi-ácida (VAUGHAN; GOTTO, 2004). Já a sinvastatina é administrada na forma de lactona inativa (GARCIA et
al., 2003). Ambas vastatinas são biotransformadas primariamente pela enzima CYP3A4 do citocromo P450 e sofrem conjugação com ácido glicurônico mediado pelas enzimas UDP-glicuronil transferases UGT1A1 e UGT1A3 (JACOBSEN et
al., 2000; PRUEKSARITANONT et al., 2002). A captação e o efluxo celular da atorvastatina são realizados pelos transportadores OATP1B1, glicoproteína P e outros (BOGMAN, 2001; CHEN et al., 2005). Poucos trabalhos estudaram a captação e efluxo celular da sinvastatina. A sinvastatina inibe o transporte mediado pela OATP1B1, sugerindo que ela também pode ser um substrato da OATP1B1. Entretanto, a contribuição desse transportador para a captação da sinvastatina parece ser baixa porque essa vastatina lactônica é lipofílica e é captada pelos hepatócitos, e mesmo por outros tecidos, através de difusão passiva. (SHITARA; SUGIYAMA, 2006)
Alonso et al (2005) demonstraram que o tratamento isolado da sinvastatina em pacientes com HF reduziu efetivamente as concentrações séricas de LDL-C. A sinvastatina também reduziu os triglicérides séricos e aumentou o HDL-C sérico, além de reduzir a oxidação do LDL-C e a inflamação vascular, e melhorar a função endotelial.
O principal trabalho avaliando a eficácia da atorvastatina foi o Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Lipid Lowering Arm (ASCOt-LLA). Esse estudo multicêntrico avaliou 10.305 indivíduos tratados com a atorvastatina e tiveram como resultados a redução em 24% nas concentrações séricas de colesterol total após um ano de tratamento com atorvastatina 10mg/dia e redução em 35% nas concentrações de LDL-C no mesmo período (SEVER et
al., 2003).
Uma meta-análise recente demonstrou que a redução de LDL-C contribui com mais de 75% da variação na redução de risco da mortalidade por eventos cardiovasculares. A redução de 1 mmol/L (39 mg/dL) de LDL-C leva a redução de 15% na mortalidade em geral, 24% de mortalidade coronariana, 27% na incidência de infarto do miocárdio não fatal e 24% em acidente vascular cerebral (GENSER; MARZ 2006). Esse estudo conclui que à medida que as vastatinas reduzem as concentrações plasmáticas de LDL-C, há melhoras significantes nos desfechos clínicos de eventos cardiovasculares.
séricas de colesterol total, LDL-C e triglicérides. Os autores também observaram que, em altas doses, a sinvastatina tem maior efeito sobre o aumento HDL-C sérico que a atorvastatina.
A ezetimiba é um hipocolesterolemiante que bloqueia a absorção seletiva de colesterol nos enterócitos por inibição do transportador NPC1L1 presente na membrana plasmática. Esse bloqueio não afeta a absorção de triglicérides, ácidos graxos, ácidos biliares ou vitaminas lipossolúveis e os alfa- e beta-carotenos (JURADO; SEIP; THOMPSON, 2004).
A ezetimiba sofre rápida conjugação com ácido glicurônico nas células intestinais, é captado pelo sistema porta no fígado e excretado pela bile, resultando em baixas concentrações plasmáticas. Notavelmente, seu metabólito, o glicuronídio de ezetimiba, é ainda mais potente como inibidor da absorção do colesterol do que o composto original (BRUCKERT; GIRAL; TELLIER, 2003). O longo tempo de meia vida, 22 horas, permite uma única dose diária, mas não afeta sua atividade e a alimentação não afeta sua biodisponibilidade. A ezetimiba não interage com medicamentos ou xenobióticos biotransformados por enzimas da família citocromo P450 (CYP) 1A2, 2D6, 2C8, 2C9 OU 3A4, principalmente as vastatinas, sugerindo que tem um baixo potencial de interação medicamentosa (DAVIDSON, 2003).
com ezetimiba produziu redução mais significativa desses lipídeos séricos (colesterol total: 38 % e LDL-C: 52 %) (SAGER et al., 2003).
Yamamoto et al (2006) verificou que o uso de ezetimiba é recomendável com uma vastatina para reduzir os níveis de LDL-C em pacientes com HF homozigótica submetidos à aférese de LDL. As taxas de redução de LDL-C e CT nesse estudo foram de 9,6% e 9,0% respectivamente. Estudos mostraram que a co-administração de ezetimiba com a sinvastatina de 10 ou 20 mg permitiu que mais pacientes em prevenção secundária pudessem atingir as concentrações séricas de LDL-C abaixo de 100 mg/dL. (FARNIER et al 2005, DAVIDSON et al 2002).
Uma meta análise comparou estudos publicados entre janeiro de 1993 e dezembro de 2005 e revelou que a média de redução de colesterol total por ezetimiba em associação com vastatinas foi de 17,3%, maior que a de vastatina isoladamente (14,8%, p<0, 0001); em relação à redução de LDL-C, a associação com ezetimiba reduziu em 25,6%, redução mais acentuada quando comparado com o tratamento de vastatinas em monoterapia (21,7%, p<0,0001) (MIKHAILIDIS et al., 2007).
Embora as vastatinas tenham alta eficácia terapêutica, foram observadas diferenças interindividuais significativas na resposta farmacológica. Vários fatores que interferem na farmacocinética das vastatinas podem alterar a duração ou magnitude da exposição a esses medicamentos e afetar a sua eficácia e toxicidade.
(ALSHEIKH-ALI et al.2007). No estudo não foi encontrada relação entre a porcentagem de redução de LDL-C e o aumento de enzimas hepáticas ou rabdomiólise. Entretanto, com altas doses de vastatinas, a cada 10% de redução de LDL-C, as taxas de enzimas aumentaram, sugerindo que o risco de aumento de lesão hepática e ou rabdomiólise pelas vastatinas não está relacionado com a magnitude da redução do LDL-C.
As vastatinas passam por um extenso metabolismo via CYP450 e particularmente a sinvastatina e a atorvastatina são metabolizadas pela CYP3A4. (NEUVONEN; NIEMI; BACKMAN, 2006). Portanto, variantes genéticas associadas com a farmacocinética das vastatinas parecem ter um significativo impacto na resposta terapêutica a estes medicamentos.
Kajinami et al. (2004) avaliaram dois polimorfismos no gene da CYP3A4 e encontraram que a variante A-290G foi associada com maiores concentrações de LDL-C, após o tratamento com atorvastatina, enquanto que o polimorfismo M445T foi associado com menores concentrações de LDL-C, antes e após o tratamento com atorvastatina.
redução de LDL-C e colesterol total em pacientes tratados com atorvastatina (WILLRICH et al, 2008).
Os transportadores de membrana também estão envolvidos na biodisponibilidade das vastatinas. Fiegenbaum et al. (2005b) estudaram variantes no gene da glicoproteína P, denominado ABCB1, e encontraram que a variante ABCB1 1236T foi relacionada com maior redução no colesterol total e LDL-C após o tratamento com sinvastatina. Rodrigues et al. (2006) descreveram que a atorvastatina causa uma diminuição da função da ABCB1 e modula sua síntese em células HepG2 e em células mononucleares do sangue periférico. A resposta de LDL-C sérica a fluvastatina também parece estar influenciada por variantes nos genes do ABCB1 e da proteína de transferência do colesterol esterificado (CETP) em indivíduos portadores de HF (BERCOVICH et al., 2006).
Variantes em genes que regulam o metabolismo do colesterol e que estão envolvidos na estrutura, secreção e catabolismo de lipoproteínas têm sido associados com variabilidade na resposta as vastatinas.
Em estudo prévio de nosso grupo, foi observado que o polimorfismo
Ins/del do gene da apolipoproteína B (APOB) foi associado com menor resposta a fluvastatina (GUZMAN et al., 2000). Também observamos que os alelos comuns das variantes G-75A (rs670) e C+83T (rs5069)do gene da apo A (APOA1) foram associadas com menores concentrações séricas de triglicérides e VLDL-C, em mulheres, após o tratamento com atorvastatina (SORKIN et al., 2005). Recentemente, descrevemos a relação de variantes do gene ATP binding
A relação de variantes do gene do LDLR e a resposta a fluvastatina foi observada em estudo anterior do nosso grupo (SALAZAR et al., 2000). Os polimorfismos LDLR AvaII (rs5925) e PvuII (rs2569542) foram associados com menores reduções nas concentrações séricas de colesterol total, LDL-C e apolipoproteína B após o tratamento. Esta associação não foi influenciada pela idade, gênero e menopausa. Lahoz et al. (2005) descreveram que o polimorfismo LDLR AvaII está relacionado com maior reposta à pravastatina.
Variantes genéticas da HMGCR, o alvo terapêutico das vastatinas, são pouco estudadas. O estudo Pravastatin Inflammation/CRP Evaluation (PRINCE) identificou duas variantes nesse gene relacionadas com a magnitude da resposta do LDL-C a pravastatina. Os SNPs HMGCR 12 (rs17244841) e 29 (rs17238540) foram relacionados com menores reduções de colesterol total e LDL-C séricos quando comparadas aos alelos comuns (CHASMAN et al., 2004). Por outro lado, no estudo Atorvastatin Comparative Cholesterol Efficacy and Safety Study (ACCESS) não foi observada associação do SNP 29 com diferenças nas taxas de redução de colesterol total e LDL-C (THOMPSON et al., 2005).
de SCAP nos pacientes portadores do genótipo AA do polimorfismo SCAP A2386G (rs12487736) (ARAZI et al. 2008).
O polimorfismo SCAP A2386G também parece estar relacionado com a redução de colesterol total e triglicérides séricos após o tratamento com sinvastatina (FIEGENBAUM et al., 2005a).
Os estudos sobre fatores genéticos associados com a resposta a ezetimiba são mais escassos. Polimorfismos no gene NPC1L1 foram relacionados com a maior resposta terapêutica a ezetimiba (WANG A. et al., 2005; SIMON et al., 2005; HEGELE et al., 2005). Pisciotta et al. (2007) observaram que a variante NPC1L1 L272L (rs2072183) (C1679G) foi associada com maior redução de LDL-C após o tratamento com ezetimiba em indivíduos portadores de HF heterozigótica.
Como visto anteriormente, a concentração plasmática de colesterol é regulada por um conjunto de processos metabólicos complexos que envolvem a participação de proteínas e enzimas envolvidas na absorção, síntese, transporte, captação e eliminação do colesterol. As proteínas LDLR, HMGCR e NPC1L1, envolvidas nesses processos, são reguladas pelas proteínas SREBPs e SCAP que são expressas em maior quantidade quando há depleção de colesterol nas células. Além disso, numerosos fatores genéticos podem influenciar a concentração plasmática do colesterol e a resposta terapêutica, aumentando o risco para doenças cardiovasculares.
do colesterol na expressão gênica e na resposta a hipolipemiantes e também avaliar os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão destes genes.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar os efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1 em indivíduos hipercolesterolêmicos.
2.2. Objetivos específicos
2.2.1. Avaliar o efeito do tratamento com atorvastatina sobre a expressão do mRNA dos genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2 e SCAP em células mononucleares periféricas de indivíduos com hipercolesterolemia não familial
2.2.2. Avaliar o efeito de polimorfismos dos genes SREBF1a, SREBF2 e
SCAP sobre a expressão do mRNA em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com hipercolesterolemia não familial tratados com atorvastatina.
2.2.3. Avaliar o efeito de polimorfismos dos genes SREBF1a, SREBF2 e
SCAP sobre os valores de lípides basais e após a terapia com atorvastatina em pacientes com hipercolesterolemia não familial.
2.2.4. Avaliar o efeito do tratamento com sinvastatina e ezetimiba sobre a expressão do mRNA dos genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Casuística e Protocolo Terapêutico
Foram selecionados 125 indivíduos normolipidêmicos (NL) entre 40 e 70 anos, apresentando concentrações séricas de colesterol total inferiores a 200 mg/dL, triglicérides inferiores a 150 mg/dL e LDL-C inferiores a 160mg/dL. Também foram selecionados 72 indivíduos com hipercolesterolemia não-familial (HNF) entre 40 e 70 anos com indicação para o uso de atorvastatina (colesterol total > 200 mg/dL, triglicérides < 350 mg/dL, LDL-C > 160mg/dL). Ambos os grupos de indivíduos foram selecionados randomicamente entre os atendidos na Divisão de Clínica Médica do Hospital Universitário da USP (HU-USP).
No Ambulatório de Dislipidemias do Serviço de Endocrinologia e Metabologia do Hospital das Clínicas de São Paulo foram selecionados 25 indivíduos portadores de hipercolesterolemia familial (HF) com base nos critérios de histórico familiar e clínico, exames físicos (xantomas, xantelasmas, etc.) e análises laboratoriais e genéticas (CIVEIRA, 2004). A pesquisa de mutações do gene do LDLR associadas com a HF foi empregando-se o método de polimorfismo de conformação de fita única (SSCP - Single Strand Conformation
Neste estudo, não foram incluídos os indivíduos com hipotiroidismo (TSH> 4,00 mcUI/mL) , diabete melito (glicose > 100mg/dL), doenças hepática (ALT> 43 U/L e AST> 35 U/L) e renal (creatinina > 1,3 mg/dL) graves, e mulheres em uso de contraceptivos orais ou grávidas.
Os indivíduos do grupo HNF fizeram uso de atorvastatina (10 mg/dia/via oral) durante quatro semanas após permanecerem quatro semanas sem medicação hipocolesterolemiante e em dieta com baixo teor gordura saturada e colesterol. (CHAHOUD; AUDE; MEHTA, 2004).
Os indivíduos do grupo HF em prevenção primária de DAC permaneceram por quatro semanas sem medicação hipocolesterolemiante, de acordo com critério clínico, e fizeram uso de dieta com baixo teor gordura saturada e colesterol. Após esse período, os pacientes fizeram uso de sinvastatina (40 mg/dia/via oral) por quatro semanas e, a seguir, fizeram uso de sinvastatina (40mg/dia/via oral) e ezetimiba (10 mg/dia/via oral) por mais quatro semanas.
3.2 Amostras biológicas
Os indivíduos dos grupos HF e HNF foram submetidos a coletas de sangue adicionais (12 a 14 h de jejum), após cada fase do protocolo terapêutico. Em cada coleta, foram obtidos 10 mL de sangue em tubo com EDTA K2 (1,8 mg/mL de sangue) para extração de RNA e 5 mL em tubo sem anticoagulante para a obtenção de soro para determinação de concentrações de colesterol total e frações, triglicérides, apoA , apoB, ALT, AST, CK, glicose, uréia, creatinina, TSH e T4L.
As concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicerídeos, apoAI e apoB foram utilizadas a fim de avaliar a resposta terapêutica aos hipolipemiantes. A avaliação de TSH e T4 livre foi utilizada para exclusão de pacientes com hipo ou hipertireoidismo. A glicemia foi determinada para excluir os indivíduos com diabete melito. A dosagem de uréia e creatinina, a avaliação da atividade das enzimas ALT e AST e a avaliação de CK foram utilizadas para exclusão de pacientes com lesão renal , hepática, ou muscular respectivamente.
3.3 Determinações bioquímicas
As concentrações séricas de colesterol total, HDL-C e triglicérides foram determinadas por métodos enzimático-colorimétricos (SIEDEL et al., 1983; SUGIUCHI, et al., 1995, SULLIVAN et al., 1985) utilizando conjuntos diagnósticos (Siemens Medical/Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY, EUA), em analisador automático Advia 1650® (Siemens Medical/Bayer Diagnostics,
Tarrytown, NY, EUA). A determinação de HDL-C foi realizada por método enzimático (NAUCK 1998) com o conjunto diagnóstico da DiaSys® (DiaSys
VLDL-C e LDL-C foram calculadas segundo a fórmula de Friedewald et
al.(1972).
Amostras de soro foram enviadas ao Laboratório Álvaro, em Cascavel no estado do Paraná, para determinação das concentrações de apoA e apoB por métodos nefelométricos (RIFAI 1986) utilizando conjuntos diagnósticos da Dade Behring (Dade Behring GmbH, Marburg, Alemanha), em analisador automático BN II® (Dade Behring GmbH, Marburg, Alemanha). Este laboratório é membro
participante dos programas PNCQ (Programa Nacional de Controle de Qualidade) , PALC (Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos) PELM (Proficiência em Ensaios Laboratoriais).
O índice aterogênico do plasma (AIP) calculado como log (TG/HDL-C) também foi avaliado. O AIP foi proposto como marcador de aterogenicidade do plasma porque está aumentado em indivíduos com alto risco para DAC e é inversamente proporcional ao tamanho da partícula de LDL (DOBIASOVA; FROHLICH, 2001). Rasouli et al. (2006) sugeriram que a relação apoB/apoA é um fator de risco independente para DAC e é superior a outros índices sendo o melhor marcador de risco de DAC na prática clínica. O índice LDL-C/apoB é conhecido como um marcador indireto da subclasse de LDL densa e pequena e baixos índices desse parâmetro estão relacionados com DAC.(PACKARD; CASLAKE; SHEPERD, 2000)
(FABINY 1971; TRINDER, 1969). Estas análises também foram realizadas em analisador automático Advia 1650® (Siemens Medical/Bayer Diagnostics,
Tarrytown, NY, EUA).
3.4 Extração do DNA genômico
O DNA genômico foi obtido a partir do sangue total periférico, colhido com EDTA, usando o procedimento desenvolvido em nosso laboratório (SALAZAR et
al., 1998). A integridade das amostras foi avaliada por separação eletroforética em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM) durante 30 minutos a 100V e 60mA, corado com brometo de etídeo a 0,5 µg/mL (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). A visualização das bandas foi feita em transluminador UV utilizando o sistema de captura de imagem Chemilmager 4400 (Alpha Innotech Corporation, CA, EUA).
A quantificação de DNA foi realizada por espectrofotometria a 260nm, e a pureza do DNA determinada pela relação A260/A280 ((SAMBROOK; RUSSEL,
2001).
3.5 Análise dos polimorfismos genéticos
Foram estudados as variantes dos genes SREBF1 -36delG (região promotora), SREBF2 G1784C (A595G exon 10, rs2228314 do banco dnSNP) e
Para o polimorfismo SREBF1a –36delG foram utilizados os iniciadores previamente descritos (VEDIE et al., 2001, ARAZI et al, 2008). Para os polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G foram desenhados iniciadores com auxílio do programa Primer Premier® v. 5.0 (Premier Biosoft International, EUA). Na Tabela 1, estão descritos os iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para os polimorfismos estudados.
Tabela 1 - Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR-RFLP
Polimorfismo Seqüências dos Iniciadores do Produto Tamanho de PCR
Referência
SREBF1a -36delG 5’ CGAGGCTGGATAAAATGAAT 3’ 5’ CACACCTTCGATGTCGGTCA 3’ 464 bp
VEDIE et al., 2001
SREBF2 G1784C 5’-GGGGGAGTAGAAGTCTATATCA-3’ 5’-AGAACTGGCAAATCAAGCTA-3’ 435 bp
----
SCAP A2386G 5’-AGAAGGGGCAAGGGAAAAG-3’ 5’-TTCTGCAGGACATCGAGTG-3’ 342 bp
ARAZI et al. 2008
Nota:www.ensembl.org Número de acesso: SREBF2: ENSG00000198911;
Nos ensaios de PCR, foram utilizados de 100 a 400 M dos iniciadores (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 0,2 mM de cada nucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Amersham Biosciences, NJ, EUA), e 1 unidade de DNA polimerase e tampão de PCR [composição: Tris-HCl a 75mM pH 9.0, MgCl2 a
2mM, KCl a 50 mM, (NH4)2SO4 a 20mM (Biotools, Madri, Espanha)], e 100 g de
Tabela 2 - Condições de amplificação pela PCR para os polimorfismos SREBF1a
-36delG, SREBF2 G1784C e SCAP A2386G.
Polimorfismo Desnaturação Hibridação Extensão Ciclos
SREBF1a-36delG 96oC/1 min 60oC/2 min 72oC/2 min 30
SREBF2 G1784C 96oC/1 min 53oC/1 min 72oC/1 min 32
SCAP A2386G 95oC/1 min 58oC/1 min 72oC/1 min 38
Os produtos de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM) durante 30 minutos a 100V e 60mA, corado com brometo de etídeo a 0,5 µg/mL (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).e documentados como descrito no item 3.4. Como referência, foi utilizado um marcador de tamanho molecular de DNA de 100 bp (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). Os produtos de PCR foram digeridos com endonucleases de restrição por 4h, em banho de água (FANEM Ltda., São Paulo, SP, Brasil) a 37oC, em volume final de reação de 10 µL, nas condições apresentadas na tabela 3.
Tabela 3 - Condições otimizadas para os ensaios de restrição dos produtos de PCR com endonucleases.
Polimorfismo Endonuclease Quantidade Produtos de restrição
SREBF1a -36delG Apa I 30 U 131, 333 bp
SREBF2 G1784C Nae I 4 U 185, 150, 98bp
Os produtos de digestão enzimática para o polimorfismo –36delG do
SREBF1a foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM) durante 50 minutos a 100V e 60mA, corado com brometo de etídeo a 0,5 µg/mL (SAMBROOK; RUSSEL, 2001)., utilizando-se como referência um marcador de tamanho molecular de DNA de 100 bp. Os géis foram corados e documentados como indicado no item 3.4. Na figura 4, podem ser observados os genótipos G+G+ (linha 1), G+ (linha 2) e G-G- (linha 3).
Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo, dos produtos de restrição do SNP SREBF1a -36delG Linha M: marcador de tamanho molecular de DNA de 100 bp. Linha 1: genótipo G+G+. Linha 2: genótipo G+G-. Linhas 3: genótipo G-G-.
caracterizar os tamanhos dos fragmentos gerados pela restrição enzimática. Os géis foram, posteriormente, corados com nitrato de prata (Merck S.A., Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e documentados utilizando-se o sistema de digitalização de imagem (HP Scan Jet 3400C, Hewlett-Packard®, Hong Kong, China).
Nas figuras 5 e 6, são apresentados os perfis de RFLP dos polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G, respectivamente. A banda de 185bp observada na figura 5 indica a presença do sítio constitutivo para corte da endonuclease de restrição NaeI para o polimorfismo SREBF2 G1784C. Podemos observar os genótipos CC (linha 2), GC (linha 1, 3 e 4) e GG (linha 5). Para o polimorfismo SCAP A2386G, observa-se os genótipos AA (linha 2), AG (linhas 1, 3 e 5) e GG (linhas 4 e 6). O corte da enzima no sítio constitutivo pode ser observado pela presença da banda de 152bp.
Figura 5 - Eletroforese em gel de acrilamida 10% dos perfis de RFLP do polimorfismo
SREBF2 G1784C. Trilha M: marcador de tamanho molecular de DNA de 50 bp. Linha 2:
Figura 6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, dos produtos de restrição do SNP SCAP A2386G Linha M: marcador de tamanho molecular de DNA de 100 bp. Linha 2: genótipo AA. Linhas 1,3 e 5: genótipo AG. Linhas 4 e 6: genótipo GG.
3.6 Triagem de mutações dos genes LDLR e APOB
As mutações R3500Q e R3531C do gene APOB foram triadas utilizando o método PCR-RFLP de acordo com Cavalli et al (2000).
Para a triagem de mutações no gene LDLR nos indivíduos do grupo HF foi utilizada o método de SSCP. Os exons e a região promotora do LDLR foram amplificados utilizando-se os iniciadores descritos previamente (HOBBS et al., 1992, Salazar et al., 2002). Brevemente, foram utilizados 100 nM de iniciadores (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 0,2 mM de dNTPs (Amersham Biosciences, NJ, EUA), e 1 unidade de DNA polimerase e tampão de PCR (composição: Tris-HCl a 75mM pH 9.0, MgCl2 a 2mM, KCl a 50 mM, (NH4)2SO4 a 20mM (Biotools,
Os produtos de PCR foram desnaturados e separados em condições não-desnaturantes utilizando-se o sistema GenePhor™ (GE Health Care, Chalfont St. Giles, Reino Unido). Resumidamente, 1µL de produto de PCR foi diluído em 20µL de solução desnaturante (formamida a 95%, EDTA a 10mM, xilenocianol a 0,05% e azul de bromofenol a 0,05%), submetido à desnaturação por 8 min a 95oC e imediatamente transferido para banho de gelo. A seguir, 5 µL dessa mistura foram submetidos à separação eletroforética no equipamento GenePhor™, utilizando o Kit comercial GeneGel Excel 12.5/24 (GE Health Care, Chalfont St. Giles, Reino Unido) que inclui os tampões de eletroforese e os géis de poliacrilamida a 12,5%. A seguir, os géis foram revelados pela coloração com nitrato de prata e a documentação foi feita como descrito no item 3.5.
3.7 Seqüenciamento de DNA
Para análise das seqüências foi utilizado o programa BioEdit (Carlsbad, CA, EUA), os eletroferogramas e a seqüência de referencia (http://www.ucl.ac.uk/ldlr/ LOVDv.1.1.0/refseq/).
3.8 Extração e avaliação do RNA total de células mononucleares
As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram separadas por gradiente descontínuo de Ficoll-Hypaque (Sigma Aldrich, MO, USA) densidade específica de 1,070 g/mL, a temperatura ambiente (SALAZAR et al., 2000). Resumidamente, em tubos cônicos de 15 mL de capacidade, foram pipetados 10 mL de sangue humano com EDTA (1mg/mL), diluídos com igual volume de tampão Tris-EDTA (Tris-HCl a 10mM, pH 7,4 e EDTA a 10mM, pH 8,0), sobre 3 mL de Ficoll-Hypaque. O tubo foi centrifugado a 800 g por 30 min. a temperatura ambiente e a camada de células mononucleares foi recolhida. As células foram lavadas com tampão Tris-EDTA contadas em câmara de Neubauer e imediatamente submetidas à extração do RNA total.
O RNA extraído foi quantificado (A260nm) e foi avaliado o grau de pureza
(A260/A280) por espectrofotometria no ultravioleta (UV) (SAMBROOK; RUSSEL,
2001). A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1,0% contendo formaldeído a 2,2M e tampão MOPS [MOPS a 20mM (pH 7,0), acetato de sódio a 8mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] preparado com água esterilizada tratada com DEPC (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
Os valores de concentração do RNA total extraído estão descritos na tabela 4. As concentrações médias de RNA total foram similares entre os grupos de indivíduos (p = 0,675). A razão 260/280 nm determina o grau de pureza de um ácido nucléico. Para amostras de RNA, a faixa dessa razão deve estar entre 1,8 e 2,0 (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
Tabela 4 - Dados de quantificação das amostras de RNA obtidas de células mononucleares do sangue periférico nos indivíduos estudados
Grupos Fases do tratamento Concentração (µg/mL)
HF (25) Basal 427,1 ± 221,1
Sinvastatina 368,9 ± 237,6 Sinvastatina + Ezetimiba 488,7 ± 318,5
HNF (72) Basal 441,8 ± 273,5
Atorvastatina 447,2 ± 286,4 NL (125) Sem tratamento 391,8 ± 209,1
3.9 Análise da expressão do mRNA por RT-PCR em tempo real
A quantificação da expressão de mRNA dos genes SREBF1a, SREBF2,
SCAP, LDLR, HMGCR e NPC1L1 em CMSP, foi realizada por transcrição reversa do mRNA seguida de PCR (RT-PCR) em tempo real, utilizando o sistema de amplificação TaqManTwo Step RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA).
A primeira etapa consistiu da síntese de cDNA a partir de 1 µg de RNA, na presença de 200 g de iniciadores aleatórios (random primers) (Invitrogen, MD, EUA), DTT 20 mM (Invitrogen, MD, EUA), 200 µM dNTP 10 mM (Amersham-Pharmacia Biotech do Brasil, Brasil), 200 U de transcriptase reversa (SuperScriptTM II RT RNase H-) e tampão de RT (Tris-HCl 250mM pH 8,3, KCl
375 mM, MgCl2 15mM) (Invitrogen, MD, EUA). A mistura foi incubada por 10 min
a 25ºC, seguida de 50 min a 42ºC e 15 min a 70ºC. O cDNA obtido foi armazenado a –20ºC até a realização da PCR.
Tabela 5 - Número de catálogo dos ensaios utilizados (iniciadores + sonda)
Gene Número de catálogo
SREBF1a Hs00231674_m1
SREBF2 Hs00190237_m1
SCAP Hs00299593_m1
HMGCR Hs00168352_m1
LDLR Hs00181192_m1
Os demais reagentes de PCR foram adquiridos em solução denominada
Master Mix (MgCl2 25 mM, dNTPs 10 mM, AmpEraseR UNG 30U, enzima
AmpliTaq Gold 150 U e tampão de reação) (Applied Biosystems, Foster City, CA EUA). Para uso, essa solução foi diluída 2 vezes. Foi utilizado volume final de 25
µL por reação e os ensaios foram realizados em duplicata.
Para o gene NPC1L1, foram sintetizados iniciadores e sonda separadamente devido à baixa expressão desse gene nas CMSP. Após otimização a concentração da sonda escolhida foi de 300 nM e dos iniciadores de 200 nM.
O programa de PCR em tempo real foi constituído de: (1) um ciclo 2 min a 50ºC, (ativação da UNG); (2) um ciclo de 10 min a 95ºC, (inativação da UNG); (3) 40 ciclos de 15 s a 95ºC (desnaturação) e 1 min a 60ºC (hibridização e extensão).
System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA EUA) que geram curvas semi-logaritímicas dos sinais de amplificação. Esse programa fornece o parâmetro ciclo em que o sinal de fluorescência é significativo, denominado ciclo
treshold (Ct) (KUBISTA 2006; BUSTIN; MUELLER, 2005). Para cada amostra
cDNA, o Ct de cada gene é registrado e comparado com o do gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPD) que é utilizado como controle endógeno.
A escolha do controle endógeno foi feita avaliando 6 genes diferentes (GAPD, HRPT1, SDHS, HMBS, B2M e UBC) em uma amostragem de cDNAs que incluíram pacientes normolipidêmicos, hipercolesterolêmicos não tratados e tratados. Após a reação de PCR em tempo real, os dados foram analisados no programa geNorm (PrimerDesign Ltd.). Os genes com menor variação entre as amostras foram GAPD e HRPT1. O GAPD foi o gene escolhido pela disponibilidade do produto.
A quantidade de cDNA utilizada nos ensaios foi otimizada a partir de curva-padrão que permite avaliar a linearidade da amplificação bem como a eficiência da mesma. Para essa finalidade, foram utilizadas diluições seriadas (1:2, 1:4, 1:8 e 1:16) de cDNA de amostras usadas apenas para teste nos ensaios de PCR em tempo real. As diluições de cDNA e os respectivos valores de Ct foram plotados em gráfico que permite verificar a relação entre essas duas variáveis (Ct x log da diluição de cDNA).
