LUCIANA LAMARÃO DAMOUS
EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO
TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE OVÁRIO FRESCO E
CRIOPRESERVADO EM RATAS
São Paulo
2009
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo
Programa de Pós4Graduação em Cirurgia e
LUCIANA LAMARÃO DAMOUS
EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO
TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE OVÁRIO FRESCO E
CRIOPRESERVADO EM RATAS
São Paulo
2009
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo
Programa de Pós4Graduação em Cirurgia e
Experimentação.
Orientadora: Profa Dra Edna Frasson de Souza Montero
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRURGIA
Chefe do Departamento: Profa Dra Lydia Masako Ferreira
Presidente da banca:
Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Profa. Dra. Nara Macedo Botelho Brito
!
À minha mãe biológica SILVIA, que infelizmente não nos encontramos nessa vida tempo suficiente para que eu pudesse lembrar do seu rosto, nem sequer que um dia estivemos juntas. Luz que ilumina meus passos, amenizando sua ausência ao colocar as pessoas certas ao meu lado;
" # #$ % &$ 'Professora Afiliada e Livre Docente da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP, minha orientadora, quem tive o privilégio de conhecer ainda na graduação por ocasião do Curso para Monitores em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental, organizado anualmente por ela. Grande figura humana, caráter incontestável, competência e dedicação admiráveis, além da orientação desta obra, me proporcionou o desenvolvimento de atividades paralelas em Congressos e Cursos de Monitoria o que contribuiu em muito para o meu amadurecimento na vida acadêmica, indo além das atividades obrigatórias do Programa de Pós4Graduação. Sem dúvida uma das melhores pessoas que conheci. Dedico a ela toda minha gratidão e lealdade e espero continuar em seus planos para além desta obra.
"( ( $) #$ *$ +$ , Professor Livre Docente da Disciplina de Histologia e
Ao "( ( * , % & , Coordenador do Programa de Pós4Graduação em Cirurgia e Experimentação, Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Pediátrica da UNIFESP, pelo seu empenho em aprimorar a qualidade do Programa, sempre acessível em atender nossas solicitações.
Ao "( ( !$ - $ . & , Professor Adjunto e Coordenador da Disciplina
de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental e Anestesiologia da Universidade do Estado do Pará (UEPA), e Coordenador do Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da UEPA, meu pai acadêmico. Uma vez egresso deste Programa fundou o LCE da UEPA, permitindo meu primeiro contato com a pesquisa experimental ainda na graduação, o que foi imprescindível para minha formação como futura pesquisadora. Viabilizou minha participação do Curso de Monitores de Cirurgia Experimental em 1996 da UNIFESP, a organização de cursos e coordenação dos estagiários do Laboratório, experiências que me fizeram ter certeza do caminho a seguir depois de concluída a Graduação. Agradeço e admiro seu pioneirismo na região, o empenho em aprimorar o Laboratório e a dedicação e ensino aos estagiários, além da amizade e lealdade desde sempre.
À ,) $/ #$ % .$%$ 0 ' médica citopatologista do Departamento de
Ginecologia da UNIFESP, pela padronização da técnica de coloração e orientação na leitura da citologia dos esfregaços vaginais, permitindo meu livre acesso ao laboratório diariamente durante todo o experimento.
À colega de Pós4Graduação 1 # )2 , do Programa de Pós4Graduação em
Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, minha grande companheira na fase experimental e no dia4a4dia. Sem a sua imensurável ajuda este projeto não teria fluído com a mesma eficiência e qualidade.
Ao colega de Pós4Graduação # * , $)) , do Programa de Pós4Graduação em
Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, sempre disponível para ajudar em qualquer dificuldade.
À Pós4Graduanda # 3 $ # $ % 4 $), do Programa de Morfologia da
UNIFESP, pela contribuição nas análises morfométricas e captura de imagens.
Ao Pós4Graduando $ & &1 /) 3$ ' do Programa de Patologia da
UNIFESP, pela contribuição na técnica de coloração e na análise dos esfregaços vaginais.
À Farmacêutica 5$))6 & #$ ) 2$ , Mestranda da UNIFESP, pela realização da
dosagem hormonal.
Às técnicas do Laboratório de Imunohistoquímica da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo, $ )# &$ 7$ ' # #$ $ $ $%) $ /$) . & &
# & , pela realização da imunohistoquímica.
Ao técnico * - $ #$ ) $ # , do Departamento de Patologia da UNIFESP, pelo
processamento e coloração das lâminas.
À secretária do Programa de Pós4Graduação em Cirurgia e Experimentação )#$) $
* & $ , pelo seu empenho e ajuda em diversos aspectos no decorrer do curso.
Aos meus pais, $ # $ , meu amor incondicional, agradeço pelo carinho e,
principalmente, pelos irmãos que me deram. Vivo com saudades.
Aos meus sogros e pais de coração, 4 $ 8& , dívida de gratidão eterna, pela pessoa
que ensinaram o Sérgio a ser, pela família que somos e pelo carinho de filha que sempre recebi. Ainda pretendo retribuir a altura.
Aos meus irmãos queridos $ # $ % ) e cunhados e irmãos de coração
divido todos os momentos. Presentes de Deus em minha vida, saber que estaremos sempre juntos é o que tenho de mais sólido.
Aos meus sobrinhos recém4chegados * ) ' ) $ % , o verdadeiro sentido
da vida, razão pela qual lutamos e ainda acreditamos em um mundo melhor.
À: , pela alegria que sua existência me proporciona, o melhor de todos os presentes.
; # < #$ 3 = $ - # & # #$ ) > ?'pelo financiamento
do Projeto de Pesquisa e da bolsa de Doutorado Direto, sem os quais não seria possível o desenvolvimento da pesquisa com o mesmo rigor, viabilizando minha participação em congressos nacionais e internacionais para divulgação dos resultados. Processos números 2007/0010749 e 2007/0039448.
Aos #$ $@3$ $ & < , sem os quais nada disso seria viável, dedico meu grande
“Vós, pesquisadores, não deveis confiar em autores que, apenas pelo emprego da imaginação, se fazem intérpretes entre a natureza e o homem, mas somente naqueles que exercitaram seu intelecto com os resultados de experimentos”
Dedicatória ... v
Homenagem Póstuma ... vii
Agradecimentos ... viii
Listas ... xiv
Resumo ... xix
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Objetivos ...4
2. MÉTODOS ... 5
Animais de experimentação... 5
Procedimentos operatórios... 5
Anestesia... 5
Protocolo de ooforectomia e transplante de ovário... 6
Protocolo de precondicionamento isquêmico remoto... 7
Protocolo de criopreservação... 7
Séries de estudo... 9
Protocolo de coleta e coloração dos esfregaços vaginais... 13
Coleta de material e eutanásia... 13
Análise histológica... 13
Protocolo de dosagem hormonal... 14
Protocolo de imunohistoquímica... 15
Análise estatística... 16
3. RESULTADOS ... 17
Série 1... 17
Série 2... 21
Série 3... 33
com e sem PCI4R... 47
4. DISCUSSÃO ... 49
5. CONCLUSÕES ... 60
6. APÊNDICES ... 61
Apêndice 1... 61
Apêndice 2... 63
Apêndice 3... 65
Apêndice 4... 66
Apêndice 5... 67
Apêndice 6... 68
7. REFERÊNCIAS ... 69
Abstract... 76
Anexos... 77
Anexo 1... 77
Anexo 2... 78
Anexo 3... 79
& #$ /
Figura 1 (A) e (B) – Fotografia mostrando o implante de ovário íntegro em
retroperitônio... 6
Figura 2 4 (A) Fotografia mostrando o local de realização do PCI4R na artéria ilíaca comum. (B) Clampeamento da artéria ilíaca comum para
o PCI4R... 7
Figura 3 (A) e (B) – Fotografia mostrando o freezer de congelação lenta com taxas programáveis (CL48800,
) utilizado para criopreservação dos ovários... 8
Figura 4 (A) e (B) – Fotografia mostrando a criopreservação dos ovários em nitrogênio líquido a 4196oC por 24 horas... 8
Figura 5 – Fotografia mostrando criotubos com ovários antes (A) e após a criopreservação (B). (C) Aspecto macroscópico do ovário após
descongelação... 9
Figura 6 – Seqüência dos procedimentos operatórios no grupo de transplante a fresco submetido ao PCI4R... 10
Figura 7 – Seqüência dos procedimentos operatórios no grupo de
transplante criopreservado submetido ao PCI4R... 11
Figura 8 – Delineamento experimental da Série 3... 12
Figura 9 – Fotografia mostrando o local de coleta de sangue na veia cava inferior (VCI) (A) e punção da VCI para coleta de amostra de
sangue(B)... 12
Figura 10 – Fotomicrografias de esfregaços vaginais de ratas mostrando as
fases de estro (A) e de diestro (B) do ciclo estral. ... 17
Figura 11 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e GTx+PCI4R 15 (B). F=folículos. CL=corpos lúteos. M=músculo.
HE... 17
Figura 12 – Média de graduação do VEGF,conforme os grupos... 18
Figura 13 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e
GTx+PCI4R 15 (B). CL=corpos lúteos. VEGF... 19
Figura 14 – Atividade proliferativa pelo Ki467, conforme os grupos... 19
Figura 15 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e
Figura 16 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias
(G) e GTx+PCI4R 21 dias. F=folículos. CL=corpos lúteos. HE... 23
Figura 17 – Comparação entre o número de folículos imaturos viáveis e
atrésicos, conforme os grupos... 25
Figura 18 – Comparação entre o número de folículos maduros viáveis e
atrésicos, conforme os grupos... 25
Figura 19 – Comparação entre o número de corpos lúteos funcionantes e degenerados,conforme os grupos. Funcionantes: p<0,05, 14 dias. Degenerados: p>0,05. Teste de ANOVA... 26
Figura 20 – Média da Graduação do VEGF conforme os grupos... 27
Figura 21 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e
GTx+PCI4R 21 dias. F=folículos. CL=corpos lúteos. VEGF... 28
Figura 22 – Média da Atividade Proliferativa, conforme os grupos... 29
Figura 23 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e
GTx+PCI4R 21 dias. F=folículos. CL=corpos lúteos. Ki467... 30
Figura 24 – Média da Atividade Apoptótica, conforme os grupos... 31
Figura 25 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e
GTx+PCI4R 21 dias. F=folículos. CL=corpos lúteos. Caspase43... 32
Figura 26 – Dia de reinício do estro, expresso em médias por grupo... 33
Figura 27– Linhas de tendência da média do número de dias em estro, para cada grupo separadamente, a cada intervalo de cinco dias, num total de 30 dias de pós4operatório. Dia zero (0) corresponde ao dia da operação... 34
Figura 28 – Linhas de tendência da média do número de ciclos estrais, para cada grupo separadamente, a cada intervalo de cinco dias, num total de 30 dias de pós4operatório. Dia zero (0) corresponde ao dia da operação... ... 35
GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. TG=tecido
de granulação. HE... 37
Figura 30 – Comparação entre o número de folículos imaturos viáveis
e atrésicos, conforme os grupos... 39
Figura 31 – Comparação entre o número de folículos maduros viáveis
e atrésicos, conforme os grupos... 39
Figura 32 – Comparação entre o número de corpos lúteos funcionantes e
degenerados, conforme os grupos... 40
Figura 33 – Média da Graduação VEGF conforme os grupos... 41
Figura 34 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e,
GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. VEGF... 42
Figura 35 – Atividade proliferativa pelo Ki467, conforme os grupos... 43
Figura 36 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e,
GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. Ki467... 44
Figura 37 – Atividade apoptótica, conforme os grupos... 45
Figura 38 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e,
& #$ & 4$)
Tabela 1 4 Número de folículos ovarianos, independente do estágio de
desenvolvimento, conforme o grupo ... 18
Tabela 2 4 Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis e
atrésicos, conforme o grupo ... 24
Tabela 3 4 Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis,
conforme o subgrupo... 24 Tabela 4 4 Número de corpos lúteos totais, considerando4se funcionantes e
degenerados, conforme o grupo... 26
Tabela 5 4 Média e Desvio Padrão dos resultados imunohistoquímicos,
conforme o grupo... 27
Tabela 6 4 Média dos níveis séricos de estradiol (em nmol/L) após 30 dias
de PO, conforme o grupo... 35
Tabela 7 4 Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis
e atrésicos, conforme o grupo... 38
Tabela 84 Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis,
conforme o grupo... 38
Tabela 9 4 Número de corpos lúteos totais, considerando4se funcionantes e
degenerados, conforme o grupo... 40
Tabela 104 Média e Desvio Padrão dos resultados imunohistoquímicos,
conforme o grupo... 41
Tabela 11 4 Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis
e atrésicos, conforme o grupo... 47
Tabela 12 4 Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis,
conforme o grupo... .... 47
Tabela 13 4 Número de corpos lúteos totais, considerando4se
funcionantes e degenerados, conforme o grupo... 48
Tabela 14 4 Médias e Desvio Padrão dos resultados imunohistoquímicos,
& #$ 4 $2 & $ 9 4 )
I/R Isquemia e Reperfusão
PCI Precondicionamento isquêmico
PCI4R Precondicionamento isquêmico remoto
o
C graus Celsius
cm centímetros
mL mililitros
DMSO dimetilsufóxido
M molar
PO Pós4operatório
nmol/L nanomol/litro
H2O2 Água oxigenada
VEGF Vascular endothelial growth factor
4A$& 2 B Avaliar o efeito do precondicionamento isquêmico remoto (PCI4R) no transplante autólogo de ovário fresco e criopreservado em ratas. ,& # B Foram utilizadas 97 ratas Wistar EPM41, adultas jovens, distribuídas em três Séries de estudo: Série 1: Determinar do melhor tempo de PCI4R; Série 2: Avaliar a repercussão precoce e tardia do PCI4R no transplante ovariano (após 4, 7, 14 e 21 dias); e, Série 3: Comparar o efeito do PCI4R no transplante ovariano a fresco e criopreservado, após 30 dias. Foram avaliados esfregaços vaginais, dosagem sérica de estradiol, morfologia, morfometria, estudo da neoangiogênese pelo VEGF, da atividade proliferativa pelo ki4 67 e apoptose pela caspase43. O PCI4R foi realizado na artéria ilíaca comum. O tecido ovariano autólogo foi implantado íntegro e sem anastomose vascular em retroperitônio, fixado por meio de um ponto com fio inabsorvível. A eutanásia foi realizada por meio de dose letal dos anestésicos utilizados após coleta dos materiais para análise.
C( DE
A expectativa de vida de pacientes com câncer tem aumentado drasticamente
com o diagnóstico precoce e com a melhora dos tratamentos com radio e
quimioterapias agressivas. A sobrevida global em cinco anos de seguimento aumentou,
de forma que a qualidade de vida pós4tratamento, influenciada principalmente pelas
seqüelas, tem sido importante motivo de discussões.1,2,3 Dentre estas, destacam4se a
falência ovariana e a infertilidade, especialmente quando acometem mulheres sem
proles constituídas.4,5,6
Algumas estratégias têm sido propostas para preservar a fertilidade de pacientes
com câncer, porém apenas o armazenamento de embriões e oócitos congelados para
futura fertilização não são consideradas experimentais.3,7,8 A criopreservação de
embriões e oócitos necessitam de estimulação ovariana prévia, sendo uma alternativa
apenas para pacientes que tenham parceiro ou aceitem doação de esperma e,
portanto, inviável em crianças. Para muitas pacientes já adultas, o tratamento citotóxico
se inicia imediatamente após o diagnóstico, não havendo tempo suficiente para o
estímulo ovariano.6Já a criopreservação de oócitos tem como desvantagens as baixas
taxas de sobrevida e de fertilização, pois os oócitos humanos maduros são
extremamente sensíveis a variações de temperatura e têm baixa capacidade de
reparar lesões celulares.7,9
A criopreservação de tecido ovariano permanece como uma técnica promissora
porque milhares de oócitos podem ser preservados sem a necessidade de estímulo
ovariano, além de ser viável em crianças e adolescentes.4,9,10 O objetivo dessa técnica
é reimplantar, posteriormente, o tecido ovariano na cavidade pélvica (sítio ortotópico)
ou em sítios heterotópicos como antebraço ou parede abdominal quando o tratamento
for concluído e a paciente considerada livre de doença.4,7,11414,16,17
A partir da década de 90, estudos experimentais realizados em diferentes
espécies, incluindo roedores, ovelhas e primatas, mostraram a influência de diversos
fatores sobre o transplante de ovário. Dentre esses, ressalta4se: número de folículos
primordiais, massa tecidual/espessura cortical do ovário, sítio do transplante,
criopreservação/vitrificação, duração da isquemia, compatibilidade imunológica e idade
O ovário transplantado sem anastomose vascular produz fatores de crescimento
que levam a neoangiogênese em intervalo crítico após o transplante,19 desencadeado
pela hipóxia, principalmente quando o ovário é implantado em sítios ectópicos.20,21
Embora este estímulo ocorra em intervalo curto de tempo, ainda não é suficiente para
evitar a lesão de isquemia e reperfusão (I/R). A lesão isquêmica conseqüente à hipóxia
é agravada à medida que o processo de revascularização se estabelece, ocorrendo
lesão celular intensa principalmente em virtude da geração de espécies reativas de
oxigênio durante o período de reperfusão.19
Os folículos ovarianos são as principais estruturas afetadas pela lesão de I/R
durante a neovascularização acarretando em falência funcional precoce do enxerto.
Neste âmbito, as pesquisas devem focar em medidas que otimizem o processo de
revascularização com conseqüente redução da perda folicular que se estabelece após
o implante.6,9,22425
Algumas estratégias têm sido estudadas com intuito de atenuar a lesão de I/R.
Dentre estas, destacam4se o uso de fatores angiogênicos que aceleram a
revascularização do enxerto e de antioxidantes, que combatem as espécies reativas de
oxigênio.15,22,23,26428 Além do uso de substâncias, táticas operatórias como o implante
do enxerto em áreas de tecido de granulação24 e a criação de uma janela peritoneal
como sítio do transplante14têm sido investigadas no transplante ovariano.
No transplante de fígado e rins, a manobra de oclusão vascular temporária
prévia à preservação do órgão para o transplante, denominado de precondicionamento
isquêmico (PCI) tem sido utilizado.29,30 Tanto estudos experimentais quanto clínicos
confirmaram que o PCI desencadeia uma resposta protetora à lesão de I/R em vários
órgãos e tecidos, com conseqüente aumento da tolerância do órgão a hipóxia.30437
A repercussão sistêmica do PCI atenua a lesão à distância causada pela I/R.
Este processo é chamado de precondicionamento isquêmico remoto (PCI4R) ou PCI à
distância e não é limitado a um órgão ou sistema. Em 1993, Przyklenk et al.38
descreveram um mecanismo de proteção cardíaco com uso de breves períodos de
isquemia em território distante da área do infarto. Posteriormente, Liaw et al. (1996)39
observaram que a isquemia de um grupo muscular protegeu o membro contralateral.
Estudos no laboratório mostraram que o PCI atenua a lesão de I/R no fígado e
intestino, estendendo esta proteção aos pulmões.33,40
Com relação ao seu efeito sobre a vascularização, o PCI promoveu angiogênese
pelo aumento da densidade capilar/arteriolar.41 Kimura et al. (2007)36 mostraram que
na prática clinica o PCI4R promove aumento da vascularização endotelial, podendo ser
uma técnica simples, segura e viável para proteção endotelial de vasos periféricos, já
sendo considerado de uso seguro e útil em cirurgias eletivas de coração, fígado e
pulmão.42,43
Tendo em vista o efeito do PCI4R na angiogênese36,41443 e a necessidade de
acelerar este processo, reduzindo o período de isquemia no enxerto ovariano pós4
transplante, elaborou4se esta pesquisa com a finalidade de se observar o papel do PCI4
C(C 4A$& 2
4A$& 2 $ )
Avaliar o efeito do precondicionamento isquêmico remoto (PCI4R) no transplante
autólogo de ovário em ratas.
4A$& 2 3$ 9"
, $ CB Determinar o melhor tempo de PCI4R, sob o ponto de vista da morfologia, morfometria, neovascularização e proliferação do ovário transplantado
, $ FB Avaliar a repercussão precoce e tardia do PCI4R no transplante ovariano, segundo parâmetros morfológicos, morfométricos e imunohistoquímicos para
neovascularização, proliferação e apoptose
, $ GB Comparar o efeito do PCI4R no transplante ovariano a fresco e
criopreservado, após 30 dias, segundo esfregaço vaginal, morfologia, morfometria,
F H
Antes do início, este projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) sob protocolo 1327/2006 e
aprovado em 20/10/2006.
#$ $@3$ $ & <
Foram utilizados 115 ratos EPM41, fêmeas, adultas, virgens, com idade
entre três e quatro meses, procedentes do Centro de Desenvolvimento de Modelos
Experimentais para Biologia e Medicina (CEDEME) da UNIFESP e receberam água e
ração própria para a espécie e água potável à vontade durante todo o experimento,
sendo mantidos em condições sanitárias, iluminação e temperatura adequadas.
Os animais foram distribuídos em distintas Séries de estudo de acordo com o
enfoque investigado: 1) Determinação do tempo de PCI4R para o ovário; 2)
Repercussão precoce e tardia do PCI4R no transplante ovariano; e, 3) Comparação do
efeito do PCI4R no transplante ovariano a fresco e criopreservado.
$# $ & 3$ &I $ &$
Após a pesagem, os animais foram anestesiados mediante administração de um
composto anestésico na dose de 15 mg.Kg41 peso corpóreo de Xilazina e 60 mg.Kg41
peso corpóreo de Cetamina, aplicado por via intramuscular na face lateral da pata
traseira direita do animal. Quando necessário, foi utilizada metade da dose inicial para
a manutenção do plano anestésico. O animal foi considerado em plano anestésico ao
ocorrer perda dos reflexos córneo4palpebral e de retirada da pata traseira contra4lateral
ao estímulo doloroso por preensão. Em seguida, os animais foram acomodados em
bancada cirúrgica equipada com colchão térmico, mantido em 37oC durante todo o
experimento.
Os animais foram fixados com fita crepe à mesa cirúrgica em decúbito dorsal,
feita tricotomia e anti4sepsia da região abdominal com álcool4iodado e colocação de
campo fenestrado. Foi realizada laparotomia na linha mediana, a partir do segundo par
de glândulas mamárias, no sentido crânio4caudal, com extensão de 6 cm. Foram
foram fixados com fita crepe à bancada cirúrgica. Os procedimentos operatórios foram
realizados com auxílio de microscópio cirúrgico no aumento de 16 vezes, além de
instrumental microcirúrgico apropriado ao procedimento. O fechamento da parede foi
realizado em dois planos: peritôneo4músculo4aponeurótico; e o segundo, pele, ambos
com fio monofilamentar de náilon 540.
& ) #$ " $ & $ & 3) &$ #$ 28
Após a abertura da cavidade abdomino4pélvica, os ovários foram identificados,
seus pedículos clampeados e imediatamente ligados com fio de náilon 840. Em
seguida, os ovários foram removidos bilateralmente na junção dos cornos uterinos
seguida de revisão da hemostasia. Em seqüência os ovários foram lavados com
solução fisiológica (NaCl 0,9%) e ressecadas as tubas uterinas com os fragmentos de
gordura periovarianos.
Após esses procedimentos um ovário íntegro foi implantado no retroperitônio por
meio de um ponto com fio de náilon 840, próximo aos grandes vasos (artéria aorta e
veia cava inferior), sem anastomose vascular. Cada animal recebeu seu próprio ovário
sendo que o contralateral, não utilizado para o transplante foi fixado em formol a 10% e
enviado para análise morfológica (Figura 1).
& ) #$ 3 $ # $ & - J $ &
Figura 1 (A) e (B) – Fotografia mostrando o implante de ovário íntegro em retroperitônio.
.
K )
28
O PCI4R foi realizado por meio de clampeamento da artéria ilíaca comum com
dois microclampes vasculares. Na Série 1, foi realizado por períodos de 5, 10 e 15
minutos de isquemia e igual tempo de reperfusão, conforme o subgrupo. Nas Séries
subseqüentes, por 15 minutos de isquemia seguidos de 15 minutos de reperfusão,
antes de serem realizados os demais procedimentos (ooforectomia e transplante),
conforme o grupo. Nos grupos em que não foi realizado PCI4R, os animais foram
submetidos a um período de observação correspondente ao tempo deste procedimento
para padronizar o tempo operatório (Figura 2).
& ) #$ 3 $ $ 2 <
Nos grupos submetidos ao transplante de ovário criopreservado, após
ooforectomia unilateral, a criopreservação foi realizada conforme protocolo a seguir: O
ovário íntegro foi imediatamente congelado em freezer de congelação lenta. Os ovários
foram colocados em criotubos de 1,2ml com 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) 1,4M
como crioprotetor em meio TL4HEPES e mantidos em temperatura ambiente por 5
minutos. Os criotubos foram selados enroscando a tampa, colocados em freezer com
taxas programáveis (CL48800, ), e congelados
1oC/minuto de 25oC a 10oC, então de 0,5oC/minuto to 47oC, e finalmente mantidos em 4
7oC por 5 minutos. O tecido foi então congelado em 455oC a taxas de 0,5oC/minuto,
colocados em nitrogênio líquido a 4196oC, e mantidos por 24h (Figuras 3 e 4).44 &
&, )9
Figura 2 4 (A) Fotografia mostrando o local de realização do PCI4R na artéria ilíaca comum. (B) Clampeamento da artéria ilíaca comum para o PCI4R.
.
&,)9
Para descongelação, o criotubo foi mantido em temperatura ambiente até que
todo o gelo estivesse derretido (15 a 20 minutos) e, em seguida, o tecido foi transferido
para 5mL de TL4HEPES 5mL em temperatura ambiente por 10 minutos, agitando
suavemente para promover o efluxo de DMSO do tecido. O tecido foi mantido em TL4
HEPES a 37oC até o transplante (Figura 5).44 Para isso, foi realizada uma segunda
laparotomia nos grupos correspondentes para exérese do ovário remanescente e
transplante do criopreservado utilizando4se a mesma técnica descrita anteriormente.
Figura 3 (A) e (B) – Fotografia mostrando o freezer de congelação lenta com taxas programáveis (CL48800, ) utilizado para criopreservação dos ovários.
Figura 4 (A) e (B) – Fotografia mostrando a criopreservação dos ovários em nitrogênio líquido a 4196oC por 24 horas.
.
, $ #$ $ & #
, $ C L $&$ < # $)7 &$ 3 #$ M ' 4 3 & #$ 2 & #
" ) / ' " $& ' $ 2 ) % < $ 3 ) "$ < # 28
& 3) & # > NFO?(
Os animais foram distribuídos em quatro grupos de seis animais cada, de acordo
com os procedimentos realizados:
Grupo Transplante (GTx): animais submetidos à ooforectomia bilateral
seguida de transplante de ovário (n=6);
Grupo Precondicionamento isquêmico remoto (GTx+PCI4R): animais
submetidos ao PCI4R, por período de 5, 10 ou 15 minutos, (GTx+PCI4R 5,
GTx+PCI4R 10 e GTx+PCI4R 15), respectivamente; seguido de
transplante de ovário (n=18).
A eutanásia foi realizada no quarto dia de pós4operatório (PO).
, $ F L 2 ) $3$ 3 $ $ $ & # # M & 3) &$
2 ' $/ # 3 P $& " )I/ ' " ,& $
7 & - 9 3 $ 2 ) % < ' 3 ) "$ < $ 3 3& $ > NOQ?(
Os animais foram distribuídos em cinco grupos de seis animais cada, de acordo
com os procedimentos realizados:
GTx (Grupo Transplante): animais submetidos a transplante de ovário
(n=24);
Figura 5 – Fotografia mostrando criotubos com ovários antes (A) e após a criopreservação (B). (C) Aspecto macroscópico do ovário após descongelação.
GTx+PCI4R (Grupo Transplante + PCI4R): animais submetidos ao PCI4R,
pelo período de 15 minutos e transplante de ovário (n=24).
Os grupos foram distribuídos em subgrupos de acordo com os dias de PO
padronizados para eutanásia: 4o, 7o, 14oe 21odias de PO. Foram coletados esfregaços
vaginais em dias alternados a partir do 2º dia de PO até a identificação de retorno da
ovulação (fase estro).
OOFORECTOMIA UNILATERAL
PCI4R
15min isquemia/15 min rerperfusão
OOFORECTOMIA CONTRA4LATERAL
TRANSPLANTE DE OVÁRIO A FRESCO
, $ G L 3 < # $"$ & # M & 3) &$ 2 " $ $
3 $ $ 2 # ' 3I GR # ' $/ # $ " $/ < 2 / )' " ) / '
" $& ' # /$ 7 )' $ 2 ) % < ' 3 ) "$ < $ 3 3& $
> NOG?(
Os animais foram distribuídos em seis grupos, de acordo com os procedimentos
realizados (FIGURA 7):
GC (Grupo Controle): ooforectomia unilateral (n=6);
GPCI4R (Grupo precondicionamento isquêmico remoto): ooforectomia
unilateral seguido de PCI4R no ovário remanescente (n=6);
GTxF (Grupo Transplante Fresco): ooforectomia bilateral seguido de
transplante unilateral de ovário a fresco (n=6);
GTxC (Grupo Transplante Criopreservado): ooforectomia bilateral seguido
de transplante unilateral de ovário criopreservado (n=6);
Análise histológica
GTxF+PCI4R (Grupo Transplante Fresco + PCI4R): PCI4R, seguido de
ooforectomia bilateral e transplante unilateral de ovário a fresco (n=10);
GTxC+PCI4R (Grupo Transplante Criopreservado + PCI4R): PCI4R,
seguido de ooforectomia bilateral e transplante unilateral de ovário
criopreservado (n=9).
PCI4R
15min isquemia/15 min rerperfusão
OOFORECTOMIA UNILATERAL
OOFORECTOMIA CONTRA4LATERAL
TRANSPLANTE DE OVÁRIO CRIOPRESERVADO
Na Série 3, quinze dias antes dos procedimentos operatórios, todos os animais
foram submetidos à coleta diária de esfregaços vaginais, sempre no mesmo horário,
para caracterização da regularidade do ciclo estral. Foram utilizados apenas os animais
que apresentaram ciclos regulares com duração de quatro a cinco dias, com
caracterização das fases proestro4estro4diestro. Para o transplante ovariano, foi
estabelecida a fase diestro, e para a eutanásia, a fase estro do ciclo estral (Figura 8).
No 1o dia de PO, foi reiniciada a coleta dos esfregaços vaginais, diariamente,
sempre no mesmo horário durante 30 dias. Do 31o ao 35o dias de PO, os animais
foram sendo selecionados para eutanásia, de acordo com a ocorrência da fase estro,
em todos os grupos de estudo (Figura 8).
Criopreservação do ovário por 24h
Análise histológica
Descongelamento 1o tempo
2o tempo
Após 30 dias de coleta, foi considerado para análise o dia de PO em que houve
retorno do ciclo estral (fases proestro e estro), assim como o número de dias em estro
e o número de ciclos estrais. Nesta Série, depois de realizada a laparotomia e antes da
exérese do enxerto ovariano, foi realizada punção da veia cava para coleta de sangue
e dosagem de estradiol sérico (Figura 9).
Figura 9 – Fotografia mostrando o local de coleta de sangue na veia cava (VC) (A) e punção da VC para coleta de amostra de sangue(B).
" $/ < 2 / # 8
& 8 L " $ $ &
CS # C M GR # #$ GC L GS
# #$
3 & # CT # B
$# $ & 3$ &I M " $
# $ &
Figura 8 – Delineamento experimental da Série 3. .
& ) #$ )$& $ ) < # $ " $/ < 2 /
No 1o dia de pós4operatório, foi iniciada a coleta de esfregaço vaginal por meio
de um embebido em solução fisiológica, em lâmina padrão, sempre com os
animais imobilizados, sendo imediatamente fixados em álcool absoluto para posterior
coloração pela técnica de , conforme técnica descrita a seguir: 1) Álcool
70%; 2) Água destilada; 3) Hematoxilina de Harris – 1 minuto 30 seg; 4) Água corrente;
5) Álcool amoniacal por 1 minuto; 6) Água destilada; 7) Álcool 70%; 8) Álcool 96%; 9)
Shorr durante 8 minutos; 10) Álcool absoluto; 11) Xilol; 13) Montagem das lâminas.
As lâminas foram analisadas em microscópio de luz, em aumentos de 10x e 40x.
Foram consideradas as seguintes fases do ciclo estral, de acordo com a proporção de
células observadas nos esfregaços: 1) Proestro: predomínio de células epiteliais
nucleadas; 2) Estro: predomínio de células queratinizadas anucleadas; e, 3) Diestro:
mesma proporção de leucócitos e células epiteliais nucleadas e queratinizadas.45
)$& #$ &$ ) $ $ & 8
Nos dias pré4estabelecidos, conforme a Série, foi realizada eutanásia dos
animais por meio de dose letal dos anestésicos utilizados, após a coleta do enxerto
ovariano, para processamento histológico, e do sangue para dosagem hormonal.
8) $ 7 & )I/
O ovário transplantado em retroperitônio foi removido e imediatamente fixado em
formol tamponado a 10% por 12h, para posterior processamento histológico de rotina e
coloração pela Hematoxilina4Eosina.
Para avaliação do desenvolvimento folicular nas três séries, os folículos
ovarianos foram contados e classificados em dois grupos: folículos em
desenvolvimento, independente do estágio a que pertencessem; e, folículos atrésicos.
Nas Séries 2 e 3, os folículos ovarianos foram classificados de acordo com o grau de
maturidade: folículos imaturos (incluindo primordial, primário e secundário) e folículos
maduros (com único antro volumoso), além dos corpos lúteos. Para contagem foram
considerados tanto os folículos viáveis quanto os atrésicos, assim como os corpos
lúteos funcionantes e degenerados.46
Foram considerados folículos atrésicos aqueles que apresentavam zona
núcleos picnóticos, independentemente do seu tamanho. Os folículos viáveis eram
aqueles que não apresentavam alterações degenerativas, sendo classificado em:
folículo primordial, o que apresentava apenas oócito e uma camada de células
pavimentosas; folículo primário, o que apresentava oócito e uma camada ou mais
camadas de células de forma cúbica ou prismática, mas sem antro; e, folículo
secundário o que apresentava oócito e antro. O folículo maduro era aquele que
apresentava oócito com antro volumoso.46
Corpo lúteo funcionante era o que apresentava células lúteas íntegras, com
núcleo volumoso e rodeadas por capilares sanguíneos. Corpo lúteo em degeneração
era o que apresentava entre suas células infiltrado inflamatório de leucócitos e
macrófagos, em especial de neutrófilos. O infiltrado inflamatório foi considerado intenso
quando o número de leucócitos superava o número de células presentes no tecido
normal.46
A captura e as medições foram realizadas com o auxilio de um sistema
computadorizado, constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a uma
câmera de alta resolução (Axio Cam MRC da Carl Zeiss) e monitor de vídeo colorido.
As medidas foram obtidas utilizando4se o programa de análise de imagens AxionVision
REL 4.6 da Carl Zeiss. As contagens foram realizadas sempre em 4 campos por animal
em aumento de 10x.
& ) #$ # /$ 7 )
A dosagem hormonal dos níveis séricos de estradiol foi realizada no Laboratório
de Esteróides da UNIFESP, utilizando4se o kit Delfia Estradiol (
! "! ! ). O ensaio DELFIA estradiol é um
fluoroimunoensaio de fase sólida, baseado na competição entre o estradiol marcado
com európio e o estradiol da amostra pelo anticorpo policlonal anti4estradiol (derivado
de ratos). As amostras contendo estradiol inibem a ligação entre o estradiol marcado
com európio e as moléculas de anticorpo. Um segundo anticorpo, anti4IgG de rato é a
fase sólida (marcado na placa), e a ligação IgG4complexo estradiol permite a
separação entre o anticorpo ligado e o antígeno livre. A solução de #
dissocia os íons de európio da molécula de estradiol, liberando alta fluorescência
captada pelo aparelho. A fluorescência de cada amostra é inversamente proporcional a
concentração de estradiol na amostra. O Coeficiente de variação intra4ensaio é de
de variação inter4ensaio é de 7% para amostra de 0,21nmol/L e 3,6% para amostras de
0,67nmol/L.
& ) #$ 7 & - 9
A imunohistoquímica utilizada para a pesquisa do anticorpo em tecido ovariano
foi realizada pelo método peroxidase. Os cortes histológicos a 3 fm de espessura
foram realizados em lâminas silanizadas (34Aminopropil4trietoxi4silano4 Sigma) e
seguiu4se o protocolo descrito a seguir: 1) Hidratação: As lâminas foram
desparafinadas com xilol quente (65ºC) 15 minutos e xilol frio por 15 minutos, lavadas
em álcool absoluto 95% e hidratas em água corrente e deionizada; 2) Recuperação
antigênica: Obtida através de alta temperatura em Panela Pascal, com tampão EDTA
pH8,0 para VEGF a 125ºC por 1minuto e para Ki467 e caspase43 com tampão citrato
Ph:6,0, também na panela Pascal na mesma temperatura e tempo. Após este período,
as lâminas foram e lavadas em PBS; 3) Bloqueio: foi realizado o bloqueio da
peroxidase endógena com água oxigenada (H2O2) 10V 3% 10 vezes de 5 minutos
cada e em seguida lavagem com água e PBS; 4) Incubação com o anticorpo primário:
Após os bloqueios, o anticorpo primário Ki467 (Anticorpo monoclonal anti4humano mib4
1 m7240, Dako) e caspase43 (caspase43 p20 (N419:sc41226, Santa Cruz
$ ), título 1:100 foi diluído em BSA foi aplicado sobre os cortes e controles, positivo e negativo de tecido, e as lâminas incubadas % e o anticorpo primário
VEGF (A420:SC4152, Santa Cruz$ ), título 1:100.
As lâminas então foram lavadas em PBS e incubadas pelo Novolink, marca
Novocastra, cód. RE72604K, o pós4primário, em temperatura ambiente, por 30 minutos
o Polímero por 30 minutos, também em temperatura ambiente. Em seguida foi
realizada a revelação pelo cromógeno 3,3 Diaminobenzidina DAB líquido, por 5
minutos. As lâminas foram lavadas abundantemente em água corrente e contra4
coradas com Hematoxílina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha). Em seguida, as
mesmas foram lavadas em água corrente, desidratadas, diafanizadas e montadas com
resina para microscopia Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).
A análise imunohistoquímica para identificação do Fator de Crescimento
Endotelial Vascular (& ! 4 VEGF) foi realizada no
estroma ovariano enquanto que a avaliação dos índices de proliferação e apoptose por
A imunoexpressão foi avaliada, utilizando4se representação de imagem por meio de um
sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a
uma câmera de alta resolução (Axio Cam MRC da Carl Zeiss) e monitor de vídeo
colorido. As imagens foram obtidas utilizando4se o programa de análise de imagens
AxionVision REL 4.6 da Carl Zeiss.
A imunoexpressão do VEGF foi realizada de acordo com a intensidade da cor
nos campos e porcentagem de células marcadas: ausente ou 0 (< 10%), fraca ou 1 (10
a 25%), moderada ou 2 (25 a 50%) ou forte ou 3 (>50%). As atividades proliferativa e
apoptótica foram medidas de forma quantitativa por meio da contagem do número de
células marcadas por 1.000 células no folículo ovariano e em seguida calculado o
índice de proliferação ou apoptose. As contagens foram realizadas sempre em 4
campos por animal em aumento de 40x.
8) $ $ & &9 &
Para análise dos resultados utilizou4se inicialmente a Análise de Variância (ANOVA),
levando4se em consideração a natureza das variáveis estudadas. Quando houve
significância, complementou4se com o teste de Comparações Múltiplas de Tukey4Kramer, com
o propósito de observar se ocorreram diferenças significantes entre os grupos. Fixou4se em
0,05 ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade, assinalando4se com asterisco
G(
, $ C L $&$ < # $)7 &$ 3 #$ M ' 4 3 & #$ 2 & #
" ) / ' " $& ' $ 2 ) % < $ 3 ) "$ < # 28
& 3) & # > NFO?( " $/ < 2 /
Todos os animais mostraram retorno da função ovariana de acordo com a
citologia do esfregaço vaginal que evidenciou a fase estro do ciclo (Figura 10).
" ) / $ " $&
Todos os grupos apresentaram infiltrado inflamatório, corpo lúteo e folículos
ovarianos em vários estágios de desenvolvimento, sendo que em GTx+PCI4R 5 e
GTx+PCI4R 10 o infiltrado inflamatório foi mais intenso do que GTx e em GTx+PCI4R
15 foi menos do que nos demais grupos (Figura 11).
Em relação ao GTx, os grupos com PCI4R apresentaram maior número de
folículos ovarianos viáveis, vascularização aumentada (neovascularização) e
Figura 10 – Fotomicrografias de esfregaços vaginais de ratas mostrando as fases de estro (A) e de diestro (B) do ciclo estral. .
.
Figura 11 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e GTx+PCI4R 15 (B). F=folículos. CL=corpos lúteos. M=músculo. HE.
vasodilatação, sendo que em GTx+PCI4R 15 havia o maior número de folículos viáveis
em relação aos demais grupos (p=0,6759).
Tabela 1 4 Número de folículos ovarianos, independente do estágio de desenvolvimento, conforme o grupo
82$ & , & ) U 2 82$
@ 9 23 32 28
@V M S 11 24 35 31
@V M CR 16 29 45 36
@V M CS 24 36 60 40
p= 0,6759. Teste de Kruskal4Wallis'
7 & - 9
Quanto ao estudo da neovascularização pelo VEGF, a análise de células por
campo em GTx+PCI4R 10 mostrou maior intensidade de cor em relação aos outros
grupos, coincidindo com a maior marcação para VEGF neste mesmo grupo (média de
graduação igual a 3,0), seguido de GTx+PCI4R 15, GTx+PCI4R 5 e GTx com médias de
graduação 2,5; 2,3 e 2,0 respectivamente. Entretanto, ocorreu diferença significante
somente na comparação entre os grupos GTx+PCI4R 10 % GTx (p<0,05) (Figuras 12 e 13).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
GTX GTx+PCI4R 5 GTx+PCI4R 10 GTx+PCI4R 15 2,0
2,3
3,0
2,5
#
<
A atividade proliferativa avaliada pela marcação do Ki467 mostrou atividade
proliferativa em todos os grupos, com os seguintes valores: GTx com 80%, GTx+GPCI4
R 5 com 76%, GTx+GPCI4R 10 com 67% e GTx+GPCI4R 15 com 64%, entretanto não
houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) (Figuras 14 e 15).
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%
GTX GTx+PCI4R 5 GTx+PCI4R
10 GTx+PCI4R 15 80% 76% 67% 64% & 2 # # $ ) "$ & 2 >5 MT W ?
Figura 14 – Atividade proliferativa pelo Ki467, conforme os grupos. p>0,05. Teste de Kruskal4Wallis.
Figura 13 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e GTx+PCI4R 15 (B). CL=corpos lúteos. VEGF.
Figura 15 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx (A) e GTx+PCI4R 15 (B). F=folículos. CL=corpos lúteos. Ki467.
, $ F L 2 ) $3$ 3 $ $ $ & # # M & 3) &$
2 ' $/ # 3 P $& " )I/ ' " ,& $
7 & - 9 3 $ 2 ) % < ' 3 ) "$ < $ 3 3& $ > NOQ?(
" $/ < 2 /
Todos os animais mostraram retorno da função ovariana de acordo com a
citologia do esfregaço vaginal que evidenciou a fase estro do ciclo.
" ) /
Na análise morfológica do ovário transplantado, observou4se evolutivamente (4, 7, 14 e
21 dias) que o PCI4R atenuou as lesões. No grupo sem PCI4R, aos quatro dias, notou4se
corpos lúteos degenerados e intenso infiltrado inflamatório rico em macrófagos, células
intersticiais e folículos atrésicos; aos sete dias de PO as alterações eram mais intensas do que
aos quatro dias, predominando corpos lúteos degenerados com grande quantidade de vasos
sanguíneos na periferia e áreas de intenso infiltrado inflamatório com neutrófilos e células
intersticiais funcionantes e infiltradas; após 14 dias, havia folículos ovarianos maduros e em
desenvolvimento, corpos lúteos funcionantes e pequena quantidade de infiltrado inflamatório;
ao final de 21 dias predominavam corpos lúteos íntegros e funcionantes, folículos ovarianos
maduros e em desenvolvimento e ausência de infiltrado inflamatório (Figura 16).
Comparando4se agora com os achados morfológicos descritos acima com o grupo de
animais submetidos ao PCI4R, notou4se que no 4o dia os achados foram semelhantes, com
predomínio de corpos lúteos degenerados, folículos ovarianos em estado de degeneração e
infiltrado inflamatório intenso, porém menor do que no grupo sem PCI4R; Com sete dias,
diferentemente dos animais sem PCI4R, predominavam corpos lúteos funcionantes, sendo o
infiltrado inflamatório mínimo; Após 14 dias os achados foram semelhantes do grupo sem PCI4
R, havendo corpos lúteos funcionantes, folículos ovarianos em vários estágios de
desenvolvimento, assim como mínimo infiltrado inflamatório; finalmente, com 21 dias notou4se
maior número de corpos lúteos funcionantes do que no grupo sem PCI4R, vários folículos
Figura 16 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e GTx+PCI4R 21 dias (H). F=folículos. CL=corpos lúteos. HE.
.
.
" $&
Ao se comparar os folículos viáveis com os atrésicos, observou4se que o PCI4R
mostrou tendência de aumentar o número de folículos ovarianos totais à custa dos
folículos viáveis enquanto que os folículos atrésicos permaneceram com valores
semelhantes. Esse aumento foi mais evidente nas avaliações mais tardias (14 e 21
dias, p>0,05) (Tabela 2).
Tabela 2 4 Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis e atrésicos, conforme o grupo
O # W # CO # FC #
@ @V M @ @V M @ @V M @ @V M
2 82$ 59 60 30 33 78 94 78 94
& , 36 40 20 27 10 7 11 10
Total 95 100 50 60 88 101 89 104
Viáveis: p>0,05; Atrésicos: p>0,05. ANOVA.
Analisando4se apenas os folículos imaturos, em todos os dias o PCI4R mostrou
tendência a maior número de folículos do que o grupo sem PCI4R, sendo estes
achados significantes no 14o dia de observação (p<0,001), e o maior número de
folículos imaturos foi observado nas fases mais precoces (quatro e sete dias) (Tabela
3, Figura 17).
Em contrapartida, o inverso ocorreu com relação aos folículos maduros viáveis,
sendo mais numerosos nos períodos mais tardios de avaliação (14 e 21 dias). Ao se
analisar o efeito do PCI4R, este promoveu aumento do número de folículos ovarianos
maduros e viáveis no 21o dia (p<0,05) sendo que nos demais dias os valores foram
semelhantes (p>0,05). Em ambos os grupos, houve um decréscimo do número de
folículos imaturos e aumento dos maduros no decorrer do experimento (Tabela 3,
Figura 18).
Tabela 3 4 Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis, conforme o subgrupo
O # W # CO # FC #
@ @V M @ @V M @ @ V M @ @V M
)9 ) & 50 52 26 30 30* 46* 30 36
)9 ) # 9 8 4 3 48 48 48* 58*
52 30 46 36 50 26 30 30 8 9 2 4 6 4 5 5 0 10 20 30 40 50 60
4 7 14 21
K $ # $ )9 ) & DIAS Viáveis GTx+PCI4R Viáveis GTx Atrésicos GTx+PCI4R Atrésicos GTx
Figura 17 – Comparação entre o número de folículos imaturos viáveis e atrésicos, conforme os grupos. Viáveis: p<0,01 14 dias. Atrésicos: p>0,05. Teste de ANOVA.
8 3 48 58 9 4 48 48 32 18 5 6 30 16 5 6 0 10 20 30 40 50 60 70
4 7 14 21
K $ # $ )9 ) # DIAS Viáveis GTx+PCI4R Viáveis GTx Atrésicos GTx+PCI4R Atrésicos GTx
Figura 18 – Comparação entre o número de folículos maduros viáveis e atrésicos, conforme os grupos. Viáveis: p<0,01 21 dias. Atrésicos: p>0,05. Teste de ANOVA.
Com relação aos corpos lúteos, o PCI4R aumentou o número total à custa de
corpos lúteos funcionantes (p<0,05 14 dias), porém a proporção entre funcionantes e
degenerados se manteve (p>0,05). À semelhança da análise dos folículos maduros,
menor número de corpos lúteos foi observado no 4o e 7o dia, com recuperação
progressiva, sendo que a maior diferença entre os grupos ocorreu no 14o dia, com
maior número de corpos lúteos nos animais submetidos ao PCI4R (p<0.05), fato este
também observado no 21o dia, porém este sem significância estatística (p>0,05)
(Tabela 4, Figura 19).
*
*
Tabela 4 4 Número de corpos lúteos totais, considerando4se funcionantes e degenerados, conforme o grupo
O # W # CO # FC #
@ @V M @ @V M @ @V M @ @V M
" &$ 5 5 4 4 34 46 48 55
#$/$ $ # 38 40 11 12 4 6 5 7
Total 43 45 15 16 38 52 53 62 Funcionantes: p<0,05, 14 dias.
Degenerados: p>0,05. Teste de ANOVA.
5 4 46 55 5 34 48 40 12 6 7 38 11 4 5 0 10 20 30 40 50 60
4 7 14 21
K $ # $ 3 K& $ DIAS Funcionantes GTx+PCI Funcionantes GTx Degenerados GTx+PCI Degenerados GTx
Figura 19 – Comparação entre o número de corpos lúteos funcionantes e degenerados,conforme os grupos. Funcionantes: p<0,05, 14 dias. Degenerados: p>0,05. Teste de ANOVA.
7 & - 9
As análises imunohistoquímicas, analisadas em conjunto mostram que o
efeito benéfico do PCI4R é mais evidente nos períodos tardios de avaliação, quando
ocorre tendência a maior neovascularização, maior atividade proliferativa e menor
atividade apoptótica nas células, sendo estes últimos estatisticamente significantes
(p<0.05) (Tabela 5, Figuras 20 a 24).
Na avaliação do neovascularização, nos dois primeiros dias de avaliação o
PCI4R não mostrou diferença entre os grupos. Nas avaliações seguintes, houve
aumento da expressão, com tendência a maior expressão nos animais submetidos
ao PCI4R, sendo máximo ao final do experimento (21 dias, p>0,05) (Tabela 5,
Figuras 20 e 21).
Com relação à atividade proliferativa, os maiores valores com quatro e sete
dias foram observados nos grupos sem PCI4R (92% % 90% e 82% % 80%,
respectivamente) enquanto que com 14 e 21 dias nos grupos com PCI4R (69% %
81% e 53 % 67%, respectivamente), sendo estes dois últimos estatisticamente significantes (p<0,001) (Tabela 5, Figuras 22 e 23).
Na avaliação da atividade apoptótica, os valores foram progressivamente
menores no decorrer do estudo e os grupos sem PCI4R mostraram tendência a
maiores valores em todos os dias de avaliação: 4 dias – 84% % 82% (p>0,05); 7 dias – 70% % 65% (p<0,01); 14 dias – 59 % 57% (p>0,05); 21 dias – 54%% 47% (p<0,001) (Tabela 5, Figuras 23 e 24).
Tabela 5 – Média e Desvio Padrão dos resultados imunohistoquímicos, conforme o grupo
O # W # CO # FC #
@ @V M @ @V M @ @V M @ @V M
1,7 ± 0,5 1,7 ± 0,5 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 2,3 ± 0,5 2,6 ± 0,5 2,6 ± 0,5 3,0 ± 0
5 MTW 92±10,5 90 ± 11,3 82 ± 22,4 80 ± 0,9 69 ± 8,3 81 ± 1,6 53 ± 1,1 67 ± 2,6
3 $MG 84 ± 3,3 82 ± 1,7 70 ± 2,3 65 ± 2 59 ± 2,0 57 ± 2,8 54±1,5 47 ± 1,4 Comparação intra4grupos (GTx e GTx+PCI4R) – Teste de ANOVA:
VEGF: p>0,05.
Ki467: p>0,05 4 e 7 dias; p<0,001 14 e 21 dias. Caspase43: 4 e 14 dias p>0,05; p<0,05 7 e 21 dias.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
4 dias 7 dias 14 dias 21 dias 1,7 1,6 2,3 2,6 2,6 3 # < GTx GTx+PCI4R
Figura 20 – Média da Graduação do VEGF conforme os grupos.
Figura 21 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e GTx+PCI4R 21 dias (H). F=folículos. CL=corpos lúteos. VEGF.
.
Figura 22 – Média da Atividade Proliferativa, conforme os grupos. Comparação intergrupos (GTx vs GTx+PCI4R):
4 e 7 dias p>0,05; 14 e 21 dias: p<0,001. Teste de ANOVA.
Figura 23 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e GTx+PCI4R 21 dias (H). F=folículos. CL=corpos lúteos. Ki467.
.
0 20 40 60 80 100
4 dias 7 dias 14 dias 21 dias 84
70
59
54 82
65
57
47
&
2
#
#
$
3
3
&I
&
>
3
$
MG
?
GTx GTx+PCI4R
Figura 24 – Média da Atividade Apoptótica, conforme os grupos. Comparação intergrupos (GTx vs GTx+PCI4R):
4 e 14 dias p>0,05; 7 dias: p<0,01; 21 dias: p<0,001. Teste de ANOVA.
Figura 25 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GTx 4 dias (A), GTx+PCI4 R 4 dias (B), GTx 7 dias (C), GTx+PCI4R 7 dias (D), GTx 14 dias (E), GTx+PCI4R 14 dias (F), GTx 21 dias (G) e GTx+PCI4R 21 dias (H). F=folículos. CL=corpos lúteos. Caspase43.
.
!
, $ G L 3 < # $"$ & # M & 3) &$ 2 " $ $
3 $ $ 2 # ' 3I GR # ' $/ # $ " $/ < 2 / )' " ) / '
" $& ' # /$ 7 )' $ 2 ) % < ' 3 ) "$ < $ 3 3& $
> NOG?(
" $/ < 2 /
Todos os animais mostraram esfregaços vaginais com atividade estrogênica no
período pós4operatório (100% de freqüência), exceto um animal de GTxC+PCI4R
(freqüência de 83,3%).
Nos animais submetidos ao transplante de ovário o retorno foi mais tardio do que
naqueles submetidos à ooforectomia, com ou sem PCI4R (GTxC, GTxF, GTxC+PCI4R,
GTxF+PCI4R % GC p<0,001). Entre os grupos transplantados sem PCI4R, GTxF apresentou retorno mais precoce do estro do que GTxC (13% 20 dias) (p>0,05). Ao se analisar o impacto do PCI4R houve tendência de retorno mais precoce tanto em
GTxF+PCI4R quanto em GTxC+PCI4R (p>0,05). GPCI4R apresentou retorno do estro
mais tardiamente em relação a GC (6 % 4 dias, p>0,05) (Figura 26).
0 5 10 15 20 4 6 13 20 11 18 , # # $ # # $
Figura 26 – Dia de reinício do estro, expresso em médias por grupo. p<0,05. Teste de ANOVA. GC < GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R, GTxF, GTxC.
GPCI4R < GTxC+PCI4R, GTxF, GTxC. GTxF > GPCI4R, GC.
GTxC > GTxF+PCI4R, GPCI4R, GC. GTxF+PCI4R < GTxC; > GC. GTxC+PCI4R > GC, GPCI4R.
Todos os animais transplantados apresentaram aumento do número de dias em
estro quando comparados com os animais ooforectomizados (GC e GPCI4R) (p<0,05
fresco apresentaram mais dias em estro do que os criopreservados, com ou sem PCI4
R (p<0,05 11 A 15 dias e 16 a 20 dias) (Figura 27).
Nos grupos transplantados, além do aumento de dias em estro, houve menor
regularidade do ciclo estral, com alternância predominante entre as fases estro e
diestro. -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
1 a 5 6 a 10 11 a 15 16 a 20 21 a 25 26 a 30
GC GPCI-R GTxF GTxC GTxF+PCI-R GTxC+PCI-R
Figura 27– Linhas de tendência da média do número de dias em estro, para cada grupo separadamente, a cada intervalo de cinco dias, num total de 30 dias de pós4operatório. Dia zero (0) corresponde ao dia da operação. Teste de ANOVA. p<0,05:
11 A 15 dias: GTxF+PCI4R > GTxC, GTxC+PCI4R; GTxC+PCI4R < GTxF+PCI4R e > GPCI4R. 16 A 20 dias: GC < GTxF+PCI4R;
GPCI4R < GTxF+PCI4R;
GTxF+PCI4R > GC, GPCI4R, GTxC+PCI4R 21 a 25 dias: GC < GTxF, GTxF+PCI4R;
GPCI4R < GTxF, GTxF+PCI4R.
Ao analisar o número de ciclos estrais durante os 30 dias de pós4operatório, o
PCI4R mostrou tendência em aumentar o número de ciclos no grupo com transplante a
fresco enquanto que no transplante criopreservado o número de ciclos foi semelhante,
-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
1 a 5 6 a 10 11 a 15 16 a 20 21 a 25 26 a 30
GC GPCI-R GTxF GTxC GTxF+PCI-R GTxC+PCI-R
Figura 28 – Linhas de tendência da média do número de ciclos estrais, para cada grupo separadamente, a cada intervalo de cinco dias, num total de 30 dias de pós4operatório. Dia zero (0) corresponde ao dia da operação. Teste de ANOVA. p<0,05: 11 A 15 dias: GTxC+PCI4R < GC, GPCI4R.
/$ , #$ $ & # )
Em geral, os animais transplantados, exceto GTxF, apresentaram níveis séricos
de estradiol mais elevados do que GC (p<0,05). Dentre os transplantados, os enxertos
criopreservados apresentaram tendência a valores mais elevados, entretanto sem
significância (p>0,05). O PCI4R mostrou tendência a aumentar os níveis de estradiol
dos enxertos a fresco, porém não interferiu na resposta dos criopreservados (p>0,05)
(Tabela 6).
Tabela 6 – Média dos níveis séricos de estradiol (em nmol/L) após 30 dias de PO, conforme o grupo
M @ @ @ V M @ V M
,# 0,05 0,125 0,061 0,151 0,105 0,147 0,006 0,159 0,017 0,086 0,055 0,103 p<0,05 Teste de Kruskal4Walis.
GC< GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R.
" ) /
No grupo Controle, a região cortical apresentava folículos ovarianos em vários
estágios de desenvolvimento, além de corpos lúteos. Entre os folículos e corpos lúteos
foram observadas células intersticiais poliédricas. Na região medular havia inúmeros
vasos sanguíneos. Em alguns casos havia infiltrado de leucócitos, sugestivo de
degeneração.
No GPCI4R os achados foram semelhantes aos do grupo Controle. Nos Grupos
se bem preservado, sendo possível identificar o local do implante com a presença de
cistos ao redor, que podem corresponder a áreas de ovulação, além de
neovascularização neste local com tecido de granulação rico em vasos sanguíneos. Os
achados foram semelhantes em ambos os grupos, com presença de inúmeros folículos
ovarianos em vários estágios de desenvolvimento e corpos lúteos funcionantes e
degenerados (Figura 29).
O GTxF+PCI4R apresentava morfologia mais preservada do que GTxF, mesmo
nas áreas de fixação do enxerto, porém menos preservado do que o Grupo Controle.
Já com relação aos achados morfológicos de GTxC+PCI4R, estes foram semelhantes a
" $&
Os grupos transplantados apresentaram maior número de folículos ovarianos
viáveis do que os grupos ooforectomizados (p>0,05). Com relação aos folículos
atrésicos, os valores foram semelhantes entre os grupos (p>0,05). O PCI4R promoveu
tendência de aumento dos folículos viáveis tanto no transplante fresco quanto no
criopreservado (Tabela 7).
Figura 29 – Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e, GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. TG=tecido de granulação. M=músculo. HE.
Tabela 7 4 Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis e atrésicos, conforme o grupo
M @ @ @ V M @ V M
82$ 56 56 91 88 107 106
& , 8 7 7 10 7 6
64 63 98 98 114 112 Viáveis: p>0,05. Atrésicos p>0,05. Teste de ANOVA.
Quando individualizados os folículos viáveis em imaturos e maduros, novamente
nos grupos transplantados ambos foram mais numerosos do que nos
ooforectomizados, com diferença estatística entre estes e o grupo com transplante
criopreservado com PCI4R (p<0,05 GC% GTxC+PCI4R; GPCI4R% GTxC+PCI4R). Nos folículos maduros houve diferença estatística entre os grupos ooforectomizados (GC e
GPCI4R) e todos os grupos transplantados (p<0,05). O PCI4R mostrou tendência de
aumento tantos dos folículos imaturos e maduros tanto nos enxertos frescos quanto no
criopreservado (Tabela 8, Figuras 30 e 31).
Tabela 8 4 Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis, conforme o grupo
M @ @ @ V M @ V M
)9 ) & 32 31 32 36 41 46
)9 ) # 24 25 59 52 66 60
56 56 91 88 107 106 Folículos imaturos: p<0,05.
GC < GTxC + PCI4R; GPCI4R < GTxC + PCI4R; GTxF < GTxC + PCI4R; Folículos maduros: p<0,05.
GC < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GPCI4R < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GTxC < GTxF+PCI4R.
Teste de ANOVA.
0 10 20 30 40 50
32 31 32
36 41
46
6
4 4 5 4 3
K $ # $ )9 ) & VIÁVEIS ATRÉSICOS
Figura 30 – Comparação entre o número de folículos imaturos viáveis e atrésicos, conforme os grupos. p<0,05. Teste de ANOVA.
0 10 20 30 40 50 60 70 24 25 59 52 66 60
2 3 3 5 3 3
K $ # $ )9 ) # VIÁVEIS ATRÉSICOS
Figura 31 – Comparação entre o número de folículos maduros viáveis e atrésicos, conforme os grupos. p<0,05. Teste de ANOVA.
GC < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GPCI4R < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GTxC < GTxF+PCI4R.
Com relação aos corpos lúteos, os funcionantes foram mais numerosos do que
os degenerados, e à semelhança da análise dos folículos ovarianos, com os grupos
transplantados apresentando maior número de corpos lúteos funcionantes do que os
grupos ooforectomizados (p<0,05). Com relação aos corpos lúteos degenerados, os
valores foram semelhantes entre os grupos (p>0,05). O PCI4R mostrou tendência de
aumentar o número de corpos lúteos funcionantes tanto nos enxertos frescos quanto
no criopreservado (Tabela 9, Figura 32).
Tabela 9 4 Número de corpos lúteos totais, considerando4se funcionantes e degenerados, conforme o grupo
M @ @ @ V M @ V M
&$ 30 32 59 61 65 70
$/$ $ # 4 5 4 5 4 5
34 37 63 66 69 75
Funcionantes: p<0,05.
GC < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GPCI4R < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; Degenerados: p>0,05.
0 10 20 30 40 50 60 70 30 32 59 61 65 70
4 5 4 5 4 5
K $ # $ 3 K &$ FUNCIONANTES DEGENERADOS
Figura 32 – Comparação entre o número de corpos lúteos funcionantes e degenerados, conforme os grupos. Funcionantes: p<0,05.
GC < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; GPCI4R < GTxF < GTxC < GTxF+PCI4R < GTxC + PCI4R; Degenerados: p>0,05.
Teste de ANOVA.
7 & - 9
Na avaliação da neovascularização, os grupos transplantados apresentaram
maior graduação do VEGF do que os ooforectomizados. Quando se analisa o impacto
do PCI4R nos grupos transplantados, no transplante a fresco os valores foram
semelhantes, independente do estímulo PCI4R (2,7 % 2,5 respectivamente). Já nos animais submetidos ao transplante criopreservado, o PCI4R apresentou tendência de
aumentar a graduação (2,3 % 2,8), embora não tenham significância estatística (p>0,05) (Tabela 10, Figura 33).
O PCI4R promoveu aumento da atividade proliferativa e diminuição da atividade
apoptótica tanto nos enxertos frescos quanto nos criopreservados (p<0,05) (Tabela 10,
Tabela 10 – Média e Desvio Padrão dos resultados imunohistoquímicos, conforme o grupo
M @ @
@ V M
@ V M
0,9 ± 0,4 1,7 ± 0,5 2,7 ± 0,5 2,3 ± 0,8 2,5 ± 0,5 2,8 ± 0,4
5 MTW 35 ± 2,6 41 ± 3,3 43 ± 1,7 51 ± 4,2 66 ± 3,7 73 ± 2,8
3 $MG 31 ± 1,8 48 ± 1,5 50 ± 1,5 50 ± 1,5 43 ± 1,7 47 ± 1,5 VEGF:p<0,05:
GC < GTxF, GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GPCI4R < GTxF, GTxC+PCI4R
Ki467: p<0,05:
GC < GPCI4R, GTxF, GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GPCI4R > GC < GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GTxF > GC, GTxC < GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GTxC > GC, GPCI4R, GTxF < GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GTxF+PCI4R > GC, GPCI4R, GTxF, GTxC < GTxC+PCI4R; GTxC+PCI4R > GC, GPCI4R, GTxF, GTxC, GTx+PCI4R. Caspase43: p<0,05.
Teste de ANOVA.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0,9 1,7 2,7 2,3 2,5 2,8 # <
Figura 33 – Média da Graduação VEGF conforme os grupos. p<0,05. Teste de ANOVA. GC < GTxF, GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R;
Figura 34 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e, GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. VEGF.
0 20 40 60 80
35 41
43
51
66 73
&
2
#
#
$
)
"$
&
2
>5
MT
W
?
Figura 35 – Atividade proliferativa pelo Ki467, conforme os grupos. p<0,05. Teste de ANOVA.
GC < GPCI4R, GTxF, GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GPCI4R > GC < GTxC, GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R; GTxF > GC < GTxF+PCI4R, GTxC+PCI4R;
Figura 36 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e, GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. Ki467.
0 20 40 60
31
48 50 50
43 47
&
2
#
#
$
3
3
&I
&
>
3
$
MG
?
Figura 38 4 Fotomicrografias dos enxertos ovarianos dos grupos GC (A), GPCI4R (B), GTxF (C), GTxC (D), GTxF+PCI4R (E) e, GTxC+PCI4R (F). F=folículos. CL=corpos lúteos. Caspase43.
8) $ A & # , $ F $ G' #$ # / 3 & 3) &$ " $
$ $ M
" $&
Em todos os parâmetros estudados, o 14º dia mostrou ser o período a partir do qual ocorre a recuperação da morfologia do enxerto transplantado, independente do estímulo PCI4R. Quando analisado o impacto do PCI4R sobre esta recuperação, este mostrou em tendência em aumentar o número de folículos ovarianos viáveis quando comparado com o grupo sem PCI4R (GTx) (p>0,05). Este efeito só foi notado quando se analisou folículos viáveis e corpo lúteos funcionantes (p<0,05 14 dias), não interferindo na evolução dos folículos atrésicos e dos corpos lúteos degenerados. TABELA 11.
Tabela 11 – Número de folículos ovarianos totais, considerando4se viáveis e atrésicos, conforme o grupo
O # W # CO # FC # GR #
@ @V M @ @V M @ @V M @ @V M @ @ V M
2 82$ 59 60 30 33 78 94 78 94 91 107
& , 36 40 20 27 10 7 11 10 7 7
Total 95 100 50 60 88 101 89 104 98 114 Viáveis: p>0,05; Atrésicos: p>0,05.
Teste de ANOVA.
Os folículos ovarianos maduros e os corpos lúteos funcionantes apresentaram maior número nas fases mais tardias de avaliação (p<0,05 21 dias e 14 dias, respectivamente), enquanto que os folículos imaturos permaneceram com valores semelhantes após o aumento no 14º dia (p<0,05 14 dias e p>0,05 21 e 30 dias). TABELAS 12 e 13.
Tabela 12 – Número de folículos ovarianos imaturos e maduros viáveis, conforme o grupo
O # W # CO # FC # GR #
@ @V M @ @V M @ @V M @ @ V M @ @ V M
)9 ) & 50 52 26 30 30 46 30 36 32 41
)9 ) # 9 8 4 3 48 48 48 58 59 66
Total 59 60 30 33 78 94 78 104 91 107 Folículos imaturos: p<0,01 14 dias.
