Carolina Baeta Neves Duarte Ferreira
Efeitos da administração de metformina e pioglitazona sobre
o metabolismo glicídico e a pressão arterial de ratos
hipertensos tornados obesos pela injeção neonatal de
glutamato monossódico.
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Carolina Baeta Neves Duarte Ferreira
Efeitos da administração de metformina e pioglitazona sobre
o metabolismo glicídico e a pressão arterial de ratos
hipertensos tornados obesos pela injeção neonatal de
glutamato monossódico.
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Carolina Baeta Neves Duarte Ferreira
Efeitos da administração de metformina e pioglitazona sobre
o metabolismo glicídico e a pressão arterial de ratos
hipertensos tornados obesos pela injeção neonatal de
glutamato monossódico.
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Kohlmann Jr.
À minha mãe Vania, Que por tantas vezes critiquei e hoje me pego roubando suas falas. Que bom! Obrigada por participar da minha formação acadêmica, profissional, e mais importante, do meu caráter.
À Bebel,
Por você simplesmente existir na minha vida. Por dividir comigo o soneca do despertador tocando nove vezes de manhã, o meu “nariz alérgico” e o barulho do secador de cabelo.
À “Dona Lu”,
Pela torcida, pelas orações e por ser a avó mais linda que uma neta pode ter.
À Madrinha, Fafá e Flávia,
Apesar da distância, vocês estão inexplicavelmente sempre presentes em todos os momentos importantes pra mim. Sinto saudades e amo vocês demais.
À Maura,
Por ter sempre cuidado de mim e da Bebel como se fôssemos suas filhas.
Ao Prof. Dr. Osvaldo Kohlmann,
Por acreditar em mim desde o primeiro ano da graduação e possibilitar a construção de um caminho acadêmico do qual muito me orgulho.
Ao Prof. Dr. Mário Cesaretti,
Por ter participado da construção deste trabalho diariamente; pelas correções, pelas aulas, por manter a porta da sua sala sempre aberta.
Ao Dr. Milton Ginoza,
Pela ajuda constante e por fazer com que o dia-a-dia de trabalho no laboratório seja descontraído e agradável, sem nunca perder o profissionalismo e a responsabilidade.
Ao Prof. Dr. Agostinho Tavares,
Por ter sido o primeiro a instigar minha vontade em defender uma dissertação de mestrado. Por ser um professor verdadeiramente presente na formação dos alunos não só da pós, mas também da graduação.
À Aline,
Por ser sempre tão companheira, tão competente e tão doce.
Ao Bruno,
À Dra. Fernanda Aragüez,
Pela confiança depositada em mim tanto nas vezes em que eu pedi para mudar meu horário de trabalho no ambulatório, quanto nas vezes em que tive total liberdade para tomar decisões importantes e assinar no “seu impedimento”. Mas principalmente por me “guardar no seu coração”, nunca me esquecerei disso.
Aos amigos: Tathi, Guindalini, Nené, Júlia, Cris, Léo, Ri, Kátia, Clô, Nati,
Vocês são a parte mais gostosa da minha graduação, início disso tudo. Obrigada por estarem sempre ao meu lado.
Aos meus preceptores e colegas da Disciplina de Anestesiologia,
Meu agradecimento pela compreensão da minha ausência para o término deste trabalho e meu orgulho por fazer parte de um programa de residência médica em que posso contar sempre com vocês.
Ao Diego,
RESUMO
Introdução: Resistência insulínica (RI) e adiposidade visceral estão envolvidas na fisiopatogenia da Síndrome Metabólica (SM). Tratamento farmacológico da RI pode melhorar anormalidades glicêmicas e níveis pressóricos.
Objetivos: Produzir modelo de SM, administrando glutamato monossódico (MSG) a ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e analisar efeitos da metformina e pioglitazona sobre pressão arterial de cauda (PAC), peso corporal (PC), metabolismo glicídico (MG), gordura epididimal (GE) e massa ventricular esquerda (VE).
Métodos: SHR receberam até 11º dia de vida MSG (SHR-MSG). Controles receberam solução salina (SHR). Parte dos animais dos dois grupos, a partir de 12 semanas, recebeu metformina (SHR-Metformina e SHR-MSG-Metformina) ou pioglitazona (SHR-Pioglitazona e SHR-MSG-Pioglitazona) por 12 semanas. Neste período, acompanhou-se PAC e PC e, ao final, realizado teste de tolerância à glicose oral (TTGO), para medir áreas sob curvas de glicose e insulina (ASCG; ASCI) e índice de sensibilidade insulínica (ISI). Após, mediu-se GE e VE.
Resultados: Administração de MSG intensificou RI e aumentou GE, sem alterar PAC. Tratamento com metformina nos dois grupos melhorou sensibilidade insulínica e reduziu GE e PAC. Pioglitazona não alterou PAC nos dois grupos; elevou PC nos SHR-MSG; piorou sensibilidade insulínica nos SHR e reduziu GE nos SHR-MSG.
SUMMARY
Background: Insulin resistance and visceral adiposity are key factors regarding metabolic syndrome (MS) physiopathology. Insulin resistance pharmacologic treatment might control diverse factors including glicemic abnormalities and blood pressure.
Objectives: To produce MS model through monossodium glutamate (MSG) administration to spontaneously hypertensive rats (SHR) and analyze metformin and pioglitazone effects upon tail pressure, weight, glucose metabolism, epididimal fat (EF) and left ventricular mass weight.
Methods: SHR received MSG until 11th day after born (SHR-MSG). Controls received saline (SHR). After 12 weeks, part of the two groups received metformin (Meformin and MSG-Metformin) or pioglitazone (Pioglitazone and SHR-MSG-Pioglitazone) during 12 weeks. Tail pressure and weight were recorded. After, oral glucose tolerance test (OGTT) was performed and areas under glucose (AUCG) and insulin (AUCI) curves and insulin sensibility index were measured. Following OGTT, EF and ventricular mass were assessed.
Results: MSG administration increased insulin resistance and EF deposition without affecting tail pressure. Metformin improved insulin sensibility, reduced epididimal fat content and tail pressure. Pioglitazone didn´t impact upon tail pressure in both groups; increased weight in SHR-MSG; worsened insulin sensitivity in SHR, but decreased visceral fat content in SHR-MSG.
ÍNDICE
INTRODUÇÃO 1 OBJETIVOS 12
MATERIAIS E MÉTODOS 13
1. Animais e grupos experimentais 13 1.1. Descrição dos animais e formação dos grupos 13
2. Parâmetros analisados 14
3. Teste de Tolerância à Glicose Oral (TTGO) 15
Procedimento cirúrgico 15
Descrição da técnica e parâmetros utilizados durante o TTGO 15
Dosagem de glicose 16
Dosagem de insulina 16
4. Análise estatística 18
R
ESULTADOS 191. Análise da pressão arterial de cauda 19
2. Análise do peso corporal 19
3. Análise do Teste de Tolerância Oral à Glicose 22 3.1. Glicemia e área sob a curva de glicose 22 3.2. Insulinemia e área sob a curva de insulina 23 3.3. Índice de Sensibilidade à insulina 24 4. Análise da gordura epididimal relativa 26 5. Análise do peso ventricular esquerdo relativo 27
DISCUSSÃO 29 CONCLUSÕES 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
1
INTRODUÇÃO
A Síndrome Metabólica caracteriza-se por um conjunto de fatores de risco para aterosclerose e doença cardiovascular. Esta síndrome tornou-se o protótipo do estilo de vida atual marcado pelo estresse psicossocial, pela mudança de hábitos alimentares e pela diminuição da prática de atividade física.
De acordo com a literatura atual, foi na década de 1920, que Kylin, um pesquisador sueco, relacionou pela primeira vez hipertensão, hiperglicemia e gota com aumento de risco para doenças cardiovasculares (DCV). Duas décadas mais tarde, Vague descreveu a obesidade central ou do tipo andróide como a mais associada a anormalidades metabólicas vistas no diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e DCV. Em 1988, Reaven deu nome à Síndrome X, caracterizando-a pela presença de obesidade visceral, hipertensão arterial e dislipidemia e ligando todos estes fatores a um denominador comum representado pela resistência à insulina (Reaven, 1988; Reaven, 2005; Miranda
et al, 2005a; Eckel, Grundy & Zimmet, 2005; Alberti, Zimmet & Shaw, 2006; Astrup, 2006).
Ainda assim, a Síndrome X era algo não totalmente esclarecido, uma vez que descrevia anormalidades e síndromes clínicas mais prováveis de ocorrerem em associação com a resistência à insulina, já que nem todos os indivíduos portadores dessas anormalidades possuem resistência insulínica, ao mesmo tempo em que nem todos os pacientes resistentes desenvolvem todas estas características. Além disso, num mesmo indivíduo, nem todos os tecidos são igualmente resistentes à insulina e a maioria das manifestações da Síndrome X é secundária à hiperinsulinemia compensatória agindo em tecidos normalmente sensíveis.
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como insulino-insensíveis, de tal forma que desde o aumento da intolerância à glicose até o aparecimento da hiperglicemia de jejum significativa, a resposta à insulina torna-se progressivamente atenuada. A partir daí, na década de 1960, diversos estudos começaram a mostrar a associação entre resistência à insulina (RI), hiperinsulinemia compensatória e DCV. Finalmente, nos anos 80, houve a confirmação de que os indivíduos com hipertensão arterial essencial apresentavam hiperinsulinemia (Reaven, 2005).
Atualmente existem diferentes critérios para o diagnóstico da Síndrome Metabólica (SM), mas todas incluem resistência à insulina, hipertensão arterial, obesidade visceral e dislipidemia – caracterizada por níveis elevados de triglicerídeos e LDL (low density lipoprotein) e níveis baixos de HDL (high density lipoprotein). (J Denis McGarry, 1999; Sprecher & Pearce, 2000; Lindblad et al, 2001; Fulop, Larbi & Douziech, 2003; Miranda et al, 2005a; Pladevall et al, 2006; Alberti, Zimmet & Shaw, 2006; Bahia et al, 2006; Siqueira, Abdalla & Ferreira, 2006).
Estima-se que em 2000 havia 151 milhões de pessoas portadoras desta síndrome no mundo, número que deve aumentar para 221 milhões em 2010 e para 300 milhões em 2025 (Zimmet, McCarty & Courten, 1997; Zimmet, 2002). De acordo com os critérios do NCEP, a prevalência da SM é de 22% na população norte-americana (Miranda et al, 2005a) e de 24% segundo os critérios da WHO (Zimmet, 2002) e do NHANES – National Health and Nutrition Examination Survey-2002 (Brunzell & Ayyobi, 2003). Astrup (2006) analisou os critérios da WHO, EGIR e NCEP e verificou uma prevalência variando de 10 a 23% na população mundial.
No Brasil, segundo a I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica (2006), não foram encontrados estudos de prevalência. No entanto, os autores dessa diretriz analisaram dados mexicanos, norte-americanos e asiáticos e observaram que, de acordo com o critério utilizado, a prevalência da Síndrome Metabólica variou de 12,4 a 28,5% em homens e de 10,7 a 40,5% em mulheres.
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do risco de doenças cardiovasculares e diminuição de sobrevida, ainda se discute qual é a seqüência temporal de aparecimento das alterações metabólicas.
Sprecher & Pearce (2000) estudaram a relação entre a presença de obesidade, DM2, hipertensão arterial e hipertrigliceridemia, isoladamente e em associação, e diminuição de sobrevida. O estudo destes autores mostra que quanto maior é o número de fatores de risco encontrados em um mesmo indivíduo, menor é a sobrevida em 10 anos.
Alguns estudos demonstraram associação significativa entre os principais critérios para diagnóstico da SM e DCV. Lindblad et al (2001) estudaram mais de 2000 pessoas com idade média de 70 anos e demonstraram que todos os indivíduos com achados eletrocardiográficos de doença isquêmica coronariana possuíam todos os componentes da SM (os critérios considerados foram: peso, glicemia de jejum, insulinemia de jejum e após 2 horas de sobrecarga de glicose e pressão arterial).
Em 2002, Han et al analisaram o valor dos índices antropométricos (índice de massa corpórea, circunferência da cintura e relação cintura-quadril) e da hiperinsulinemia em predizer SM. Estes autores demonstraram aumento do risco de desenvolver SM diretamente proporcional aos índices antropométricos e à hiperinsulinemia. Além disso, houve forte correlação com os índices antropométricos, o que nos faz pensar que medidas simples como peso, altura e circunferência da cintura e do quadril são suficientes para a implementação de políticas públicas de prevenção e promoção de saúde.
A partir do estudo INTERHEART, Yusuf et al (2004) estudaram a associação entre o primeiro episódio de infarto agudo miocárdico (IAM) e 9 fatores de risco (tabagismo, dislipidemia, hipertensão, diabetes, obesidade, dieta, atividade física, consumo de álcool e fatores psicossociais). Todos estes fatores estavam estreitamente relacionados com a grande maioria (90%) dos casos de IAM, sendo que os dois mais importantes foram tabagismo e dislipidemia, seguidos por fatores psicossocias, obesidade abdominal, diabetes e hipertensão arterial.
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(2000), esta síndrome é a maior causa de DM2 e aumenta significativamente o risco de doença arterial coronariana.
Embora não se saiba a causa exata da Síndrome Metabólica, a resistência à insulina e a adiposidade visceral são consideradas como os principais fatores envolvidos na fisiopatogenia desse conjunto de desordens metabólicas (Zimmet, 2002; Alexander, 2003; Brunzell & Ayyobi, 2003; Miranda et al, 2005a; Eckel, Grundy & Zimmet, 2005; Astrup, 2006).
A insulina é um hormônio com ações bem conhecidas sobre o metabolismo. No entanto, também possui efeitos sobre o sistema nervoso central e autônomo; o sistema imunológico; o transporte iônico nas membranas celulares; o rim; o endotélio; o tecido adiposo; o turnover ósseo; além de interferir na função de proteínas quinases e fosfatases; na proliferação, diferenciação celular e apoptose; no aumento de fatores de crescimento e na síntese de tecido conjuntivo a partir do estímulo à síntese de DNA e na ativação da transcrição gênica (Rowe et al, 1981; Giordano et al, 1997; Muscelli, 1998; McGarry & Dobbins, 1999; Pessin & Saltiel, 2000; Penicaud et al, 2000;Spiegelman & Flier 2001; Saltiel & Pessin, 2003; Dijk et al, 2003; Bajaj & DeFronzo, 2003; Saltiel, 2003; Carvalho, Colaço & Fortes, 2006; Bahia et al, 2006; Berggren & Leibiger, 2006). O receptor da insulina pertence à superfamília dos receptores tirosino-quinases transmembrana e é uma glicoproteína formada por duas subunidades α e duas
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2002; Bajaj & DeFronzo, 2003; Saltiel, 2003; Fulop, Larbi & Douziech, 2003; Pirola, Johnston & Van Obberghen, 2004; Basuki et al, 2006; Carvalho, Colaço & Fortes 2006; Taniguchi, Emanuelli & Kahn, 2006).
A resistência à insulina é um defeito na transdução do sinal deste hormônio revelando um estado no qual a insulina estimula inadequadamente o transporte de glicose no músculo esquelético e no tecido adiposo e não consegue inibir a produção hepática de glicose. Associada à disfunção das células do pâncreas, a resistência à insulina é uma das anormalidades centrais do diabetes tipo 2 e geralmente está presente vários anos antes do aparecimento de alterações dos níveis plasmáticos de glicose, sendo uma anormalidade precocemente detectada no desenvolvimento desta doença. Nos estados de resistência à insulina, a hiperinsulinemia que aparece como um mecanismo compensatório para tentar aumentar a captação periférica de glicose e acaba afetando outros tecidos e outras vias metabólicas. Na célula pancreática, os AGL, que a princípio estimulam a secreção de insulina, após um período prolongado de exposição em excesso, levam à falência da célula, um efeito conhecido como lipotoxicidade. Com a progressão destas alterações, teremos o desenvolvimento do DM2 marcado resumidamente pelas seguintes características: resistência à insulina, definida como piora na função da insulina em suprimir a produção hepática de glicose e promover aumento da glicemia plasmática e comprometimento da função da célula em secretar insulina. (Saltiel, 2003; Bajaj & DeFronzo, 2003; Ferrannini et al, 2003). Observa-se também que a hipeglicemia e a hiperinsulinemia levam à formação de produtos avançados da glicosilação e outros marcadores de estresse oxidativo que regulam o crescimento celular, a expressão gênica, a ativação de quinases e modulação de canais iônicos, os quais criam um ciclo vicioso de mais disfunção celular e mais alterações de vias metabólicas agravando a própria hiperinsulinemia e hiperglicemia (Fulop, Larbi & Douziech, 2003; Oliveira et al, 2003; Furukawa, 2004; Goldstein et al, 2005).
O DM2 ocorre então por um defeito na secreção de insulina associado à resistência a este hormônio nos tecidos sensíveis a ele como fígado, tecido adiposo e músculo, revelando-se uma doença poligênica (Fulop, Larbi & Douziech, 2003; Bajaj & DeFronzo, 2003).
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ainda é incerta. Surge então a obesidade como um elo entre os fatores de risco cardiovascular e a resistência à insulina, impondo-se como um importante modulador da Síndrome Metabólica.
A adiposidade é reconhecida com um fator modificador da relação entre resistência à insulina, concentração plasmática de glicose e concentração plasmática de insulina (Kim, Abbasi & Reaven, 2004). Já foi demonstrado que a resistência à captação de glicose mediada pela insulina está aumentada em indivíduos obesos não-diabéticos e que esta resistência diminui com a perda de peso (Olefsky, Reaven & Farquhar, 1974; Jones et al, 2000). De acordo com Edmin et al (2001), a obesidade associa-se a um aumento da incidência de hipertensão e morbidade cardiovascular através da hiperinsulinemia. Para estes autores, a hiperinsulinemia: a) afeta diretamente a excitabilidade da célula muscular vascular, levando à vasoconstrição; b) aumenta a atividade simpática; c) dessensibiliza os barorreceptores (que sabidamente inibem o sistema nervoso simpático); d) aumenta o débito cardíaco.
A obesidade passou então a ser reconhecida como um potente fator de risco para o surgimento de diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares, sendo que a ocorrência de diabetes em obesos é 5 a 10 vezes maior do que em indivíduos normais (Brown et al,
2000; Dijk et al, 2003; Wang et al, 2005). No entanto, o acúmulo de gordura visceral vem sendo apontado como um dos mais importantes preditores de alterações metabólicas, que irão culminar em resistência à insulina, DM2, hipertensão arterial e dislipidemia, cujo desfecho é a doença aterosclerótica (Okosum et al, 2000 e 2001; Brown et al, 2000; Harris et al, 2000; Kim et al, 2000; Smith et al, 2001; Nagaretani et al, 2001; Chan et al, 2003; Wang et al, 2005; Wannamethee et al, 2005; Zanella et al,
2006).
Os pacientes portadores de distribuição visceral de gordura têm risco aumentado de doença macrovascular em relação aos obesos com distribuição periférica ou subcutânea (Keller & Lemberg, 2003; Lebovitz, 2003; Ahima & Flier, 2000; Schuldiner, Yang & Gong, 2001; Miyazaki et al, 2002).
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produtor de uma série de peptídeos bioativos como angiotensinogênio, resistina, leptina, adiponectina, TNF-α (fator de necrose tumoral), IL-6 (interleucina) e PAI-1 (inibidor do ativador de plasminogênio) e que recebe influência de diversos sinais neuroendócrinos, associando-se a anormalidades bioquímicas hepáticas e periféricas que se relacionam à resistência à insulina e à Síndrome Metabólica (McGarry, 1995, 1998, 1999, 2001 e 2002; Spiegelman & Flier, 1996 e 2001; Bollheimer et al, 1998; Ahima & Flier, 2000; Penicaud et al, 2000; Steppan et al, 2001; Kim et al, 2001; Shuldiner et al, 2001; Mark
et al, 2002; Steppan & Lazar, 2002; Miyazaki et al, 2002; Dobbins et al, 2002; Stefan & Stumvoll, 2002; Gastaldelli et al, 2002 e 2004; Díez & Iglesias, 2003; Beltowsi, 2003; Dijk et al, 2003; Hauner, 2004; Strazzullo & Galletti, 2004; Touyz, 2005; Caspar-Bauguil, 2005; Kadowaki & Yamauchi, 2005; Bahia et al, 2006; Fleming, Kohlstedt & Busse, 2006; Carvalho, Colaço & Fortes, 2006; Fonseca-Alaniz et al, 2006; Velloso, 2006; Zanella et al, 2006).
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Em 1966, Welborn et al 1 demonstraram que pacientes hipertensos apresentavam hiperinsulinemia, apesar de normoglicêmicos. Este foi um dos primeiros artigos responsáveis pelo início dos estudos que tentaram entender a contribuição da hiperinsulinemia e da resistência à insulina para a patogênese da hipertensão arterial.
O PIUMA (Progetto Ipertensione Úmbria Monitoraggio Ambulatoriale) é um estudo observacional de registro de morbidade e mortalidade em pacientes hipertensos inicialmente não tratados, com início em 1986 e seguimento de 16 anos. Para verificar a co-existência entre HAS e DM2, Verdecchia et al (2004), analisaram os sujeitos deste estudo quanto ao surgimento de DM2 ao longo do período de 16 anos e sua correlação com eventos cardiovasculares. Os eventos considerados foram: acidente vascular encefálico, ataque isquêmico transitório, infarto agudo do miocárdio, doença arterial coronariana, insuficiência cardíaca com necessidade de internação hospitalar, oclusão arterial crônica, oclusão da artéria retiniana e insuficiência renal crônica dialítica. Os resultados encontrados mostram que tanto os pacientes portadores de DM2 antes do início do estudo, quanto aqueles que desenvolveram a doença ao longo do acompanhamento, tiveram um risco 3 vezes maior do que os pacientes apenas hipertensos de apresentar eventos cardiovasculares.
Outros fatores também incluídos como alterações presentes na Síndrome Metabólica são: microalbuminúria, hiperuricemia, hiperleptinemia, aumento da homocisteinemia, esteatose hepática não-alcoólica, apnéia obstrutiva do sono, síndrome dos ovários policísticos e até alguns tipos de neoplasias (Zimmet, McCartey & Courten, 1997; Eckel, Grundy & Zimmet, 2005; Carvalheira & Saad, 2006).
Em relação à terapêutica, vimos que a resistência à insulina representa um papel chave entre todas as alterações encontradas na Síndrome Metabólica. Logo, o tratamento farmacológico desse elo metabólico pode levar ao controle tanto das anormalidades glicêmicas, quanto de outros fatores como a elevação nos níveis pressóricos.
Neste trabalho, foram utilizadas duas drogas hipoglicemiantes de classes diferentes: metformina e pioglitazona.
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A metformina é uma droga do grupo das biguanidas – atualmente a única representante desse grupo na prática clínica – amplamente utilizada no tratamento de pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2.
Esta droga tem revelado diversos efeitos como estímulo da atividade quinase dos receptores de insulina; melhora a atividade das enzimas envolvidas na cascata de sinalização intracelular da insulina; aumento do transporte do GLUT4 até a membrana plasmática e de sua atividade; diminuição do risco de complicações macrovasculares relacionadas ao DM2 como infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral2; diminuição da lipólise e dos ácidos graxos livres circulantes; diminuição dos níveis séricos de triglicérides; diminuição da glicogenólise e da gliconeogênese hepáticas; diminuição do ganho de peso corporal; aumento da captação de glicose estimulada pela insulina nos tecidos periféricos como músculo esquelético e tecido adiposo (DeFronzo, 1999; Goodarzi & Bryer-Ash, 2004; Holland et al, 2004; Bailey, 2005).
Por apresentar tantos efeitos, pode-se supor que a metformina apresenta diversos mecanismos da ação, que embora ainda não estejam completamente definidos, têm sido objetos de muitos estudos.
A pioglitazona é uma droga do grupo das tiazolidinedionas (TZD), uma nova classe de medicações sensibilizadoras da insulina desenvolvidas para o tratamento do DM2. As TZD são agonistas dos receptores PPAR , uma isoforma dos PPARs, receptores nucleares hormonais amplamente estudados na atualidade pelo número crescente de evidências mostrando importante papel na diferenciação dos adipócitos, metabolismos glicídico e lipídico, além de controle vascular.
Foram identificados três tipos de PPARs. O PPARα foi o primeiro deles e está presente predominantemente no fígado e contribui para a oxidação dos ácidos graxos; pode ser ativado em períodos de jejum prolongado, gerando corpos cetônicos como fonte alternativa de energia para os tecidos periféricos. O PPARδ possui distribuição abundante por todo organismo e tem sido visto como um potente regulador do catabolismo dos ácidos graxos e da homeostase energética; o tratamento com agonistas destes receptores retardou o ganho de peso e melhorou a sensibilidade à insulina em animais submetidos à dieta hipercalórica. O PPAR tem sua expressão
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induzida durante a diferenciação dos adipócitos, e quando presente em outros tipos celulares possui a capacidade de transformá-los em adipócitos maduros (Tenenbaum, Fisman & Motro, 2003; Evans, Barish & Wang, 2004); também é expresso nas células -pancreáticas, no endotélio, nos macrófagos e em células hematopoiéticas (Gomes, 2006).
Existem dois tipos de PPAR , o PPAR 1, presente em níveis baixos em muitos tecidos e o PPAR 2, presente em altos níveis no tecido adiposo (Spiegelman & Flier, 1996; Rosen & Spiegelman, 2001).
Spiegelman & Flier (1996) estudaram estes receptores e demonstraram que os PPAR aparecem precocemente na diferenciação dos adipócitos e estão presentes em altos níveis nos pré-adipócitos (mais do que em outras células fibroblásticas). Eles funcionam como reguladores diretos de muitos genes específicos da gordura, apresentam-se como os maiores reguladores que podem atingir o programa genético da adipogênese e formam heterodímeros com outros fatores de transcrição. Alguns ativadores (que estimulam a proliferação celular dos ligantes do PPAR) incluem drogas que causam a proliferação do peroxissomo como os fibratos e uma variedade de derivados dos ácidos graxos, além das tiazolidinedionas.
Pode-se concluir, citando uma revisão sistemática de Natali & Ferrannini (2006), que analisou 19 estudos envolvendo a metformina e 23 envolvendo as glitazonas. A revisão mostrou que o principal efeito da metformina é a redução da produção hepática de glicose, sem ação significante na captação periférica de glicose mediada pela insulina. Já as glitazonas caracterizam-se predominantemente por potencializar a captação periférica, com leve efeito sobre a produção hepática da glicose. Desse modo, temos duas drogas sensibilizadoras da insulina que agem por mecanismos distintos e podem ser usadas simultaneamente sem antagonismos e com a vantagem de, em associação, serem usadas em doses menores, com redução de seus efeitos colaterais.
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OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo são:
1. Produzir um novo modelo experimental para o estudo da Síndrome Metabólica, por meio da administração neonatal de glutamato monossódico (MSG) a ratos espontaneamente hipertensos (SHR – spontaneously hypertensive rats).
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MATERIAISEMÉTODOS
1. Animais e grupos experimentais
1.1.Descrição dos animais e formação dos grupos
Foram utilizados para este estudo, ratos da cepa SHR (Spontaneously Hypertensive Rats – catalogados no Índex Internacional de Animais de Laboratório) fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para a Medicina (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Os ratos foram mantidos no biotério da Disciplina de Nefrologia da mesma instituição em gaiolas coletivas, contendo no máximo seis animais em cada, e permaneceram durante todo o estudo em condições ideais de temperatura (25o C), umidade ambiental (55%) e ciclo luz/escuro com alternância de 12 horas, com acesso livre à água e comida balanceada padrão (Nuvital®).
O protocolo deste estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (CEP n° 0463/06).
Primeiramente, os animais foram divididos em dois grupos: “ SHR-CONTROLE” e “SHR-MSG” (Glutamato Monossódico - Sigma, St. Louis, MO, USA). Este último grupo recebeu injeção de 2 mg/kg de MSG (solução de MSG em pó diluído em água destilada) do segundo até o 11º dia de vida, por via subcutânea, em dias alternados. Os animais SHR-controles receberam o mesmo volume de salina.
A partir do final da 12ª. semana de vida, as pressões arteriais de cauda e o peso corporal foram medidos (medidas basais) e parte dos animais de cada um desses dois grupos passou a receber, por gavagem, 500mg/kg/dia de metformina (Cloridrato de Metformina, Merck genéricos) ou 20mg/kg/dia de pioglitazona (Actus® - Laboratório
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a) SHR-Controle (SHR): 10 animais
b) SHR – Metformina (SHR – Met): 8 animais c) SHR – Pioglitazona (SHR – Pio): 9 animais d) SHR – MSG (SHR – MSG): 5 animais
e) SHR – MSG – Metformina (SHR – MSG - Met): 10 animais f) SHR – MSG – Pioglitazona (SHR – MSG - Pio): 9 animais
2. Parâmetros analisados
Após 12 semanas de vida, os animais tiveram mensurados a pressão arterial de cauda e o peso corporal por duas vezes durante uma semana, no mesmo período do dia. As médias aritméticas destas aferições foram definidas como medidas basais. Os valores da pressão arterial de cauda foram utilizados para a seleção de todos os animais. Os ratos com pressão arterial inferior a 150 mmHg foram excluídos.
Na semana seguinte à realização das medidas basais, iniciou-se então o tratamento com a metformina ou com a pioglitazona, conforme os grupos definidos anteriormente. A partir daí, todos os animais tiveram a pressão arterial de cauda e o peso corporal medidos duas vezes por semana, sempre no mesmo período do dia, sendo representativa a média aritmética dos dois valores semanais.
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A balança utilizada para mensuração da massa dos animais foi da marca Micronal (São Paulo, Brasil) com capacidade máxima de 2610 gramas e precisão de 1,0 grama.
3. Teste de tolerância à glicose oral - TTGO
3.1. Procedimento cirúrgico para o TTGO
Ao final de 12 semanas de tratamento e acompanhamento todos os animais foram submetidos ao teste de tolerância à glicose oral (TTGO). Vinte e quatro horas antes da realização do TTGO, os animais foram anestesiados com cetamina (100mg/kg) e xilasina (10mg/kg) ambas administradas pela via intraperitoneal. Uma vez estabelecida a anestesia, os animais foram colocados em decúbito dorsal e por meio de uma incisão oblíqua na região inguinal, um catéter de polietileno do tipo PE-10 (Intramedic, Clay Adams, New Jersey, USA) foi implantado na artéria femoral esquerda. Este catéter estava conectado a um catéter PE-50 (CPL, São Paulo, Brasil) de 20 centímetros de comprimento. Estes catéteres eram previamente preenchidos com solução salina heparinizada (10 U/ml). O mesmo catéter PE-50 foi passado, com a ajuda de um trocáter, subcutaneamente pelo dorso do animal até a região cervical posterior, onde foi exteriorizado e fixado.
Terminado o efeito da anestesia, os animais foram colocados em gaiolas individuais e permaneceram em jejum de alimento sólido 12 horas antes da execução do teste de tolerância oral à glicose.
3.2. Descrição da técnica e parâmetros analisados durante o TTGO
Ao término do período de 12 horas de jejum, um catéter de polietileno PE-50 de 15 centímetros foi fixado ao catéter do animal como uma extensão, com a finalidade de que a mão do executor do teste não se aproxime do animal a cada coleta de sangue, desta forma evitando que haja estresse adicional para o rato. Aguardou-se um intervalo de tempo variável para que todos os animais se mantivessem calmos.
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sódica pura (5.000U/mL). Depois de realizadas as coletas basais, os animais receberam, por gavagem, 1,7 g/kg de glicose anidra diluída em água destilada. Novas coletas de sangue foram realizadas 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após administração de glicose. Para evitar obstrução do catéter, este era mantido com solução heparinizada 10 mU/mL após cada coleta.
3.2.1. Dosagem de glicose
A dosagem da glicose plasmática foi determinada em uma gota de sangue utilizando-se um glicosímetro (Optium – Abbott MediSense) e tiras reagentes apropriadas (Optium Point-of-Care - Abbott MediSense). Quando a amostra de sangue é aplicada na tira-teste, a glicose do sangue reage com os produtos contidos na tira, produzindo uma pequena corrente elétrica, que é medida e o resultado mostrado no sensor do aparelho.
3.2.2. Dosagem de insulina
O volume de sangue coletado nos tubos Eppendorfs foi centrifugado (Eppendorf Centrifuge 5403) à velocidade de 10.000 rpm por 10 minutos em 4°C, para separação do plasma e dos elementos figurados sangüíneos. O plasma foi separado, colocado em novos tubos Eppendorfs e armazenado à temperatura de -70°C em freezer (Revco Scientific Inc. Asheville NC, USA).
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procedeu-se à leitura dos tubos secos no contador de radioatividade (Wallac 1277 Gammamaster – Automatic Gamma Counter), disponibilizado também pela mesma disciplina. A relação entre a radioatividade da amostra e a quantidade de insulina presente no plasma é inversamente proporcional. Para construir esta relação, os valores obtidos no contador em contagem por minuto foram plotados num programa de computador (Prisma®) e calculados a partir da curva padrão baseada na calibração feita no início do procedimento. Assim, os resultados apresentados pelo computador expressam a concentração de insulina plasmática em µU/mL.
A técnica de radioimunoensaio foi realizada seguindo todas as normas de segurança de manipulação de material radioativo estabelecidas pelo Núcleo de Proteção Radioativa da UNIFESP. Da mesma forma, o material utilizado neste procedimento foi devidamente identificado e depois descartado em local apropriado para elementos radioativos.
Por fim, os valores obtidos no TTGO permitiram o cálculo das áreas sob as curvas de glicose e insulina (ASCG e ASCI) pela regra trapezoidal (Tai, 1994; Monaco & Anderson, 1994) e com estes dois dados o cálculo do índice de sensibilidade à insulina (ISI), pela fórmula modificada de Sluiter et al (1976):
ISI = 10.000/ASCG × ASCI
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4. Análise estatística
Para a análise dos resultados foram utilizados testes paramétricos e testes não-paramétricos, levando-se em consideração a natureza das variáveis estudadas e a variabilidade das medidas obtidas. Foram aplicados os seguintes testes:
a) Análise de variância de medidas repetidas (paramétrica): para comparar as variações temporais da pressão arterial de cauda e do peso corporal. Quando eram observadas diferenças estatisticamente significantes, foi realizado o “teste de comparações múltiplas de Bonferroni”, para distinguir os valores significantes.
b) Análise de variância entre os diferentes grupos (paramétrica): para comparar os valores do peso da gordura epididimal e do ventrículo esquerdo, tanto absolutos quanto relativos. Quando eram observadas diferenças estatisticamente significantes, foi realizado o “teste de comparações múltiplas de Bonferroni”, para distinguir os valores significantes.
c) Análise de variância por postos de Kruskal-Wallis (ANOVA on Ranks – medidas não-paramétricas): foi utilizada para comparar os valores do TTGO, ou seja, as áreas sob as curvas de glicose e insulina e o índice de sensibilidade à insulina. Quando existiam diferenças significantes entre os valores comparados, era aplicado o “teste de comparações múltiplas de Dunn”, para distinguir os valores significantes.
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RESULTADOS
Os resultados estão apresentados como médias aritméticas dos valores individuais de cada grupo, acompanhadas do erro-padrão da média (EPM) como medida de dispersão. Para melhor compreensão dos dados, os resultados da pressão arterial de cauda e do peso corporal estão demonstrados sob forma de variação percentual. Os gráficos correspondentes à variável analisada estão inseridos durante a apresentação do texto e as tabelas contendo os valores individuais estão inseridas no Apêndice.
1. Análise da pressão arterial de cauda (PAC) – Tabelas 1 a 6
A variação percentual da pressão arterial de cauda entre o período basal e a 12ª. semana para os animais SHR foi de +13, 37 ± 3,11 % e quando comparada com a variação entre os animais SHR-MSG (+11,91 ± 3,81%) não apresentou diferença estatística significativa.
O tratamento com metformina produziu diminuição significativa na pressão arterial de cauda dos ratos SHR (SHR: +13, 37 ± 3,11 % versus SHRMet: -7,81 ± 2,58 %, p<0,05) e naqueles que receberam MSG neonatal (SHR-MSG: +11,91 ± 3,81 % versus SHR-MSG-Met: -3,63 ± 2,61 %, p<0,05).
Diferentemente do tratamento com metformina, tratamento com a pioglitazona não produziu redução da pressão arterial de cauda nas 12 semanas de estudo. Tanto a pressão arterial de cauda dos animais do grupo SHR (SHR: +13, 37 ± 3,11 % versus SHR-Pio: +5,79 ± 2,53 %, n.s.3), quanto dos animais MSG (SHR-MSG: +11,91 ± 3,81 % versus SHR-MSG-Pio: +3,46 ± 2,38 %, n.s.), não apresentou variações significativas em relação aos seus respectivos controles.
Em suma, a produção de obesidade pela administração de glutamato monossódico não alterou a pressão arterial de cauda dos animais. O tratamento com metformina foi eficaz em reduzir a pressão arterial tanto nos animais SHR, como nos animais SHR-MSG. Já com o uso da pioglitazona, embora não tenha sido estatisticamente significativa, nota-se uma tendência à redução da variação da pressão arterial de cauda em ambos os grupos.
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Figura 1: Valores médios ± EPM da variação percentual da pressão arterial de cauda (basal/12º semana), dos grupos SHR, SHR-Metformina, SHR-Pioglitazona, SHR-MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona.
*p<0,05 versus SHR; # p<0,05 versus SHR-MSG
2. Análise do peso corporal (PC) – Tabelas 7 a 12
A variação percentual do peso corporal não mudou significativamente com a administração de glutamato monossódico (SHR: +26,11 ± 1,21 % versus SHR-MSG: +17,75 ± 1,32 %, n.s.).
O tratamento com metformina produziu um menor ganho ponderal de peso corporal quando estes animais foram comparados aos animais controles (SHR: +26,11 ± 1,21 % versus SHR-Met: +9,87 ± 2,12 %, p<0,05). Já nos animais MSG, o tratamento com metformina não alterou a variação do peso corporal nas 12 semanas de acompanhamento (SHR-MSG: +17,75 ± 1,32 % versus SHR-MSG-Met: +19,89 ± 1,82 %, n.s.).
Nos animais tratados com pioglitazona, não houve diferença na variação do peso corporal quando comparados os grupos SHR e SHR-Pio (SHR: +26,11 ± 1,21 %
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MSG, houve aumento significativo do peso após tratamento (SHR-MSG: +17,75 ± 1,32 % versus SHR-MSG-Pio: +44,17 ± 2,34 %, p<0,05).
Portanto, os resultados mostram que não se há alteração do peso corporal total com a administração neonatal de glutamato monossódico. O tratamento com metformina levou à redução do peso corporal apenas nos animais SHR. E o tratamento com pioglitazona elevou significativamente o peso corporal total no grupo SHR-MSG-Pio.
Figura 2: Valores médios ± EPM da variação percentual do peso corporal (basal/12º semana), dos grupos SHR, Metformina, Pioglitazona, MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona.
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3. Análise dos Testes de Tolerância Oral à Glicose (TTGO) 3.1. Área sob a curva de glicose (ASCG) – Tabelas 13 a 30
Entre os animais SHR, a administração neonatal de MSG provocou aumento significativo da área sob a curva de glicose (SHR: 237,54 ± 15,81 mg/dL versus SHR-MSG: 261,15 ± 5,28 mg/dL, p<0,05).
O tratamento com metformina levou à diminuição deste parâmetro tanto nos animais controle, quanto nos animais MSG (SHR: 237,54 ± 15,81 mg/dL versus SHR-Met: 148,66 ± 11,03 mg/dL, p<0,05); (SHR-MSG: 261,15 ± 5,28 mg/dL, SHR-MSG-Met: 198,96 ± 15,55 mg/dL, p<0,05).
O mesmo resultado pode ser observado em relação ao tratamento com a pioglitazona (SHR: 237,54 ± 15,81 mg/dL versus SHR-Pio: 173,47 ± 10,92 mg/dL, p<0,05); (SHR-MSG: 261,15 ± 5,28 mg/dL, SHR-MSG-Pio: 186,28 ± 16,57 mg/dL, p<0,05).
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Figura 3: Valores médios ± EPM da área sob a curva de glicose (mg/dL), dos grupos SHR, SHR-Metformina, SHR-Pioglitazona, SHR-MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona, durante o teste de tolerância à glicose oral.
*p<0,05 versus SHR; # p<0,05 versus SHR-MSG
3.2. Área sob a curva de insulina (ASCI) – Tabelas 13 a 30
A administração neonatal de MSG levou a um aumento importante na área sob a curva de insulina dos animais SHR (SHR: 2,44 ± 0,12 µU/mL versus SHR-MSG: 21,68 ± 1,71 µU/mL, p<0,05).
O tratamento dos animais SHR com metformina não alterou esta área (SHR: 2,44 ± 0,12 µU/mL versus SHR-Met: 2,51 ± 0,17 µU/mL, n.s.). Enquanto no grupo SHR-MSG a metformina produziu redução significativa da ASCI (SHR-MSG: 21,68 ± 1,71 µU/mL versus SHR-MSG-Met: 1,85 ± 0,06 µU/mL, p<0,05).
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Houve, portanto, aumento significativo na área sob a curva de insulina entre os animais que receberam MSG no período neonatal e entre os animais SHR tratados com pioglitazona. No grupo SHR-MSG, apenas o tratamento com metformina foi capaz de melhorar a insulinemia durante o teste de tolerância oral à glicose.
Figura 4: Valores médios ± EPM da área sob a curva de insulina (µU/mL), dos grupos SHR, SHR-Metformina, SHR-Pioglitazona, SHR-MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona, durante o teste de tolerância à glicose oral.
*p<0,05 versus SHR; # p<0,05 versus SHR-MSG
3.3. Índice de sensibilidade à insulina (ISI) – Tabelas 13 a 30
O cálculo do ISI mostrou que a administração de MSG aos animais SHR provocou redução significativa do índice de sensibilidade à insulina (SHR: 18,59 ± 1,45 mg-1µU-1mL-1versus SHR-MSG: 1,66 ± 0,14 mg-1µU-1mL-1, p<0,05).
O tratamento com metformina levou à melhora significativa da sensibilidade à insulina nos animais dos grupos SHR (SHR: 18,59 ± 1,45 mg-1µU-1mL-1 versus SHR-Met: 29,04 ± 3,23 mg-1µU-1mL-1, p<0,05) e SHR-MSG (SHR-MSG: 1,66 ± 0,14 mg
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Do mesmo modo que os valores de insulinemia durante o teste de tolerância à glicose oral, o índice de sensibilidade à insulina apresentou piora significativa nos animais SHR que receberam pioglitazona (SHR: 18,59 ± 1,45 mg-1µU-1mL-1 versus
SHR-Pio: 5,54 ± 0,56 mg-1µU-1mL-1, p<0,05). Não houve diferença para os animais SHR-MSG (SHR-MSG: 1,66 ± 0,14mg-1µU-1mL-1 versus SHR-MSG-Pio: 4,12 ± 1,16 mg-1µU-1mL-1, n.s.).
O tratamento neonatal com MSG em animais SHR produziu resistência à insulina, uma vez que determinou diminuição do índice de sensibilidade à insulina. O tratamento com metformina, mas não com pioglitazona, produziu melhora neste parâmetro seja em animais SHR ou SHR-MSG, onde se induziu obesidade neuroendócrina.
Figura 5: Valores médios ± EPM do índice de sensibilidade à insulina (mg-1.µU-1.mL-1),
dos grupos SHR, SHR-Metformina, SHR-Pioglitazona, SHR-MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona, durante o teste de tolerância à glicose oral.
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4. Análise da gordura epididimal relativa – Tabelas 31 a 36
Houve aumento significativo na deposição de gordura visceral representada pela gordura epididimal no grupo de animais que recebeu glutamato monossódico no período neonatal (SHR: 1,17 ± 0,03 g/100g versus SHR-MSG: 1,71 ± 0,08 g/100g, p<0,05).
Nos animais que receberam metformina, observa-se redução significativa do conteúdo de gordura epididimal (SHR: 1,17 ± 0,03 g/100g versus SHR-Met: 0,90 ± 0,06 g/100g, p<0,05; SHR-MSG: 1,71 ± 0,08 g/100g versus SHR-MSG-Met: 0,92 ± 0,04 g/100g, p<0,05).
Para o grupo tratado com pioglitazona, apenas entre os animais SHR-MSG pode-se notar diminuição significativa do conteúdo de gordura epididimal (SHR: 1,17 ± 0,03 g/100g versus SHR-Pio: 1,12 ± 0,04 g/100g, n.s.; SHR-MSG: 1,71 ± 0,08 g/100g
versus SHR-MSG-Pio: 1,10 ± 0,05 g/100g, p<0,05).
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Figura 6: Valores médios ± EPM da gordura epididimal relativa (g/100g), dos grupos SHR, SHR-Metformina, SHR-Pioglitazona, SHR-MSG, SHR-MSG-Metformina e SHR-MSG-Pioglitazona.
*p<0,05 versus SHR; # p<0,05 versus SHR-MSG
5. Análise do peso ventricular esquerdo relativo – Tabelas 31 a 36
O peso ventricular esquerdo não sofreu alteração em nenhuma das intervenções.
Não houve diferença após a administração de MSG (SHR: 2,69 ± 0,13 mg/g
versus SHR-MSG: 2,77 ± 0,28 mg/g, n.s.).
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O mesmo pode ser observado com o tratamento com a pioglitazona (SHR: 2,69 ± 0,13 mg/g versus SHR-Pio: 2,78 ± 0,09 mg/g, n.s.; SHR-MSG: 2,77 ± 0,28 mg/g
versus SHR-MSG-Pio: 2,83 ± 0,10 mg/g, n.s.).
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DISCUSSÃO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de duas drogas hipoglicemiantes de classes distintas em animais hipertensos que receberam glutamato monossódico (MSG) no período neonatal.
A administração de MSG aumentou significativamente a resistência à insulina nos animais SHR, o que ocorreu tanto por meio da piora na captação periférica de glicose, quanto pelo aumento na concentração plasmática de insulina. Observou-se também aumento significativo de depósito de gordura visceral, que se traduziu em elevação do conteúdo de gordura epididimal nos ratos que receberam MSG, embora o peso corporal total não tenha diferido nestes dois grupos. A pressão arterial de cauda não foi alterada pelo MSG, assim como o peso ventricular esquerdo.
O animal SHR é um modelo genético amplamente empregado nos estudos de hipertensão arterial, pois este modelo assemelha-se à hipertensão arterial essencial humana. Neste modelo verifica-se uma diminuição do diâmetro arterial podendo ser devido a uma diminuição do diâmetro transmural, que acontece em aproximadamente 5 semanas. Este aumento na resistência periférica pode ocorrer devido ao aumento do influxo de cálcio por meio de canais de cálcio voltagem-dependentes na membrana celular ou ainda por uma sensibilidade exacerbada a vasoconstritores e atenuada a vasodilatadores (Hughes & Bund, 2002)
30
cardiovascular à contração muscular e os neurônios da medula rostro-ventro-lateral provavelmente desempenham um papel importante nessa reatividade cardiovascular acentuada (Kramer & Waldrop, 2001).
O modelo SHR também se caracteriza por apresentar defeitos na captação de glicose mediada por insulina e alterações no metabolismo dos ácidos graxos nos adipócitos. A análise genética de SHR identificou mutação no gene de uma proteína envolvida na captação e no metabolismo dos ácidos graxos livres, denominada Cd36. Normalmente, as cepas de ratos exibem duas cópias da Cd36, mas os SHR só expressam uma cópia. A deleção no locus dessa proteína Cd36 foi mediada por uma recombinação desigual entre seu gene e um segundo pseudogene, Cd36-ps2, e induzida por uma extensa homogeneidade entre essas seqüências. Tal recombinação resultou na criação de um único gene quimérico nos SHR. A proteína codificada por este gene é então indetectável na membrana plasmática dos adipócitos, o que sugere fortemente que essa mutação é a causa da resistência à insulina, do defeito no metabolismo dos ácidos graxos e da hipertrigliceridemia encontradas nos SHR (Okuda et al, 2002; Glazier, Scott & Aitman, 2001; Pravenec et al, 2002). Um estudo realizado por Hajri et al (2001), demonstrou que os SHR apresentam função diminuída da Cd36 em relação à captação de ácidos graxos pelos tecidos adiposo e muscular, os quais normalmente expressam níveis elevados desta proteína. Os tecidos deficientes em captar ácidos graxos passam a absorver glicose avidamente, o que resulta em hiperinsulinemia e resistência à insulina.
As alterações no metabolismo da glicose nos animais SHR também podem decorrer dos níveis pressóricos elevados, isto é, a hipertensão arterial causa resistência à insulina e hiperinsulinemia pois a resistência vascular periférica aumentada leva ao decréscimo da oferta de glicose e insulina para os tecidos periféricos, especialmente o músculo esquelético. Além disso, a quantidade de glicogênio encontrada no tecido muscular desses animais é diminuída tanto no período pós-prandial, quanto durante o jejum, em que há mobilização de glicogênio, muito embora a atividade das enzimas glicogênio sintetase e glicogênio fosforilase sejam normais. Tal fato pode ser reflexo de respostas metabólicas diferentes à insulina (Gouveia, Kettelhut & Foss, 2000).
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sensibilidade a este hormônio. A combinação da maior atividade adrenérgica e hiperinsulinemia leva à retenção hidrossalina e ao aumento da resistência vascular periférica. A hiperinsulimenia também promove menor produção de óxido nítrico e maior produção de endotelina. Dessa forma, temos um ciclo vicioso de hipertensão, hiperinsulimenia e resistência à insulina (Cesaretti & Kohlmann, 2006).
As alterações descritas até agora se referem apenas aos animais SHR, sem qualquer tipo de intervenção, o que justificou a escolha desta cepa para o estudo da Síndrome Metabólica neste trabalho.
A indução de obesidade através do glutamato monossódico em ratos já foi estudada por outros pesquisadores. Segundo Hirata et al (1997), esse modelo de obesidade decorre da propriedade neurotóxica deste aminoácido neurotransmissor que, após sua administração no período neonatal, ainda com a barreira hemato-encefálica não formada, provoca lesões no sistema nervoso central incluindo neurônios dopaminérgicos da área pré-óptica e do núcleo arqueado do hipotálamo, bem como neurônios colinérgicos do núcleo arqueado sem, no entanto, afetar fibras de passagem. Estas lesões acarretam uma série de alterações como: estímulo à secreção de hormônio luteinizante (LH) via hormônio estimulador de gonadotrofina (GnRH) e à secreção de prolactina (Fernstrom, 2000); aumento no tamanho dos adipócitos (Ochi et al, 1988 e Marmo, 1992); redução da resposta lipolítica do tecido adiposo epididimal estimulado pela noradrenalina (Cheung et al, 1988); aumento na atividade lipogênica do fígado e aumento na atividade da enzima lipase lipoprotéica dos tecidos adiposos epididimal e retroperitoneal (Nascimento Curi et al, 1991); redução da atividade do tônus simpático modulador da atividade do tecido adiposo marrom, o que desencadearia uma atividade funcional ineficiente com menor perda de calor e maior acúmulo de gordura (Yoshida et al, 1984, 1985; Duloo & Young, 1991).
32
animais SHR-MSG apresentaram aumento significativo no conteúdo de gordura epididimal, que não foi acompanhado de aumento no peso corporal total.
33
Desse modo, os animais MSG apresentam uma série de alterações neuroendócrinas, como: menor produção de GH, hipercorticosolismo, hiperinsulinemia e resistência à insulina, hiperleptinemia, menor atividade da enzima translocadora de glicose intracelular GLUT4, menor atividade do tecido adiposo marrom e maior acúmulo de gordura visceral (Cesaretti & Kohlmann, 2006), que associadas às modificações produzidas pela administração de MSG, fornece modelo experimental muito útil para o estudo da Síndrome Metabólica. Tal fato torna-se relevante, uma vez que ainda existem diversos mecanismos fisiopatológicos que precisam ser elucidados, além da importância de termos um modelo animal onde seja possível estudar novas terapias farmacológicas.
Com relação ao método utilizado para chegar ao índice de sensibilidade à insulina, ou seja, o teste de tolerância oral à glicose (TTGO), algumas considerações devem ser feitas. Na prática clínica, sabemos que a evolução para hiperglicemia mantida detectada pela dosagem da glicemia de jejum é resultado de estágios intermediários de tolerância à glicose diminuída que podem durar períodos de tempo variáveis. A tolerância diminuída à glicose não é detectada na dosagem da glicemia de jejum porque neste estágio a euglicemia é mantida à custa de maior secreção pancreática de insulina, ou seja, há também um estado de hiperinsulinemia (Haffner, 1997; Consenso Brasileiro sobre Diabetes, 2002; Radikova, 2003; Atualização Brasileira sobre Diabetes – versão atualizada, 2006).
Algumas críticas são feitas em relação ao TTGO. Para Geloneze & Tambascia (2006) a variação na absorção intestinal de glicose, a influência dos efeitos dos hormônios do eixo êntero-insular e a supressão na produção hepática de glicose em graus variados durante o teste são os principais fatores limitantes.
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Edwards, 2004; Ahrén & Pacini, 2004; Penesova & Radikova, 2004; Marie et al, 2001 e 2005; Matsuda & DeFronzo, 1999; Soonthornpun et al, 2003). Para Ahrén & Pacini (2004), a necessidade de alcançar e manter diferentes steady-states possivelmente num mesmo experimento o torna longo, penoso e de difícil realização na rotina, além de não avaliar a secreção de insulina.
Radikova (2003) avaliou criticamente o uso de alguns índices para a estimativa da sensibilidade à insulina provenientes do TTGO e os comparou com o
clamp. Os índices analisados foram: Índice de Matsuda (Matsuda & DeFronzo, 1999), Índice de Belfiore (Belfiore et al, 19984), Índice de Cederholm (Cederholm & Wibell, 19905), Índice de Gutt (Gutt et al, 20006), Índice de Avignon (Avignon et al, 19997) e Índice de Stumvoll (Stumvoll et al, 20008 e 20019). Todos estes índices apresentaram correlações positivas com o clamp para pacientes com tolerância à glicose normal e intolerantes à glicose; as correlações variaram de 0,48 a 0,89 com nível de significância entre 0,05 e 0,0001. Para os pacientes já portadores de DM tipo 2, a força da correlação diminuiu, embora os valores de significância permanecessem sempre menores que 0,05. Tal achado pode ser atribuído às alterações da motilidade gastrointestinal e da absorção de carboidratos tão comuns nestes pacientes (Urita et al, 2006). Corroborando com Radikova, outros autores também vêem os vários ISI derivados do TTGO como substitutos adequados ao clamp, uma vez que têm mostrado acurácia satisfatória (Ahrén & Pacini, 2004; Aloulou, Brun & Mercier, 2006; Mari et al, 2001 e 2005; Pontiroli et al, 2004; Di Nardo et al, 2006; Matsuda e DeFronzo, 1999; Soonthornpun et al, 2003).
Os parâmetros utilizados neste trabalho para avaliar a sensibilidade à insulina, ou seja, o produto das áreas sob as curvas de glicose e insulina, já vêm sendo
4 Belfiore F, Iannello S, Volpicelli G. Insulin sensitivity indices calculated from basal and OGTT-induced
insulin, glucose, and FFA levels. Mol Gen Metabol 1998; 63: 134-141 apud Radikova (2003).
5 Cederholm J, Wibell L. Insulin release and peripheral sensitivity at the oral glucose tolerance test.
Diabetes Res Clin Prat 1990; 10: 167-175 apud Radikova (2003).
6 Gutt M, Davis CL, Spitzer SB, Llamre MM, Kumar M, Czarnecki EM, Schneiderman N, Skyler JS,
Marks JB. Validation of the insulin sensitivity index (ISI0,120): comparison with other measures. Diabetes
Res Clin Pract 2000; 47: 177-184 apud Radikova (2003).
7 Avignon A, Boegner C, Mariano-Goulart D, Colette C, Monnier L. Assessment of insulin sensitivity
from plasma insulin and glucose in the fasting or post oral glucose-load state. Int J Obes Relat Metab Disord 1999; 23: 512-517 apud Radikova (2003).
8 Stumvoll M, Mitrakou A, Pimenta W, Jenssen T, Yki-Järvinen H, Van Haeften T, Renn W, Gerich J.
Use of the oral glucose tolerance test to assess insulin release and insulin sensitivity. Diabetes Care 2000; 23: 295-301 apud Radikova (2003).
9 Stumvoll M, Van Haeften T, Fritsche A, Gerich J. Oral glucose tolerance test index for insulin
35
utilizados desde 1960 (Yalon & Berson, 196010; Levine & Haft, 197011; Myllynen, Kolvesto & Nikkila, 198712). O conceito presente na fórmula modificada de Sluiter et al
(1976) baseia-se no fato de que quanto maior a concentração plasmática de insulina na presença de maior concentração plasmática de glicose, maior o estado de resistência à insulina. Matsuda & DeFronzo (1999) compararam o índice de resistência à insulina obtido pelo produto das duas áreas com a disposição de glicose mediada pela insulina durante o clamp e obtiveram uma correlação de 0,56 (p<0,0001).
O tratamento com metformina, tanto dos animais controles como dos animais MSG, levou à redução significativa da pressão arterial, da gordura epididimal e da resistência à insulina. Para estes animais, houve aumento do ISI tanto por meio de melhora na sensibilidade insulínica como por redução dos níveis glicêmicos.
No estudo UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study), o grupo que utilizou metformina apresentou diminuição dos eventos cardiovasculares, apesar do controle metabólico semelhante quando comparado com outras modalidades de tratamento (UKPDS group, 1998).
Segundo De Fronzo (1999), o aumento da produção hepática de glicose (PHG) na presença de hiperinsulinemia, que revela um estado de resistência hepática à insulina, é a primeira causa responsável pela hiperglicemia de jejum. É de acordo com esse mecanismo que vem sendo evidenciada a importância da metformina no tratamento do DM2, uma vez que diversos autores consideram a diminuição da produção hepática de glicose o principal efeito desta droga (Luna & Feinglos, 2001; Freemark & Bursey, 2001; Goodarzi & Bryer-Ash, 2004; Kefas et al, 2004; Strowig & Raskin, 2005; Bailey, 2005; Luna et al, 2006; Mahrouf et al, 2006; Natali & Ferrannini, 2006).
Se a redução da PHG parece ser a principal ação da metformina em diminuir a glicemia e se é a ativação do receptor de insulina o mecanismo responsável pela inibição da gliconeogênese e da glicogenólise, pode-se supor que a metformina ativa
10 Yalow R, Berson S. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest 1960; 39:
1157–1175 apud Matsuda & DeFronzo (1999).
11 Levine R, Haft D. Carbohydrate homeostasis. N Engl J Med 1970; 283:237–246 apud Matsuda &
DeFronzo (1999).
12 Myllynen P, Koivisto V, Nikkila E. Glucose intolerance and insulin resistance accompany
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esse receptor. Na tentativa de elucidar os mecanismos moleculares envolvidos neste efeito, Holland et al (2004) estudaram as ações da metformina sobre a atividade quinase do receptor de insulina e sobre a atividade das enzimas tirosino-fosfatases em oócitos Xenopus, um modelo já bem caracterizado para o estudo da metformina. Os autores observaram que a metformina estimula a sinalização da insulina aumentando a fosforilação de sítios específicos de tirosina no receptor e inibe, através de moléculas intermediárias, a atividade da PTB1B (já citada como uma tirosino-fosfatase considerada a maior inibidora do receptor de insulina). Tais resultados revelam, respectivamente, efeitos diretos e indiretos da metformina em estimular o receptor de insulina.
Ampliando as ações da metformina sobre o receptor de insulina, Kumar & Dey (2002) trataram células musculares esqueléticas com insulina cronicamente e verificaram diminuição da fosforilação em tirosina do receptor, da atividade da PI3-K e da captação de glicose. O posterior tratamento com metformina restituiu essas três alterações, mostrando sua participação na captação periférica de glicose estimulada pela insulina. Corroborando com estes dados, Detaille, Wiernsperger & Devos (1999) estudaram a captação de glicose em oócitos Xenopus e viram que, na presença de insulina, a metformina estimula a translocação de transportadores de glicose para a membrana, aumentando a captação desta. Eles descreveram que a metformina facilita a entrada de glicose pela membrana através da modulação das propriedades catalíticas dos transportadores e/ou do aumento da afinidade destes pela glicose.
Por outro lado, algumas linhas de pesquisa atribuem os efeitos sobre a PHG e a captação periférica de glicose à ação da metformina na cadeia respiratória mitocondrial e na ativação da AMPK – AMP activated protein kinase (Goodarzi & Bryer-Ash, 2004; Kefas et al, 2004; Luna et al, 2006; Mahrouf et al, 2006).
A AMPK é ativada em situações de carência de ATP e excesso de AMP, como na hipoglicemia, nos estados de choque, na hipoxemia, na isquemia. Ela fosforila e inativa uma série de enzimas metabólicas envolvidas na síntese de colesterol em ácidos graxos, incluindo a acetil-CoA carboxilase e a HMG-Coa redutase (Kefas et al,
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ativação da AMPK aumenta a atividade da PKB/Akt e de isoformas atípicas da PKC, que por sua vez, levam ao aumento da atividade da PI3-K e da translocação do GLUT4 para a membrana celular (Luna et al, 2006). Goodarzi & Bryer-Ash (2004) acrescentam ainda que a inibição da gliconeogênese pela metformina também ocorre por aumento da fosforilação do IRS-2, inibição de enzimas chaves como fosfoenolpiruvato-carboxilase e glicose-6-fosfato, ativação da piruvato-quinase e diminuição da captação pelo hepatócito de substratos para a gliconeogênese como lactato e alanina, possivelmente por despolarização da membrana celular.
Embora não tenha ação direta sobre a liberação de insulina das células -pancreáticas, motivo pelo qual não causa hipoglicemia, a metformina pode afetar a viabilidade e a função dessas células por meio da ativação da AMPK. Ao estimular a AMPK, a metformina pode inibir parcialmente a biossíntese e a liberação de insulina pelas células , o que pode prevenir a exaustão funcional dessas células em condições de exposição crônica a altas concentrações de glicose e ácidos graxos (Kefas et al,
2004).
Ainda em relação aos efeitos sobre a célula -pancreática, Lupi et al (1998) prepararam culturas de ilhotas humanas purificadas e as incubaram por 24 horas com concentrações diversas de glicose, com e sem metformina. Após este período, foi possível verificar que a metformina teve um efeito protetor nas células expostas a altas concentrações de glicose, em relação à dessensibilização por hiperglicemia.
Quanto à diminuição do risco de complicações macrovasculares, foi descrito que a metformina diminui a concentração do PAI-1, de fibrinogênio, de moléculas de adesão endotelial, diminui a agregação plaquetária e a diferenciação de monócitos em macrófagos que se fixam ao endotélio, revertendo o estado pró-trombótico característico do DM2 (Goodarzi & Bryer-Ash, 2004; Bailey, 2005).
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angiotensina e pela PKC (Mahrouf et al, 2006). Em estudo com culturas de células do endotélio da aorta bovina, estes autores demonstraram que a incubação de concentrações farmacológicas de metformina exerce efeitos anti-oxidantes por meio da redução da translocação para a membrana e da atividade da PKC, o que leva à inibição da produção de espécies reativas de oxigênio.
Segundo Bahia et al (2006), além de melhorar o metabolismo glicídico, lipídico, parâmetros hemostáticos e pressão arterial, recentemente foi demonstrado que a metformina possui efeitos vasculares diretos através da ativação da enzima AMP-quinase (AMPK) nas células endoteliais promovendo oxidação de ácidos graxos e diminuindo a lipotoxicidade presente nos estados de resistência insulínica. Holland et al
(2004), também observaram efeito inibitório da metformina sobre a PTB1B. Tal fato pode explicar a melhora na sensibilidade insulínica dos animais MSG, se nos lembrarmos do estudo de Hirata e colegas mencionado anteriormente.
De acordo com as ações da metformina descritas acima, pode-se sugerir que a melhora na sensibilidade à insulina vista tanto no grupo SHR, quanto no grupo SHR – MSG tratados com esta droga pode ser atribuída a diversos fatores como a redução da produção hepática de glicose; estimulação da captação de glicose pelo músculo; aumento da oxidação de ácidos graxos; supressão da lipogênese; inibição parcial da síntese e liberação de insulina pelo pâncreas.
Estes efeitos da metformina em diminuir a lipotoxicidade e melhorar a sinalização da insulina são mecanismos indiretos e diretos que atuam para aumentar a sensibilidade insulínica, respectivamente. A partir daí, pode-se compreender a diminuição nos níveis pressóricos dos animais tratados com esta droga, ou seja, o aumento da sensibilidade à insulina leva à diminuição da hiperinsulinemia compensatória com conseqüente diminuição de seus efeitos sobre os mecanismos que elevam a pressão arterial: estimulação da atividade simpática, reabsorção tubular renal de sódio e água, aumento da contratilidade da célula muscular lisa vascular secundária ao aumento de cálcio citoplasmático, estímulo à proliferação celular, diminuição da liberação de óxido nítrico pelo endotélio, potencialização dos efeitos da angiotensinaII
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O tratamento com a pioglitazona, embora não tenha revelado resultados significativos em relação à pressão arterial de cauda, mostrou uma tendência de queda neste parâmetro, tanto nos animais SHR, quanto nos SHR-MSG. Houve aumento significativo do peso corporal nos animais que receberam MSG, embora tenha ocorrido queda significativa no conteúdo de gordura epididimal neste grupo. O grupo SHR também teve redução do conteúdo de gordura epididimal, mas que não foi significativa e também não foi acompanhada de alteração do peso corporal. Quanto ao metabolismo glicídico, houve melhora na área sob a curva de glicose em ambos os grupos e elevação significativa da área sob a curva de insulina no grupo SHR tratado com pioglitazona. Tal dado, levou à em piora do índice de sesnibilidade à insulina neste grupo. Os animais do grupo SHR-MSG-Pio mostraram apenas tendência de queda na área sobre a curva de insulina, sem diferença significativa no índice de sensibilidade à insulina. Assim como nos animais tratados com metformina, não se observou alteração no peso do ventrículo esquerdo.
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controle. A alteração no Cd36 também poderia explicar estas mudanças tão frustas no metabolismo glicídico deste segundo grupo.
As TZDs também aumentam a atividade das enzimas responsáveis pela oxidação lipídica, tornando possível a utilização da gordura como fonte de energia, o que em última análise, leva à melhora da sensibilidade à insulina (McGarry, 2002).
Além disso, a ativação dos receptores PPAR normaliza os desarranjos metabólicos por estimular a síntese de adiponectina e influencia na liberação de hormônios/fatores adipocitários. Ocorre diminuição da secreção de TNF-α e resistina, adipocitocinas que promovem resistência à insulina com conseqüente bloqueio do efeito inibitório na cascata de sinalização desse hormônio. Este mecanismo ao lado da diminuição na liberação de AGL por promoção da adipogênese, melhora as ações celulares da insulina. Ao mesmo tempo, a liberação de adiponectina leva à oxidação dos ácidos graxos e aumento da sensibilidade à insulina no músculo e no fígado. Como resultado, temos diminuição da produção hepática de glicose e aumento da captação de glicose pelo músculo (Dijk et al, 2003; Evans, Barish & Wang, 2004; Furukawa et al, 2004; Bailey, 2005; Bahia et al, 2006; Gomes, 2006).
Promover adipogênese e melhorar a sensibilidade à insulina parece um paradoxo, uma vez que a obesidade é uma condição estreitamente relacionada à resistência insulínica. No entanto, a diferenciação dos adipócitos aumenta a sensibilidade à insulina, pois aumenta a expressão do receptor de insulina, IRS-1 e GLUT4 e provavelmente de muitos outros genes que são fundamentais na resposta metabólica a este hormônio. Um número excessivo de adipócitos só contribui para um estado de resistência à insulina quando associado com excessivo estoque de energia. Diminuindo a resistência insulínica, há inibição da lipólise, com conseqüente diminuição da liberação de ácidos graxos o que por sua vez, diminui ainda mais a resistência. As TZDs também aumentam o número de células pequenas (que tendem a ser mais sensíveis à insulina) e promovem redistribuição de lipídeos em mais células, outro mecanismo que pode aumentar a sensibilidade insulínica (Spiegelman & Flier, 1996; Bailey, 2005; Gomes, 2006).
