Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPS) dos genes PPARy2, lipase lipoproteica, receptor de LDL, apolipoproteina C3, e adiponectina podem modular o perfil lipídico de pacientes com a síndrome de Berardinelli-Seip

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNPS) DOS GENES PPARy2, LIPASE LIPOPROTEICA, RECEPTOR DE LDL, APOLIPOPROTEINA C3, E ADIPONECTINA PODEM MODULAR O PERFIL LIPÍDICO DE PACIENTES COM A

SÍNDROME DE BERARDINELLI-SEIP.

MARIA DE FÁTIMA PAIVA BARACHO

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Orientador: Prof. Dr. José Brandão Neto

Co-orientadora: Profa. Dra. Adriana Bezerra Nunes

Natal – RN 2013

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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Aprovada em 20/03/2013

Banca Examinadora

Prof. José Brandão Neto (Presidente)

Profª. Dra. Daniella Regina Arantes Martins – UFRN (Membro Interno)

Profª. Dra. Neidmar da Mata – UFRN (Membro Externo)

Profª. Dra. Paula Frassinete Vasconcelos de Medeiros - UFCG (Membro Externo)

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v .

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AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus, Pai Misericordioso, com quem sempre conto em todos os momentos da minha vida e que nas horas mais difícieis eu sinto que estou sendo embalada em seus braços;

Ao meu marido, Benedito Braz Baracho, pelo apoio e compreensão em todos os momentos;

À minha querida irmã, Bernadete de Lurdes Paiva, pelo apoio e carinho em todas as horas;

À minha querida filha, Wanessa Raquel dádiva de Deus e estímulo para lutar pelas minhas conquistas;

À minha amiga de todas as horas e parceira em todas as minhas pesquisas, Profª Dra Maria Goretti do Nascimento Santos, pelo apoio e pela colaboração irrestrita. Enfim pela sua amizade;

Ao meu amigo, Josemar dos Santos pela solicitude e pelo apoio durante todo o processo deste estudo.

À diretoria da ASPOSBERN e a todos as pessoas que tem a síndrome de Berardinelli-Seip, em especial aos participantes da pesquisa, pela confiança em mim depositada;

Ao meu orientador, Prof. Dr. José Brandão Neto, pelo conhecimento compartilhado, pelo ensinamento acrescentado, orientação e dedicação a mim dispensada;

À minha co-orientadora, Prof. Dra Adriana Bezerra Nunes, pelas orientações prestadas e que em muitos momentos deste trabalho foi um anjo na minha vida;

À Profª. Dra Maria Helena Constantino Spyrides e às consultoras

Camiliane Azevedo Ferreira, Izabelly Cristina Mendes Tinoco e Pollyanne Evangelista da Silva, pela ajuda na análise estatística;

A todos os Colegas do Departamento de Medicina Clínica - DMC, em especial ao chefe, Prof. Dr. Ivanildo Cortez de Sousa pelo apoio manifestado e compreensão externada nos momentos necessários;

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Aos Funcionários Técnico-administrativos e de apoio do DMC, pelo auxílio necessário;

Aos colegas Prof. Msc. Francisco Paulo Freire Neto, Profª Dra Adriana Augusto de Rezende, Profª Dra Maria das Graças Almeida, pela colaboração valiosa e fundamental para esta tese;

Ao Prof. Dr Mario Hiroyuki Hirata, Prof. Dra Rosario Dominguez Crespo Hirata e Farmacêutica Bioquímica Cristina Moreno Fajardo, pela colaboração valiosa e fundamental para a conclusão deste trabalho;

Aos Farmacêuticos Bioquimícos e Auxiliares do Laboratório Integrado de Análises Clínicas-LIAC/UFRN e HUOL/UFRN, pela imensurável colaboração;

Aos meus familiares e amigos pela torcida e compreensão nas ausências sentidas;

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“O amor é paciente, é benfazejo. Ele desculpa tudo, crê tudo, espera tudo, suporta tudo.

O amor jamais acabará”.

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RESUMO

Baracho MFP, Nunes AB, Brandão J et al. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) dos genes PPARy2, Lipase lipoproteica, Receptor de LDL, da Apolipoproteina C3, e da Adiponectina podem modular o perfil lipídico de pacientes com a síndrome de Berardinelli-Seip. Tese apresentada ao PPGCSA para obtenção do título de doutor. 2013.

A Síndrome de Berardinelli-Seip (SBS) é um distúrbio raro do metabolismo dos lipídios, caracterizada pela ausência quase total de tecido adiposo subcutâneo, hipertrigliceridemia, hipoleptinemia e diabetes insulino resistente ou lipoatrófico. Sua etiologia envolve implicações hipotalâmicas, alterações nos receptores de insulina e mutações nos genes AGPAT2, Gng3lg, CAV1 e PTRF. O tecido adiposo secreta diversas substâncias, tais como: leptina, resistina, adiponectina, esteróides, TNF , IL-6, PAI-1, angiotensinogênio, IGF-1. Muitas delas estão associadas ao diabetes mellitus tipo 2, obesidade e hipertensão. Os PPARs são fatores transcricionais pertencentes à superfamília de receptores nucleares ligantes ativados. Sabe-se que o PPAR , é importante para o metabolismo lipídico e glicídico e que o ligante natural do PPAR é derivado do ácido graxo. Nesse sentido, foram avaliados 24 pacientes portadores da SBS, provenientes do Estado do Rio Grande do Norte, com a mediana das idades de 18,5 anos (0,55 a 47 a), sendo 9 (37,5 %) do gênero masculino e 15 (62,5 %) do gênero feminino. Quanto ao grupo étnico, foram classificados em caucasóides (brancos) 21 (87,5 %) e negróides 3 (12,5 %) pacientes. Foram feitas avaliações clínico-endocrinológica, bioquímica, hormonal, molecular e o estudo dos polimorfismos Adiponectina ADIPOQ, PPARγ2 Pro12Ala,

LPL-PvuII, APOC3-SstI e LDLR-AvaII em portadores da SBS. Nesta população nós

não encontramos nenhuma associação de parâmetros lipídicos e glicídicos com os polimorfismos LPL-PvuII, APOC3-SstI e LDLR-AvaII. Porém, observamos associação entre Adiponectina ADIPOQ e PPARγ2 Pro12Ala e níveis lipídicos mais elevados, sugerindo um papel biológico para estes fatores, indicando estudos mais aprofundados.

- PALAVRAS-CHAVE

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGL Ácido Graxo Livre

AGPAT2 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2

ASPOSBERN Associação de Pais e Pessoas com a Síndrome de Berardinelli-Seip BSCL1 Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy – Tipo 1

BSCL2 Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy – Tipo 2 BSCL3 Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy – Tipo 3 BSCL4 Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy – Tipo 4

CAV1 Caveolin1

CGL Congenital GeneralizedLipodystrophy DAC Doença Arterial Coronariana

DM Diabetes Mellitus DM2 Diabetes Mellitus tipo 2

Gng3lg Guanine nucleotide-binding protein (G protein) 3-subunit-linkedgene HOMA-IR Homeostatic Model Assessment-Insulin Resistance

IL6 Interleucina -6

IGF1 Fator de crescimento similar à insulina LGC Lipodistrofia Generalizada Congênita

PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 PPARs Peroxisome proliferator activated receptors PPARα Peroxisome proliferator activated receptors alfa PPΑR Peroxisome proliferator activated receptors beta PPAR Peroxisome proliferator activated receptors gama PPARδ Peroxisome proliferator activated receptors delta PTRF

RFLP

Polymerase I and transcript release factor

Polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição SBS Síndrome de Berardinelli-Seip

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LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Tabela 1 Iniciadores para amplificação...21

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xii SUMÁRIO

RESUMO... IX LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... X LISTA DE TABELAS E FIGURAS... XI

1. INTRODUÇÃO……… 13

2. JUSTIFICATIVA……….. 17

3. OBJETIVOS………. 18

4. MÉTODO……….. 19

5. ARTIGO PRODUZIDO_……….. 29

6. CO_{MENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES………..} 33

7. _{REFERÊNCIAS………...} 35

8. APÊNDICES………. 40

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13 1. INTRODUÇÃO

A Síndrome de Berardinelli-Seip (SBS) ou lipodistrofia generalizada congênita é um distúrbio raro, do metabolismo dos carboidratos e dos lipídeos,com herança autossômica recessiva(1,2).

Caracteriza-se por variável perda de tecido adiposo subcutâneo e resistência insulínica, apresentando complicações tais como intolerância à glicose, diabetes

mellitus (DM), hiperinsulinemia, esteatose hepática, acantose nigricans, ovários

policísticos e hipertensão arterial(1-6).

Os aspectos clínicos principais desta síndrome são a dislipidemia, principalmente a hipertrigliceridemia, níveis diminuídos de leptina e de adiponectina(7,8), aspecto acromegaloide, hepatoesplenomegalia e esteatose hepática, evoluindo para cirrose e morte por insuficiência hepática (9,10). A resistência à insulina precede e prediz o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) por vários anos ou décadas, sendo que o aparecimento do diabetes ocorre na SBS com idade média de 12 anos(1,3,11-14)_.

Os primeiros casos de SBS foram descritos por Waldemar Berardinelli (1954)(1)_{, no Brasil e por Martin Seip (1959)}(3)_{, na Noruega. Acomete, igualmente,} homens e mulheres em todos os grupos étnicos, tem uma prevalência mundial estimada de 1 caso para 10 milhões de pessoas, e cerca de 300 casos publicados na literatura(1,3,15-17)

.

No Rio Grande do Norte, com população estimada em pouco mais de 3 milhões de habitantes, a ocorrência é elevada, com uma prevalência 1,28/100.000 habitantes, ultrapassando o número de 41 pacientes com a síndrome de Berardinelli-Seip, vivos, todos procedentes da região do Seridó e de Natal RN, integrantes da Associação de Pais e Pessoas com a Síndrome de Berardinelli-Seip (ASPOSBERN).

Embora a fisopatologia da síndrome não esteja totalmente esclarecida, foram evidenciadas implicações hipotalâmica-pituitárias e alteração nos receptores de insulina, afetando primariamente o tecido adiposo (1,3,18,19).

(15)

14

mutação em BSCL2, que respondem por 95% de todos os casos, apresentando alguns aspectos clínicos semelhantes e outros distintos(24)_{. A heterogeneidade} genética da síndrome permanece evidente independente das especificidades relacionadas à gravidade da doença e à variabilidade fenotípica(25). Estudo realizado no Rio Grande do Norte revelou mutações nos genes AGPAT2 e Gng3lg, com os pacientes apresentando muitas e divergentes manifestações clínicas, sugerindo influências modificadoras de outros genes e/ou do ambiente(26).

A principal anormalidade bioquímica encontrada na SBS é a resistência insulínica, cuja associação com as alterações nos níveis de leptina e adiponectina favorece as complicações metabólicas(7,27). Adicionalmente, o diabetes insulino

resistente manifestado, também conhecido como diabetes lipoatrófico(28-30)

,

predispõe à deficiência de zinco e ao aparecimento de distúrbios renais(31,32)_.

O tecido adiposo considerado como tecido inativo, passou atualmente a desempenhar papel de importância na regulação energética por vias autócrina, parácrina e endócrina, possibilitando ao adipócito influenciar a atividade metabólica de outros tecidos, como cérebro (hipotálamo), músculo, fígado e células pancreáticas, secretando diversas substâncias, tais como: leptina, resistina, adiponectina e esteróides; ácidos graxos livres (AGL); citocinas: fator de necrose tumoral (TNF ), interleucina 6 (IL-6); proteínas com ação cardiovascular: inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1), angiotensinogênio; e fator de crescimento similar à insulina (IGF-1)(33,34).

O tecido adiposo desempenha papel relevante no desenvolvimento do DM2 e da lesão vascular. É o equilíbrio entre componentes derivados do tecido adiposo: AGL, TNF , leptina, adiponectina e PAI-1 que determina o estado de resistência à insulina e de propensão à inflamação vascular (35).

O pré adipócito apresenta capacidade de diferenciação em adipócito por toda a vida do indivíduo e o sinal para a diferenciação de novos adipócitos está relacionado ao estado nutricional, sendo um destes estímulos a quantidade de AGL circulante, o qual ativa os receptores denominados peroxisome proliferator activated

receptors (PPARs)(36)_{. O ligante natural do PPAR é derivado do ácido graxo. Esta}

(16)

15

nucleares ligantes ativados. Os 4 maiores tipos são: PPAR , PPAR , PPAR , PPAR ( 39,40).

Os PPAR / são cruciais para o metabolismo dos lipídios e glicose, respectivamente. Para a função do PPAR as informações são limitadas, porém, estudos mostram que ele também regula o metabolismo da glicose e a oxidação de ácidos graxos(41). Os PPARs estão também envolvidos na regulação de vários tipos de tumores como os liposarcomas, inflamação, doenças cardiovasculares, infertilidade, e na melhora das complicações das doenças crônicas, tais como aterosclerose e diabetes mellitus (42).

A substituição da prolina (P) por alanina (A) no codon 12 do gene do PPARy2 (polimorfismo Pro12Ala) é muito estudado e a associação com DM, obesidade e outros parâmetros clínicos tem sido relatada e discutida em diversos grupos étnicos(43)_.

A adiponectina, uma proteína específica e abundante no tecido adiposo, é secretada e existe na circulação de indivíduos saudáveis em altas concentrações. Desempenha papel importante na modulação da sensibilidade à insulina e tem suas concentrações aumentadas quando ativada pelo PPARy. A adiponectina encontra-se diminuída na obesidade, DM2 e doença arterial coronariana (DAC), levando à resistência à insulina. É codificada pelo gene ADIPOQ, localizado no cromossomo 3q27 em uma região com evidência de associação ao DM2 e à síndrome metabólica(44).

Variantes frequentes e raras do gene ADIPOQ são genotipadas em diferentes grupos étnicos. O gene da adiponectina localiza-se em um locus susceptível para o DM2 e DAC e uma variação na região promotora confere o risco para obesidade e DM2. Duas variantes comuns nessa região são rs17300539 e rs266729. O rs266729 (-11377C>G) tem sido estudado em relação ao risco cardiovascular(44).

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16

estudadas visando esclarecer a base genética das doenças cardiovasculares e síndromes correlacionadas(45)_.

A variante Pvu II resulta de uma transição de timina (T) em citosina (C) no intron 6 do gene LPL, entre o exon 6 e 7 e tem sido associada com níveis plasmáticos elevados de triglicerídeos e colesterol, doenças cardiovasculares e infarto agudo do miocárdio em populações caucasianas(46).

O receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) é uma proteína transmembrana celular, que tem papel crucial na mediação do receptor no metabolismo lipoprotéico. Seu gene em humanos consiste de 18 exons e 17 introns, mapeado no cromossomo 19q13.2 e o seu polimorfismo Ava II tem mostrado associação com a variação nos níveis plasmáticos dos lipídeos e com a doença cardiovascular em alguns estudos( 47,48).

APOC3 é uma glicoproteina que está primariamente associada com lipoproteína rica em triglicerídeos. O gene da APOC3 é parte do gene Apo AI/CIII/AIV/AV agrupados no cromossomo 11q23q24. Este agrupamento no cromossomo 11 está associado com variação nos triglicerídeos em crianças e adultos(49)_.

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17 2. JUSTIFICATIVA

Os aspectos clínicos da SBS variam de paciente a paciente(13) , sendo a resistência à insulina um aspecto constante desta síndrome, muito embora seus mecanismos, provavelmente, de cunho heterogêneo, ainda não estejam totalmente esclarecidos. Sabe-se, no entanto, que o tecido adiposo desempenha papel relevante no desenvolvimento do DM2 e da lesão vascular e que é o equilíbrio entre componentes derivados do tecido adiposo - AGL, TNF , leptina, adiponectina e PAI-1 - quem determina o estado de resistência à insulina e da propensão à inflamação vascular(35).

Há alguns estudos direcionados para a ligação insulina-receptor, afinidade e número total de receptores(50,51)_{. As mutações nos genes AGPAT2 e Gng3lg} relatadas no grupo em estudo, cujos pacientes apresentaram muitas e divergentes manifestações clínicas, sugerem influências modificadoras de outros genes e/ou do ambiente(26). O estudo dos polimorfismos do PvuII, AvaII, APOC 3, PPAR e Adiponectinana na SBS torna-se necessário, em virtude de encontrarmos associação entre esses polimorfismos e as doenças cardiovasculares, hipertrigliceridemia e DM2(44,47-49).

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18 3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral:

Investigar parâmetros bioquímico, hormonal e genético na SBS num grupo de pacientes pertencente ao Rio Grande do Norte.

3.2. Objetivos específicos:

Detectar e caracterizar os polimorfismos dos genes PPAR (Pro12Ala), Apo C3, Adiponectina, PvuII do gene LPL e AvaII do gene RLDL;

Avaliar a distribuição de genótipos e a frequência relativa de alelos para os polimorfismos do gene PPAR (Pro12Ala), Apo C3, Adiponectina, PvuII do gene LPL e AvaII do gene RLDL e sua influência sobre o perfil lipídico;

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19 4. MÉTODO

4.1. Amostra

Estudamos 24 pacientes portadores da SBS, provenientes do Estado do Rio Grande do Norte, que procuraram o Ambulatório de Endocrinologia do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) – UFRN,

Os critérios de inclusão adotados foram: ter a SBS, aceitarem participar da pesquisa e comparecerem ao ambulatório do HUOL e como critérios de exclusão: pacientes com doenças inflamatórias ou infecciosas, agudas ou crônicas, bem como aqueles que se submeteram à cirurgia recente, não concordaram em participar da pesquisa e não concordaram com Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).

A nossa amostra foi não probabilística (de conveniência) e os pacientes foram controles de si mesmo.

O projeto teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), sob o protocolo de no018/03 e os portadores ou seus representantes legais, após inteirados dos objetivos do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

4.2. Parâmetros Bioquímicos

As análises bioquímicas (glicose, CT, TG, HDL-c) foram realizadas por metodologia enzimática-colorimétrica, em equipamento de automação (Konelab 60i, Vantaa, Finlândia), utilizando-se kit comercial Wiener™.

(21)

20

Dublin, Irlanda). A leptina foi medida por fluoroimunoensaio (Auto Delfia-1235, Perkin Elmer, MA, USA.) e a insulina por imunoensaio competitivo de fase sólida e enzimas quimioiluminescente IMMULITE 1000 (DPCCA, USA). O HOMA-IR foi calculado pela fórmula (insulina em jejum x glicemia em jejum)/(22,5x18,5), sendo classificado como provável resistência insulínica índice maior que 2,7(53).

As análises foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas do HUOL e no Laboratório Multidisciplinar de Doenças Crônicas Degenerativas (Programas de Pós-graduação em Ciências da Saúde e em Ciências Farmacêuticas, ambos da UFRN).

4.3. Parâmetros Genéticos da Biologia Molecular

Os polimorfismos foram analisados no Laboratório de Biologia Molecular (Departamento de Análises Clínica e Toxicológica, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, São Paulo).

4.3.1 Extração do DNA genômico

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21 4.3.2 Quantificação e avaliação de integridade

A integridade das amostras de DNA foi avaliada por separação eletroforética em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris-HCl a 90mM, ácido bórico a 90 mM e EDTA a 2,0 mM, pH 8,0), corado com Gel Red Nucleic Acid Gel Stain 10000X in

DM (Biotium, Inc, CA,USA) e brometo de etídeo. A quantificação do DNA foi

realizada por espectrofotometria a 260nm, e a pureza do DNA determinada pela relação A260/A280(55).

Os fragmentos do DNA genômico foram amplificados por reação de polimerase em cadeia (PCR) a partir de nucleotídeos/iniciadores que foram previamente desenvolvidos utilizando os programas Primer Premier e Blast e por PCR em Tempo Real utilizando o sistema TaqMan e o equipamento 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Os reagentes utilizados nos ensaios foram fornecidos prontos para uso TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay (20X) (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA).

4.3.3 Iniciadores para amplificação

Tabela 1. Iniciadores utilizados na amplificação das regiões polimórficas dos genes

LDRL-AVAII, Adiponectina, PPAR , Apolipoproteína C3, Lipoproteína Lipase–PVUII

Polimorfismos Sequências dos iniciadores Temperatura de hibridização LDLR[C/T]

C2804279_10 AvaII

3-ACCTACTGTCCCCAGAGGATATGGT-5’

3’- CTCTTCCACAACCTCACCCAGCCAA -5’ 50 o_C ADIPOQ[C/G] C2412786_10 Adiponectina 5´-TTGCAAGAACCGGCTCAGATCCTGC-3´ 5´- CTTCAAAAACAAAACATGAGCGTGC-3´ 50ºC PPAR PRO12ALA

5´ - CCA ATTCAAGCCCAGTCC TCC3

5´ - CAGTGAAGGAATCGCTTTCCG -3´ 62ºC

Apolipoproteína APOC3

5´ - ACCTGGAGTCTGTCCCAGTGCC- 3´

5´ - TCGTCCAGTGGGGACATGGGTGTGG -3´ 65ºC LPL

PVU II

5´ - ATCAGGCAATGCGTATGAGGTAA -3´

(23)

22 4.3.4 Análise dos polimorfismos por qPCR

A genotipagem dos SNPs AVAII e Adiponectina foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction) em Tempo Real (qPCR), utilizando-se o sistema TaqMan e o equipamento 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Os reagentes utilizados nos ensaios são fornecidos prontos para uso Taq Man Drug Metabolism Genotyping Assay (20X) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

A reação foi padronizada para um volume final de 8 L sem perda de sensibilidade em relação ao volume de 25 L recomendado pelo protocolo. Para a reação de PCR foram utilizados 4 L do Genotyping Master Mix (2X), 0,4 L de TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay (40X) e 1,5 L de DNA (20 ng) diluído em água livre de nuclease. As condições de amplificação adotadas foram as recomendadas pelo protocolo do ensaio, ou seja, uma fase inicial de 10 min a 95o_C, seguida por 50 ciclos com uma etapa de denaturação (15 segundos a 92oC) e uma etapa de extensão (1 min a 60o_C).

Os ensaios utilizados para a genotipagem apresentam os seguintes dados:

Tabela 2: Dados da genotipagem dos pacientes avaliados.

ID do Ensaio Gene Troca dbSNP Tipo SNP

Fita Molde

C___2804279_10 LDLR C/T rs5925 Mutação

Missenso Antisenso

C___2412786_10 ADIPOQ C/G rs266729

Mutação

Missenso Senso

4.3.5 Análise dos polimorfismos por RFLP

(24)

23 4.3.5.1 Análise do SNP PPAR PRO12ALA

Amplificação pela PCR

Para amplificação, pipetou-se 2 uL da solução de DNA genômico a 50 ng/μL; 2,5 μL de tampão de reação de PCR 10X; 0,5 μL de deoxinucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,5 μl de cada iniciador, 1U da enzima Taq DNA polimerase e água Milli-Q (Sistema Millipore Milli-Q Direct 8) para volume final de 50 μL. A PCR foi realizada em termociclador automático PTC-200 TM (Pelter Thermal Cycler, M&J Research, USA) com o seguinte programa: 1) desnaturação inicial a 98ºC por 3 min, 2) amplificação, desnaturação a 94ºC por 45 seg, hibridização a 62,5ºC por 1 min 30 seg, extensão a 72ºC por 1 min 30 seg) extensão final a 72ºC por 10 min, 4) interrupção da PCR por resfriamento a 4ºC com 30 ciclos.

Avaliação eletroforética dos produtos de PCR

Avaliou-se os produtos de amplificação pela PCR em géis de agarose 1% em tampão TBE 0,5X, utilizando-se cubas eletroforéticas horizontais da GIBCO BRL (Life Technologies INC., Gaithersburg, MD, USA). Com o gel de agarose imerso em tampão TBE 0,5X aplicou-se 5 μL de solução contendo 2 μL de produto de PCR, 2 μL de loading buffer 6X e 1 μL de Gel Red Nucleic Acid Gel Stain 10000X in DM

(Biotium, Inc.,USA) diluído 1:500; aplicou-se 3 μL do marcador de peso molecular

de 100pb (Gibco BRL Life Technologies, NY, USA) e 1 μL de Gel Red Nucleic

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Reação de restrição enzimática dos produtos de amplificação pela PCR

Para análise do polimorfismo PRO12ALA do gene PPAR digeriu-se os produtos de amplificação pela PCR específicos com 1,0U da enzima de restrição BstU I (New England BioLabs Inc., MA, USA). Realizou-se reação de digestão enzimática em tubos de 0,5 mL, contendo 5,0 μL do produto de amplificação pela PCR, 1,0 μL do tampão de reação 10X e água ultrapura Milli-Q em q.s.p volume final de 10 μL. Incubou-se a reação em banho de água a 60ºC por 1 hora.

Análise dos fragmentos de restrição

Identificou-se os produtos de restrição enzimática do polimorfismo PPAR PRO12ALA em gel de poliacrilamida 8%. Para o polimorfismo PRO12ALA do gene PPAR , os indivíduos que apresentaram somente um fragmento de 244 pb indicaram ausência de sítio de restrição para a enzima BstU I, caracterizando-se como genótipo homozigoto CC não polimórfico. Para genótipo GG, caracterizado pela presença dos fragmentos de restrição 223 pb e 21 pb, classificou-se como polimórfico homozigótico. Caracterizaram-se genótipo CG heterozigoto os indivíduos que apresentaram os fragmentos de restrição 244 pb, 223 pb e 21 pb.

4.3.5.3 Análise do SNP APOC3

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25

Avaliou-se os produtos de amplificação pela PCR em géis de agarose 1% em tampão TBE 0,5X, utilizando-se cubas eletroforéticas horizontais da GIBCO BRL (Life Technologies INC., Gaithersburg, MD, USA). Com o gel de agarose imerso em tampão TBE 0,5X aplicou-se 6 μL de solução contendo 4 μL de produto de PCR e 2 μL de loading buffer 6X; aplicou-se 3 μL do marcador de peso molecular de 100pb (Gibco BRL Life Technologies, MD, USA); realizou-se a separação eletroforética a 100V 60mA por 30 min, utilizando fonte de energia da Pharmacia Biotech modelo EPS 200 (CA, USA). Após eletroforese, corou-se o gel com brometo de etídeo a 0,5 mg/L por 10 minutos, lavou-se em água destilada para retirar o excesso de brometo por 10 minutos. Os fragmentos obtidos foram visualizados em sistema de foto documentação Chemilmager TM (Alpha Innotech Corporation, San Leandro CA-USA). Documentou-se os resultados empregando o sistema de captura de imagens (Multimagen Light Cabinet, Alpha Innotech Co, San Leandro CA, USA) e com o software de análise de imagens Chemilmager 4400 v 5.5 (Alpha Innotech Co.,San Leandro CA, USA).

Para análise do polimorfismo SstI do gene APOC3 (CAGCT/C) digeriu-se os produtos de amplificação pela PCR específicos com 10U da enzima de restrição SstI (Invitrogen Life Technologies CA, USA). Realizou-se reação de digestão enzimática em tubos de 0,5 mL, contendo 7 μL do produto de amplificação pela PCR, 1,5μL do tampão de reação 10X e água ultrapura Milli-Q em q.s.p volume final de 15 μL. Incubou-se a reação em banho de água a 37ºC por 4 horas.

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não polimórfico. Para genótipo S2S2, caracterizado pela presença de dois fragmentos de restrição 249 pb e 235 pb, classificou-se como polimórfico. Caracterizaram-se genótipo S1S2 heterozigoto os indivíduos que apresentaram os três fragmentos de restrição 484, 249 e 235 pb.

4.3.5.4 Análise do SNP LPL-PVUII

Para amplificação, pipetou-se 2 μL da solução de DNA genômico a 50 ng/μL; 5 μL de tampão de reação de PCR 10X; 1,0 μL de deoxinucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1,0 μL de cada iniciador, 1U da enzima Taq DNA polimerase e água ultrapura Milli-Q para volume final de 50 μL. A PCR foi realizada em termociclador automático PTC-200 TM (Pelter Thermal Cycler, M&J Research,USA) com o seguinte programa: desnaturação inicial a 98ºC por 3 min, amplificação com desnaturação a 95ºC por 1 min, hibridização a 61ºC por 1 min, extensão a 72ºC por 1 min, extensão final a 72ºC por 10min, interrupção da PCR por resfriamento a 4ºC a 30 ciclos.

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27

(Multimagen Light Cabinet, Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, USA) e com o software de análise de imagens Chemilmager 4400 v 5.5 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA,USA).

Para análise do polimorfismo PVUII do gene LPL (CAG/CTG) digeriu-se os produtos de amplificação pela PCR específicos com 10 U da enzima de restrição PVUII (Invitrogen Life Technologies, CA, USA). Realizou-se reação de digestão enzimática em tubos de 0,5 mL, contendo 7 μL do produto de amplificação pela PCR, 1,5 μL do tampão de reação 10X e água ultrapura Milli-Q em q.s.p volume final de15 μL. Incubou-se a reação em banho de água a 37ºCpor 4 horas.

Identificou-se os produtos de restrição enzimática do polimorfismo APOC3 em gel de agarose 3%. Para o polimorfismo PVUII do gene LPL, os indivíduos que apresentaram somente um fragmento de 430 pb foram caracterizados como genótipo homozigoto P1P1, indicando ausência do sítio de restrição. Os indivíduos com genótipo homozigoto P2P2, apresentaram os fragmentos 221 pb e 209 pb, indicando a presença do sítio de restrição. Já nos heterozigotos, pode-se observar a presença dos três fragmentos 434 pb, 221 pb e 209 pb, sendo estes caracterizados como genótipo P1P2.

4.6. Análise estatística

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28 4.7. Resultados

Estudamos 24 pacientes portadores da SBS, provenientes do Estado do Rio Grande do Norte, que procuraram o Ambulatório de Endocrinologia do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) – UFRN, com a mediana das idades de 18,5 anos (0,55 a 47), sendo 9 (37,5%) do gênero masculino e 15 (62,5%) do gênero feminino. Quanto ao grupo étnico, foram classificados em caucasóides 21 (87,5%) pacientes e o restante em negróides 3 (12,5%).

(30)

29 5. ARTIGO PRODUZIDO

Título: SNPs of PPAR-γ2, LPL, LDLR, APOC3, and adiponectin genes modulate the lipid profile of patients with Berardinelli-Seip syndrome

Periódico: Metabolism Clinical and Experimental ISSN: 0026-1495

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30

Manuscrito submetido ao Metabolism Clinical and Experimental

Text: 2803 words Abstract: 203 words Number of references: 39 Number of figures: 0 Number of tables: 4

SNPs of PPAR-γ2, LPL, LDLR, APOC3, and adiponectin genes modulate the lipid profile of patients with Berardinelli-Seip syndrome

Maria F. P. Barachoa, Maria G. N. Santosb, Mario H. Hiratac, Rosario D.C. Hiratac, Cristina M. Fajardoc_{, Adriana B. Nunes}a_{, Bernardo L. Wajchenberg}d_{, Luiz A. de} Marcoe_{, José Brandão-Neto}a,_*

a_{Department of Internal Medicine, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,}

RN 59 012-570, Brazil;

b_{Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio Grande}

do Norte, Natal, RN 59 012-570, Brazil;

c_{Department of Clinical and Toxicological Analysis, University of São Paulo, São}

Paulo, SP 05508-000, Brazil;

d_{Heart and Diabetes Center, Instituto do Coração (InCor), University of São Paulo,}

São Paulo 05403-000, Brazil;

e_{Department of Surgery, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG}

31270-901, Brazil.

*_{Corresponding author. Tel: +55 84 3234 9748; fax: +55 84 3234 9776. E-mail}

(32)

31 Abstract

Objective. Berardinelli-Seip syndrome is a recessive autosomal genetic disorder characterized by the near total loss of adipose tissue. Methods. Biochemical andhormonal parameters and the PPAR- 2, LPL, LDLR, APOC3 and adiponectin gene polymorphisms of twenty-four patients with Berardinelli-Seip syndrome were analyzed. Results. Parental consanguinity, insulin resistance anddiabetes mellitus were observed in 66.7%, 83.3% and 54.2% of patients, respectively. All individuals presented high triglyceride levels, and 70.8% presented high cholesterol levels. The Pro/Pro genotype of the Pro12Ala polymorphism of the PPAR- 2 gene was found in 87.5% of patients. The Ala/Ala variant was not observed in any of them. The PvuII polymorphism of the LPL gene showed a frequency of 45.8% for the P1P2 variant. The AvaII polymorphism of the LDLR gene showed a similar frequency of 41.7% for both CT and TT variants. The S1S1 genotype of the Sstl polymorphism of the APOC3 gene had a frequency of 79.1%. The CC genotype of the ADIPOQ polymorphism of the adiponectin gene was found in 58.3% of patients. Conclusions. No association was found between lipid parameters and the PvuII, AvaII, and SstI polymorphisms. However, we observed an association of the Pro12Ala and ADIPOQ polymorphisms with higher lipid levels, suggesting a close relationship between these factors.

Keywords: Lipodystrophy Dyslipidemia Insulin resistance Leptin

Diabetes mellitus

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33 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES

Desde 1997 que estudamos a SBS, gerando diversas publicações em eventos científicos, periódicos nacionais e internacionais e apresentações orais em congressos nacionais (Apêndice 2).

O projeto inicial, cujo objetivo era avaliar o polimorfismo do gene PPAR associado à dislipidemia, motivou a ampliação do estudo a outros polimorfismos, por estarem relacionados com o metabolismo dos lipídios e glicídios, distúrbio grave e frequente encontrado nesta síndrome, sem contudo apresentar alterações do delineamento da metodologia inicial.

Trata-se de um estudo inédito e necessário, tendo em vista a etiologia multigênica e ainda não totalmente esclarecida da SBS, refletido no número elevado de pesquisas científicas, que buscam incessantemente a aquisição de novos conhecimentos.

O aspecto multidisciplinar do Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde é contemplado no presente estudo, pois além de contribuir para realização desta tese na área de genética molecular, ora defendida, gerou ainda outras dissertações e teses na área de: geografia, nutrição, análises clínicas e cardiologia.

A obtenção de um título de doutor significa uma árdua conquista e não traduz, tão simplesmente, a conclusão dos estudos, mas, a finalização de uma etapa que nos capacita para outras jornadas e desafios. Desse modo, a doutoranda, professora auxiliar II do Departamento de Medicina Clínica, além de ministrar aulas na graduação do Curso de Medicina e na especialização Residência Médica em Endocrinologia, desenvolve atividades de supervisão e orientação acadêmica, integra um grupo de pesquisa em síndrome Berardinelli-Seip e coordena o projeto de pesquisa: Estudo clínico molecular de indivíduos com a síndrome de Berardinelli-Seip. Colabora com os projetos de pesquisa: Obesidade: aspectos bioquímicos, moleculares e epidemiológicos; Prevalência dos Fatores de Risco da Síndrome Metabólica em Escolares Pré-adolescentes e Adolescentes da Cidade do Natal/RN e Avaliação da Função Tireoideana em Indivíduos Portadores da Síndrome de Berardinelli-Seip.

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34

Projeto: Ações de Apoio e Educação Junto ao Indivíduo Diabético; Atendimento Sistematizado de Indivíduos portadores de Doença Tireoideana; Liga Acadêmica de Atenção aos Portadores de Diabetes Mellitus e Curso de Atualização em Medicina Clínica – 2013, ministrando as seguintes aulas: O paciente Diabético e O Paciente com Obesidade.

Apesar das dificuldades encontradas no desenvolvimento de um trabalho de pesquisa, as alterações ocorridas refletiram num saldo cientificamente positivo, uma vez que fatos como esses se convertem em oportunidades enriquecedoras. Diante disso, temos como perspectivas futuras, continuar estudando os pacientes com a SBS, investigando as complicações ósseas, classificando os demais integrantes do grupo quanto aos tipos da SBS existentes e identificando a presença de comorbidades da síndrome.

A exemplo de um trabalho de conclusão do Curso de Medicina, recentemente por nós orientado em colaboração com outros colegas da área de Análises Clínicas, estaremos disponíveis para orientações em quaisquer níveis acadêmicos, bem como para a formação e solidificação de grupos de pesquisa.

Reportamos que o nosso grupo publicou recentemente artigos revendo as implicações cardíacas e metabólicas nesta síndrome. Isso, adicionado aos inúmeros trabalhos publicados e/ou apresentados em congressos (Apendice 2), nos quais atuamos como autor ou colaborador, traduz uma longa jornada de acompanhamento e assistência aos componentes da ASPOSBERN.

(36)

35

7. REFERÊNCIAS

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40 8. APÊNDICES

Apêndice 1-A

ALGUMAS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA SBS

Mãos grandes Pés grandes

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41 Apêndice 1-B

ALGUMAS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA SBS

Macroglossia Lábios volumosos e dentes afastados

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42 Apêndice 2

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

* Santos MGN; Baracho MFP; Vale S H L; Leite LD; Rocha EDM; Brito N J N; França MC; AlmeidaMG; Chiquetti S C; Marchini JS; Brandão-Neto J. Kinetics of zinc status and zinc deficiency in Berardinelli-Seip syndrome. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, v.26, p.7-12, 2012.

* Rocha EDM; Leite LD; Baracho MFP; Santos MGN; Araújo DM; França MC; Silva CAB; Almeida MG; Rezende AA; Marchini JS; Brandão-Neto J. Effect of diet intervention and oral zinc supplementation on metabolic control in Berardinelli-Seip Syndrome. Annals of Nutrition & Metabolism, v.57, p.9-17, 2010.

* Rêgo AG; Mesquita ET; Faria CA; Rêgo MAG; Baracho MFP; Santos MGN; Egito EST; Brandão-Neto J. Anormalidades cardiovasculares e metabólicas em pacientes com a síndrome de Berardinelli-Seip. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.94, p.109 -118, 2010.

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* Santos MGN; Monte AAL; Brito TNS; Baracho MFP; Sousa ZMD; Cândido KS. Determinação do perfil lipídico em 16 pacientes portadores de diabetes lipoatrófico generalizado congênito In: XXVII Congresso Brasileiro de Análises Clínicas, 2000, Recife/PE. Revista Brasileira de Análises Clínicas. Rio de Janeiro - RJ: Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, 2000. v.32. p.117 – 117.

* Baracho MFP; Santos MGN; Brito TNS; Pardini VC; Nobrega MLC. Parâmetros bioquímicos de pacientes portadores de síndrome de Seip-Berardinelli. In: XV Congresso Panamericano de Endocrinología - III Congresso Argentino de Endocrinología, 2000, Bariloche. Revista Argentina de Endocrinologia y Metabologia. Buenos Aires: Gráfica Latina S.A., 2000. v.37. p.90 – 91.

* Santos MGN; Baracho MFP; Freire GM; Vasconcelos MG; Pardini VC. Avaliação dos níveis de leptina e insulina em pacientes portadores da síndrome de Seip-Berardinelli In: XXV Congresso Brasileiro de Análises Clínicas, 1998, Porto Alegre. Revista Brasileira de Análises Clínicas. Rio de Janeiro: SBAC, 1998. v.30. p.83 – 83. * Santos MGN; Baracho MFP; Sousa ZM; Monte AAL; Brito TNS; Freire GM. Perfil Bioquímico de Pacientes Portadores da Síndrome de Seip-BerardinelliIn: XXV Congresso Brasileiro de Análises Clínicas, 1998, Porto Alegre. Revista Brasileira de Análises Clínicas. Rio de Janeiro: SBAC, 1998. v.30. p.83 – 83.

* Santos MGN; Baracho MFP; Vasconcelos MG; Freire GM; Barros L. Dislipidemia em Pacientes portadores de lipodistrofia generalizada congênita In: VIII Jornada Norte-Nordeste de Endocrinologia e Metabologia, 1998, Natal/RN. Programa Oficial. Natal: SBEM, 1998. v.1. p.21 – 21.

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Seip-47

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48 9. ANEXO