DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE
VICILINAS DE SEMENTES Erythrina velutina SOBRE
MOSCAS-DAS-FRUTAS
Ceratitis capitata
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE
VICILINAS DE SEMENTES Erythrina velutina SOBRE
MOSCAS-DAS-FRUTAS
Ceratitis capitata
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Dr. Maurício Pereira de Sales
LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE VICILINAS DE SEMENTES Erythrina velutina SOBRE MOSCAS-DAS-FRUTAS Ceratitis capitata
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________ Dr. Maurício Pereira de Sales
Departamento de Bioquímica - UFRN Orientador
____________________________________________________ Dr. Aldo Malavasi Filho
Diretor Presidente, Biofábrica Moscamed Brasil – BA 1º Examinador
____________________________________________________ Dra. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes
Dedico esta obra
A Deus, nosso senhor, por sua luz, pelo seu amor e pela grande oportunidade de convivência com os amigos.
À minha vovó Rita da Silva Macedo (In memoriam) pelo exemplo de luta, de resignação e de amor.
Aos meus pais Francisco Pepino de Macedo e Adelaide Maria Ferreira de Lima, que não mediram esforços para ajudar em minha formação, pelo amor, paciência e apóio incondicional. Dedico também a meus irmãos, Linardo e Cristina, principalmente pela
alegria de vivermos em família acima de tudo nos amando.
À Carol, um grande presente de Deus, pela paciência e dedicação ao nosso amor.
Ao meu orientador, professor Maurício, pela oportunidade de fazer parte da família LQFPB, pela paciência, pela confiança, pelos valiosos ensinamentos e incentivos,
AGRADECIMENTOS
“Nunca atribua a você o sucesso desta ou daquela tarefa, compreendendo que em todo trabalho há que considerar o espírito de equipe.”
André Luiz (Chico Xavier)
Às eternas amigas Gioconda, Kátia Anaya e Ticiana. Eu não merecia e por isso sou muito grato a Deus pela oportunidade de ter convivido e aprendido com vocês o
nobre sentimento de uma fraterna amizade.
A todos os professores do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial: Fernanda, Hugo, Edda, Luiz, Dilma, Suely, João
Felipe e Selma; o meu sincero agradecimento.
Ao Prof. Elizeu Antunes dos Santos pelas palavras amigas, orientações, sugestões e dicas importantíssimas para a execução deste trabalho.
A professora Luciana Duarte Martins da Matta por importantes sugestões durante a Qualificação.
Aos meus inestimáveis e inesquecíveis amigos Adeliana e Fabiano Teixeira pelos longo e prazeroso tempo de convivência e sinceridade.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN: Eliene, Ana, Creuza. Em especial a: Itamar, Jonas, pela boa vontade e criatividade.
Aos amigos do mestrado, Duda, Robério, Edílson, Dani Bananinha, Daniele (Dani de Elizeu), Josane, Leila, Erica, Cybele, Nednaldo, Virginia, Leandro.
Aos imprescindíveis amigos do LQFP, Ludovico, Rodrigo, Ana Celly, Jannison, Ibson, ABCDeyse, Joelma, Hugo, Cleysyvan, André magão, Norberto e professor
A todos os funcionários e a grande família do Centro de Biociências, a dona Mariquinha, ao Galego, a Geomar por mesmo sem saber serem indispensáveis nas
horas difíceis.
Ao Departamento de Biologia Celular e Genética, por oferecerem as condições necessárias para o desenvolvimento da pesquisa.
Aos professores e funcionários do departamento de Biologia Celular e Genética, a Edvaldo, Marilda, Francisco, Núbia e Carmem. Professor Sebastião, João Maria,
Gleider, Marcos,Katia Scortecci, Lucymara, Cristiane. Muito obrigado.
À professora Adriana Uchôa pela imprescindível contribuição durante todo o trabalho, por importantes sugestões durante a qualificação e pelas palavras amigas
nas horas difíceis.
A Maria do Carmo, por sua importantíssima colaboração e paciência no Laboratório de Moscas-das-frutas, que sempre foi uma mãe para as Ceratitis, e sem a sua ajuda
eu não estaria aqui te escrevendo.
A todos os professores, funcinários e alunos do Laboratório de Petróleo da UFRN (LAPET), em especial às Professoras Rosângela Balaban e Marta Costa. À inesquecível e amiga Dona Telma e aos amigos Michele, Fabio, Keila, Vanessa,
Rusa, Suzan, Odemar, Mauricio. Muito obrigado pela ajuda e companhia.
À Marcel Dore da Dore refrigerantes, pela doação das garrafas “pet” importantes para os bioensaios.
Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), pela aquisição de sementes de Mulungu.
“Fracassos? Não sei do que falas, em cada experiência descubro um dos motivos pelo qual a lâmpada não
funciona. Agora sei mais de mil maneiras de como não fazer a lâmpada.”
RESUMO
A mosca-da-fruta Ceratitis capitata é considerada a praga mais destrutiva da fruticultura mundial, para o seu controle vários programas de erradicação baseados em agroquímicos foram criados para permitir o comércio mundial de frutas. Soluções para a diminuição do uso de inseticidas sintéticos na agricultura estão baseadas no desenvolvimento de novos compostos alvos-específicos com menos persistência no meio ambiente, em especial proteínas vegetais com efeitos inseticidas. Neste trabalho o principal objetivo foi avaliar o efeito deletério de uma vicilina purificada de sementes de E. velutina (EvV) para larvas de C. capitata e propor o mecanismo de ação da proteína. EvV foi purificada, caracterizada e o seu efeito deletério foi testado em sistemas de bioensaios. O mecanismo de ação de EvV foi determinado por técnicas de imunodetecção e localização por fluorescência em estruturas quitinosas, presentes no sistema digestório de C. capitata. EvV é uma glicoproteína com afinidade a quitina cuja massa molecular foi de 216,57 kDa, determinado por cromatografia de gel filtração em sistema de FPLC. Por SDS-PAGE, EvV dissociou-se em duas subunidades principais de 54,8 e 50,8 kDa, e quando foi submetida a eletroforese em condições nativas apresentou uma banda única de característica eletroforética ácida. Nos bioensaios a WD50 e a LD50para as larvas foram de 0,13%
ABSTRACT
The fruit fly Ceratitis capitata is considered the most destructive pest of the world fruitculture. Many pest management practices, mainly based on agrochemicals, have been developed to allow the world-wide commerce of fruit. Solutions to decrease the use of synthetic insecticides in agriculture are based on the development of new target-specific compounds which cause less damage to the environment, especially vegetal proteins with insecticidal effects. The aim of this work was to evaluate the deleterious effect of a purified vicilin of E. velutina (EvV) seeds to C. capitata larvae and adult insects and to investigate the mechanisms involved in these effects. EvV was purified, characterized and its deleterious effect was tested in bioassay systems. EvV mechanism of action was determined by immunodetection techniques and fluorescence localization in chitin structures that are present in C. capitata digestory system. EvV is a glycoprotein with affinity to chitin. Its molecular weight, of 216,57 kDa, was determined by gel filtration chromatography in FPLC system. Using SDS-PAGE, it was possible to observe EvV dissociation in two main subunits of 54,8 and 50,8 kDa. When it was submitted to eletrophoresis in native conditions, EvV presented only one band of acid characteristic. The WD50 and LD50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo de vida de Moscas-das-Frutas (Salles, 2000) ...19
Figura 2 – Inseto adulto e larva de Ceratitis capitata...22
Figura 3 – Sementes de Mulungu (Erythrina velutina)...33
Figura 5 – Esquema da Metodologia empregada no trabalho ...55
Figura 6 – Perfil de eluição de EvV em cromatografia de afinidade em quitina...56
Figura 7 – (A) Perfil de eluição protéica de EvV em cromatografia Superose 6 10 300 GL. ...58
Figura 8 – (A) SDS-PAGE (15%) de EvV corado com Comassie ...59
Figura 9 – Curva de densidade para avaliação do efeito da competição das larvas deC. capitata pela dieta ...61
Figura 10 – Curva de instares larvais em relação ao comprimento corporal.. ...62
Figura 11 – (A) Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata em diferentes concentrações...64
Figura 12 – Efeito EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata em diferentes concentrações...65
Figura 15 – (A) SDS-PAGE e (B) Imunobloting das proteínas extraídas de fezes de larvas de C. capitata. M- marcador; 1 – BSA; 2 – Larva + BSA; 3 – EvV; 4 – Larva + EvV. ...66
Figura 16 – Western blotting das proteínas extraídas de membranas peritróficas de larvas de C. capitata. 1 – EvV; 2 – Larva + BSA; 3 – Larva + EvV. ...68
LISTA DE TABELA
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA Albumina sérica bovina
DMSO Dimetilsulfóxido
EB Extrato Bruto de Erythrina velutina EvV Vicilina de E. velutina
F0-70 Fração protéica obtida do fracionamento com sulfato de amônia em 0-70% de saturação. Também denominada fração albuminíca F70-90 Fração protéica obtida do fracionamento com sulfato de amônia em
70-90% de saturação. Também denominada fração globulínica.
FITC Fluoresceína isotiocianato
HIL Homogenato Intestinal de larvas de C. capitata
IgG Imunoglobulina da classe G
kDa Quilodalton
LC50 Quantidade de vicilina capaz causar uma mortalidade de 50% LT50 Tempo necessário para a vicilina causar 50% de mortalidade da
população experimental
mA Miliampere
MP Membrana peritrófica
nm Nanômetro
p/p Relação peso/peso
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em Gel de poliacrilamida com SDS
TCA Ácido tricloroacético
Tris tris hidroximetil amino metano
UH Unidade de Hemaglutinação
v/v Relação volume/volume
WD50 Quantidade de vicilina necessária para reduzir a massa das larvas em 50%
WGA Lectina de germe de trigo específica para quitina
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ...16
1.1 – PRODUÇÃO BRASILEIRA DE FRUTAS ...16
1.2 – MOSCAS-DAS-FRUTAS...18
1.2.1 – Ceratitis capitata...21
1.3 – CONTROLE DE PRAGAS...23
1.4 – SISTEMA DIGESTÓRIO DOS INSETOS...26
1.5 – MECANISMOS DE DEFESA DAS PLANTAS ...28
1.6 – VICILINAS ...30
2.0 – OBJETIVO ...34
3.0 – MATERIAL...35
3.1 – MATERIAL BIOLÓGICO ...35
3.1.1 – Moscas-das-Frutas - Ceratitis capitata...35
3.1.2 – Sementes de Mulungu...35
3.2 – REAGENTES ...36
3.3 – APARELHOS ...36
4.0 – MÉTODOS ...37
4.1 – CRIAÇÃO DA POPULAÇÃO DE C. CAPITATA...37
4.1.2 - Dieta artificial para C. capitata...38
4.2– PURIFICAÇÃO DE VICILINAS DAS SEMENTES...38
4.2.1 – Preparo da Farinha de Sementes de E. velutina...38
4.2.2 – Preparo do Extrato Bruto das Sementes ...38
4.2.3 – Fracionamento com Sulfato de Amônio...39
4.2.4 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina...39
4.3 – CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR EM SUPEROSE 6-10-300 GL DE EVV ...39
4.4 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS ...40
4.4 – DOSAGEM DE CARBOIDRATOS ...40
4.5.1 – Ensaio de Inibição das Atividades Proteolíticas no Homogenato Intestinal de
Larvas de C. capitata...41
4.5.1.1– Preparação do Homogenato Intestinal de C. capitata...41
4.5.1.2 – Preparo de Azocaseína 1,0%...42
4.5.1.3 – Ensaio de inibição da atividade azocaseinolítica...42
4.5.2 – Ensaio de Hemaglutinação...43
4.5.2.1 – Tratamento de Eritrócitos com Papaína ...43
4.5.2.2 – Ensaio de Hemaglutinação de EvV ...43
4.6 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA VICILINA DE E. VELUTINA...44
4.6.1 – Obtenção de soro pré-imune...44
4.6.2 – Imunização ...44
4.6.3 – Isolamento de imunoglobulinas do tipo G (IgG) ...45
4.7 – ANÁLISE DE EVV ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA...45
4.7.1 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e desnaturante ...45
4.7.2 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e não desnaturante ...46
4.7.3 – Coloração com Coomassie Blue ...46
4.8 – IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS - “WESTERN BLOTTING”...46
4.9 – BIOENSAIO COM LARVAS DE C. capitata...49
4.9.1 – Curva de Densidade...49
4.9.2– Curva de instares larval...50
4.9.3 – Efeito de vicilinas sobre o Desenvolvimento de Larvas de C. capitata...50
4.11– ANÁLISE ESTATÍSTICA ...50
4.12 – DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DE VICILINAS ...51
4.12.1 – Digestibilidade in vivo de vicilinas por larvas de C. capitata...51
4.12.2 – Detecção de quitina em Intestino médio de C.capitata...51
4.12.3 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membrana peritrófica de larvas de C. capitata...52
4.12.4 – Detecção de EvV-FITC retidas em estruturas quitinosas de larvas C. capitata...52
4.12.4.2 - Localização de EvV-FITC fluorescente no epitélio intestinal e em membrana peritrófica de larvas de C. capitata e ensaio de inibição de ligação com
N-acetil D-glicosamina ...53
4.12.4.3 - Ensaio de inibição da ligação de EvV–FITC a estruturas quitinosas com N-acetil D-glicosamina ...53
5.0 – RESULTADOS...56
5.1 – ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE VICILINA DE Erythrina velutina....56
5.1.1 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina...56
5.1.2 – Análise da presença de proteínas de defesa ligantes a quitina co-eluídas da matriz de quitina ...57
5.1.3 – Cromatografia de Exclusão Molecular em Superose 6-10-300 GL em sistema de FPLC AKTA Purifier e Determinação da Massa Molecular de EvV...57
5.1.4 – Análise eletroforética de EvV em gel de poliacrilamida em condições desnaturante e não desnaturante...59
5.1.5 – Quantificação de carboidratos em EvV ...60
5.2 – BIOENSAIOS ...60
5.2.1- Bioensaios com larvas ...60
5.2.1.1 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas de C. capitata – Curva de densidade...60
5.2.1.2 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas de C. capitata – Curva de Instars/ comprimento corporal ...62
5.2.2 – Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata...63
5.2.3 – Efeito de EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata...63
5.3 – MECANISMO DE AÇÃO DE EVV ...66
5.3.1 – Digestibilidade in vivo de EvV ...66
5.3.2 – Mecanismo de ação de EvV baseado na ligação à quitina presente na membrana peritrófica de C. capitata...67
5.3.2.1. Teste de Von Wisseling para detecção de quitina em intestinos de C. capitata...67
5.3.2.3. – Localização fluorescente de EvV-FITC no epitélio intestinal e em
membrana peritrófica de larvas de C. capitata...69
xLocalização fluorescente de EvV-FITC em larvas ...69
6.0 – DISCUSSÃO ...72
7.0 – CONCLUSÃO ...80
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – PRODUÇÃO BRASILEIRA DE FRUTAS
As frutas são alimentos essenciais para uma dieta balanceada e saudável
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002). Elas são consideradas junto com as
hortaliças as principais e mais baratas fontes de importantes micronutrientes como
vitaminas e minerais, e ricas em fibras, desempenhando papel importante na
prevenção de deficiências de micronutrientes e promovendo o funcionamento
saudável do intestino (NANDI & BHATTACHARJEE, 2005). A Organização Mundial
da Saúde (OMS) e a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e
Alimentação (FAO) (2005) recomendam o consumo mínimo de 400 g de frutas e
verduras por dia para a prevenção de doenças crônicas como cardiopatias, câncer,
diabetes tipo 2 e obesidade (DE CHAVEZ & CHAVEZ, 1998; RIBOLI & NORAT,
2003; HUNG et al., 2004). Segundo o World Health Report (2002) estima-se que mais de 2,6 milhões de mortes a cada ano poderiam ser evitadas se o consumo de
frutas e hortaliças fosse aumentado. De acordo com a FAO o mercado mundial de
frutas frescas esteve em plena ascensão na ultima década (FAOSTAT-FAO
STATISTICS DIVISION, 2007). A produção mundial de frutas frescas cresceu cerca
de 2,5% ao ano, alcançando um volume de 520 milhões de toneladas em 2005
contra 415 milhões de toneladas em 1995 (FAOSTAT-FAO STATISTICS DIVISION,
2007). Este aumento está associado a uma maior conscientização da população
para os efeitos benéficos do consumo de frutas na saúde humana, e das melhorias
na logística de produção e comercialização das frutas e produtos relacionados
O Brasil é o terceiro produtor mundial de frutas, atrás de China e Índia
(NANDI & BHATTACHARJEE, 2005), com uma produção que supera os 39 milhões
de toneladas, sendo que destes aproximadamente 20 milhões de toneladas foram
destinados aos mercados de fruta fresca. Não obstante essa colocação, o Brasil
exporta pouco mais de 1% da sua produção de frutas in natura, ocupando o 20° lugar entre os países exportadores (SECEX, 2006). De 1998 a 2005 o país
aumentou suas exportações em mais de 200%, passando de US$ 120 milhões para
US$ 440 milhões de dólares obtidos na venda de frutas para o exterior (PEREIRA,
2006). Os principais destinos das frutas brasileiras são os países europeus, as
Américas do Norte e do Sul, o Oriente Médio, além de perspectivas de vendas para
o mercado asiático (IBRAF, 2005).
A fruticultura hoje é um dos principais segmentos da agricultura brasileira,
respondendo por 25% do valor da produção agrícola nacional (LACERDA et al., 2004). A base agrícola da cadeia produtiva das frutas abrange 2,9 milhões de
hectares, gera 6 milhões de empregos diretos, ou seja, 27% do total da mão-de-obra
agrícola ocupada no país (IBGE, 2005). O valor bruto da produção de frutas atingiu
em 2006 cerca de 13,5 bilhões de reais, 14,1% do valor da produção agrícola
brasileira (IBGE, 2005).
O comércio internacional de produtos alimentares é fortemente condicionado
por vários mecanismos de regulação fitossanitária (FAVERET FILHO et al., 1999). Preocupados com possíveis efeitos sobre consumidores e, especialmente, sobre
suas regiões produtoras, quase todos os países impõem restrições ao trânsito de
alimentos (FAVERET FILHO, et al., 1999; SILVA, 2000). No caso de produtos frescos, a preocupação é redobrada, pois um lote infectado pode anular esforços de
Note-se que os países com regras e instituições de controle de qualidade mais
rigorosas são justamente os grandes importadores: Estados Unidos, União Européia
e Japão, o que torna extremamente seletivo o acesso de novos exportadores aos
fluxos de comércio internacional de frutas (FAVERET FILHO, et al., 1999). No Brasil, as moscas-das-frutas ocupam uma posição de destaque entre as maiores pragas da
fruticultura (DUARTE & MALAVASI, 2000).
1.2 – MOSCAS-DAS-FRUTAS
As moscas-das-frutas (Diptera: Tephritidae) são insetos pragas que atacam
uma grande variedade de espécies vegetais, podendo infestar flores, ramos,
sementes e frutos, no entanto os danos causados em frutos representam os maiores
prejuízos para a fruticultura (NISHIDA, 1980; DUARTE & MALAVASI, 2000; LIMA,
2001). Os tefritídeos possuem ciclo de vida relativamente curto, porém apresentam
metamorfose completa (holometabólicos). O desenvolvimento larval, em três
instares, dá-se no interior das frutas infestadas onde crescem alimentando-se da
polpa e abrindo galerias, de onde as larvas saem para empupar no solo. Após algum
tempo, que varia para cada espécie, emergem os adultos, que recomeçam o ciclo
(Figura 1) (MORGANTE, 1991; DUARTE & MALAVASI, 2000; SALLES, 2000a).
Os danos causados pelas moscas-das-frutas podem ser diretos, através da
oviposição nos frutos e da alimentação na fase larvais, ou indiretos, através da
invasão dos tecidos vegetais por microorganismos tornando os frutos impróprios
Figura 1 – Ciclo de vida de Moscas-das-Frutas (Salles, 2000)
A família Tephritidae apresenta ampla distribuição geográfica, com
predominância na região Neotropical, apresentando 4.352 espécies agrupadas em
481 gêneros (NORRBOM, 2004), dos quais somente cinco são de importância
econômica: Anastrepha, Ceratitis, Bactrocera, Rhagoletis e Toxotrypana (WHITE & ELSON-HARRIS). No gênero Toxotrypana, a única espécie de importância
econômica, T. curvicauda (mosca-da-papaia), não ocorre no Brasil. O gênero Bactrocera está representado por uma única espécie, B. carambolae (mosca-da-carambola), recentemente introduzida e restrita ao Oiapoque (AP) (ZUCCHI, 2000).
As quatro espécies de Rhagoletis registradas no Brasil têm pouca importância agrícola, pois são referidas como pragas esporádicas na região Sul (ZUCCHI, 2000).
O Gênero Ceratitis, de origem sub-Saariana, é um dos mais conhecidos em todo o mundo por causa da notoriedade de uma de suas espécies, a
mosca-do-mediterrâneo, C. capitata. Mais de 100 espécies de Ceratitis já foram descritas e estão limitadas ao continente africano, seis das quais são pragas, atacando uma
enorme variedade de plantas (CAREY, 1996). A única espécie do gênero no Brasil é
a C. capitata, que juntamente com sete espécies de Anastrepha — A. fraterculus (Wied.), A. sororcula (Zucchi), A. zenildae (Zucchi), A. striata Schiner, A. pseudoparallela (Loew), A. grandis (Macquart) e A. obliqua (Macquart) —, representam as moscas-das-frutas mais importantes do ponto de vista econômico no
Brasil (ZUCCHI, 2000).
A grande variedade de hospedeiros infestados confirma as observações de
BATEMAN (1976), que considera as espécies tropicais de “moscas-das-frutas” como
tendo alta capacidade de colonização. Elas ocorrem em grande variedade de
hospedeiros em regiões ecológicas bastante diversas. As medidas do grau de
infestação mostraram que em hospedeiros nativos, a freqüência de Anastrepha ssp. é maior que a de C. capitata, invertendo-se em hospedeiros introduzidos (MALAVASI, 1977). Apesar desta preferência, já existe adaptação de C. capitata às frutas nativas e de Anastrepha ssp. aos hospedeiros introduzidos (MALAVASI & MORGANTE, 1980). A expansão de hospedeiros nas moscas-das-frutas pode ser
facilitada por um comportamento de oviposição de baixa discriminação e habilidade
das larvas para sobreviverem e se desenvolverem nos novos hospedeiros
(KRAINACKER et al., 1987; FLETCHER & PROKOPY, 1991).
Em muitas partes do mundo, as perdas causadas em regiões infestadas por
internacional de frutas frescas impõe normas que visam impedir a introdução de
espécies que ocorrem no país exportador para o país importador, por isso um dos
maiores obstáculos à produção e livre comercialização de frutas frescas entre o
Brasil e no resto do mundo é a presença de moscas-das-frutas nas áreas de
produção (DUARTE & MALAVASI, 2000). Tratamentos quarentenários são
requeridos pelos Estados Unidos para o controle de moscas-das-frutas que infestam
manga (Mangifera indica) e goiaba (Psidium guajava), no Brasil e Perú (SHARP & PICHOMARTINEZ, 1990; NASCIMENTO et al., 1992). A adequação a essas normas e exigências dos mercados, a busca pela segurança alimentar e quarentenária,
exigem rápidas mudanças nas técnicas de controle utilizadas na fruticultura
brasileira (CARVALHO, 2005).
1.2.1 – Ceratitis capitata
A mosca do mediterrâneo, Ceratitis capitata Wied.(1824) é a única espécie do gênero Ceratitis no Brasil (ZUCCHI, 1988) (figura 2). Essa espécie é considerada a mais cosmopolita e invasora dentre todos os tefritídeos. É a praga mais destrutiva da
fruticultura mundial, devido à natureza do dano causado, ao grande número de
gerações por ano e à sua grande adaptabilidade a vários tipos de hospedeiros,
sendo capaz de infestar mais de 350 espécies vegetais, inclusive aquelas de
importância econômica (WEEMS, 1981; METCALF, 1995). O provável centro de
origem dessa espécie é a África Equatorial, mas um processo global de invasão tem
ocorrido desde o século passado. No Brasil, onde sua presença foi registrada no
início do século XX (IHERING, 1901), ela é considerada uma das pragas de maior
importância quarentenária (MALAVASI & MORGANTE, 1980).
Devido aos danos causados por moscas-das-frutas, bilhões de dólares são
esta praga. Cada vez mais inseticidas são utilizados, como forma de proteção
mesmo quando a população de moscas-das-frutas ainda não atingiu o nível de dano
econômico, implicando em gastos e danos ao meio ambiente (DENT, 2000).
1.3 – CONTROLE DE PRAGAS
O aumento da população mundial e a demanda crescente de alimentos têm
motivado o uso de grandes quantidades de pesticidas nas plantações (para prevenir
ou combater pragas), visando assegurar maior produtividade (CALDAS & DE
SOUZA, 2000). Segundo OERKE et al. (1994) o ataque de insetos pragas consomem cerca de 14% da produção agrícola mundial. Atualmente a proteção da
lavoura está baseada na utilização de agroquímicos, que em 2001 movimentou um
mercado mundial de aproximadamente 32 bilhões de dólares, segundo a agência de
proteção ambiental dos Estados Unidos (KIELY et al., 2004). Porém na ausência desse meio de combate às pragas, as perdas poderiam ser muito mais sérias
(HILDER & BOULTER, 1999). Segundo Krattiger (1997) os danos causados na
agricultura mundial sem o uso de pesticidas e outras estratégias de controle são
estimados em 70% da produção agrícola, totalizando cerca de 400 bilhões de
dólares por ano.
Os primeiros inseticidas realmente eficientes foram introduzidos no combate
de pragas na metade do século 20, antes, o controle de pragas era baseado na
utilização de compostos inorgânicos como enxofre, arsênio, cianetos e boratos
(CASIDA & QUISTAD, 1998), os quais apresentavam alta toxidade e baixa
especificidade, sendo tóxicos para vertebrados (LOPEZ et al., 2005). A introdução dos inseticidas organoclorados, organofosforados e carbamatos, todos químicos
neurotóxicos, significou uma grande revolução na agricultura (ISHAAYA, 2003).
Contudo, a utilização dos pesticidas constitui-se num dos mais importantes fatores
destes casos em paises em desenvolvimento (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2003c). Alguns pesticidas dependendo da sua persistência e volatilidade, dispersam
globalmente (WILKENING, 2001; GODDUHN & DUFFY, 2003). Cada vez mais,
grandes quantidades de pesticida e seus metabólitos são detectados contaminando
águas superficiais e subterrâneas (KOLPIN et al., 2004; FAVA et al., 2005; WORRALL & BESIEN, 2005), solos (SIVANESAN et al., 2004; CRAVEN & HOY, 2005), a atmosfera (DUBUS et al., 2000; DUYZER, 2003). Estes pesticidas bioacumulam em cadeias alimentares (KIDD et al., 1995), provocam impactos sobre a saúde humana e de outras espécies longe de seu local de liberação até muitos
anos depois de liberados (WOLKERS et al., 2006; SAGIV et al., 2007).
Em muitos paises, como no Brasil, há ocorrências de casos concretos de
fracassos no controle de pragas através do uso exclusivo de pesticidas,
principalmente devido a problemas decorrentes da eliminação de inimigos naturais,
desenvolvimento ou aumento de resistência e ressurgência de pragas secundárias.
O potencial acúmulo de resíduos de pesticidas no agrossistema e nos produtos
vegetais causa uma crescente preocupação mundial. Além das exigências impostas
pela lei à não presença ou aceitação de resíduos tóxicos nos alimentos, a sociedade
está, a cada dia, exigindo por produtos que estejam seguramente livres de
agrotóxicos (SALLES, 2000b). Além dos aspectos ambientais negativos e afim de
superar a resistência de populações de insetos resistentes aos inseticidas
neurotóxicos convencionais a tendência nas pesquisas é a procura por pesticidas
com diferentes mecanismos de ação e com baixa toxicidade para a saúde humana e
para o meio ambiente (DHADIALLA et al., 1998; GRAPOV, 1999).
Em meados de 1960 pesquisadores começaram a questionar o modelo de
problemas ecologicamente e economicamente insustentáveis (GEIER, 1966;
KOGAN, 1998). Como conseqüência surgiu um novo conceito de controle de pragas
visando a minimização de todos esses problemas. Este novo conceito recebeu
inicialmente a denominação de Controle Integrado, evoluindo para o termo "Manejo
Integrado de Pragas" (MIP) para designar o controle de insetos com bases
ecológicas e envolvendo qualquer tipo de problema que limitasse a produção
agrícola decorrente da competição interespecífica (patógenos, insetos, nematóides,
plantas daninhas, etc) (KOGAN, 1998). A prática do MIP foi descrita por Geier (1966)
e baseia-se nos seguintes pontos: (1) como se deve modificar o sistema de vida de
uma praga para reduzir a sua população a níveis toleráveis, ou seja, inferior ao nível
de dano econômico; (2) aplicação do conhecimento biológico e da tecnologia
disponível para obter a modificação desejada (ecologia aplicada); e (3) uso de
táticas no controle de pragas adequado à tecnologia existente, compatível com os
aspectos qualitativos, econômicos e ambientais, ou seja de aceitação econômica e
social. O manejo integrado de moscas-das-frutas no Brasil utiliza basicamente a
técnica do monitoramento de adultos com armadilhas e o uso de iscas tóxicas ou
pulverização de inseticida em cobertura (NASCIMENTO & CARVALHO, 2000).
Havendo, portanto uma necessidade por novos métodos alternativos eficazes de
controle que mantenham a população das moscas em níveis seguros, e que possam
ser associadas aos programas de manejo de pragas dentro do agronegócio.
Um dos principais objetivos de investigações básicas associadas ao manejo
integrado de pragas é a perspectiva de entender e interferir nos processos vitais do
inseto (genéticos-bioquímicos-morfofisiológicos), de modo que tal interferência
possua escassa ou nenhuma influência sobre outros animais, e ao mesmo tempo,
(CRUZ et al., 2000). Dentro desta perspectiva o sistema digestório dos insetos é uma região importante de exposição deste com o meio ambiente, dessa forma,
estratégias que interferiram na bioquímica e fisiologia desta região, visando à
redução de absorção de nutrientes, seriam ferramentas potencialmente eficientes no
manejo de pragas (SHEWRY & LUCAS, 1997).
1.4 – SISTEMA DIGESTÓRIO DOS INSETOS
A habilidade dos insetos de se alimentar de praticamente todo tipo de matéria
orgânica é o maior fator para o seu sucesso, capacitando-os para os mais diversos
nichos ecológicos (WIGGLESWORTH, 1972). A grande variedade de alimentos que
podem ser ingeridos pelos insetos é refletido na diversidade de estruturas das peças
bucais bem como, na diversidade do trato digestório, com um alto grau de
especialização que varia com o tipo particular de dieta (WIGGLESWORTH, 1972).
Seu trato digestório é constituído por um tubo de células epiteliais que se estende da
boca até o ânus (WIGGLESWORTH, 1972; TERRA & FERREIRA, 1994). Está
dividido em três principais regiões baseado na origem embrionária e na sua função
fisiológica em estomodeu (intestinos anterior), mesêntero (intestino médio) e
proctodeu (intestino posterior), onde o principal local de absorção e digestão é o
intestino médio (WIGGLESWORTH, 1972; TERRA & FERREIRA, 1994; TERRA et al., 1996).
O trato digestório animal está exposto a uma variedade de agentes nocivos
de natureza química, física e biológica, necessitando de mecanismos para a sua
proteção. Nos vertebrados, o muco é uma secreção que recobre e protege o epitélio
intestinal, enquanto auxilia o processo de digestão. Nos insetos, entretanto, não se
observa uma camada mucosa propriamente dita recobrindo o trato digestório, em
semipermeável denominada membrana peritrófica ou matriz peritrófica ou gel
peritrófico (PETERS, 1992; LEHANE, 1997; TERRA, 2001). A membrana peritrófica
é uma estrutura mucosa (WANG & GRANADOS, 1997), que difere do muco dos
vertebrados pela incorporação de quitina, resultando em uma estrutura protéica
reforçada por fibrilas de quitina (PETERS, 1992). É constituída principalmente por
glicoproteínas e proteoglicanos (20-55%) e por quitina (3-40%) (KRAMER et al., 1995; LEHANE, 1997) em uma organização que fornece semi-permeabilidade e
elasticidade a estrutura (LEHANE, 1997). A quitina é um importante componente
estrutural da membrana peritrófica por além de fornecer rigidez, serve também como
sítio de ancoragem para proteínas como as peritrofinas (WANG & GRANADOS,
2001). A presença desta membrana define a formação de um espaço
endoperitrófico, o qual contém o alimento ingerido; e o espaço ectoperitrófico
correspondendo a região entre a membrana peritrófica e o epitélio intestinal.
A Membrana peritrófica, em insetos pode ocorrer em duas formas, definidas
quanto ao seu sitio de síntese: Tipo I e Tipo II (WIGGLESWORTH, 1972; PETERS,
1992). A membrana peritrófica do tipo I, produzida por exemplo em muitos insetos
adultos hematófagos, é sintetizada por células epiteliais do intestino médio, sendo
produzida em resposta a ingestão de alimento, que por descamação da superfície
epitelial, dá origem a uma estrutura em forma de bolsa que recobre o alimento
(LEHANE, 1997). O Tipo II de membrana peritrófica é produzido a partir de um
pequeno órgão altamente especializado chamado de cárdia situado na região
anterior do intestino médio. Este tipo de Membrana peritrófica é constitutivamente
produzida como um contínuo tubo com estrutura altamente organizada. As mais bem
caracterizadas membranas peritróficas do tipo II são de larvas de dípteros
As principais funções atribuídas a esta membrana são a de proteção
mecânica contra injúria as células do intestino médio (WIGGLESWORTH, 1972),
uma barreira física contra microorganismos (PETERS, 1992), uma barreira seletiva
para enzimas digestivas e produtos de digestão (DAY & WATERHOUSE, 1953) e
atuação no mecanismo de reciclagem de enzimas digestivas, fenômeno conhecido
como circulação ecto-endoperitrófica (TERRA, 1988; TERRA & FERREIRA, 1994;
TERRA, 2001).
Diversos trabalhos demonstram que alteração na permeabilidade da
membrana peritrófica pode causar a morte de insetos por desnutrição (EISEMANN
et al., 1994; TELLAM & EISEMANN, 1998; WANG & GRANADOS, 2001). Esse efeito pode ser alcançado pela incorporação, na dieta destes insetos, de proteínas
que tenham afinidade por quitina, como lectinas, anticorpos e vicilinas (EISEMANN &
BINNINGTON, 1994; HARPER et al., 1998; HOPKINS & HARPER, 2001; MACEDO et al., 2007; MOURA et al., 2007).
1.5 – MECANISMOS DE DEFESA DAS PLANTAS
Em resposta a herbivoria excessiva dos insetos as plantas desenvolveram
diversas estratégias de proteção e ou resistência. A resistência é o termo usado para
descrever a capacidade das plantas em prevenir, restringir ou retardar a penetração
de um predador no tecido hospedeiro (KOGAN, 1986; HAMMOND-KOSACK &
JONES, 1996). Essa resistência é baseada nos vários mecanismos de defesa
desenvolvidos pelas plantas, durante a evolução (SCHULER et al., 1998). As defesas de plantas podem ser classificadas como físicas (espinhos, tricomas, e
tegumentos) ou químicas se há envolvimento de substâncias químicas nos
mecanismos pelos quais elas se protegem. As defesas químicas, por sua vez,
outro lado, as defesas também podem ser agrupadas em duas categorias: defesas
constitutivas, se sua ação faz-se dentro do programa de desenvolvimento normal da
planta nos diferentes tecidos vegetais; ou induzidas quando estão envolvidas
diretamente na resposta a infecção ou estímulos ambientais (CHESSIN & ZIPF,
1990). Essa resposta induzida pode resultar em efetivos mecanismos de resistência
a doenças quando ela é expressa pela planta, sistemicamente. Nesse caso, os
agentes envolvidos induzem uma resposta do hospedeiro, não apenas em torno das
partes atingidas, como também em partes da planta distante da área onde ocorreu à
injúria, sendo este processo denominado imunização sistêmica adquirida (DEAN &
KUC, 1986; GOTTSTEIN & KUC, 1989). As defesas induzidas são mais importantes
para as defesas de partes vegetativas das plantas, enquanto que as defesas
constitutivas são mais importantes para as defesas das sementes (XAVIER-FILHO,
1993; UCHÔA et al., 2002).
Diversas proteínas envolvidas no processo de defesa presentes em sementes
de leguminosas foram isoladas, purificadas e caracterizadas. Entre elas estão
enzimas como, quitinases (SANTOS et al., 2004) , E–1,3 glucanases, inibidores de enzimas hidrolíticas como, inibidores de amilases (SAWADA et al., 2006) e de proteinases (ARAUJO et al., 2005; GOMES et al., 2005b), e proteínas de reserva como as arcelinas (MINNEY et al., 1990), vicilinas (MOURA, et al., 2007), lectinas (MORAES et al., 1996).
Muitas destas proteínas de defesa podem ser divididas em dois principais
grupos segundo a forma pelas quais podem causar efeitos tóxicos no processo de
digestão dos insetos. No primeiro grupo, elas podem ser proteínas que inibem
OLIVEIRA et al., 2003; FRANCO et al., 2004; GOMES et al., 2005a; GOMES, et al., 2005b). Os efeitos tóxicos causados por estas proteínas são devido a privação de
nutrientes decorrido pela inibição seletiva de enzimas digestivas presentes no trato
intestinal dos insetos (JONGSMA & BOLTER, 1997; GATEHOUSE, et al., 1999). No segundo grupo estão as proteínas que se ligam a quitina, como lectinas (DUTTA et al., 2005; GUPTA et al., 2005; MACEDO, et al., 2007) e vicilinas (MACEDO et al., 1995; SALES et al., 1996; MOURA, et al., 2007) , e, portanto capazes de se ligarem à membrana peritrófica interferindo na assimilação de nutrientes, e levando o inseto
à morte (SALES, et al., 1996)..
Em estudos recentes de caracterização das enzimas proteolíticas em Ceratitis capitata foi verificado que estes insetos utilizam principalmente proteases alcalinas do tipo serínicas (SILVA et al., 2006; SAN ANDRES et al., 2007), esta detecção motivou a utilização de inibidores de proteinases serínicos obtidos de sementes,
como promissores candidatos a bioinseticidas, atuando na inibição especifica da
digestão das proteínas. A utilização destes inibidores em sistema de dieta artificial
afetou significantemente o desenvolvimento larval de C. capitata, porém, causou pouco efeito sobre a mortalidade das larvas (ARAUJO, et al., 2005; GOMES, et al., 2005b). Com relação ao efeito de proteínas que se ligam a estruturas presentes no
trato digestório de insetos, muitos estudos comprovaram sua ação inseticida em
dípteros (EISEMANN, et al., 1994; TELLAM & EISEMANN, 1998), contudo a potencial utilização destas proteínas no combate as moscas-das-frutas não foi
testada.
1.6 – VICILINAS
As vicilinas compreendem uma classe de proteína de reserva muito bem
proteínas triméricas de peso molecular entre 150 a 190 kDa, não formam pontes
dissulfeto devido a ausência de resíduos de cisteína (DERBYSHIRE et al., 1976; PEDALINO et al., 1992). As subunidades da vicilina de ervilha são sintetizadas inicialmente como um grupo de polipepitídeos de peso molecular entre 47 a 50 kDa,
porém a proteólise pós-traducional e glicosilação resulta em subunidades com pesos
moleculares entre 12,5 a 33 kDa (GATEHOUSE et al., 1984). Esta característica pode também ser resultado da adição incompleta ou degradação parcial da ligação
dos oligossacarídeos nas cadeias laterais dos peptídeos tornando difícil sua
digestão por insetos (CHEE et al., 1991; MACEDO, et al., 1995). As subunidades são codificadas, na sua maioria, por 2 a 3 tipos de genes, com 3 a 4 copias de cada
tipo por genoma haplóide (GOLDBERG et al., 1981; SUN et al., 1981; TIERNEY et al., 1987; BOWN et al., 1988; HARADA et al., 1989). Observa-se que os genes de vicilinas de Phaseolus vulgaris, Pisum sativum e Glycine max quando comparados apresentam alta homologia (DOYLE et al., 1986). Cada gene tem 6 éxons e 5 íntrons (DOYLE, et al., 1986; HIGGINS et al., 1988).
Em sementes de legumes, as vicilinas são proteínas multifuncionais,
funcionando como uma fonte de aminoácidos durante a germinação e ao mesmo
tempo sendo tóxica para bruquídeos (MACEDO et al., 1993; SHUTOV et al., 1995; SALES et al., 2000). Vicilinas de Vigna unguiculata mostraram forte associação com quitina, quitosana e quitina completamente acetilada (SALES, et al., 1996). Por esta razão, estas proteínas podem se ligar à parede celular de fungos, interferindo na
Portanto, vicilinas são proteínas bioativas importantes nos processos de
defesa de muitas espécies de plantas. Essas proteínas possuem atividades
bioinseticidas sobre diversas pragas associando-se a estruturas do epitélio e
membranas peritróficas presentes no intestino de vários insetos, podendo ser
usadas como aleloquímicos no controle de pragas importantes, seja como
constituinte tóxico de iscas ou nos programas de melhoramento de plantas
cultivadas por meio de técnicas de transgenia.
No nosso laboratório são realizados estudos de bioprospecção por proteínas
tóxicas em sementes ditas selvagens presentes nos biomas de mata atlântica e
caatinga. Dentre essas sementes destacam-se as de mulungu (Erythrina velutina) que é uma leguminosa de grande porte endêmica de regiões semi-áridas do
nordeste do Brasil (RIBEIRO et al., 2006) (figura 3). Resultados recentes do nosso grupo mostraram que vicilinas extraídas das sementes desta leguminosa foi tóxica
para os bruquídeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes sufasciatus. Neste estudo, vicilina de sementes de E. velutina foi purificada, caracterizada e utilizadas em sistema de bioensaio com o intuito de se propor um modelo de controle biorracional
2.0 – OBJETIVO
Objetivo geral:
Investigar o potencial bioinseticida de vicilinas de Erythrina velutina (Mulungu) sobreC. capitata .
Objetivos específicos:
1. Isolar, purificar e caracterizar vicilinas de sementes da leguminosa
Erythrina velutina (Mulungu).
2. Avaliar o efeito de vicilinas de leguminosas sobre a massa e mortalidade de
larvas de C. capitata, determinando o LD50 e WD50.
3.0 – MATERIAL
3.1 – MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1 – Moscas-das-Frutas - Ceratitis capitata
Neste trabalho, o material biológico constituído do inseto adulto e de larvas
de C. capitata, foi obtido a partir de frutos de castanholas (Terminalia catappa L.) infestadas recolhidas no campus da UFRN (5°50'18.47"S; 35°12'3.99"O), na
cidade de Natal, no Estado do Rio Grande do Norte.
3.1.2 – Sementes de Mulungu
3.2 – REAGENTES
x Azocaseína, BSA, Dimetilsulfóxido, anti-IgG de coelho conjugada à
peroxidase, Fluoresceína 5-isotiocianato isômero I (SIGMA Chemical Co., St.
Louis, MO, EUA).
x Membrana de Nitrocelulose - Amersham Hybond™-C Extra (GE
Healthcare Bio-Sciences Corp.)
x Coomassie brilliant blue G – 250 - Bio Rad
x Os demais reagentes foram de grau analítico e adquiridos
comercialmente.
3.3 – APARELHOS
x Agitador Magnético Mod. 257 FANEM
x Banho Maria TCE – 056 TECNAL
x BOD - TECNAL
x Centrífuga Eppendorf – Netheler Hlnz GmbH 22331 Hamburg
x Centrífuga Refrigerada Sigma Laborzentrifugen 2K15
x Espectrofotômetro Femto 700 Plus
x Medidor de pH Analyser 300
x Microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E200
4.0 – MÉTODOS
4.1 – CRIAÇÃO DA POPULAÇÃO DE C. capitata
Os frutos de castanholas (Terminalia catappa L.) infestadas por Ceratitis capitata foram colhidos no campus da UFRN e deixados em bandejas plásticas (49 x 28 x 7 cm) com vermiculita até a empupação. As pupas foram peneiradas e
colocadas em recipientes plásticos fechados e arejados. Os insetos adultos, após
emergirem, foram classificados e os que pertenciam ao gênero Ceratitis foram separados e colocados em gaiolas. Esses insetos foram mantidos à base de dieta
composta por: 150 g de açúcar mascavo, 100 g de açúcar refinado, 36 g de lêvedo
de cerveja, 3 g de sustagen®, 60 mL mel de abelha e 180 mL de hidrolisado de
proteína de milho. Uma esponja embebida com água ficou permanentemente a
disposição dos insetos.
Após um período de aproximadamente 10 dias de idade, os insetos adultos
atingiram o estágio de maturação sexual. As fêmeas começaram a ovipositar na
malha do filó - que cobre uma das faces da gaiola, estimuladas pela incidência de
luz nesta face. Os ovos foram então recolhidos em uma calha coletora contendo
salina, o que dessa forma evitou-se o ressecamento dos ovos. No período da
manhã, as calhas foram limpas e a suspensão, contendo os ovos, filtrada em filó.
Por fim os ovos foram espalhados na superfície da dieta artificial para larvas de
Ceratitis capitata. Após um período de 48 horas as larvas emergiram dos ovos e após mais 120 horas as larvas atingiram o terceiro instar. Como comportamento
característico dessa espécie, as larvas começaram a saltar e conseguiram sair do
recipiente que contém a dieta, caindo em vermiculita onde empuparam. Esse
acima foram realizadas a 28 °C com a umidade relativa em torno de 75%. Os
adultos foram mantidos em fotoperíodo 12:12 (Luz:Escuro).
4.1.2 - Dieta artificial para C. capitata
O preparo de 500 g de dieta artificial (Walder, 2002) foi realizado
adicionando-se gérmen de trigo (15 g), farinha de trigo (32,5 g), açúcar cristal (60 g), extrato de
levedura (49,5 g), benzoato de sódio (1,5 g), HCl (4,5 g), H2O (285 g) e bagaço de
cana-de-açúcar (52 g). O material foi misturado até a formação de uma pasta
homogênea.
4.2– PURIFICAÇÃO DE VICILINAS DAS SEMENTES
4.2.1 – Preparo da Farinha de Sementes de E. velutina
Sementes secas Erythrina velutina depois de retirados seus tegumentos, foram trituradas em multiprocessador, passadas no moinho elétrico e peneiradas
para obtenção de uma farinha de granulação fina.
4.2.2 – Preparo do Extrato Bruto das Sementes
O extrato bruto da farinha das sementes foi obtido a partir da
homogeneização em tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5 na proporção de
1:10 (m/v) sob agitação constante por 2 horas à temperatura ambiente. A suspensão
foi centrifugada a 12000 x g por 30 minutos a 4 ºC. O precipitado foi descartado e o
4.2.3 – Fracionamento com Sulfato de Amônio
O extrato bruto foi fracionado com sulfato de amônio em duas etapas de
concentração: 0-70% e 70-90%. Após cada etapa de fracionamento, a solução
permaneceu a 4 ºC por aproximadamente 16 horas e, posteriormente centrifugada a
12.000 x g durante 30 minutos, a 4 ºC. Os precipitados resultantes de cada
fracionamento foram ressuspensos em tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5
submetidos à diálise durante 18 horas a 4 °C contra o mesmo tampão. Após diálise
as frações foram denominadas F0-70 (fração albumínica) e F70-90 (fração
globulínica), de acordo com a faixa de saturação de sulfato de amônio em que
precipitaram.
4.2.4 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina
A fração F70-90 das sementes foi submetida a uma cromatografia de
afinidade em matriz de quitina, previamente equilibrada com tampão tetraborato de
sódio 50 mM pH 7,5. Frações de 3,0 mL foram coletadas e a absorbância
acompanhada a 280 nm. Após a eluição das proteínas não adsorvidas com tampão
de equilíbrio, as proteínas retidas foram eluídas com tampão Glicina 100 mM, pH
2,0. Os eluatos correspondentes ao pico retido foram dialisadas contra água
destiladas, liofilizadas e denominadas EvV.
4.3 – CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR EM SUPEROSE 6-10-300
GL DE EvV
Para confirmação da purificação e determinação da massa molecular de EvV,
um mililitro de solução da proteína (0,83 mg/mL) foi submetida à cromatografia de
previamente equilibrada em tampão tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. Esta coluna
foi previamente calibrada com os seguintes padrões de proteínas: tireoglobulina
(669 kDa), ȕ-amilase (200 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa) e anidrase
carbônica (29 KDa). Frações de 0,5 ml foram coletadas sob um fluxo de 0,5 ml/min e
absorbância medida a 280 nm. As massas moleculares aparentes das vicilinas
foram estimadas a partir da interpolação logarítmica entre massas moleculares dos
diferentes marcadores protéicos utilizados e os seus respectivos volumes de eluição.
4.4 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS
As concentrações protéicas foram determinadas pelo método colorimétrico de
Bradford (1976), no qual albumina sérica bovina é utilizada como padrão. Para o
ensaio, 50 ȝL de amostra protéica foram completados com 2500 ȝL com Reagente
de Bradford. A reação foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos, agitada
em vortex. As leituras das amostras foram verificadas à absorbância a 595 nm. A
concentração protéica das amostras foi calculada a partir da equação da curva
previamente construída.
4.4 – DOSAGEM DE CARBOIDRATOS
A quantificação de açucares totais foi determinada pelo método do fenol/ácido
sulfúrico como previamente descrito por Dubois et al. (1956) empregando-se como padrão D-glicose. EvV foi dissolvida em tampão tetraborato de sódio, 50 mM pH 7,5
na concentração de 10 mg/mL. Para o ensaio 40 ȝL desta solução foram
completados para 1000 ȝL com água destilada e acrescida de 25 ȝl fenol 80%, 2,5
ml de ácido sulfúrico. A reação foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos,
agitada em vortex, e deixada em banho-maria a 37 ºC por mais 30 minutos. As
carboidratos das amostras foi calculada a partir da equação da curva previamente
construída.
4.5 – DETECÇÃO DE OUTRAS PROTEÍNAS DE DEFESA LIGANTES Á QUITINA
NA FRAÇÃO ELUÍDA DA MATRIZ QUITINOSA
Para detectar a presença de outras proteínas de defesa ligantes à matriz de
quitina de amostras de vicilinas purificadas foram feitos ensaios inibitórios contra
enzimas do tipo serínicas, de homogenatos intestinais de larvas de C. capitata. Também foram realizados ensaios de hemaglutinação para detectar a presença de
lectinas.
4.5.1 – Ensaio de Inibição das Atividades Proteolíticas no Homogenato Intestinal de Larvas de C. capitata
4.5.1.1– Preparação do Homogenato Intestinal de C. capitata
Larvas de terceiro instar de C. capitata foram mergulhados em solução de NaCl 150 mM e mantidos no gelo até a dissecação. Esta foi realizada a frio com
auxílio de uma lupa esterioscópica. Após a exposição do trato intestinal, o intestino
foi seccionado e transferido para tubo de microcentrífuga contendo 200 ȝL do
tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 (TBS) e mantido em gelo até a retirada
de 100 intestinos por tubo. Estes permaneceram estocados a -20ºC até sua
utilização nos ensaios.
Os intestinos obtidos como acima descrito foram homogeneizados em Potter
durante 5 minutos em banho de gelo, após a homogeneização, foram adicionados
800ȝL de tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi centrifugada
denominado homogenato intestinal de larvas (HIL). Os homogenatos foram
utilizados imediatamente nos ensaios.
4.5.1.2 – Preparo de Azocaseína 1,0%
Um grama de azocaseína foi pesado e dissolvido em 100 mL de tampão
Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi aquecida e deixada em
ebulição por 5 minutos. Após o resfriamento, o pH da solução foi reajustado e o
volume completado para 100 mL com água destilada. Essa solução foi armazenada
a -20 °C até sua utilização.
4.5.1.3 – Ensaio de inibição da atividade azocaseinolítica
A inibição da atividade azocaseinolítica de homogenatos intestinais de larvas
deC. capitata foi determinada pré-incubando-se por 15 minutos a 37 °C alíquotas de 50 ȝL das soluções (4 mg/ mL) de vicilinas com 50 ȝL de homogenatos. Após o
tempo de pré-incubação foram adicionados 400 ȝL de tampão tetraborato de sódio
50 mM pH 7,5 e 500 ȝL de azocaseina 1,0% a 37°C por 60 minutos. A reação foi
parada com a adição de 300 ȝL de TCA 20%. Os tubos foram deixados em repouso
por 15 minutos e centrifugados por mais 15 minutos a 13000 x g. alíquotas de 400
ȝL do sobrenadante foram alcalinizadas com o mesmo volume de NaOH 2N. O
efeito das vicilinas sobre a atividade proteolítica a pH 7,5 foi determinada pela
medida da absorbância dos peptídeos diazotizados produzidos a 440 nm. O ensaio
controle foi realizado na ausência de vicilinas nas mesmas condições acima
4.5.2 – Ensaio de Hemaglutinação
4.5.2.1 – Tratamento de Eritrócitos com Papaína
Uma solução estoque de papaína a 1% em solução salina foi preparada e
mantida a 4 °C por 24 horas com agitação ocasional. A solução foi estocada em
alíquotas de 3 mL de papaína a –20 °C. Quando necessário, foi diluído na proporção
1:10 (v/v) com tampão SORENGEN (3 partes de NaH2PO4 0,067 M e 1 parte de
KH2POH, 0.067 M).
A solução de papaína foi adicionada ao sangue, previamente lavado, na
proporção de 1:1 (v/v). A mistura foi incubada por 30 minutos a 37°C, com agitação
ocasional. Em seguida foi centrifugado a 2.500 x g, por 5 minutos e seu precipitado
foi lavado 6 vezes com solução salina gelada. O hematócrito foi realizado e as
hemáceas foram diluídas a 4% em solução salina.
4.5.2.2 – Ensaio de Hemaglutinação de EvV
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em placas de ELISA
com fundo em “V” por meio de diluição seriada (1/2, 1/4, 1/8, etc...). Em cada poço
foram adicionados 25 PL de NaCl 0,15 M, 25 PL da amostra e 25 PL da suspensão
de eritrócitos humanos a 4%. A placa foi deixada em descanso à temperatura
ambiente; após 30 minutos a aglutinação foi observada, e o título expresso em
unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido como inverso da maior diluição
da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação (MOREIRA & PERRONE,
1977).
4.6 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA VICILINA DE E. velutina
4.6.1 – Obtenção de soro pré-imune
Os Coelhos de três meses de idade foram imobilizados e sangrados através
de corte na extremidade da orelha feito com bisturi cirúrgico, para obtenção do soro
pré-imune. Após a coleta de 5 mL de sangue este material foi deixado em repouso
por 16 horas a 5 °C . O soro foi separado do coágulo formado, centrifugado para
clarificar e reservado a -20 °C.
4.6.2 – Imunização
Após a obtenção do soro pré-imune, amostras de EvV foram preparadas a
uma concentração de 1 mg/mL em solução salina, NaCl 150 mM. Este material foi
emulsificado em adjuvante completo de Freund (ACF) na proporção 1:1 (solução de
EvV: adjuvante). Após 30 dias, novas aplicações de antígenos emulsificados em
adjuvante incompleto de Freund (AIF) foram realizadas regularmente. O protocolo
utilizado para imunização do coelho com obtenção de anticorpos policlonais foi
seguindo o método descrito por Thorpe (1994):
1° dia – imunização subcutânea do antígeno + ACF (0,5 mL)
30° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL)
60° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 1° sangria
90° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 2° sangria
120° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 3° sangria
A obtenção e estocagem do soro após imunização seguiram o mesmo
procedimento do soro pré-imune. Reforços foram aplicados semanalmente e
4.6.3 – Isolamento de imunoglobulinas do tipo G (IgG)
As amostras de antissoros obtidas foram passadas em uma coluna de
proteína A-Sepharose previamente equilibrada com tampão NaH2PO40,02M pH 8,0,
150 mM NaCl. O material não adsorvido foi eluído com tampão de equilíbrio. A
eluição de IgGs adsorvidas na coluna foi realizada com tampão Na2HPO4 50mM,
Acido cítrico 25mM, pH 3,0. As IgG isoladas foram neutralizadas com NaOH 0,1M,
dialisadas contra água e liofilizadas. Soluções estoques de IgG foram preparadas
em PBS pH 7,5, BSA 2% na concentração de 10 mg/mL. Os anticorpos assim
obtidos foram utilizados para o imunoblot. O título do anticorpo foi estabelecido pela
técnica de “dot-blot”.
4.7 – ANÁLISE DE EvV ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
4.7.1 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e
desnaturante
A eletroforese das amostras foi feita segundo o método desenvolvido por
Laemmli (1970). Foram utilizadas placas de vidro de dimensões 10 x 14 cm,
espaçadores de 1,0 mm e solução estoque de acrilamida/bisacrilamida (30%/ 0,8%,
w/w) dissolvidas em água destilada em volume para 100 mL. Esta solução foi filtrada
em papel de filtro Whatman n°1 e estocada em frascos escuros a 5 0C. O gel de
separação foi preparado numa concentração de 15% contendo: 1,2 mL de água
destilada, 1,3 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 50 Pl de SDS 10%, 2,5 mL de
solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 25 Pl de persulfato de amônio e 2,5 Pl
de TEMED. O gel de concentração foi preparado com 1,5 mL de água destilada,
solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 12,5 Pl de persulfato de amônio e 2,5 Pl
TEMED. Às frações protéicas contendo 15 Pg de proteínas, foi adicionada tampão
de amostra constituído de Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10% v/v, e
0,01% de azul de bromofenol. O tampão de corrida continha trizma base 25 mM,
glicina 192 mM e SDS 10%. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de
20 mA por aproximadamente 2 horas e após o marcador de corrida (azul de
bromofenol) atingir o final do gel, a eletroforese foi parada.
4.7.2 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e não
desnaturante
A metodologia estabelecida por Laemmli (1970) foi modificada para a análise
de EvV. O protocolo do item 4.7.1 foi repetido, sem a adição de SDS. A eletroforese
foi realizada sob corrente constante de 20 mA por aproximadamente 2 horas e após
o marcador de corrida (azul de bromofenol) atingir o final do gel, o tempo de corrida
foi estendido por mais 3 horas.
4.7.3 – Coloração com Coomassie Blue
Após a eletroforese o gel foi corado segundo procedimento descrito por
Weber e Osborne (1969). A solução corante foi preparada usando-se Comassie Blue
R-250 a 1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água destilada. O descoloração foi
feito com uma solução contendo ácido acético 10% e etanol 30%.
4.8 – IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS - “WESTERN BLOTTING”
O método de “western blotting” ou “imunoblotting” representa uma
objetivo de visualizar a especificidade de interação antígeno/anticorpo por meio de
uma imunoreação (TOWBIN et al., 1979).
Após a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, os géis foram
retirados das placas e equilibrados em tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina
192 mM pH 8,0, metanol 20%). Membranas de nitrocelulose e papéis de filtros
Whatman 3MM foram cortados no tamanho dos géis. As membranas foram também
equilibradas com tampão de transferência por 5 minutos. Em uma bandeja de vidro
foi montado um “sanduiche” que tinha a seguinte ordem de empilhamento: primeiro
foi colocado o suporte plástico do aparelho de transferência, seguido de uma
esponja, três folhas de papel de filtro, o gel de eletroforese, a membrana de
nitrocelulose e por último mais três folhas de papel de filtro, esponja e outro suporte
de plástico (Figura 2). Entre o gel e a membrana teve-se o cuidado de retirar bolhas
de ar que poderiam interferir na transferência das proteínas. O “sanduiche” foi
comprimido pelos suportes plásticos que se conectavam, colocado em uma cuba de
eletrotransferência (célula comercial Transblot) e imerso em tampão de
transferência. A eletrotransferência foi feita por 90 minutos com uma corrente
constante de 200 mA a 4 °C. Após transferência o “sanduiche” foi desfeito e a
membrana, retirada cuidadosamente, foi corada com Vermelho de Ponceau 2%,
Figura 6 – Esquema de montagem do “sanduíche” para eletrotransferência de proteínas de gel de poliacrilamida para membrana de nitrocelulose.
A imunodetecção das proteínas seguiu o procedimento descrito por Towbin et al., 1979:
1. Bloqueio dos sítios não específicos na membrana com tampão bloqueador
(tampão fosfato 0,1 M, NaCI 0,15 M Tween 20 0,05%, leite desnatado 2%, pH 7,4).
A membrana ficou nesta solução por 1 hora;
2. Lavagem da membrana com tampão fosfato 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 7,4
por 6 vezes, cada lavagem com duração de 10 minutos;
3. Reação com o anticorpo primário. Os anticorpos anti-EvV produzidos em
coelho foram utilizados na titulação 1:2000. Todos os anticorpos foram diluídos em
bloqueador, e as membranas imersas nestas soluções por 1 hora;
4. Repetição do ítem 2;
5. Reação com o anticorpo secundário. HRP-anti-lgG de coelho foi diluída em
tampão bloqueador (1:5000) e a membrana imersa nesta solução por 1 hora;
6. Repetição do ítem 2;
Suporte plástico Esponja
Papel Whatman Gel
Nitrocelulose Papel Whatman
Esponja
7. Visualização da reação imunológica. As bandas protéicas imunoreativas
para EvV foram reveladas por uma reação com o cromógeno diaminobenzidina
(DAB). As membranas foram imersas em uma solução contendo 5 mg de DAB
dissolvidos em 4,9 mL de água destilada, 0,3 mL de imidazol 0,1M, 0,1 mL de
tampão Tris-HCl 2M pH 7,5 e 5 PL de H2O2 a 30% (4°C). As membranas ficaram
imersas nesta solução por 10 minutos ou até aparecerem bandas coradas em
marrom.
8. Provas em branco com soro pré-imune foram incluídas.
4.9 – BIOENSAIO COM LARVAS DE C. capitata
4.9.1 – Curva de Densidade
Para determinação do número mínimo de larvas que poderiam ser usadas no
bioensaio sem, entretanto, afetar o resultado em decorrência da competição, uma
curva de densidade foi primeiramente construída.
O Bioensaio foi realizado em tubo de ensaio para hemólise, onde para cada
tubo foi adicionada dieta para larvas de C. capitata. Cinco densidades foram testadas (20, 40, 60, 80 e 100 larvas por grama de dieta). Para isto, larvas recém
eclodidas foram cuidadosamente transferidas para as dietas dos tubos, e após 96
horas o bioensaio foi paralisado, colocando os tubos em banho de gelo, as larvas
foram retiradas da dieta, lavadas, contadas, enxugadas em papel toalha e por fim
pesadas.
Os experimentos foram feitos em quadruplicatas e os tubos ordenados de
forma aleatória, ordenação esta obedecida na hora da contagem e pesagem das
4.9.2– Curva de instares larval
Para a determinação e caracterização dos instares larvais de C. capitata, quinze larvas foram coletadas durante cada um dos seis dias do desenvolvimento
larval. Estas larvas foram acondicionadas em microtubos de centrifuga com solução
fixadora (Solução de Pampel: 44% etanol; 4% formaldeído; 6% Ácido acético),
fervidas por um minuto e deixadas em descanso por no mínimo 24 horas. Após esse
período as larvas foram fotografadas e suas imagens analisadas no programa Image
Tool ver. 3.0. Os comprimentos larvais obtidos foram plotados em um gráfico para a
determinação dos instares. Neste tipo de análise cada instar larval é caracterizado
pela formação de agrupamentos de pontos.
4.9.3 – Efeito de vicilinas sobre o Desenvolvimento de Larvas de C. capitata
Para avaliar o efeito das vicilinas purificadas sobre o desenvolvimento de C. capitata, quantidades crescentes de EvV foram adicionadas à dieta das larvas. Foram utilizadas as seguintes concentrações: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2;
0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0% (p/p). Neste bioensaio 15 larvas recém eclodidas foram
colocadas cuidadosamente em 500 mg de dieta e após 96 horas, as larvas foram
retiradas da dieta, lavadas em NaCl 0,15 M, contadas, enxugadas em papel toalha e
por fim pesadas. Os experimentos foram feitos em quadruplicatas e os tubos
ordenados de forma aleatória, ordenação esta obedecida na hora da contagem e
pesagem das larvas.
4.11– ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para analisar os dados obtidos nos bioensaios foi aplicado uma análise de
