Teste de Von Wisseling para detecção de quitina em intestinos de C capitata de C capitata

Para detecção qualitativa de quitina em intestinos médios de larvas foi utilizado o teste de Von Wisseling (ROGERS & PERKINS, 1968). Este teste colorimétrico comprovou a presença de quitina em estruturas de intestinos médios de C. capitata (tabela 1). O que indica que estas estruturas quitinosas possam servir de sítios de ligação para EvV.

Tabela 1. Detecção de quitina em intestinos médios de C. capitata

Teste de Von Wisseling

Coloração marrom (lugol) Coloração violeta (H2SO4) Quitina + +

Intestinos de larvas de C. capitata + +

Algodão ND ND

(ND) não detectado; (+) detecção. Controle positivo: quitina de lagosta; Controle negativo: algodão.

5.3.2.2 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membranas peritróficas de

C. capitata

A ligação de EvV à membrana peritrófica de larvas de C. capitata foi analisada por imunodetecção da vicilina em estruturas quitinosas dos animais. Larvas de C. capitata, previamente alimentados com EvV, tiveram os intestinos dissecados e as membranas peritróficas retiradas e estocadas. As membranas peritróficas foram lavadas com tampão tetraborato de sódio 50mM pH 7,5, até que as proteínas presentes e não ligadas às estruturas quitinosas fossem totalmente

retiradas. As proteínas retidas foram eluídas com uma solução de HCl 10 mM e posteriormente submetidas a um SDS-PAGE. Em seguida as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e submetidas a imunodetecção, utilizando um anticorpo gerado contra EvV. A reação de IgG anti-EvV e as proteínas eluídas da membrana peritrófica foi positiva, confirmando que EvV adicionada à dieta se ligou in vivo em estrutura da membrana peritrófica (Figura 16).

Figura 16 – Western blotting das proteínas extraídas de membranas peritróficas de larvas de C.

capitata. 1 – EvV; 2 – Larva + BSA; 3 – Larva + EvV.

5.3.2.3. – Localização fluorescente de EvV-FITC no epitélio intestinal e em membrana peritrófica de larvas de C. capitata

x Localização fluorescente de EvV-FITC em larvas

A ligação de EvV em estruturas quitinosas presente em intestinos de larvas de C. capitata foi comprovada por microscopia de fluorescência de larvas alimentadas em dieta artificial contendo EvV-FITC a 0,12% (p/p). A fluorescência observada nos painéis 1A e 3A da figura 17 comprovou a ligação de EvV-FITC ao epitélio intestinal e a membrana peritrófica das larvas de C. capitata. A adição de 2,5% de N-acetil D-glicosamina foi eficiente na inibição da ligação de Evv-FITC à estruturas quitinosas, observada nos painéis 2A e 4A, e pode ser indicativo que a ligação de EvV-FITC nessas estruturas foi específica. Tratamentos controles com EvV não marcada não apresentaram nenhum sinal de fluorescência.

Figura 17 –Fotomicrografia de fluorescência e de campo claro do epitélio intestinal e da membrana

peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dietas contendo EvV-FITC acrescida ou não de N-acetil D-glicosamina.

Painel 1A: Microscopia de fluorescência do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.

Painel 1B: Microscopia de campo claro do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.

Painel 2A: Microscopia de fluorescência do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.

Painel 2B: Microscopia de campo claro do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.

Painel 3A: Microscopia de fluorescência da membrana peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.

Painel 3B: Microscopia de campo claro da membrana peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.

Painel 4A: Microscopia de fluorescência da membrana peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.

Painel 4B: Microscopia de campo claro da membrana peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.

OBS: Painéis 1 e 2 a barras = 200 ȝm; Painéis 3 e 4 a barra = 50 ȝm

1A 2A 3A 4A 1B 2B 3B 4B

6.0 – DISCUSSÃO

A necessidade de controlar as pragas e patógenos na agricultura tem impulsionado o desenvolvimento de uma variedade de pesticidas que diminuem as perdas no agronegócio. Estudos toxicológicos baseados nos efeitos agudos e crônicos da exposição a estas substâncias revelaram que muitos inseticidas sintéticos são altamente tóxicos não somente à espécie da praga alvo, mas também aos mamíferos e seres humanos. Conseqüentemente é necessária a busca por alternativas mais seguras, com diferentes mecanismos de ação e ambientalmente sustentáveis para o controle de pragas (LOPEZ, et al., 2005).

No curso de mais de 300 milhões de anos de coevolução as plantas adquiriram efetivas contra-repostas aos insetos predadores. Muitos tipos de compostos tóxicos são naturalmente depositados nas sementes como uma das formas de garantir a integridade do genoma contra a herbivoria das pragas (KOGAN, 1986). Isso torna as sementes de plantas selvagens como verdadeiros armazéns de moléculas que podem ser utilizados como bioprodutos nas áreas agronômicas e biomédicas. Por isso, uma especial atenção tem sido direcionada na busca de biomoléculas, em particular as de origem protéica, com atividades antimetabólicas e ou tóxicas para patógenos e pragas. Neste grupo, proteínas como os inibidores de proteinases (cisteínicas e serínicas), inibidores de D-amilases, lectinas, quitinases, glucanases e mais recentemente as vicilinas (globulinas 7S) fazem parte do arsenal protéico de defesas das sementes (XAVIER-FILHO et al., 1989; MACEDO, et al., 1993; SALES, et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2002; ARAUJO, et al., 2005).

Em sementes de leguminosas, as vicilinas possuem papel fisiológico tanto como fonte de aminoácidos para a plântula durante a germinação, quanto de defesa

durante o período de quiescência da semente (MACEDO, et al., 1993; SHUTOV, et al., 1995; SALES et al., 2001). Essa propriedade de defesa das vicilinas foi primeiramente descritas em sementes nigerianas de Vigna unguiculata (acesso TVU 2027 e seus descendentes IT81D-032 e IT81D-1045) resistentes ao bruquídeo Callosobruchus maculatus. As vicilinas das sementes nigerianas foram indicadas como as responsáveis por tal resistência, pois foram capazes de causar a mortalidade e ou interferir no desenvolvimento de C. maculatus (MACEDO, et al., 1993).

Sales et al. (1996) observaram que vicilina de sementes de Vigna unguiculata ficavam retidas em matrizes composta de quitina, um polímero de N- acetilglicosamina. Resultados posteriores mostraram que as vicilinas (globulinas 7S de diversas outras leguminosas, como o feijão azuki (Vigna angularis), feijão-de- porco (Canavalia ensiformis), soja (Glycine max), feijão-comum (Phaseolus vulgaris) e fava (P. lunatus) ligavam-se fortemente à quitina (YUNES, et al., 1998), indicando que estas proteínas tinham afinidade por este polissacarídeo. No presente estudo, a vicilina da semente da leguminosa Erythrina velutina foi isolada quando a fração globulinica da semente foi submetida à uma cromatografia em matriz de quitina, onde as proteínas retidas e eluídas da matriz eram na maior parte de natureza vicilínica.

Diversas proteínas de defesa presentes em sementes são capazes de se ligar a matrizes de quitina entre elas quitinases (KRISHNAVENI et al., 1999; TAIRA et al., 2001; SANTOS, et al., 2004), lectinas (BLOCH & BURGER, 1974; DATTA et al., 1984; SANTI-GADELHA et al., 2006) e inibidores de proteinases (MACEDO et al., 2002; MACEDO et al., 2003). Amostras de EvV isolada neste trabalho foram submetidas a ensaios de detecção dessas outras proteínas de defesa, depois dos

quais foi confirmado que estavam livres destes outros fatores antimetabólicos. Na etapa seguinte, para verificar o grau de purificação, amostras de EvV foram submetidas a uma cromatografia analítica de exclusão molecular em Superose 6-10- 300 GL em sistema de FPLC AKTA Purifier. A eluição de um único pico protéico comprovou a eficiência da etapa de cromatografia em quitina para a purificação de EvV. Este método se mostrou um eficiente método alternativo àquele descrito por Macedo et al. (1995).

A Vicilina de E. velutina apresentou peso molecular de 216,57 KDa, por cromatografia de exclusão molecular e por SDS-PAGE, EvV se dissociou em duas principais subunidades de 54,8 e 50,8 kDa, apresentando um bandeamento eletroforético semelhantes ao encontrados para vicilina Vigna angulares (YUNES, et al., 1998), portanto, na sua forma nativa EvV é um tetrâmero formado por 2 subunidades de 54,8 kDa e por 2 subunidades 50,8 kDa. Além das duas de EvV foi verificada também a presença de subunidades de menores massas moleculares provenientes de processamento proteolítico pós-traducional das subunidades da proteína, que é uma das características dessa classe de proteínas oligoméricas (SCHOLZ et al., 1983; SPENCER et al., 1983; SHEWRY et al., 1995). A homogeneidade de EvV foi analisada em eletroforese nativa e foi observado a presença de uma única banda com característica levemente ácida em concordância com resultados encontrados para diversas globulinas 7S (PEDALINO, et al., 1992; ORRUNO & MORGAN, 2007). Assim como outras vicilinas, EvV é uma glicoproteína com 1,85% de sua massa composta por carboidratos, este resultado está dentro da faixa observada para outras vicilinas que foi de 1 a 2% (DERBYSHIRE, et al., 1976; BURKS et al., 1995; SHEWRY, et al., 1995; MÜLLER et al., 2000; LAUER et al., 2004).

Yunes et al. isolaram vicilinas de sementes de várias espécies de leguminosas e testaram-nas contra o bruquídeo C. maculatus. Essas vicilinas mostraram-se deletérias para este inseto praga (YUNES, et al., 1998). Em outro estudo foi mostrado que essas vicilinas poderiam ser usadas contra outros insetos não predadores de sementes como broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis, que também foram susceptíveis a ação tóxica de vicilinas de Vigna unguiculata a qual causou uma redução considerável na taxa de sobrevivência deste inseto (MOTA et al., 2003). Teixeira et al. (2007) comprovaram que vicilina da semente da leguminosa E. velutina comportou-se também como uma proteína tóxica, semelhantes a outras vicilinas isoladas de sementes de leguminosas, quando adicionada à dieta de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus, bruquídeos predadores de sementes armazenadas. Com a finalidade de verificar o efeito tóxico de EvV sobre o díptera C. capitata, um modelo de bioensaio foi utilizado para larvas (EISEMANN, et al., 1994; CHANG, 2004). Um curva dose-resposta foi realizada para avaliar o efeito de EvV sobre o desenvolvimento larval. EvV na concentração de 0,20% reduziu o peso das larvas em 81,12%, e foi letal em concentrações acima de 0,25%. A WD50 e a LD50 calculados no bioensaio larval foram de 0,118% e 0,15% (p/p), respectivamente.

Os possíveis mecanismos de ação de EvV podem ser os mesmos observados por Sales et al. (2001) para vicilina de V.unguiculata, onde a interação à quitina, presente no intestino médios das larvas de C. maculatus, associada a baixa digestibilidade destas proteínas poderiam explicar a baixa taxa de emergência e o longo período de desenvolvimento dos insetos.

Para testar a hipótese de que o efeito tóxico de EvV estava relacionado a indigestibilidade, fezes das larvas foram coletadas e analisadas por imunodetecção.

EvV se mostrou resistente a proteólise pelas enzimas intestinais de larvas de C. capitata. Proteínas de sementes, geralmente, são resistentes à ação de enzimas heterólogas (ROMERO & RYAN, 1978; NIELSEN et al., 1988). Durante a germinação a mobilização das proteínas de reserva só é iniciada quando uma proteinase cisteínica especifica abre a molécula para que outras proteinases possam iniciar a degradação num sistema de proteólise em “zipper” (SHUTOV & VAINTRAUB, 1987). Os insetos que se alimentam de grãos armazenados desenvolveram um sistema proteolítico que permitiu utilizar como fonte de nitrogênio as proteínas das sementes. A semelhança entre o sistema de degradação das proteínas durante a germinação e o sistema proteolítico de bruquídeos é constatada na utilização por estes insetos de enzimas de classes mecanísticas semelhantes àquelas encontradas em sementes, como as proteinases cisteínicas e aspárticas (WIEMAN & NIELSEN, 1988; CAMPOS et al., 1989; LEMOS et al., 1990; SILVA & XAVIER-FILHO, 1991). Estudos demonstraram que as formas nativas das proteínas de reserva são resistentes à proteólise por enzimas de mamíferos e enzimas bacterianas do tipo serínicas. Segundo Silva et al. (2006) as enzimas proteolíticas predominantes no sistema digestivo de C. capitata são do tipo serínicas. A ausência de um sistema enzimático específico explicaria a indigestibilidade de EvV por C. capitata. A indigestibilidade de EvV, contudo, não pode ser relacionada como a principal determinante da toxicidade de EvV em C. capitata, uma vez que o tratamento controle contendo BSA, que é uma proteína resistente a digestão (BERETTA et al., 2001; RESTANI et al., 2004), não foi capaz de causar mortalidade das larvas.

A existência de estruturas quitinosas no sistema digestivo de C. capitata foi comprovada pelo teste de Von Wisseling. A hipótese de que a toxicidade de EvV

estava relacionada a sua capacidade de se ligar em estruturas quitinosas no trato intestinal de C. capitata foi então analisada por imunodetecção e por localização fluorescente de EvV-FITC no sistema digestório de larvas. A presença de EvV nas amostras eluídas das membranas peritróficas foi confirmada pela ligação de EvV à estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica. A especificidade de EvV pela quitina presentes nestas estruturas foi confirmada quando a dieta dos insetos foi suplementada com N-acetil-D-glucosamina que inibiu a ligação de EvV-FITC nas estruturas quitinosas e consequentemente não foi detectada por fluorescência. Esse mecanismo de ação foi observado em larvas de Callosobruchus maculatus onde a propriedade de se ligar à estruturas quitinosas presente em membrana peritrófica e ao ápice de células epiteliais do intestino médio causaram o efeito deletério para este inseto (FIRMINO et al., 1996; SALES, et al., 2001).

Este provável mecanismo de ação de vicilinas é semelhante aos mecanismos propostos para algumas lectinas, que se ligam a constituintes glicoprotéicos presentes nos intestinos médios de insetos (ZHU-SALZMAN et al., 1998; FITCHES et al., 2001). Eiseman et al. (1994), utilizando WGA mostraram que essa proteína se liga à estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica e no ápice das células do epitélio intestinal das larvas de Lucilia cuprina. A ingestão desta proteína causou redução na taxa de crescimento larval e morte das larvas em concentrações altas de lectina. Segundo os mesmos autores, estes efeitos foram provavelmente causados por três mecanismos de ação: (1) redução na ingestão da dieta; (2) bloqueio parcial dos poros da membrana peritrófica; e (3) a ligação direta das lectinas nas microvilosidades do epitélio intestinal. Esta ligação poderia afetar várias funções da membrana celular. Um mecanismo semelhante a este pode ser invocado para explicar a ação de EvV sobre larvas de C. capitata.

A ligação de EvV no epitélio intestinal das larvas de C. capitata também foi observada, além da ligação à estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica. Resultado semelhante foi observado por Eisemann et al (1994) que propuseram que possivelmente os sítios de ligação de proteínas ligantes à quitina podem estar distantes ou ausentes em áreas restritas da membrana peritrófica (PETERS, 1992), resultando em uma maior permeabilidade nestas regiões (EISEMANN, et al., 1994). Sendo que o bloqueio aparente dos poros da membrana peritrófica pela ingestão de proteínas que se ligam a quitina não é um evento simples, e as membranas peritróficas, particularmente as do tipo II, não são barreiras homogêneas de filtração, mas sim uma série de barreiras com diferentes potenciais de filtração. Diversos fatores físicos e químicos alteram a permeabilidade da membrana peritrófica (LEHANE, 1997) e estudos para determinação dos limites de filtração em membranas peritróficas do tipo I e II de uma grande variedade de dípteros sugerem que os diâmetros máximos dos poros estão entre 2 a 10nm, e a faixa de exclusão para proteínas globulares está entre 6 a 200 kDa, aproximadamente (PETERS & WIESE, 1986; MILLER & LEHANE, 1990). A detecção de EvV-FITC ligada no epitélio de larvas de C. capitata está provavelmente relacionada ao tamanho dos poros da membrana peritrófica e a massa molecular de EvV.

Muitas proteínas tóxicas, como toxinas de Bacillus thuringiensis e lectinas, têm os seus mecanismos de ação baseados na sua capacidade de se ligar em determinados alvos no epitélio intestinal (MAJUMDER et al., 2005; GOMEZ et al., 2006). Muitas lectinas foram inseticidas a uma grande variedade de pragas economicamente importantes (POWELL et al., 1993; RAHBE et al., 1995; STOGER et al., 1999), onde a ligação de lectinas no epitélio afetou o mecanismo de regulação

enzimática no microambiente das microvilosidades, causou anormalidades nas células epiteliais e o rompimento das microvilosidades (FITCHES & GATEHOUSE, 1998). Em adição a destruição celular, estudos ultraestruturais mostraram a presença de proliferação bacteriana nos sítios de ligação da lectina (POWELL et al., 1998).

Portanto de acordo com os resultados apresentados neste trabalho o mecanismo bioinseticida de EvV se deve a sua ligação a estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica e no epitélio intestinal, associado com a baixa capacidade de C. capitata em digeri-la. Esses resultados confirmam que vicilinas 7S apresentam um papel importante nos mecanismos de defesa de plantas contra insetos, e assim como as outras proteínas ligantes à quitina, são parte do arsenal de defesa de sementes que podem ser utilizadas no combate a insetos não adaptados como as moscas-das-frutas. Este trabalho é um dos primeiros a propor um mecanismo de ação efetivo contra moscas-das-frutas baseado nas propriedades tóxicas de proteínas de origem vegetal. Isto evidencia a grande potencialidade de proteínas antimetábolicas encontradas em sementes de leguminosas de vários ecossistemas, tanto regionais como nacionais, tornando-as candidatas a serem usadas como bioinseticidas, em programas de manejo integrado de pragas, na composição de iscas tóxicas, ou mesmo nos programas de melhoramento de plantas cultivadas.

7.0 – CONCLUSÃO

1. A vicilina de E. velutina é uma glicoproteína dimérica e acida, com peso molecular de 216,57 kDa que possui afinidade por quitina.

2. EvV é um potente larvicida. Causou mortalidade total em concentrações acima de 0,25% (p/p). Esta proteína pode no futuro fazer parte de programas de melhoramento genético de frutos resistentes ao ataque por moscas-das-frutas.

3. Larvas de C. capitata não foram capazes de digerir EvV.

5. EvV foi capaz de interagir com as estruturas quitinosas presentes no intestino das larvas.

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